Tierärztliche Hochschule Hannover Untersuchungen zur Eignung der interkalierenden Substanzen Ethidiummonoazid und Propidiummonoazid für eine quantitative Bestimmung lebender Campylobacter-Zellen aus Lebensmittelproben und Wasser mittels real-time PCR INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.) vorgelegt von Diana Seinige Hannover Hannover 2014
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Tierärztliche Hochschule Hannover Untersuchungen zur ... · Tierärztliche Hochschule Hannover Untersuchungen zur Eignung der interkalierenden Substanzen Ethidiummonoazid und Propidiummonoazid
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Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zur Eignung der interkalierenden Sub stanzen
Ethidiummonoazid und Propidiummonoazid für eine qua ntitative
Bestimmung lebender Campylobacter-Zellen aus
Lebensmittelproben und Wasser mittels real-time PCR
INAUGURAL - DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Diana Seinige
Hannover
Hannover 2014
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. Corinna Kehrenberg, PhD Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit
Univ. Prof. Dr. med. vet. Günter Klein
Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit
1. Gutachter/ in: Prof. Dr. med. vet. Corinna Kehrenberg, PhD
Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit
Univ. Prof. Dr. med. vet. Günter Klein
Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit
2. Gutachter: Prof. Dr. Waldemar Ternes
Institut für Lebensmitteltoxikologie und
Chemische Analytik
Tag der mündlichen Prüfung: 17.11.2014
Teile dieser Arbeit wurden durch Mittel des Sanitätsamt der Bundeswehr (Grant M /
SAB X / 9A006) gefördert. Die Standardisierung der Methode wurde durch das
Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie (BMWi) (Fkz-01FS10019)
finanziell gefördert.
I
Publikationsverzeichnis
Die vorliegende Dissertation basiert in überwiegenden Teilen auf den folgenden Publikationen: Publikation 1:
SEINIGE, D., C. KRISCHEK, G. KLEIN and C. KEHRENBERG (2014): Comparative Analysis and Limitations of Ethidium Monoazide and Propidium Monoazide Treatment for the Differentiation of Viable and Nonviable Campylobacter Cells. Appl. Environ. Microbiol. 80 (7), 2186-92. doi: 10.1128/AEM.03962-13.
Publikation 2:
SEINIGE, D., M. VON KÖCKRITZ-BLICKWEDE, C. KRISCHEK, G. KLEIN and C. KEHRENBERG (2014): Influencing Factors and Applicability of the Viability EMA-qPCR for a Detection and Quantification of Campylobacter Cells from Water Samples. PLoS One. 9 (11):e113812. doi: 10.1371/journal.pone.0113812.
Weitere Aspekte der Dissertation wurden in Form von Artikeln, Vorträgen oder Postern präsentiert: Zeitschriftenartikel:
SEINIGE, D., C. KEHRENBERG, C., KRISCHEK, A. BINDER u. G. KLEIN (2012): „Nachweis und Unterscheidung von lebenden und toten Bakterien mit der PCR am Beispiel von Campylobacter spp.“ Wehrmedizinische Monatsschrift 56. Jahrgang. Heft 8-9. August-September 2012, 198-200
Vorträge:
SEINIGE, D., G. KLEIN u. C. KEHRENBERG (2010): „Quantifizierung und Unterscheidung von lebenden und toten Lebensmittelinfektionserregern mittels PCR im Einsatz“. 1. Zwischenbericht, Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, 02.12.2010
II
SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2011): „Untersuchungen zur Quantifizierung und Unterscheidung von lebenden und toten Campylobacter spp. mittels real-time PCR“. 52. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch, 27.09.-30.09.2011, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle S.45 SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2011): „Quantifizierung und Unterscheidung von lebenden und toten Lebensmittelinfektionserregern mittels PCR im Einsatz“. 2. Zwischenbericht, Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, 16.11.2011
SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2011): „Quantifizierung und Unterscheidung von lebenden und toten Lebensmittelinfektionserregern mittels PCR im Einsatz“. Vortrag im Rahmen des Kolloquium für Tiergesundheit und Lebensmittelqualität an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, 02.12.2011 SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2012): „Quantifizierung und Unterscheidung von lebenden und toten Lebensmittelinfektionserregern mittels PCR im Einsatz“. Vortrag im Rahmen des Workshop I „Workshop Normung von PCR-Verfahren 2012“ des Instituts für Lebensmittelqualität und -sicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, 14.02.2012
SEINIGE, D., G. KLEIN, M. VON KÖCKRITZ-BLICKWEDE u. C. KEHRENBERG (2013): Nachweis von Campylobacter spp. aus Wasserproben. Eignet sich die EMA-real-time PCR? Vortrag im Rahmen des Workshop II „Neue Entwicklungen zu Nachweismethoden und zur Epidemiologie von Campylobacter spp.“ des Instituts für Lebensmittelqualität und -sicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, 12.03.2013
SEINIGE, D., M. VON KÖCKRITZ-BLICKWEDE, G. KLEIN u. C. KEHRENBERG (2013): Untersuchungen zur Membranintegrität und zum quantitativen Nachweis von Campylobacter aus Wasserproben mittels qPCR unter Anwendung interkalierender Substanzen. 54. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch, 24.09.-27.09.2013, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle S. 62
III
Poster: KEHRENBERG, C., A. ABDULMAWJOOD, G. KLEIN u. D. SEINIGE (2011): „Quantifizierung lebender Campylobacter spp. aus Wasserproben: Eine
Evaluierungsstudie mittels EMA-real-time PCR“. 52. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch, 27.09.-30.09.2011, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle S.170 SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2011): „Eignung der Real-time PCR unter Zusatz von interkalierenden Substanzen zur Quantifizierung und Lebend/Tot-Unterscheidung von Campylobacter spp.“. Tagung der DVG-Fachgruppe „Bakteriologie und Mykologie“, Leipzig, 27.06.-29.06.2012, Tagungsband S.217 SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2012): „Eignung der EMA real-time PCR Methode zur Detektion lebender Campylobacter auf Geflügelfleisch“. 53. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch, 25.09.-28.09.2012, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle S.184 SEINIGE, D., M. VON KÖCKRITZ-BLICKWEDE, G. KLEIN and C. KEHRENBERG (2013): Applicability of a qPCR method combined with an intercalating dye for detection and differentiation of viable Campylobacter cells from water samples. FEMS 2013 5th Congress of European Microbiologists, Leipzig, Germany, 21.07.-25.07.2013 Congress Book S. 229 (Nr. 559) SEINIGE, D., C. KRISCHEK, G. KLEIN u. C. KEHRENBERG (2014): Bestimmung der Signalreduktion toter Campylobacter-Zellen mittels qPCR unter Anwendung der Differenzierungsmittel EMA und PMA. 55. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch, 23.09.-26.09.2014, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle S.188 SEINIGE, D., C. KRISCHEK, G. KLEIN and C. KEHRENBERG (2014): A Comparative Study of the Applicability and Limitations of Ethidium Monoazide and Propidium Monoazide Treatments for a Selective Detection of Viable Campylobacter Cells by qPCR. 3rd EAVLD Congress der European Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, 12 to 15 October, 2014, Pisa, Italy. Abstract Book S. 215 (Nr. 121)
V
Inhaltsverzeichnis
Publikationsverzeichnis ............................................................................................... I
Inhaltsverzeichnis ....................................................................................................... V
Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................... X
Tabellenverzeichnis .................................................................................................. XII
Abbildungsverzeichnis .............................................................................................. XII
• Planung der Experimente: D. Seinige, G. Klein, C. Kehrenberg • Durchführung der Experimente: D. Seinige • Auswertung der Ergebnisse: D. Seinige, C. Krischek, C. Kehrenberg • Verfassen oder kritische Durchsicht
des Manuskriptes: D. Seinige, C. Krischek, G. Klein, C. Kehrenberg
60 Publikationen
ABSTRACT
The lack of differentiation between viable and nonv iable bacterial cells limits
the implementation of PCR-based methods for routine diagnostic approaches.
Recently, the combination of a quantitative real-ti me PCR (qPCR) and ethidium
monoazide (EMA) or propidium monoazide (PMA) pretre atment has been
described to circumvent this disadvantage. In regar d to the suitability of this
approach for Campylobacter spp ., conflicting results have been reported.
Thus, we compared the suitabilities of EMA and PMA in various concentrations
for a Campylobacter viability qPCR method. The presence of either
intercalating dye, EMA or PMA, leads to concentrati on-dependent shifts toward
higher threshold cycle (C t) values, especially after EMA treatment. However,
regression analysis resulted in high correlation co efficient ( R2) values of 0.99
(EMA) and 0.98 (PMA) between Campylobacter counts determined by qPCR
and culture-based enumeration. EMA (10 µg/ml) and P MA (51.10 µg/ml)
removed DNA selectively from nonviable cells in mix ed samples at
viable/nonviable ratios of up to 1:1,000. The optim ized EMA protocol was
successfully applied to 16 Campylobacter jejuni and Campylobacter coli field
isolates from poultry and indicated the applicabili ty for field isolates as well.
EMA-qPCR and culture-based enumeration of Campylobacter spiked chicken
leg quarters resulted in comparable bacterial cell counts. The correlation
coefficient between the two analytical methods was 0.95. Nevertheless, larger
amounts of nonviable cells (>10 4) resulted in an incomplete qPCR signal
reduction, representing a serious methodological li mitation, but double
staining with EMA considerably improved the signal inhibition. Hence, the
proposed Campylobacter viability EMA-qPCR provides a promising rapid
method for diagnostic applications, but further res earch is needed to
circumvent the limitation.
Publikationen 61
5.2. Influencing Factors and Applicability of the V iability EMA-qPCR for a
Detection and Quantification of Campylobacter Cells from Water
• Planung der Experimente: D. Seinige, G. Klein, C. Kehrenberg • Durchführung der Experimente: D. Seinige • Auswertung der Ergebnisse: D. Seinige, M. von Köckritz-Blickwede,
C. Krischek, C. Kehrenberg • Verfassen oder kritische Durchsicht
des Manuskriptes: D. Seinige, M. von Köckritz-Blickwede, C. Krischek, G. Klein, C. Kehrenberg
62 Publikationen
ABSTRACT
In recent years, increasing numbers of human campyl obacteriosis cases
caused by contaminated water have been reported. As the culture-based
detection of Campylobacter is time consuming and can yield false-negative
results, the suitability of a quantitative real-tim e PCR method in combination
with an ethidium monoazide pretreatment of samples (EMA-qPCR) for the
rapid, quantitative detection of viable Campylobacter cells from water samples
was investigated. EMA-qPCR has been shown to be a p romising rapid method
for the detection of viable Campylobacter spp. from food samples. Application
of membrane filtration and centrifugation, two meth ods frequently used for the
isolation of bacteria from water, revealed a mean l oss of up to 1.08 log 10
cells/ml from spiked samples. Both methods used alo ne lead to a loss of dead
bacteria and accumulation of viable bacteria in the sample as shown by
fluorescence microscopy. After filtration of sample s, no significant differences
could be detected in subsequent qPCR experiments wi th and without EMA
pretreatment compared to culture-based enumeration. High correlations
(R2=0.942 without EMA, R 2=0.893 with EMA) were obtained. After centrifugatio n
of samples, qPCR results overestimated Campylobacter counts, whereas
results from both EMA-qPCR and the reference method were comparable. As
up to 81.59% of nonviable cells were detected in po nd water, EMA-qPCR failed
to detect correct quantities of viable cells. Howev er, analyses of spiked tap
water samples revealed a high correlation (R 2=0.863) between results from
EMA-qPCR and the reference method. After membrane f iltration, EMA-qPCR
was successfully applied to Campylobacter field isolates, and results indicated
an advantage over qPCR by analysing defined mixture s of viable and nonviable
cells. In conclusion, EMA-qPCR is a suitable method to detect viable
Campylobacter from water samples, but the isolation technique an d the
type/quality of the water sample impact the results .
Diskussion 63
6. Diskussion
Der quantitative Nachweis von Campylobacter spp. ist von Bedeutung, um
insbesondere bei Geflügelfleischprodukten aber auch bei Wasserproben die
lebensmittelhygienische Qualität beurteilen zu können (KEER und BIRCH 2003,
PITKÄNEN 2013, KRÜGER et al. 2014). Mit der Entwicklung einer Schnellmethode
zur Quantifizierung der Bakterien, welche nur lebende Campylobacter-Zellen
detektiert, wäre es möglich, Keimzahlen auf oder in kontaminierten Lebensmitteln zu
ermitteln und durch entsprechende Massnahmen das Infektionsrisiko für den
Konsumenten zu minimieren. Somit könnte mittels dieser Methode ein wichtiger
Schritt zur Senkung der Anzahl humaner Campylobacteriose-Fälle erreicht werden.
Das amtliche, kulturelle „Horizontale Verfahren zum Nachweis und zur Zählung von
Campylobacter spp.“ nach § 64 des LFGB, sowie die DIN EN ISO 10272-1:2006,
nutzen das kulturelle Anzuchtverfahren der Bakterien auf Agarplatten, um die Anzahl
Kolonie-bildender Einheiten (KbE) zu bestimmen (§ 64 LFGB, DIN EN ISO 10272-
1:2006).
Die quantitative Keimzahlbestimmung mittels dieses mikrobiologischen
Keimzählverfahrens ist jedoch abhängig von vielen Faktoren, wie dem gewählten
Anzuchtmedium, der Probenmatrix sowie dem metabolischen Status und der
Zellintegrität der Bakterien (RUDI et al. 2005). Zudem ist der kulturelle
Erregernachweis bei langsam wachsenden Bakterienspezies und physiologisch
anspruchsvollen Keimen wie Campylobacter stark erschwert (SOLOMON und
HOOVER 1999, BOTTELDOORN et al. 2008, STINGL et al. 2012). Aufgrund dieser
Nachteile sowie der langen Zeitdauer bis zur Erlangung von
Untersuchungsresultaten, welche nach der amtlichen Nachweismethode nach § 64
LFGB bis zu 6 - 7 Tage beträgt, ist kein zeitnaher Eingriff in die
Lebensmittelsicherheit mehr möglich. Auch Steuerungsfunktionen, welche die
Ausbreitung von Erregern verhindern sollen, können somit nicht zeitnah umgesetzt
werden. Demzufolge ist die Entwicklung von kulturunabhängigen, quantitativen
Schnellmethoden zum Nachweis von Campylobacter spp. für eine Einschätzung des
64 Diskussion
Gesundheitsrisikos von Lebensmitteln von entscheidender Bedeutung (KRÜGER et
al. 2014).
Mit der Entwicklung von PCR und real-time PCR Verfahren für den Nachweis von
Campylobacter spp. stehen Schnellmethoden zur Verfügung, die eine zeitnahe
Untersuchung von Proben ermöglichen (RUDI et al. 2005). Unter Verwendung von
EMA oder PMA in Kombination mit quantitativen real-time PCR (qPCR) Verfahren
könnten zudem lebende und somit potentiell infektiöse Bakterienstadien von toten
Zellen differenziert werden (CAWTHORN und WITTHUHN 2008, CHANG et al. 2010,
HELLEIN et al. 2012).
6.1. I. Abschnitt - Methodenentwicklung
Im ersten Abschnitt dieser Arbeit wurde eine geeignete Methode entwickelt, die einen
Nachweis lebender Campylobacter-Zellen mittels der qPCR Methode ermöglicht.
Dabei wurden Faktoren, die zu einer Beeinflussung der Ergebnisse der qPCR führen
können, wie unterschiedliche interkalierende Substanzen (Differenzierungsmittel)
und verschiedene Arbeitskonzentrationen der Differenzierungsmittel, vergleichend
untersucht. Die Ergebnisse werden in den folgenden Abschnitten diskutiert.
6.1.1. Einfluss von EMA und PMA auf die Resultate d er real-time PCR bei
Verwendung von lebenden Zellen
Da anzunehmen war, dass die eingesetzten Differenzierungsmittel zu einer
Beeinflussung von qPCR Ergebnissen führen, wurden EMA und PMA in
unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt und die Ct-Werte (als Ergebnisse der
qPCR-Analysen) mit den Resultaten der unbehandelten Zellen verglichen. Dabei
zeigten beide Differenzierungsmittel eine Erhöhung der Ct-Werte in der qPCR im
Vergleich zu den unbehandelten Zellen. Vermutlich resultierte die Ct-Verschiebung
aus dem partiellen Eindringen der Differenzierungsmittel in lebende Zellen, deren
DNA dann in einer folgenden qPCR nicht mehr amplifiziert werden konnte welches
Diskussion 65
somit zu höheren Ct-Werten im Vergleich zur unbehandelten Kontrollprobe führte.
Zum anderen war aus den Ergebnissen zu erkennen, dass die Ct-Wert Verschiebung
abhängig von dem verwendeten Differenzierungsmittel ist, denn sie zeigte sich bei
EMA deutlicher als bei einem Einsatz von PMA. Die unterschiedliche Ausprägung
der Ct-Werte-Verschiebung der getesteten Differenzierungsmittel EMA und PMA ist
vermutlich bedingt durch die unterschiedliche Ladung der beiden Substanzen. Da die
hydrophobe Phospholipidschicht der bakteriellen Zellmembran nur für ungeladene
Moleküle oder Substanzen mit einer dezentralisierten Ladung passierbar ist (CAO-
HOANG et al. 2008), resultiert die unterschiedliche Ausprägung der Penetration bei
lebenden Zellen mit intakter Zellmembran darauf, dass PMA im Gegensatz zu EMA
eine weitere positive Ladung besitzt. Dadurch wird die Penetration durch die
bakterielle Zellmembran lebender Zellen bei PMA selektiver verhindert, so dass die
Erhöhung der Ct-Werte in der qPCR bei einem Einsatz von PMA geringer ausgeprägt
ist (NOCKER et al. 2006, CAWTHORN und WITTHUHN 2008). Der Effekt einer
Erhöhung der Ct-Werte beim Einsatz der Substanz EMA wurde auch zuvor in Studien
anderer Autoren an Bakterienspezies wie Salmonella enterica, Enterobacter
sakazakii, Staphylococcus aureus und Escherichia coli beschrieben (NOCKER et al.
2006, NOCKER und CAMPER 2006, CAWTHORN und WITTHUHN 2008,
KOBAYASHI et al. 2009). Auch für Campylobacter spp. konnte eine Beeinflussung
der Ct-Werte bei Verwendung von EMA von anderen Autoren beobachtet werden
(FLEKNA et al. 2007, KRÜGER et al. 2014).
Bei der Verwendung von PMA wurde in der vorliegenden Studie ebenfalls eine Ct-
Wert Verschiebung bei lebenden Zellen beobachtet. Dieses lässt vermuten, dass
auch das Differenzierungsmittel PMA die Bakterienmembran lebender Zellen partiell
durchdringen kann. In der Literatur wird der Einfluss von PMA auf lebende Zellen
kontrovers gesehen. So konnte in weiteren Studien zur Detektion und Quantifizierung
der Bakterienspezies Mycobakterium avium subsp. paratuberculosis, Salmonella
enterica und Legionella pneumophila bei Verwendung von PMA ebenfalls eine
Erhöhung der Ct-Werte lebender Zellen in der qPCR beobachtet werden (KRALIK et
al. 2010, LIANG et al. 2011, LOOZEN et al. 2011, YÁÑEZ et al. 2011). Andere
Autoren erzielten jedoch gegensätzliche Ergebnisse und konnten bei Verwendung
66 Diskussion
von PMA keine Signalreduktion lebender Zellen bei der Detektion von Enterobacter
sakazakii, Staphylococcus aureus, Listeria monozytogenes, Escherichia coli, C.
jejuni und C. coli beobachten (CAWTHORN und WITTHUHN 2008, NOCKER et al.
2006, KRÜGER et al. 2014). In diesen Studien wurde jedoch eine geringere
Konzentration an PMA als in der vorliegenden Arbeit verwendet oder es wurde nur
eine Beurteilung über die Intensität von Agarosegelbanden durchgeführt. So
applizierten KRÜGER et al. (2014) eine geringere PMA Konzentration von 20 µmol/l.
Die niedrigste getestete PMA-Konzentration in der vorliegenden Studie betrug jedoch
50 µmol/l (25,55 µg/ml) und dabei konnte eine Konzentrationsabhängigkeit der Ct-
Wert Verschiebung dargestellt werden. Bei dem Einsatz von geringeren
Konzentrationen des Differenzierungsmittels wurden auch geringere Verschiebungen
der Ct-Werte beobachtet. Diese Resultate lassen vermuten, dass bei steigender
Konzentration der Differenzierungssubstanz eine höhere Penetration der Substanz
durch intakte Zellmembranen erfolgt. Die Konzentration von 50 µmol/l PMA stellte
sich jedoch in den weiteren Versuchen als nicht ausreichend dar, um eine
Differenzierung zwischen lebenden und toten Campylobacter-Zellen zu ermöglichen.
In der Literatur gibt es für die Verschiebung der Ct-Werte in der qPCR bei
Verwendung von Differenzierungsmitteln neben der oben erwähnten Erklärung noch
weitere Erklärungsmodelle, die im nächsten Kapitel detailliert beschrieben werden.
6.1.2. Erklärungsmodelle für C t-Wert-Verschiebungen in qPCR-
Experimenten nach Einsatz von Differenzierungsmitte ln
Neben dem partiellen Eindringen der Substanzen in lebende Zellen basiert ein
weiteres Erklärungsmodell für die Ct-Wert-Verschiebungen auf dem Vorhandensein
von membrangeschädigten Zellfraktionen, die zum Teil auch in 24 Stunden
angezüchteten Bakterienkulturen zu finden sind (YÁÑEZ et al. 2011). Dabei ist
bekannt, dass Bakterienkulturen sowohl in flüssigen als auch in festen Nährmedien
einen Anteil an membrangeschädigten Zellen beinhalten können. Frisch
angezüchtete Bakterienkulturen werden aber häufig mit dem Anteil an lebenden
(oder membranintakten) Zellen gleichgesetzt. Da das Prinzip der
Diskussion 67
Differenzierungsmittel auf der Membranpermeabilität der Zellen beruht, können aber
membrangeschädigte oder tote Zellen, welche sich in diesen frischen Kulturen
befinden, durch die aufgenommenen Differenzierungsmittel zu einer Ct-Wert
Verschiebung in der qPCR führen. Zudem ist eine Änderung der
Membranpermeabilität im Verlauf der Wachstumsphase der Bakterien möglich
(FITTIPALDI et al. 2012). GEDALANGA und OLSON (2009) beobachteten in ihrer
Studie an Escherichia coli in unterschiedlichen Wachstumsphasen, dass EMA
überwiegend bei sich schnell teilenden sowie älteren Bakterien in die Zellen
eindringen konnte und folgerten daraus, dass die Membranpermeabilität der
Bakterien im Verlaufe des Wachstums Veränderungen unterworfen ist. Bei Bakterien
in unterschiedlichen Wachstumsphasen könne somit auch eine unterschiedliche
Effektivität bei der Aufnahme von EMA in die Zelle erfolgen und somit zu einer
Verschiebung der Ct-Werte in der qPCR führen (GEDALANGA und OLSON 2009).
Eine weitere Erklärung kann der toxische Effekt der Substanzen auf lebende Zellen
sein. Zur Testung des Effektes der Substanz EMA auf die Zellen führten RUECKERT
et al. (2005) einen Zytotoxizitätstest ein. Dabei wurden flüssige Bakterienkulturen von
Anoxybacillus flavithermus mit dem Differenzierungsmittel EMA versetzt und
anschließend das Koloniewachstum auf einer Agarplatte beurteilt. Die Autoren
folgerten daraus, dass die Reduktion des Koloniewachstums um so höher ist, je
höher der zytotoxische Effekt der Substanz auf die Zellen ausgeprägt ist. Aus diesen
Ergebnissen zogen sie die Schlussfolgerung, dass der zytotoxische Effekt auf
lebende Zellen mit der Fähigkeit zur Penetration intakter Zellmembranen verglichen
werden kann. Somit ist bei einer hohen Zytotoxizität der Substanz auch ein
vermehrtes Eindringen in lebende und membranintakte Zellen möglich (RUECKERT
et al. 2005). In mehreren Studien an unterschiedlichen Bakterienspezies stellte sich
die Zytotoxizität von EMA konzentrationsabhängig dar und nahm bei steigenden
Konzentrationen an EMA zu, bis hin zu einer vollständigen Unterdrückung des
Koloniewachstums (RUECKERT et al. 2005, FLEKNA et al. 2007, SOEJIMA et al.
2007). Eine konzentrationsabhängige Zytotoxizität konnte auch bei PMA beobachtet
werden, welche dazu führte, dass höhere Konzentrationen der Substanz zu einer
gesteigerten Wachstumsreduktion führten (YÁÑEZ et al. 2011, GENSBERGER et al.
68 Diskussion
2013). Diese Wachstumsreduktion war aber nicht so deutlich ausgeprägt als bei
Verwendung von EMA.
Die Verschiebung der Ct-Werte in der qPCR kann somit durch mehrere Faktoren
bedingt sein: 1) die Differenzierungsmittel können teilweise auch in lebende Zellen
eindringen, 2) es befanden sich membrangeschädigte Zellfraktionen in der Probe, 3)
Zellen in unterschiedlichen Wachstumsphasen zeigten eine differenzierte Aufnahme
der Substanzen und 4) die Differenzierungsmittel übten einen zytotoxischen Effekt
auf lebende Zellen aus. Welcher dieser Faktoren den größten Einfluss bei dem
Bakteriengenus Campylobacter hat, ist bislang nicht geklärt. Durch die Ergebnisse
dieser Arbeit ließ sich aber zeigen, dass eine konzentrationsabhängige Ct-Wert
Verschiebung bei Verwendung beider Differenzierungsmittel vorliegt, welche bei den
Resultaten der qPCR berücksichtigt werden muss.
6.1.3. Standardkurven zur Bestimmung der Keimkonzen tration von
Campylobacter spp.
Die für eine qPCR erforderlichen Standardkurven wurden unter Zugabe von EMA
oder PMA zu Proben mit bekannter Keimkonzentration ermittelt. Dieses erschien
erforderlich, um die durch interkalierende Substanzen bedingte Ct-Wert
Verschiebung ausgleichen zu können. Bei der Erstellung von Standardkurven ist eine
Anpassung auf die Versuchsbedingungen prinzipiell notwendig (TAKAHASHI et al.
2005, KÖPPEL et al. 2012). Dieses Anpassung wurde in anderen Studien zur
Quantifizierung lebender Campylobacter-Zellen jedoch nicht durchgeführt, welches
einen Unterschied der hier entwickelten Methode darstellt (RUDI et al. 2005,
JOSEFSEN et al. 2010, BAE und WUERTZ 2012, HELLEIN 2012). Dabei ist zu
bedenken, dass die Standardkurve unter Verwendung von 24 Stunden auf
Agarplatten kultivierten Campylobacter-Zellen erstellt wurde. Eine Verwendung von
gestressten oder in anderen Medien kultivierten Zellen könnte demzufolge zu
divergierenden Ergebnissen führen. Jedoch ist eine Testung der Methode unter
Verwendung der Vielzahl an möglichen Stressfaktoren auf die Zellen sowie von
Diskussion 69
unterschiedlichen Anzuchtmedien oder Isolierungsmatrices aufgrund der zeit- und
arbeitsintensiven Versuchsdurchführung und der finanziellen Grenzen nicht möglich.
Unter Verwendung der angepassten Standardkurve konnten mittels EMA-qPCR in
mehreren Versuchsreihen vergleichbare Resultate zu der mikrobiologischen
Referenzmethode erzielt werden. Dieses zeigte sich in einer hohen Korrelation
(R2=0,947) zwischen den beiden Methoden und ließ sich durch eine
und toter Zellen im Vergleich zur NaCl-Kontrollprobe. Aus diesen Ergebnissen lässt
sich vermuten, dass die Integrität der bakteriellen Zellmembran durch Verwendung
von Leitungswasser nicht beeinträchtigt wurde. Demzufolge zeigten die Ergebnisse
der qPCR mit und ohne EMA-Zugabe bei lebenden Campylobacter-Zellen nach
Membranfiltration der Proben eine gute Übereinstimmung zu den Ergebnissen der
mikrobiologischen Referenzmethode. Dieses zeigte sich in einer hohen Korrelation in
der Pearson-Regressionsanalyse und ließ sich auch mittels einer Bland-Altman
Analyse bestätigen. Auch die Testung weiterer Wasserarten wie Mineralwasser und
Regenwasser ließ auf eine gute Eignung der EMA-qPCR Methode zum Nachweis
lebender Campylobacter schließen. In Analogie zu den Ergebnissen bei Verwendung
von Leitungswasser konnten auch bei den Mineralwasser- und Regenwasserproben
Diskussion 91
hohe Korrelationen zwischen den Ergebnissen der EMA-qPCR und der
mikrobiologischen Keimzählung erzielt werden. Die Methoden-
vergleichsuntersuchung mittels Bland-Altman Analyse zeigte bei diesen Wasserarten
ebenfalls eine hohe Übereinstimmung der beiden Detektionsmethoden.
Die Überlegenheit der EMA-qPCR Methode konnte anschließend bei Verwendung
von Gemischen aus lebenden und toten Campylobacter-Zellen (bis zu 1:100 lebende
zu toten Zellen) gezeigt werden, mit denen die Leitungswasserproben versetzt
wurden. Dabei konnte eine hohe Übereinstimmung der EMA-qPCR Methode mit der
mikrobiologischen Referenzmethode in einer vergleichenden Bland-Altman Analyse
erzielt werden. Vergleichbare Ergebnisse wurden in Studien anderer Autoren erzielt,
in denen mit Verwendung von interkalierenden Substanzen die bakteriellen Spezies
Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila und Escherichia coli aus
Wasserproben mittels der Membranfiltration detektiert und quantifiziert werden
konnten (GEDALANGA und OLSON 2009, YÁÑEZ et al. 2011, HELLEIN et al. 2012).
In der DIN EN ISO 17995:2005 Methode zum „Nachweis und Zählung von
wärmebeständigen Campylobacter“ werden zur Bestimmung der „most probable
number“ (MPN) Wasserproben mit Volumina von 10 ml, 100 ml und 1000 ml
verwendet. Damit wird in der ISO-Methode teilweise ein höheres Probenvolumen als
in der vorliegenden Studie verwendet. In dieser Studie wurden kleine Volumina (10
ml) eingesetzt, um die Handhabung der Proben zu erleichtern und um die prinzipielle
Eignung einer qPCR zur Differenzierung lebender und toter Campylobacter-Zellen
mittels EMA für den Einsatz bei Wasserproben zu testen. Eine Anwendung höherer
Probenvolumina sollte dennoch ohne Schwierigkeiten möglich sein, da sich die
Membranfiltrationsmethode in Studien anderer Autoren, welche Wasserproben von
bis zu 100 Litern verwendet haben, als geeignete Methode zur Isolierung von
Keimen dargestellt hat (HIJNEN et al. 2000, HELLEIN et al. 2012, ABULREESH et
al. 2005, KHAN et al. 2009).
92 Diskussion
6.3. Schlussfolgerung
In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig ein Vergleich der beiden
Differenzierungsmittel EMA und PMA für den Nachweis und die Quantifizierung von
lebenden Campylobacter spp. mittels qPCR durchgeführt. Dabei zeigten beide
Substanzen eine sehr gute Eignung zur Differenzierung von lebenden und toten
Campylobacter-Zellen. Unterschiedliche Vor- und Nachteile sowie methodische
Limitierungen bei der Verwendung von EMA oder PMA wurden dabei aufgezeigt.
Anschließend wurde ein Methodenprotokoll unter Verwendung von EMA erfolgreich
etabliert. Bei der Testung der entwickelten Methode an Lebensmittelproben konnte
an der Matrix Geflügelfleisch eine gute prinzipielle Eignung der EMA-qPCR Methode
zur Quantifizierung und zur Differenzierung von lebenden und toten Campylobacter
spp. Zellen gezeigt werden. Bei der Testung der Methode an Wasserproben zeigten
Faktoren wie die Isolierungsmethode oder die Art der Wasserprobe einen Einfluss
auf die qPCR Resultate. Für einen Nachweis lebender Campylobacter spp. aus
Leitungswasser-, Regenwasser- und Mineralwasserproben stellte sich die EMA-
qPCR als vielversprechende Methode dar. Eine Weiterentwicklung dieser
vielversprechenden Methode ist aber zu empfehlen, um die dargestellten
Limitierungen zu umgehen.
Zusammenfassung 93
7. Zusammenfassung
Diana Seinige
Untersuchungen zur Eignung der interkalierenden Sub stanzen
Ethidiummonoazid und Propidiummonoazid für eine qua ntitative Bestimmung
lebender Campylobacter-Zellen aus Lebensmittelproben und Wasser mittels
real-time PCR
Campylobacter (C.) spp. sind europaweit die häufigsten bakteriellen Lebensmittel-
infektionserreger und verursachen gastrointestinale Infektionen beim Menschen.
Dabei werden jährlich steigende Fallzahlen berichtet. Als überwiegende
Infektionsquelle gilt kontaminiertes Geflügelfleisch, aber auch kontaminiertes Trink-
und Oberflächenwasser stellen eine zunehmend wichtige Quelle für humane
Infektionen mit Campylobacter spp. dar. Daher ist eine schnelle und zuverlässige
Diagnostikmethode zur Detektion von Campylobacter spp. dringend erforderlich. Die
fehlende Differenzierung von lebenden und somit potentiell infektiösen Zellen von
toten Zellen limitiert aber die Anwendung der quantitativen real-time PCR (qPCR) in
der Routinediagnostik an Lebensmittelproben. In jüngster Zeit wurde deshalb die
qPCR in Kombination mit DNA-interkalierenden Substanzen, wie Ethidiummonoazid
(EMA) und Propidiummonoazid (PMA), eingesetzt, um eine Unterscheidung
zwischen lebenden und toten Zellen zu ermöglichen. Diese Substanzen dringen in
membrangeschädigte Zellen ein und verhindern durch ihre Bindung an die zelluläre
DNA eine Amplifikation dieser DNA in der anschließenden PCR.
Ziel der vorliegenden Studie war es, ein qPCR-basiertes Nachweisverfahren in
Kombination mit einer interkalierenden Substanz für thermotolerante Campylobacter
spp. zu etablieren, welches einen schnellen quantitativen Erregernachweis
ermöglicht. Zudem sollte die Eignung der Methode an Proben verschiedener
Lebensmittelmatrices, wie Geflügelfleisch und Wasser, getestet werden.
94 Zusammenfassung
In den ersten Versuchsreihen wurde eine qPCR Methode zum Nachweis
thermotoleranter Campylobacter-Zellen etabliert. Dafür wurde eine Standardkurve
zur Berechnung der Keimkonzentration in einer Probe erstellt. Bei dieser
Standardkurve konnte eine hohe Korrelation zwischen den aus Ct-Werten der qPCR
errechneten Keimgehalten und den eingesetzten Keimkonzentrationen ermittelt
werden. Zudem wurde eine hohe PCR-Effizienz von 98,9% errechnet. In einem
nächsten Schritt wurde der Einfluss der interkalierenden Substanzen EMA und PMA
in unterschiedlichen Konzentrationen getestet. Dabei konnte sowohl bei Verwendung
von EMA als auch von PMA eine konzentrationsabhängige Verschiebung der
Detektionskurve mit höheren Ct-Werten in der qPCR beobachtet werden. Aufgrund
dieser Verschiebung wurde die Standardkurve auf die Versuchsbedingungen
angepasst und mittels einer Vorbehandlung der Zellen mit EMA oder PMA erstellt.
Diese neu erstellte Standardkurve wurde erstmalig zusammen mit einem internen
DNA-Standard für die Berechnung der Keimkonzentrationen verwendet. Dabei
konnten hohe Korrelationen zur mikrobiologischen Referenzmethode erzielt werden.
Anschließend wurde die Differenzierungskraft der interkalierenden Substanzen bei
Gemischen aus lebenden und toten Zellen getestet. In diesen Versuchsreihen
zeigten EMA (10 µg/ml) und PMA (51,10 µg/ml) eine gute Eignung zur
Differenzierung lebender von toten Zellen bei bis zu 1:1000 lebenden zu toten Zellen
in den Gemischen. In weiteren Versuchsreihen wurde die Signalreduktion in der
qPCR bei einer Vorbehandlung von hitzeinaktivierten Zellen mit den interkalierenden
Substanzen untersucht. Bei einer hohen Konzentration an toten Zellen (>104 KbE/ml)
war eine unvollständige Signalreduktion zu beobachten. Um diese Limitierung zu
umgehen wurde erstmalig eine Doppelbehandlung der Campylobacter spp.-Zellen
mit EMA (10 µg/ml) durchgeführt. Dabei konnten die Resultate deutlich verbessert
werden, so dass eine ausreichende Signalreduktion bei bis zu 106 KbE/ml an toten
Zellen erzielt wurde. Das erstellte EMA-qPCR Protokoll wurde in weiteren
Versuchsreihen an C. jejuni- und C. coli-Feldisolaten erfolgreich getestet. Dabei
konnte eine hohe Korrelation zwischen den Resultaten der qPCR und der
mikrobiologischen Referenzmethode ermittelt werden. Die etablierte EMA-qPCR
Methode wurde nachfolgend für die Anwendung an Proben der Lebensmittelmatrix
Zusammenfassung 95
Geflügelfleisch getestet. Dafür wurden verschiedene Versuchsreihen mit gespikten
Hühnerfleischproben angeschlossen, bei welchen die EMA-qPCR Methode eine sehr
gute Eignung zur Detektion lebender Campylobacter-Zellen zeigte. Dabei konnte
eine hohe Übereinstimmung der Ergebnisse aus der EMA-qPCR und der
mikrobiologischen Keimzählung ermittelt und durch eine
Methodenvergleichsuntersuchung mittels einer Bland-Altman Analyse bestätigt
werden. Zur Testung der Methode bei Wasserproben wurden in einem ersten Schritt
zwei Reisolierungsmethoden vergleichend untersucht (Membranfiltration,
Zentrifugation). Bei beiden Methoden kam es zu einem Keimverlust nach der
Zentrifugation oder der Membranfiltration und die prozentualen Anteile lebender und
toter Zellen verschoben sich zugunsten der lebenden Zellen. In weiteren
Versuchsreihen wurden die Reisolierungsmethoden in Kombination mit der qPCR
Methode getestet. Bei Filtration der Proben konnte eine hohe Übereinstimmung
zwischen den Ergebnissen der qPCR und der EMA-qPCR im Vergleich zur
kulturellen Keimzählung ermittelt werden. Im Gegensatz dazu war bei der
Zentrifugation ein höherer Keimgehalt in der qPCR ohne EMA zu detektieren. Der
Einfluss von verschiedenen Wasserarten auf die Ergebnisse der qPCR wurde in
anschließenden Versuchen ermittelt. Dabei wurde in Oberflächenwasser eine hohe
Anzahl an toten Zellen detektiert, so dass mittels der EMA-qPCR keine korrekte
Bestimmung lebender Zellen möglich war. Bei Verwendung von Leitungswasser,
Regenwasser oder Mineralwasser konnten hohe Korrelationskoeffizienten zwischen
den Ergebnissen der EMA-qPCR und der mikrobiologischen Keimzählung ermittelt
werden. Die Eignung der Methode für diese Wasserarten wurde in einer
Methodenvergleichsuntersuchung mittels Bland-Altman Analyse bestätigt. Die
Anwendung der Methode bei Campylobacter-Feldisolaten erzielte eine hohe
Übereinstimmung zur mikrobiologisch ermittelten Keimkonzentration. Die
Überlegenheit der EMA-qPCR Methode konnte zudem an definierten Gemischen aus
lebenden und toten Zellen bestätigt werden.
Sowohl bei Geflügelfleisch als auch bei Wasserproben zeigte sich die EMA-qPCR
Methode als vielversprechend zur Detektion lebender Campylobacter-Zellen.
96 Zusammenfassung
Aufgrund der aufgezeigten Limitierungen sollte eine weitere Validierung der Methode
durchgeführt werden.
Summary 97
8. Summary
Diana Seinige
Investigation of the suitability of the intercalati ng dyes ethidium monoazide
and propidium monoazide for a quantitative detectio n of viable Campylobacter-
cells in food samples and water by real-time PCR
In Europe, Campylobacter (C.) spp. are the most common bacterial food-borne
pathogens. Campylobacter spp. are the causative agents of gastrointestinal
infections in humans and increasing annual numbers of cases are reported. The
predominant source of infection is poultry meat, however contaminated drinking- and
surface water are also important sources of human infections with Campylobacter
spp. Hence, a fast and reliable diagnostic method for the detection of Campylobacter
spp. is urgently required. The lack of differentiation between viable and potentially
infectious cells from nonviable cells limits the implementation of quantitative real-time
PCR (qPCR) methods in routine diagnostic analysis of food samples. Recently,
combinations of qPCR assays and ethidium monoazide (EMA) or propidium
monoazide (PMA) pretreatments of cells have been proposed to achieve a
differentiation between viable and nonviable cells. EMA and PMA penetrate
membrane damaged cells and bind to cellular DNA, preventing the amplification of
DNA in subsequent qPCR experiments.
The aim of the present study was to develop a qPCR based detection method in
combination with the use of an intercalating dye for a rapid quantitative detection of
thermotolerant Campylobacter spp. In addition, the applicability of the method for
different food matrices, such as poultry meat and water was determined.
In the first series of experiments, a qPCR method for the detection of thermotolerant
Campylobacter was used. For this, a standard curve was generated for calculating
the quantities of CFU in a sample. By using this standard curve a high correlation
98 Summary
between the amount of Campylobacter spp. calculated from qPCR results and
microbiological cell enumeration was determined. The PCR efficiency corresponded
to 98.9%. In a subsequent step, the influence of the intercalating dyes EMA and PMA
on qPCR results was determined. For this, EMA and PMA were tested at different
concentrations. Results from qPCR experiments revealed concentration dependent
shifts towards higher Ct-values after application of the intercalating dyes EMA and
PMA. Therefore, the standard curve was adapted to the experimental conditions and
Campylobacter-cells were pretreated with PMA or EMA. This adapted standard curve
was used together with an internal DNA standard for quantifying Campylobacter from
food samples. A high correlation coefficient value was achieved from a plot of log10
cell counts determined by qPCR and culture enumeration. In a subsequent step, the
suitability of the intercalating dyes for differentiating between viable and nonviable
cells was tested in mixtures of live and heat-killed cells. EMA (10 µg/ml) and PMA
(51.10 µg/ml) removed DNA selectively from nonviable cells in mixed samples.
Furthermore, heat-killed cells were pretreated with the intercalating dyes and the
signal reduction in qPCR experiments was determined. At high concentrations of
dead cells (>104 CFU/ml), an incomplete signal reduction was observed. To
circumvent this limitation, a double staining of EMA (10 µg/ml) was performed and
clearly improved the signal reduction of nonviable Campylobacter-cells, if a limit of
106 CFU/ml was not exceeded. In further experiments the EMA-qPCR protocol was
successfully applied to C. jejuni and C. coli field isolates. A high correlation
coefficient value between the results of qPCR and the microbiological reference
method was calculated. The suitability of the EMA-qPCR method was subsequently
tested by using chicken meat samples. For this, chicken meat samples were spiked
with different quantities of Campylobacter. There was a linear relationship between
results from EMA-qPCR and the microbiological reference method and a method
comparison by Bland-Altman analysis showed a low variation between the methods.
In further experiments the suitability of the method was tested for water samples. For
this, two methods frequently used for the isolation of bacteria were comparatively
analyzed (membrane filtration, centrifugation). The application of both methods
Summary 99
resulted in a loss of Campylobacter-cells and an accumulation of viable cells in the
samples. After recovery of cells by membrane filtration and centrifugation, the qPCR
method with and without EMA was used. After filtration of samples, a high agreement
between results of qPCR, EMA-qPCR and the microbiological enumeration was
achieved. In contrast, after centrifugation of samples, qPCR without EMA
overestimated the quantities of Campylobacter CFU/ml. In subsequent experiments,
the influence of different types of water on the results of qPCR was determined. A
high percentage of dead cells was detected in surface water by fluorescence
microscopy, resulting in an incorrect determination of viable cells by EMA-qPCR. In
contrast, results from tap water, rain water or mineral water samples revealed high
correlation coefficient values between results from EMA-qPCR and the
microbiological cell enumeration. The suitability of EMA-qPCR for analysis of these
types of water samples was confirmed by Bland-Altman analysis. In addition, field
isolates were subjected to EMA-qPCR quantification and a high correlation
coefficient value between results from EMA-qPCR and culture enumeration was
achieved. However, when defined mixtures of viable and nonviable cells were used,
an advantage of the EMA-qPCR method over qPCR without EMA pretreatment was
detected.
In conclusion, EMA-qPCR seems to be a promising method for the detection of
viable Campylobacter-cells from chicken meat and water samples but further studies
are needed to overcome the limitations.
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Danksagung 129
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt meinen beiden Betreuern Frau Prof. Dr. med. vet. Corinna Kehrenberg, PhD und Herrn Univ. Prof. Dr. med. vet. Günter Klein für die Überlassung dieses interessanten Themas und die Möglichkeit diese Arbeit im Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit anfertigen zu können. Besonders danken möchte ich an dieser Stelle Frau Prof. Kehrenberg für die hervorragende wissenschaftliche Betreuung während der Zeit meiner Doktorarbeit, die vielen konstruktiven Gespräche und die immer währende Bereitschaft zur Hilfestellung sowie die stets freundliche und geduldige Arbeitsatmosphäre. Dank ihrer besonderen Fachkompetenz habe ich während dieser Zeit viel lernen können. Für die finanzielle Förderung von Teilen dieser Arbeit gilt mein Dank dem Sanitätsamt der Bundeswehr, vertreten durch den Oberstabsveterinär Herrn Dr. Alfred Binder. Für die finanzielle Unterstützung der Standardisierungsarbeiten der Methode danke ich dem Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie. Danken möchte ich auch Herrn PD Dr. med. vet. Carsten Krischek für seine Bereitschaft sich in die komplizierten Sachverhalte etwaiger Fragestellungen einzuarbeiten und sein offenes Ohr bei der Diskussion von statistischen Auswertungen. Eine andere Sicht auf die Dinge kann manchmal sehr hilfreich sein. Frau PD Dr. rer. nat. Maren von Köckritz-Blickwede danke ich herzlich für die Möglichkeit im Institut für Physiologische Chemie die fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen durchführen zu können und für ihre Hilfestellung bei den Auswertungen trotz ihrer sehr knapp bemessenen Zeit. Für die Anleitung bei der Verwendung des Statistikprogrammes bin ich ihr besonders dankbar. Allen Mitarbeitern des Instituts, vor allem auch meinen Mit-Doktoranden und den technischen Mitarbeitern im PCR-Labor, möchte ich für die schöne und erlebnisreiche Zeit, ihre Unterstützung und die angenehme Arbeitsatmosphäre während der Doktorarbeit danken. Herrn Manfred Merle danke ich für die Hilfe bei Problemen mit dem Computer. Ganz besonders meiner Mit-Doktorandin und Bürokollegin, Ulrike Rensch, danke ich für die harmonische gemeinsame Zeit, für die vielen interessanten Gespräche, für die gegenseitige Unterstützung und für den Einblick in die „Welt der Lebensmittelchemie“, so dass aus einer Kollegin eine wahre Freundin wurde. Meiner Familie und insbesondere meinen Eltern und meiner Schwester danke ich sehr, dass sie mich auf meinem Weg fortwährend unterstützt haben und dabei einen sehr großen finanziellen, verständnisvollen und hilfreichen Teil geleistet haben. Herzlichen Dank für Eure Unterstützung und Geduld!
130 Danksagung
Zuletzt und ganz besonders von Herzen, danke ich meinem lieben Daniel für all die Unterstützung während der Zeit meiner Doktorarbeit. Ich danke Dir für Dein Verständnis und die Aufmunterungen sowie deine Bereitschaft Dich in das Arbeitsleben in einem Labor hineinzuversetzen, so dass auch für Dich die „Risikolebensmittel“ kein Fremdwort mehr sind. Ich freue mich sehr, dass es Dich gibt!