Spectrométrie de masse Introduction - UTCmerlier/BT06_P17/TP_BT06 MS_LCESI_MRM2017.pdfSpectrométrie de masse – Introduction - Principes 3 Principes de la MS : • 1er étape :

Spectrométrie de masse – Introduction

1

Intérêts de la Spectrométrie de masse :

• Sensibilité, limite de détection faible ( fento mole dans certaines conditions )

• Variétés des applications : analyses chimiques quantitative et qualitative réaction

ions molécule, cinétique des réactions.

• Progrès technologique rapide

Spectrométrie de masse – Introduction - Principes

2

- Un spectromètre comprend :

- Système d’introduction ( GC, LC , sas d’intro direct, … )

- Source d’ionisation

- Analyseur ( un ou plusieurs )

- Détecteur pour compter les ions

- Système de traitement de donnée

Introduction,

GC, LC

Ionisation,

EI, CI

ESI, APCI

FAB, …

Analyseur

SQ D,TQD,

EB, TOF Détecteur Logiciel

Spectrométrie de masse – Introduction - Principes

3

Principes de la MS :

• 1er étape : Produire des ions

• La quantité de fragments produit dépend de la « force » de l’ionisation

Les ions sont ensuite séparés d’après leur masse et leur charge dans le système

dispersif

Ils sont ensuite détectés.

Introduction,

GC, LC

Ionisation,

EI, CI

ESI, APCI

FAB, …

Analyseur

SQ D,TQD,

EB, TOF Détecteur Logiciel

Spectrométrie de masse – Analyse de Biomolécules

4

- Electrospray (ESI)

Ion moléculaire ou pseudo-moléculaire

Ion pseudo-moléculaire :

En mode positif : ajout d’un proton sur M : (M+H)+ (masse : M+1, charge+1)

En mode négatif : perte d’un proton : (M-H)- (masse : M-1, charge -1)

Electrospray

Spectrométrie de masse - QQQ

6

- MS : mode « Full scan »

Balayage d ’Ions moléculaires

Balayage d ’ions fragments

Introduction,

GC, LC

Ionisation,

EI, CI

ESI, APCI

FAB, …

Analyseur

SQ D,TQD,

EB, TOF Détecteur Logiciel

- MS : mode « Product ION »

7

- MS : mode « Full scan »

Balayage d ’Ions moléculaires

Principaux isotopes en chimie organique

Elément isotope % Masse

isotopique

isotope % Masse

isotopique

isotope % Masse

isotopique

Masse

moyenne

C 12C 100 12.0000 13C 1.1 13.0033 12.011

H 1H 100 1.0078 2H 0.015 2.0140 1.0079

N 14N 100 14.0031 15N 0.37 15.0001 14.0067

O 16O 100 15.9949 17O 0.04 16.9991 18O 0.20 17.9992 15.9994

S 32S 100 31.9721 33S 0.789 32.9715 34S 4.44 33.9679 32.066

F

Cl

19F

35Cl

100

100

18.9984

34.9688

37Cl

31.98

36.9659

35.453

Br 79Br 100 78.9183 81Br 97.28 80.9163 79.904

Massifs isotopiques complexes

Exemple : Allure du massif isotopique de molécules contenant 2 Cl, 3 Cl, 4 Cl

En Conclusion :

analyse de spectres de masse 10

Chaque formule brute est associée à un massif isotopique qui lui est propre

Pour des molécules de masse < 500 Da :

L’abondance des pics « M+1 » renseigne sur le nombre d’éléments Q+1 :

M+1/M (1,08 . Nombre de C) + ( 0,37 . Nombre de N ) /100

L’abondance des pics « M+2 » et suivants renseigne sur la présence d’éléments Q+2 (S,

Si, Se, Cl, Br) ainsi que le nombre de ces atomes :

Spectrométrie de masse – Analyse de Biomolécules

Q1 Q2 Q3

Source

ESI

Détecteur

Spectrométrie de masse - QQQ

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- Possibilité de la spectrométrie de masse pour l’analyse de biomolécules.

- MS², quantification.

Balayage d ’Ions moléculaires

Balayage d ’ions fragments

Spectre “Produit” de l’Atrazine à Ce =5, 19,33,47 eV

Spectre “Produit” de l’Atrazine-D5 à Ce =5, 19,33,47 eV

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Transition M.R.M pour l’ATRAZINE et son étalon interne

MRM

Compound Name ISTD? Precursor Ion MS1 Res Product Ion MS2 Res Dwell Fragmentor Collision

Energy Cell Accelerator Voltage Polarity

ATRAZINE-D5 True 221.1 Unit 179.1 Unit 200 120 17

7 Positive

ATRAZINE-D5 True 221.1 Unit 69.1 Unit 200 120 41

7 Positive

ATRAZINE False 216.1 Unit 174.1 Unit 200 110 13

7 Positive

ATRAZINE False 216.1 Unit 104 Unit 200 110 29

7 Positive

Spectrométrie de masse – Quantification

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La sensibilité = recherche de la limite de détection(LOD) et Quantification (LOQ).

En analyse Qualitative, la LOD est la quantité minimal d’échantillon nécessaire à

l’obtention d’un spectre de masse de qualité.

En analyse Quantitative la LOD est la quantité minimal détectable d’une molécule par

rapport au bruit de fond.

LOD = 3 S/N

LOQ = 10 S/N

Plusieurs paramètres conditionnent la LOQ :

- Paramètre de source du spectromètre de masse

- La technique d’ionisation

- les solvants et tampon en ESI

Spectrométrie de masse – Analyse de Biomolécules

MRM, des limitations …

1. La molécule doit s’ioniser, surtout en ESI

2. La molécule doit fragmenter, mais pas trop

3. Linéarité de 4 ordres de grandeurs ( TOF) jusqu’à 6 (TQD )

4. Précision des mesures : 10%

5. LOD , LOQ variable en fonction des molécules, des appareil et des modes

d’acquisition.

6. Répétabilité des aires : mauvais d’un jour à l’autre

1. lié à l’encrassement

2. Effet matrice en ESI ( pas en EI ).

On préfère toujours la solution de l’étalon interne à la courbe de calibration

externe

Idéalement, l’étalon interne est la molécule marqué iso topiquement (

Testostérone D3, Carnitine D3.

Spectrométrie de masse – Quantification

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La spécificité est obtenu par :

- La purification de l’échantillon

- Extraction ( liquide liquide )

- SPE / MIP

- La dérivatisation : augmentation du poids de la molécule d’intêret et

ciblage d’ion caractéristique de masse supérieur.

- Le spectromètre de masse.

- Augmenter la résolution

- R= 2000 TQD

- R= 20 000 Q-TOF

- - mode SRM ( Single Reaction Monitoring ) .

HPLC : colonne type C18 2.1 x 50 mm, 1.8µm

Debit 500µl/min Temps B%

Solvant A H2O 0.1% FA 0 10

Solvant B Acétonitrile 3 90

4 90

4.01 10

5 10

QQQ.

Vcap 3500 V

GAS Temp 350 °C

Drying gaz 12 L/min

Nebuliseur 45 psi

Fragmenteur 120 V

ESI Positif

Qualitatif

1. Définir les Transitions MRM -> Spectre « Produit »

1. Isolation de la molécule sur MS1

2. Fragmentation sur MS2 ( chambre de collision à l’Azote)

3. Définition des fragments ( intérêt et intensité) pour la quanti et la qualification.

2. Définir les paramètres optimaux de sources.

3. Réaliser la Courbe de calibration

1. Toujours la même quantité d’étalon interne dans les 200µl

2. Faire varier la quantité

4. Comparer le rapport de l’aire de l’atrazine / Aire de l’atrazine D5.

Quantitatif

IS-1 ( 1,9mg/L) : Diluer 100µl IS-0 (19mg/L) dans 900µl MEOH

Courbe étalon :

-Préparer les LEVEL : 20,10,5,2,0.5,0.1ng dans

200µl de MeOH

- Recalculer la concentration réel après ajout IS.

Mélanger :

-180µl solution STD-Lx

- 20µ solution IS-1

-Injecter 20µl en LC-MSMS

Echantillon :

- Prélever 250 ml Eau de ville

- Ajouter 20 µl IS-1

SPE – C18 :

- Equilibrer : 2x5 ml Acétone , 2x5ml H2O MilliQ

- Percolation : 250 ml D’eau +IS

- Lavage : 6 ml H2O MilliQ

- Séchage 10 min

- Elution : 3x3 ml Acétone dans ballon

Evaporation:

- Evaporation sous vide

Reprise:

- Reprendre par 200 µl de MeOH

LC-MS/MS:

- Injecter 20µl en LC-MSMS

Quantitatif

1. Etablir une courbe de calibration avec toujours la même quantité d ’étalon interne.

2. Concentré l’échantillon avec la même quantité d’étalon interne que pour la calibration

3. Comparer le rapport A Atrazine / A IS pour obtenir la quantité d’étalon interne.

Cpd # Formula RT Mass [M+H]+

DEDIA C3H4N5Cl 145.0155 146.0227

DIA C5H8N5Cl 173.0468 174.0540

DEA C6H10N5Cl 187.0625 188.0697

ATRAZINE C8H14N5Cl 5.01 215.0938 216.1010

ATRAZINE-D5 C8H9D5N5Cl 5.02 220.1252 221.1324

Quantitatif