Spectrométrie de masse dans l'identification bactérienne

+38ème Colloque Nationaldes Biologistes des HôpitauxMontpellier – 28/09 au 02/10/2009

ACNBH

Agrément FMCN° 100 168

DECLARATION D’INTERETDANS LE CADRE DE MISSIONS DE FORMATION

REALISEES POUR L’ACNBH

Dr. Alain Gravet exerçant au CH de Mulhouse déclare sur l’honneurne pas avoir d'intérêt, direct ou indirect (financier) avec les entreprisespharmaceutiques, du diagnostic ou d’éditionsen relation avec le DMDIV et/ou le sujet présenté.

+

Spectrométrie de masse etidentification bactérienne

Dr. Alain Gravet

Laboratoire de Microbiologie

Centre Hospitalier de Mulhouse

+L’identification bactérienneidentification phénotypique (1)

L’identification d’un micro-organisme est une étapeimportante dans le diagnostic d’une maladie infectieuse

Orientation famille bactérienne, un genre, voire une espèce :

Morphologie des colonies, morphologie après coloration,caractéristiques de croissance, pigmentation, odeur, caractèrecaractéristiques de croissance, pigmentation, odeur, caractèrehémolytique sur gélose au sang, catalase, oxydase

Pour une identification plus précise : utilisation de galeriesd’identification biochimique manuelles ou pouvant être luessur automates

Des tests d’agglutination peuvent également être utiliséspour l’identification bactérienne

+L’identification bactérienneidentification phénotypique (2)

Galeries biochimiques d’identification

Miniaturisation des tests : Système Api® de bioMérieux

Etude du métabolisme (incubation de 18-24h, éventuellement 48h)

Recherche d’activités enzymatiques (pas de croissance nécessaire,inoculum plus important)inoculum plus important)

Automates

utilisation de substrat chromogénique, fluorescent oufluorogéniques lecture colorimétrique, tubidimétrique oufluorométrique. Méthode dépendant du fabricant

Systèmes Vitek®, Phoenix®,Walk-away®,

Taxons +/- différents selon le fabricant, différentes cartes oucartouches (BG-…)

Certains taxons absents : anaérobie… en développement

+Identification moléculaire desmicro-orgnismes

Bouleversement de l’identification, mises en évidence des erreurs et desinsuffisances de l’identification phénotypique

Analyse de la séquence du gène de l’ARN 16S pour les bactéries etcomparaison avec les banques électroniques de séquences (GenBank,MBL…)

99% de similarité identifie à l’espèce, 97-99 le genre, < 97% possiblenouvelle espèce

Autres possibilités : séquençage du gène rpoB, puce à ADN

Utilité: Identification des bactéries fastidieuses

Les mycobactéries (PCR, hybridation)

Lorsque identification peu performante (Acinetobacter)

Discordance identification et antibiogramme par exemple

Isolement dans une circonstance inhabituelle

+Identificationphénotypique/moléculaire

Méthode Rapidité Sensibilité Spécificité Universalité Côut

Immuno +++ ++ + - +/-

API + ++ ++ +/- +

Automates ++ ++ ++ +/- ++

ARN16S +/- +/- +++ ++ +++

Puces àADN

+/- +/- ++ ++ ++

+Spectrométrie de masse et temps devol (TOF)

1897,Thompson, séparation de particules en fonction de leurcharge et de leur masse, découverte de l’élection, calcul duratio m/z

1919, Ashton, premier spectromètre de masse 1919, Ashton, premier spectromètre de masse

Source Analyseur Détecteur

Particuleschargées

EnregistrementSystème de

vide

+Spectrometrie de masse et temps devol (TOF)

1946, Stephen application du temps de vol à la spectrométrie demasse

Accélération de molécules chargée

Vitesse dépend de la charge et de la masse (m/z)

Séparation en fonction du poids et de la charge

Source Accélérateur Vide Détecteur

V 1,2,3

+Spectrométrie de masse (MS)

1968 première utilisation de la Spectrométrie de masse pourclassification et identification bactérienne (acide acétique)

1977 à 1994, développement de plusieurs

Techniques MS, analyse de molécules chargées Techniques MS, analyse de molécules chargées

GC/MS, Pyrolysis MS, FAB MS

+Maldi-Tof

Technique MALDI (matix assisted laser desorptionionisation)

Ionisation de biomolécules (peptides, protéines)

Ionisation douce

Utilisation en routine de la technique pour l’analyse debiomolécules

Analyse sur de cellules entières

+Maldi-Tof

+Maldi-Tof

+Maldi-Tof

+Maldi-Tof

+Maldi-Tof

+Maldi-Tof

+Maldi-Tof

+Maldi-Tof

+Maldi-Tof

+

+Spectromètres

Microflex®

Bruker

Première commercialisation : juin 2005

Fréquence du Laser : 60 Hz

Longueur trajet jusqu’au détecteur 1,05 m

Gamme de masses (m/z) : 50 à 300 kDa

Dépôts : Étapes d’extraction (ethanol, acétonitrile)

Possibilité de « smear »

Plaques 96 positions

Logiciel : Biotyper® Spectres

+Spectromètres

Axima®

Shimadzu

Première commercialisation : décembre 2007

Fréquence du Laser : 50 Hz

Longueur trajet jusqu’au détecteur : 1,2 m

Gamme de masses (m/z) : 1 à 500 kDa

Dépôt :

direct d’une partie de la colonies

extraction pour certains microorganismes

Plaques : 48 x 4 positions

Logiciel : Saramis® (AnagnosTec)

Superspectres

Spectres

+Différences

Technique de dépôts

Bases taxonomiques

Nombre absolu plus important de taxons pour Biotyper® (maispas de superspectres)

La grande majorité des micro-organismes d’intérêt médical dansles deux bases, quelques différences (début 2009)

Présents dans la base Biotyper®

Candida incospicua, Campylobacter lari, Campylobacter fetus,

Corynebacterium

Présents dans la base Anagnotec®

Abiotrophia defectiva, Candida guillermondii,Candida lusitaniae

Mycobacterium spp,Aspergillus, Filamenteux

+Choix Microbiologie de Mulhouse

Solution spectromètre de masse Axima® Shimatzu

Base taxonomique Saramis® Anagnostec

Solution informatique avec SIL SirWeb® - I2ASolution informatique avec SIL SirWeb® - I2A

Arrivée fin mai 2009

Utilisation en routine

+

+Saramis® AnagnosTec

Spectral ARchive And Microbial IdentificationsSystem

Superspectres : « spectre moyen d’environs 15 souches d’une même « spectre moyen d’environs 15 souches d’une même

espèce, exclusions des identifications faussement positives

Spectres de référence : comparaison en deuxième intention

Superspectres et spectres validées par le goldStandards : ARN16S, MLST et méthodes biochimiques

Centres de référence et laboratoires de diagnostic

+Saramis® AnagnosTec

SARAMIS Premium Comparaisons avec Superspectres et spectres Visualisation des spectres Génération de dendrogramme

Génération de superspectres Génération de superspectres

Mai 2009 2160 superspectres, représentant 130 genres, 462

espèces de bactéries, 39 genres et 125 espèces delevures et champignons

40.000 spectres : 235 genres, 1110 espècesbactériennes, 73 genres et 235 espèces dechampignons

+Base taxonomiques actuelle

Adaptation et évolutionconstante

Diversité des isolats cliniqueshumainshumains

Inclus des microorganismesrares et atypiques

Spectres

Pantoea agglomerans

Acinetobacter lwoffi4000 m /z 8000

4000 m/z 8000

Burkholderia cepacia

Raoultella ornithinolytica

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

+Choix de matrice

DHB • Formation de longs cristaux de la périphérievers le centre• Peu de cristaux au centre• Convient au dépôt directe de la majorité destaxons• Nécessite plus de tirs de laser• Obtention de 100 à 200 pics par spectre

HCCA

• Obtention de 100 à 200 pics par spectre• Nombreux signaux avec m/z > 10 kDa

• Acide Alpha 4-cyano-4-hydroxycinnamice•Formation de petits cristaux sphérique• Distribution homogène• Ne convient pas au dépôt direct pour certainstaxons• Nécessite moins de tirs laser• Obtention de 80-150 pics par spectre• peu de signaux avec m/z < 10 kDa

+Choix de la matrice :Clostridium speticum

DHB ~150 pics

0

20

40

60

80

100

%Int.

3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 12000 13000m/z

CHCA ~100 pics

+Préparation de l’échantillon

direct

ajout1 µL de matrice

Ac. formique 25%

dépôt1 µL, sécher

direct Évaporation du sovlant(T° ambiante)

Analyse automatiquedu spectre

Plaque Maldi

Dépôt simple mais exige :• matériel adapté• précision• un certain entrainement

Plaque Maldi avec44 positions

Préparation de l’échantillon

sélection et transfèred’une colonie ou dépôt

addition of 1 µl de matrice

d’une colonie ou dépôtD’une solution

Identification des bactéries, levures et champignons filamenteux

Utilisation d’un contrôle

+Le dépôt

Dépôt d’une petitequantité de colonieavec un cône ou unInoclic®

Ajout de la matrice (0,5ou 1µL), mélanger parde petits mouvementscirculaires

Formation des cristaux

+

+

Acquisition automatique ~30-60sec

Acquisition

<<C:\Dokumente und Einstellungen\m.erhard\Eigene Dateien\AnagnosTec-dc\Zwischenablage\Dokument Banner.tx t>> Spec [BP = 3

37

75

3000 5000 7000 9000 11000 13000

Mass (m/z)

1648.1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%In

ten

sit

y

37

75

70

75

80

74

87

44

10

93

9

94

53

99

94

79

80

10

34

7

50

15

78

63

11

57

2

70

92

59

31

96

54

35

81

68

37

93

30

73

67

10

22

6

84

50

10

60

8

11

90

6

Spectre de masse des Enterobacteriaceae :famille, genre, et espèces

Signaux retrouvés pourdifférents taxons

(ex m/z 4365 :Protéine ribosomale L36)

Escherichia coli

Hafnia alvei

Leclercia adecarboxylata

37

Possibilité dereconnaitre familles de

bactéries

> 50 espècesd‘entérobactéries

identifiées

3000 5000 7000 9000 11000 13000m/z

Leclercia adecarboxylata

Klebsiella pneumoniae

Proteus mirabilis

Enterobacter aerogenes

Klebsiellapneumoniae

Klebsiellaoxytoca

30 40percent matching masses

50 60 70 80 90

*

*

82

56

87

09

946

3

10

229

10

809

73

62

79

02

71

11

613

85

691

54

08

33

95

41

22

47

30

8256

9463

8843

10229

12282

73627111

6254

5691

3395

4122

4730

consensusspectrum:Klebsiella

oxytoca

SuperSpectrum:

type 9

Klebsiellaoxytoca

SuperSpectra: Klebsiella species

Enterobacteraerogenes

*

3000 mass m/z 15000

82

56

87

09

946

3

10

229

10

809

73

62

79

02

71

11

613

85

691

54

08

33

95

41

22

47

30

#A006528-1:Klebsiella

oxytoca

type 9

family

speciesgenus

multiple mass spectra of a species

similar ity dendrogramof mass fingerprints

Le superspectre inclut les spectres de masses spécifiques de l‘espèce

Identification d‘une souche par recherche d‘uneconcordence avec superspectres

Comparaison desspectres de 2 souches

d’isolats cliniques

nte

nsit

y

3685

3256

4404

5145

5535

6139

6820

7975

8577

8161

9109

8813

9634

1049

661

65

7371

539

Trichophyton_rubrum_1Superspectrum

Meilleure similarité avec

39

3000 4600 6200 7800 9400 11000

rela

tiv

ein 539

582

m/z

Les deux échantillons sontidentifiés

Trichophyton rubrumAvec une confiance de

99%

from Erhard et al. 2007, Exp. Dermatol.

Meilleure similarité avecT. rubrum SuperSpectre

+Algorythme

Spectre

1 min

SuperSpectra

1 min

Reference Spectra>50.000 Spectra

+Approche : identification

Identification de spectres analysés avec des spectres validésde la base

Famille genre espèce

Possibilité d’identification séquentielles par des signaux communs àUne famille, un genre, une espèce

+

3000 5000 7000 9000 11000 13000

Mass (m/z)

1648.1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%In

ten

sit

y

<<C: \ Dokum ent e und Einst ellungen\ m . er har d\ Eigene Dat eien\ AnagnosTec- dc\ Zwischenablage\ Dokum ent Banner . t xt >> Spec [ BP = 3

3775

7075

8074

8744

10939

9453

9994

7980

10347

5015

7863

11572

7092

5931

9654

3581

6837

9330

7367

10226

8450

10608

11906

Comparaison avec lesSuperSpectra™ selonalgorithme propre

Etape 3 – Identification avec Saramis

algorithme propre

+

3000 5000 7000 9000 11000 13000

Mass (m/z)

1648.1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%In

ten

sit

y

<<C: \ Dokum ent e und Einst ellungen\ m . er har d\ Eigene Dat eien\ AnagnosTec- dc\ Zwischenablage\ Dokum ent Banner . t xt >> Spec [ BP = 3

3775

7075

8074

8744

10939

9453

9994

7980

10347

5015

7863

11572

7092

5931

9654

3581

6837

9330

7367

10226

8450

10608

11906

Etape 4 – Comparaison du spectreaux spectres de la base si nécessaire

Obtention d’unObtention d’undendrogrammeComparaison simple

+

+

AXIMA™

Identification – Intégration dans lelaboratoire

dépôt

(1)

AXIMA™Acquisitiondes spectres

SARAMIS™identification

Transfert identification

3000 5100 7200 9300 11400 13500

Mass (m/z)

1.0E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%In

ten

sit

y

Vo y a g e r Sp e c # 1 M C= > Ad v BC( 3 2 , 0 . 5 , 1 . 0 ) = > NF0 . 7 [ BP = 9 7 4 0 . 9 , 1 0 2 6 9 ]

9741

7173

7200

9537

4365

6255

7186

9065

7158

8327

5381

5565

7871

6316

5096

9555

8851

8285

10923

9194

12225

4869

7706

3410

6858

10302

3204

5459

4611

6111

5723

3636

10697

8394

11741

(5)(3 +/- 4)

(2)

+Organisation LaboratoireMicrobiologie Saramis

SpectrométreServeurSirWeb®

Hémocultures Urines DiversExpectorationsCoprocultures

SIL

+Laboratoire de Microbiologie

Personnel

3 biologistes

22 techniciens – 1 cadre

Identifications avant

Galeries Api®

Utilisation de milieuxchromogènes

Tests immunologiques

Envoi à l’extérieur pourséquençage ARN 16S

Antibiogrammes sur boites

Utilisation AutoScan

+Programmation : création de projet

+

+

+

+

+

+

+

+

+Passage de contrôles qualités

Identification d’une souche d’Enterobacter gergoviae (99,9%superspectre)

Identification également donné à 99% par Api20E

Identication d’une souche d’Acinetobacter ursingii (99,9% Identication d’une souche d’Acinetobacter ursingii (99,9%superspectre)

Identification galerie Api NE : Acinetobacter lwoffi/junii

Identification d’une souche de Staphylococcus caprae (94,6%superspectre, utilisation d’acide formique)

Galerie Api Staph : 1. Staphylococcus capitis, 2. Staphylococcuscaprae (faible pourcentage)

+Contrôles qualités annéesantérieures

Référence Maldi-Tof Commentaires

Eikennella corodens Eikennella corodens 99,9% SSp

Bacillus cereus Bacilluscereus/mycoides/thuringie

99,9% SSpcereus/mycoides/thuringiensis/anthracisBacillus cereus

86,1% SSp

Escherichia hermannii Escherichia hermannii 90,0% SSp

Escherichia vulneris Escherichia vulneris 99,9% SSp

Pseudomonas fluorecens Pseudomonas fluorecens 99,9% SSp

Acinetobacter junii Acinetobacter ursingii 84,6% SSp

Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii 99,9% SSp

Pasteurella mutocida Pasteurella multocida 99,9% SSp

+Contrôles qualités annéesantérieures

Référence Maldi-Tof Commentaires

Streptococcus pyogenes Streptococcus pyogenes 82,9% SSp

Streptococcus sanguis Streptococcus sanguis 70,2% SSp

Staphylococcus hominis Staphylococcus hominis 99,9% SSpStaphylococcus hominis Staphylococcus hominis 99,9% SSp

Enterococcus gallinarum Enterococcus gallinarum 92,0% SSp

Enterococcus faecium Enterococcus faecium 99,99% SSp

Erysipelothrix rhusiopathiae Erysipelothrixrhusiopathiae

99,9% SSp

Oligella urethralis ???? 3 sp

+Oligella urethralis - masse 104

+Contrôles qualités annéesantérieures

Référence Maldi-Tof Commentaires

Candida paraspilosis Candida parapsilosis 99,9% SSp

Candida krusei Issatchenkia orietalis 99,8% SSp

Candida albicans Candida 99,9% SSpCandida albicans Candidaafricana/albicans/dublinensisCandida african/albicansCandida albicansCompare:Candida albicans

99,9% SSp

92,3% SSp88,3% SSp

25 Sp (49-32)%

Candida dublinensis Candidaafricana/albicans/dublinensisCompare :Candida dublinensis

92,5% SSp

SP

+Résultats sur 1000 identifications

Souches de routine

Certaines souches identifiées non passées :

Souches identifiées sur milieux chromogènes

Escherichia coli, Proteus mirablis (ECBU) Escherichia coli, Proteus mirablis (ECBU)

Staplylococcus aureus (test d’agglutination)

Candida albicans (milieux chromogènes)

Streptococcus pneumoniae

Haemophilus influenzae

Pseudomonas aeruginosa

+Répartitions des microorganismesidentifiés

134

20

52

6

Entérobactéries

Autres BactériesGram-Staphylocoques

571

93

126

Staphylocoques

Autres Gram+

Bactéries anaérobies

Champignons

Non identifiés

+Entérobactéries n = 569

E. coli46%K. oxytoca

3%

S. marcencens3%

M. morganii3%

C. koseri2%

C. freundii1%

autres3%

K. pneumoniae16%

E. cloacae14%

P. mirabilis5%

E. aerogenes4%

3%

+Autres bacilles Gram – (n = 91)

Bactéries Nbr Bactéries Nbr

Pseudomonas aeruginosa 38 Pseudomonas stutzeri 1

Acinetobacter baumanii 22 Neisseria subflava 1

Stenotrophomonas maltophilia 13 Neisseria meningitidis 1Stenotrophomonas maltophilia 13 Neisseria meningitidis 1

Haemophilus influenzae 6 Haemophilus parahaemoliticus 1

Achromobacter xylosidens 4 Campylobacter jejunii 1

Rothia mucilanogenes 1 Bulkhoderia cenocepacia 1

+Staphylocoques (n = 126)

Bactéries nombre

Staphylococcus epidermidis 70

Staphylococcus aureus 15

Staphylococcus hominis 12

Staphylococcus capitis 12

Staphylococcus intermedius 5

Staphylococcus simulans 3

Staphylococcus lugdunensis 3

Staphylococcus haemolyticus 3

Staphylococcus warnerii 1

Staphylococcus sciuri 1

Staphylococcus saprophyticus 1

+Autres Gram+ (n = 134)

Bactéries nombre

Enterococcus faecalis 104

Streptococcus agalactiae 7

Streptococcus anginosus 6

Enterococcus facium 4

Streptococcus bovis 3

Streptococcus sanguis 2

Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis 1

Streptococcus dysgalactiae dysgalactiae 3

Corynebacterium pseudodiphtericum 2

Rothia mucilaginosa 1

Micrococcus luttae 1

+Bactéries anaérobies (n = 20)

Bactéries nombre

Bacteroides fragilis 9

Clostridium difficile 6

Clostridium bifermentens 2

Fusobacterium necrophorum 1

Bacteroides thetaiotaomicron 1

Bacteroides distiasonis 1

+Champignons (n = 52)

Bactéries nombre

Candida glabrata 25

Candida albicans 20

Candida tropicalis 2

Candida kefyr (Kluyveromyces marxianus) 2

Candida krusei (Issatchenkia orientalis) 2

Candida lusitaniae 1

+Microorganismes non identifiés

Prélèvement IdentificationMaldi-Tof

Identification sortie

Hémoculture Acinetobacter sp Acinetobacter sp

Urines Acinetobacter sp Acinetobacter sp

Hémoculture Acinetobacter sp Streptococcus spHémoculture Acinetobacter sp Streptococcus sp

Plaie Bacillus Bacillus sp

Crachats - BK IdentificationMatches < 22%

Contaminant

Hémoculture Ochrobacter En cours

+Simplicité de l’identification,multiplication des identifications

Faible coût en réactif

Identification en répliquât

Identification en dupliquât

Hémocultures : Hémocultures :

identification de tous les flacons

Identification des souillures (arguments en faveur)

Gestion des problèmes de contamination

+Conclusions (1)

Prise en main

Importance de la qualité du dépôts (maitrise et répétabilité)

Rôle des biologistes et techniciens préservé

Garder techniques simples d’identification

Expertise de l’antibiogramme, de interprétation clinique

Résultats d’identification très satisfaisants

Quelques lacunes qui se combleront

Streptocoques, corynebactéries…

Système très ouvert, possible intégration de « spectre maison »après confirmation par S16

Echange possible avec autres laboratoires

+Conclusion (2)

Parfaite intégration dans le laboratoire, avec l’informatique

Validation avec accès au dossier du patient (antériorités…)

Gain de temps à la validation des antibiogrammes, à l’envoi surl’informatique du laboratoire

Perspectives, développement

Identification sur flacons d’hémoculture

Utilisation du module de comparaison des spectres pour étudierles souches dans le cadre de surveillance des BMR

Possibilité de reconnaître en fonction du spectre, de la présenceou non de certains pics ÷

Des résistances ou profils de résistance particuliers (SARM)

La production de toxines