Cours Spectrométrie de Masse Cours ESBS Octobre 2005 Sarah SANGLIER Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique UMR 7512 (Dir : Alain Van Dorsselaer) CNRS - Université Louis Pasteur Strasbourg Tel: 03 90 24 27 78 [email protected]La Désorption Ionisation Laser Assistée par Matrice : le MALDI
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Cours Spectrométrie de Masse Cours ESBS Octobre 2005 Sarah SANGLIER Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique UMR 7512 (Dir : Alain Van Dorsselaer)
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Cours Spectrométrie de Masse
Cours ESBS
Octobre 2005
Sarah SANGLIER
Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique
La Désorption Ionisation Laser Assistée par Matrice : le MALDI
L’ionisation laser assistée par matriceMatrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI)
Première publication:
Laser desorption ionisation of proteins with molecular masses exceeding
10000 Da, Karas M. and Hillenkamp F. Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988)
- génère des ions à une seule charge MH+ (monochargé)- l’ionisation se fait sous pression- tolérance aux sels et détergents
- principalement couplée à un analyseur TOF (Temps de Vol) :sensibilité : 10-15 - 10-18 molesrésolution : 5000 - 10 000 en routine, précision : 20 ppm
Elle se fait souvent par protonation d’un site basique, par exemple sur un acide aminé comme K, R, (H)
- Ionisation positive (le voltage de source est positif) :
- Ionisation négative (le voltage de source est négatif):
Elle se fait par perte d’un proton, par exemple sur un acide aminé comme D, EL’ionisation négative est moins sensible que le mode positif.Souvent utilisée pour DNA et RNA
-NH2 -NH3+
-COOH -COO -
L’ionisation électrospray : Règles d’ionisation des biomolécules en ESI
Les peptides et protéines contiennent de nombreux groupes basiques ou acides qui peuvent recevoir des charges positives ou négatives
L’ionisation laser assisté par matrice: MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation)
• Le MALDI est basé sur l’utilisation d’un composé (la matrice) qui absorbe à 337 nanomètres
• L’analyte est dilué environ 10 000 fois dans cette matrice
• L’échantillon est introduit dans le spectromètre après complète évaporation des solvants. Il n’y a donc pas de couplage avec la chromatographie possible
• La source d’ions MALDI est principalement couplée à un analyseur à temps de vol (MALDI-TOF)
Principe de l’analyse MALDI-TOF
1. Co-crystallisation d’une matrice et d’un échantillon2. Le dépôt cristallin est irradié par des impulsions laser3. Désorption et ionisation des molécules de matrice et de l’échantillon4. Accélération des ions formés dans un champ électrique en source5. Séparation des ions selon leur rapport m/z dans le tube de vol6. Détection des ions et mesure du temps écoulé entre un T0 et l’impact sur le
détecteur
LaserLaser
Temps de vol Masse moléculaireTemps de vol Masse moléculaire
Echantillon DétecteurTemps
Echantillon DétecteurTemps
Co-crystallisation de l’échantillon et de la
matrice photosensible
Excitation des molécules de matrices par l’impulsion laser
Laser+
Ionisation et désorption de l’échantillon
Principe de la désorption de l’échantillon
L’impulsion laser provoque localement un échauffement du dépôt et de micro-explosions
L’échauffement entraîne des collisions et le transfert de charges de la matrice à l’échantillon
1. Préparation du dépôt
La qualité de l’analyse dépend en grande partie de la qualité du dépôt du
couple échantillon matrice.
Trois types de dépôts peuvent être utilisés dans l’analyse protéomique.
- couche mince
- goutte séchée
- sandwich
Le dépôt le plus fréquemment utilisé est celui dit en goutte séchée
Matrice à saturation dans l’acétone
Echantillon cristallisé avec la matrice
H2O/TFA O,1%Protection du dépôt
Echantillon déposé sur H2O/TFA O,1%
Dépôt de l’échantillon sur la matrice
Incorporation de l’échantillon dans les couches supérieures de la matrice
Dépôt de l’échantillon sur la goutte d’eau acide
1. Préparation du dépôt Dépôt en “couche mince” (“thin layer”)
MatriceEchantillon
Matrice à saturation dans H2O/ACN
Matrice à saturation dans H2O/ACN diluée X3
Mélange
Dépôt
MatriceEchantillon
Mélange direct sur la cible
Co-cristallisation échantillon matrice
2. Préparation du dépôt Dépôt en goutte séchée (“dried droplet”)
Avantages :
Goutte séchée : rapide, résistant, lavage
Couche mince : permet un lavage (sandwich), plus sensible !
Désavantages :
Goutte séchée : mauvaise conservation
Couche mince : conservation plus longue, nombre de tirs limités
1. Préparation du dépôt Comparaison des deux techniques de dépôts
1. Préparation du dépôt Dépôt de type Sandwich
Couche de matrice à saturation dans l’acétone (0,5 µl)
H2O/TFA O,1%Protection du dépôt (0,7 µl)
Echantillon (0,5-1 µl)
Sur couche de matrice à saturation dans H2O/ACN
(Pain)
(Beurre)
(Jambon)
(Pain)
SandwichGoutte séchée
Goutte séchée 1/3
1. Préparation du dépôt Aspect de différents dépôt MALDI-TOF avec
l’-Cyano-4-HydroxyCinnamic Acid
Couche mince
Préparation de l’échantillon
L’analyse MALDI-TOF est une technique de spectrométrie de masse qui
est relativement tolérante vis à vis des composés qui accompagnent
généralement l’échantillon à analyser. Cependant certains échantillons
ne pourront être analysés qu’après un traitement préalable le rendant
compatible pour l’analyse MALDI-TOF.
La personne qui va réaliser l’analyse MALDI-TOF et qui n’est pas la
personne qui a préparé l’échantillon doit poser un certain nombre de
questions qui orienteront son choix pour la préparation de l’échantillon.
Les questions :
- type de molécule à analyser (choix de la matrice)
- type d’échantillon (gel, liquide, poudre)
- nature des solvants accompagnants l’échantillon
- pH
- présence de sels
- présence de détergents
Ces informations vont conditionner les traitements qui seront réalisés
pour rendre l’échantillon compatible pour l’analyse MALDI-TOF
Préparation de l’échantillon
ACN trop concentré (>30%)Solubilisation de la matrice et obtention d’une goutte séchée
après évaporation de l’ACNAnalyse possible
Tris HCl 0,1 M pH 8Dissolution de la matrice due au pH basique de la
solution. Analyse impossible
SDS 0,1%Formation d’une couche
cristallisée de SDSAnalyse impossible
SDS pH 8
ACN
Aspect du dépôt sandwich en présence de composés non compatibles avec l’analyse MALDI-TOF
Elimination des sels par lavage direct du dépôt
Il est possible de « dessaler » un échantillon sur cible par un lavage direct
de l’échantillon à l’aide de 1 µl d’eau acidifiée par 1% de HCOOH.
Ce type de lavage, sur un dépôt en goutte séchée ou en sandwich,
permet un dessalage rapide de l’échantillon sans quasiment aucune
perte.
Les sels sont solubilisés par l’eau, les peptides restent cristallisés avec la
matrices.
sels
matrice
échantillon
H2O/HCOOH
1. Préparation du dépôt Le choix de la matrice
Caractéristiques de la matrice
1. Petit composé organique, photosensible (cycle aromatique)
2. Faible volatilité (10-7 mbar)
3. Compatible avec le solvant de l’analyte (soluble)
4. Bonne absorbance à la longueur d’onde du laser (337 nm)
5. Capable de transférer une ou plusieurs charges à l’analyte (acide)
La matrice est un point important dans l’analyse.
Son choix peut conditionner la réussite ou l’échec de l’analyse
2. Les matrices
HOCN
OH
O
-Cyano-4-HydroxyCinnamic Acid (HCCA)
OHO
HO
OH
2,5-DiHydroBenzoic acid (DHB)
H3CO
HO
OCH3
OH
O
Sinapinic Acid (SA)
• Absorbance à 337 nm• Cristallisation aisée• Solubles dans les solvants organiques
Trois matrices permettent de réaliser une grande partie de analyses surtout dans le domaine de la protéomique.
Polymères apolaires / Molécules organiques diverses
Le point commun entre l’ensemble de ces différentes matrices est la présence d’un noyau aromatique ainsi que leur caractère acide.
2. Les matrices Autres matrices et types d’échantillons
Type d’échantillon
L’échantillon peut se présenter sous trois formes
- Solide (poudre, cristal)
- Liquide (solution)
- Gel (électrophorèse)
La forme sous laquelle se présente l’échantillon va orienté son mode de préparation pour l’analyse MALDI-TOF.
Généralement, les échantillons destinés à l’analyse « protéomique » se présentent inclus dans un gel.
L’échantillon sous forme de gel est le plus facile à traiter.L’échantillon sous forme liquide réserve souvent des surprises et nécessite un traitement qui peut être plus difficile.
L'ionisation MALDI est, par principe, naturellement couplée à un analyseur à temps de vol (TOF).
20 kVolts
0 volts
Départ:
Formation des ions
par un bref tir laser
(5 nano sec.)
Détection:
Mesure du temps
écoulé depuis le
départ des ions
Zone de vol libre d’accélérationZone d’accélération
Cible
Analyseur à temps de vol
source détecteur
Ions positifs (m/z)
V = + 30 kV -20 kV
t = d
m2zeV
d
La mesure du temps permet de calculer m/z, et donc la masse
Le mode linéaire permet d’analyser les masses élevéesMALDI - LR linear mode - intact protein mixture
- lavage par NH4HCO3/ACN (50/50) X 2- déhydratation par de l’ACN
- digestion enzymatique (12 H 37°C)
NH4HCO3 : 25 mM (98,5 mg/50 ml)
DTT : 10 mM (15,4 mg/10 ml)
Iodoacétamide : 55 mM (102 mg/10 ml)
Trypsine Proméga V5111 : 12,5 ng/µl
Préparation de l’échantillon inclus dans un gel« Digestion in gel »
Lavage par NH4HCO3/ACN (50/50) (10 min)
DéhydratationACN
Réduction(57°C_45 min)
DéhydratationACN
Digestion à la trypsine(37°C, 12 heures)
Lavage par NH4HCO3/ACN (50/50)(10 min)
Alkylation(25 min)
La digestion « in gel » est une technique relativement simple, ce
n’est qu’une succession de lavages, mais des précautions sont tout
de même indispensables.
Le risque principal est la présence de protéines contaminantes en
concentration supérieure à celle de la protéine à identifier.
Le principal contaminant est la kératine qui est une protéine
présente au niveau de la peau, des cheveux, des pulls …
Il est possible d’éviter cette contamination par la kératine en prenant
quelques précautions lors du traitement de l’échantillon
Préparation de l’échantillon inclus dans un gel« Digestion in gel »
Goutte séchée 1/3
Résolution : 12739
Spectre MALDI-TOF d’un digeste trypsique d’ADH (100 fmol ADH)
Résolution Isotopique
La “peak liste” est utilisée pour faire les recherches dans les banques de données par le biais de différents moteurs de recherche (MS-Fit, Mascot, GlobalServer, Profound, PeptideSearch,