N° 2005-ISAL-0012 Année 2005 THESE Rôle des gangliosides dans les perturbations de la prolifération des péricytes rétiniens et des cellules mésangiales rénales : implication dans le développement de la rétinopathie et de la néphropathie diabétiques Présentée devant L'institut National des Sciences Appliquées de Lyon Pour obtenir Le grade de Docteur en biochimie Par Elodie MASSON Ingénieur Agronome (ENSA de Rennes) DEA de Biologie et Production Animales (Université de Rennes / ENSAR) Soutenue publiquement le 2 février 2005 devant la commission d'examen Jury: Dr Jean-Claude MICHALSKI (rapporteur) Pr Philippe ZAOUI (rapporteur) Dr Jacques PORTOUKALIAN Dr Nicolas WIERNSPERGER Pr Michel LAGARDE Dr Samer EL BAWAB Thèse préparée au sein de l'Unité Thématique de Microangiopathie Diabétique MERCK Santé / INSERM UMR 585, à l'INSA de Lyon.
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Rôle des gangliosides dans les perturbations de la ...theses.insa-lyon.fr/publication/2005ISAL0012/these.pdf · E.E.A. ELECTRONIQUE, ELECTROTECHNIQUE, AUTOMATIQUE M. Daniel BA RBIE
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N° 2005-ISAL-0012 Année 2005
THESE
Rôle des gangliosides dans les perturbations de la prolifération des péricytes
rétiniens et des cellules mésangiales rénales : implication dans le développement
de la rétinopathie et de la néphropathie diabétiques
Présentée devant
L'institut National des Sciences Appliquées de Lyon
Pour obtenir
Le grade de Docteur en biochimie
Par Elodie MASSON
Ingénieur Agronome (ENSA de Rennes)
DEA de Biologie et Production Animales (Université de Rennes / ENSAR)
Soutenue publiquement le 2 février 2005 devant la commission d'examen
Jury:
Dr Jean-Claude MICHALSKI (rapporteur)
Pr Philippe ZAOUI (rapporteur)
Dr Jacques PORTOUKALIAN
Dr Nicolas WIERNSPERGER
Pr Michel LAGARDE
Dr Samer EL BAWAB
Thèse préparée au sein de l'Unité Thématique de Microangiopathie Diabétique MERCK Santé /
INSERM UMR 585, à l'INSA de Lyon.
Ecoles doctorales SIGLE ECOLE DOCTORALE NOM ET COORDONNEES DU RESPONSABLE
CHIMIE DE LYON M. Denis SINOU Université Claude Bernard Lyon 1 Lab Synthèse Asymétrique UMR UCB/CNRS 5622 Bât 308 2ème étage 43 bd du 11 novembre 1918 69622 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.44.81.83 [email protected]
E2MC
ECONOMIE, ESPACE ET MODELISATION DES COMPORTEMENTS
M. Daniel BARBIER INSA DE LYON Laboratoire Physique de la Matière Bâtiment Blaise Pascal 69621 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.43.64.43 [email protected]
M. Jean-Pierre FLANDROIS UMR 5558 Biométrie et Biologie Evolutive Equipe Dynamique des Populations Bactériennes Faculté de Médecine Lyon-Sud Laboratoire de Bactériologie BP 1269600 OULLINS Tél : 04.78.86.31.50 [email protected]
EDIIS
INFORMATIQUE ET INFORMATION POUR LA SOCIETE http://www.insa-lyon.fr/ediis
M. Lionel BRUNIE INSA DE LYON EDIIS Bâtiment Blaise Pascal 69621 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.43.60.55 [email protected]
M. Alain Jean COZZONE IBCP (UCBL1) 7 passage du Vercors 69367 LYON Cedex 07 Tél : 04.72.72.26.75 [email protected]
MATERIAUX DE LYON http://www.ec-lyon.fr/sites/edml
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MATHEMATIQUES ET INFORMATIQUE FONDAMENTALE http://www.ens-lyon.fr/MathIS
M. Franck WAGNER Université Claude Bernard Lyon1 Institut Girard Desargues UMR 5028 MATHEMATIQUES Bâtiment Doyen Jean Braconnier Bureau 101 Bis, 1er étage 69622 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.43.27.86 [email protected]
M. François SIDOROFF Ecole Centrale de Lyon Lab. Tribologie et Dynamique des Systêmes Bât G8 36 avenue Guy de Collongue BP 163 69131 ECULLY Cedex Tél :04.72.18.62.14 [email protected]
Novembre 2003 INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON Directeur : STORCK A. Professeurs : AMGHAR Y. LIRIS AUDISIO S. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE BABOT D. CONT. NON DESTR. PAR RAYONNEMENTS IONISANTS BABOUX J.C. GEMPPM*** BALLAND B. PHYSIQUE DE LA MATIERE BAPTISTE P. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS BARBIER D. PHYSIQUE DE LA MATIERE BASKURT A. LIRIS BASTIDE J.P. LAEPSI**** BAYADA G. MECANIQUE DES CONTACTS BENADDA B. LAEPSI**** BETEMPS M. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE BIENNIER F. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS BLANCHARD J.M. LAEPSI**** BOISSE P. LAMCOS BOISSON C. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE BOIVIN M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES SOLIDES BOTTA H. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Développement Urbain BOTTA-ZIMMERMANN M. (Mme) UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Développement Urbain BOULAYE G. (Prof. émérite) INFORMATIQUE BOYER J.C. MECANIQUE DES SOLIDES BRAU J. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Thermique du bâtiment BREMOND G. PHYSIQUE DE LA MATIERE BRISSAUD M. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE BRUNET M. MECANIQUE DES SOLIDES BRUNIE L. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION BUFFIERE J-Y. GEMPPM*** BUREAU J.C. CEGELY* CAMPAGNE J-P. PRISMA CAVAILLE J.Y. GEMPPM*** CHAMPAGNE J-Y. LMFA CHANTE J.P. CEGELY*- Composants de puissance et applications CHOCAT B. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Hydrologie urbaine COMBESCURE A. MECANIQUE DES CONTACTS COURBON GEMPPM COUSIN M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures DAUMAS F. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et Thermique DJERAN-MAIGRE I. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL DOUTHEAU A. CHIMIE ORGANIQUE DUBUY-MASSARD N. ESCHIL DUFOUR R. MECANIQUE DES STRUCTURES DUPUY J.C. PHYSIQUE DE LA MATIERE EMPTOZ H. RECONNAISSANCE DE FORMES ET VISION ESNOUF C. GEMPPM*** EYRAUD L. (Prof. émérite) GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE FANTOZZI G. GEMPPM*** FAVREL J. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS FAYARD J.M. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS FAYET M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES SOLIDES FAZEKAS A. GEMPPM FERRARIS-BESSO G. MECANIQUE DES STRUCTURES FLAMAND L. MECANIQUE DES CONTACTS FLEURY E. CITI FLORY A. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATIONS FOUGERES R. GEMPPM*** FOUQUET F. GEMPPM*** FRECON L. (Prof. émérite) REGROUPEMENT DES ENSEIGNANTS CHERCHEURS ISOLES GERARD J.F. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES GERMAIN P. LAEPSI**** GIMENEZ G. CREATIS** GOBIN P.F. (Prof. émérite) GEMPPM*** GONNARD P. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE GONTRAND M. PHYSIQUE DE LA MATIERE GOUTTE R. (Prof. émérite) CREATIS** GOUJON L. GEMPPM*** GOURDON R. LAEPSI****. GRANGE G. (Prof. émérite) GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE GUENIN G. GEMPPM*** GUICHARDANT M. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE GUILLOT G. PHYSIQUE DE LA MATIERE
GUINET A. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS GUYADER J.L. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE GUYOMAR D. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE HEIBIG A. MATHEMATIQUE APPLIQUEES DE LYON JACQUET-RICHARDET G. MECANIQUE DES STRUCTURES JAYET Y. GEMPPM*** JOLION J.M. RECONNAISSANCE DE FORMES ET VISION JULLIEN J.F. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures JUTARD A. (Prof. émérite) AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE KASTNER R. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Géotechnique KOULOUMDJIAN J. (Prof. émérite) INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION LAGARDE M. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE LALANNE M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES STRUCTURES LALLEMAND A. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et thermique LALLEMAND M. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et thermique LAREAL P (Prof. émérite) UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Géotechnique LAUGIER A. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE LAUGIER C. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE LAURINI R. INFORMATIQUE EN IMAGE ET SYSTEMES D’INFORMATION LEJEUNE P. UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE LUBRECHT A. MECANIQUE DES CONTACTS MASSARD N. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE MAZILLE H. (Prof. émérite) PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE MERLE P. GEMPPM*** MERLIN J. GEMPPM*** MIGNOTTE A. (Mle) INGENIERIE, INFORMATIQUE INDUSTRIELLE MILLET J.P. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE MIRAMOND M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Hydrologie urbaine MOREL R. (Prof. émérite) MECANIQUE DES FLUIDES ET D’ACOUSTIQUES MOSZKOWICZ P. LAEPSI**** NARDON P. (Prof. émérite) BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS NAVARRO Alain (Prof. émérite) LAEPSI**** NELIAS D. LAMCOS NIEL E. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE NORMAND B. GEMPPM NORTIER P. DREP ODET C. CREATIS** OTTERBEIN M. (Prof. émérite) LAEPSI**** PARIZET E. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE PASCAULT J.P. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES PAVIC G. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE PECORARO S. GEMPPM PELLETIER J.M. GEMPPM*** PERA J. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Matériaux PERRIAT P. GEMPPM*** PERRIN J. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE PINARD P. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE PINON J.M. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION PONCET A. PHYSIQUE DE LA MATIERE POUSIN J. MODELISATION MATHEMATIQUE ET CALCUL SCIENTIFIQUE PREVOT P. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE PROST R. CREATIS** RAYNAUD M. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Transferts Interfaces et Matériaux REDARCE H. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE RETIF J-M. CEGELY* REYNOUARD J.M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures RICHARD C. LGEF RIGAL J.F. MECANIQUE DES SOLIDES RIEUTORD E. (Prof. émérite) MECANIQUE DES FLUIDES ROBERT-BAUDOUY J. (Mme) (Prof. émérite) GENETIQUE MOLECULAIRE DES MICROORGANISMES ROUBY D. GEMPPM*** ROUX J.J. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON – Thermique de l’Habitat RUBEL P. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION SACADURA J.F. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Transferts Interfaces et Matériaux SAUTEREAU H. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES SCAVARDA S. (Prof. émérite) AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE SOUIFI A. PHYSIQUE DE LA MATIERE SOUROUILLE J.L. INGENIERIE INFORMATIQUE INDUSTRIELLE THOMASSET D. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE THUDEROZ C. ESCHIL – Equipe Sciences Humaines de l’Insa de Lyon UBEDA S. CENTRE D’INNOV. EN TELECOM ET INTEGRATION DE SERVICES VELEX P. MECANIQUE DES CONTACTS VERMANDE P. (Prof émérite) LAEPSI VIGIER G. GEMPPM*** VINCENT A. GEMPPM*** VRAY D. CREATIS** VUILLERMOZ P.L. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE
Directeurs de recherche C.N.R.S. : BERTHIER Y. MECANIQUE DES CONTACTS CONDEMINE G. UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE COTTE-PATAT N. (Mme) UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE ESCUDIE D. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON FRANCIOSI P. GEMPPM*** MANDRAND M.A. (Mme) UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE POUSIN G. BIOLOGIE ET PHARMACOLOGIE ROCHE A. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES SEGUELA A. GEMPPM*** VERGNE P. LaMcos Directeurs de recherche I.N.R.A. : FEBVAY G. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS GRENIER S. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS RAHBE Y. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS Directeurs de recherche I.N.S.E.R.M. : KOBAYASHI T. PLM PRIGENT A.F. (Mme) BIOLOGIE ET PHARMACOLOGIE MAGNIN I. (Mme) CREATIS** * CEGELY CENTRE DE GENIE ELECTRIQUE DE LYON ** CREATIS CENTRE DE RECHERCHE ET D’APPLICATIONS EN TRAITEMENT DE L’IMAGE ET DU SIGNAL ***GEMPPM GROUPE D'ETUDE METALLURGIE PHYSIQUE ET PHYSIQUE DES MATERIAUX ****LAEPSI LABORATOIRE D’ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DES PROCEDES ET SYSTEMES INDUSTRIELS
REMERCIEMENTS
Les travaux de thèse présentés dans ce manuscrit ont été menés au sein de l’Unité Thématique de
Microangiopathie Diabétique (UTMD) Merck Santé / INSERM UMR 585 co-dirigée par le Docteur
Nicolas WIERNSPERGER et le Professeur Michel LAGARDE. Je leur suis reconnaissante de
m'avoir accueillie au sein de leur unité de recherche.
Je remercie en premier lieu le Docteur Samer EL BAWAB pour m'avoir encadrée dans ce travail
de thèse et pour avoir accompagné mes premières armes dans le monde de la recherche en me
faisant partager son expérience et ses connaissances scientifiques, et aussi pour m'avoir supportée
durant ces années, dans tous les sens du terme.
Je témoigne ma gratitude au Professeur Michel LAGARDE pour sa bienveillance à mon égard,
ainsi que pour l'attention et l'intérêt qu'il a porté à mes travaux en tant que co-directeur de thèse.
Je remercie le Docteur Nicolas WIERNSPERGER pour l'intérêt qu'il a accordé à mon travail
malgré son caractère biochimique et pour avoir financé mes travaux par l'intermédiaire de Merck
Santé.
J'exprime ensuite mon estime et mes remerciements aux membres de mon jury :
Le Professeur Philippe ZAOUI et le Docteur Jean-Claude MICHALSKI qui m'ont fait l'honneur
de juger ce travail de thèse et de me faire ainsi bénéficier de leur expertise dans les domaines
respectifs de la néphropathie diabétique et des gangliosides.
Le Docteur Jacques PORTOUKALIAN pour m'avoir fait l'honneur d'accepter la présidence de ce
jury et m'avoir aimablement apporté une aide technique dans le domaine des gangliosides.
Je remercie également le Docteur Daniel Ruggiero pour avoir encadrer, avec toute sa sympathie,
ma première année de thèse.
Je remercie le Professeur Philippe LEGRAND pour les encouragements, les conseils et l'attention
qu'il m'a témoignés depuis ma sortie d'école tout comme pendant mon cursus à l'ENSAR ainsi que
pour m'avoir encouragée à choisir cette formation "par la recherche", et je l'espère aussi "pour la
recherche", qu'est la thèse.
Je tiens aussi à témoigner mon amitié à feu l'équipe Merck qui m'a accompagnée au quotidien:
Karen, compagne de thèse, je lui souhaite beaucoup de bonheur; Pierre, ancien collègue thésard à
qui je souhaite bonne chance pour l'avenir; Lysiane que je remercie vivement pour son aide
précieuse et sa gentillesse; Anne-Marie et sa bonne humeur, Brigitte que je remercie pour sa
sympathie et son soutien logistique très appréciable (c'est surtout quand elle n'est plus là qu'on s'en
rend compte), et Corinne que je remercie pour la sympathie et les encouragements qu'elle m'a
témoignés.
Je remercie enfin l'ensemble des membres du laboratoire "Physiopathologie des Lipides et
Membranes" INSA/INSERM pour la sympathie ou l'aide qu'ils m'ont témoignées durant ces trois
années, notamment Patrick, Martine, Madeleine et Madeleine, Evelyne et Catherine, Véronique,
André, Salim et l'indispensable informaticien Fabien. J'adresse particulièrement mes remerciements
aux anciens thésards (les Dr Caroline, Laurent, Pierre, Sandrine, Olivier, Hiba) qui m'ont fait
profiter de leur expérience, et mes encouragements et vœux de réussite aux futurs docteurs (Nelly,
Saïda, Bader, Caroline, Deborah).
Je n'oublie pas M. Raymond Brut, de la société STA des abattoirs de Corbas, que je remercie pour
sa serviabilité et sa bonne humeur matinale.
J'adresse pour finir mon attachement et mes remerciements à
Mes parents, grâce auxquels j'en suis arrivée là aujourd'hui.
Jérôme, pour son écoute, son soutien essentiel et son aide.
Ma famille et mes amis pour leur écoute et leurs encouragements très précieux.
LE DIABETE ...............................................................................................................................12
I. LE DIABETE SUCRE 12
1. Les differents types de diabéte.......................................................................................13
1.1. Le diabète de type 1 ...............................................................................................13
1.2. Le diabète de type 2 ...............................................................................................14
2. Les complications liées au diabète.................................................................................15
2.1. Les complications aiguës .......................................................................................15
2.2. Les complications chroniques ................................................................................15 2.2.1 La macroangiopathie diabétique ........................................................................16 2.2.2 La microangiopathie diabétique.........................................................................16
II. PHYSIOPATHOLOGIE DE LA RETINOPATHIE ET DE LA NEPHROPATHIE DIABETIQUES 17
1. Les microvaisseaux au sein de leur structure.................................................................18
1.1. La rétine..................................................................................................................18 1.1.1 L’œil et la rétine.................................................................................................18 1.1.2 Les microvaisseaux............................................................................................19 1.1.3 Les cellules.........................................................................................................20
(a) Les cellules endothéliales 20 (b) Les péricytes 21
1.2. Les reins .................................................................................................................21 1.2.1 Le système urinaire et les reins..........................................................................21 1.2.2 Les glomérules, site de filtration........................................................................24 1.2.3 Les cellules.........................................................................................................25
(a) Les cellules endothéliales 25 (b) Les podocytes, cellules epithéliales spécialisées 25 (c) Les cellules mésangiales 26
2. Deux pathologies évolutives ..........................................................................................27
2.1. Rétinopathie diabétique..........................................................................................28 2.1.1 Les différentes phases de la maladie..................................................................28
2.1.2 Les facteurs de risque.........................................................................................29 2.1.3 Le traitement ......................................................................................................29
2.2. Néphropathie diabétique (ND) ...............................................................................29 2.2.1 Les différents stades de la maladie ....................................................................29
(a) ND silencieuse et hyperfiltration glomérulaire 30 (b) ND débutante et microalbuminurie 30 (c) ND confirmée et protéinurie 30 (d) Insuffisance rénale terminale 31
2.2.2 Les facteurs de risque.........................................................................................31 2.2.3 Le traitement ......................................................................................................31
3. Altérations structurales et fonctionnelles.......................................................................32
3.1. Membrane basale et matrice extracellulaire...........................................................32
2. La voie des polyols ........................................................................................................41
3. L'activation de la pkc .....................................................................................................42
4. La glycosylation non enzymatique ................................................................................43
4.1. Formation des AGE................................................................................................43
4.2. Caractérisation et mesure .......................................................................................45
4.3. Mécanismes d’action et conséquences pathologiques ...........................................45 4.3.1 Glycation des protéines à durée de vie courte : protéines circulantes,
intracellulaires et acides nucléiques...................................................................46 4.3.2 Glycation des protéines de la matrice ................................................................47 4.3.3 Interaction avec des récepteurs membranaires spécifiques ...............................48
3. Régulation du metabolisme ...........................................................................................75
3.1. Equipement enzymatique et disponibilité des substrats.........................................75
3.2. Régulation au niveau transcriptionnel....................................................................76
3.3. Mécanismes de régulation épigénétiques...............................................................76 3.3.1 Au niveau post-transcriptionnel .........................................................................76 3.3.2 Rétrocontrôle négatif .........................................................................................77 3.3.3 Le pH .................................................................................................................78
III. FONCTIONS 78
1. Double fonction des gangliosides ..................................................................................79
1.1. Reconnaissance cellulaire ......................................................................................79 1.1.1 Propriétés antigéniques ......................................................................................80 1.1.2 Reconnaissance par des protéines de liaison aux hydrates de carbone..............81 1.1.3 Modulation des récepteurs intégrines ................................................................81 1.1.4 Interaction entre gangliosides et GSL................................................................82 1.1.5 Interaction avec des virus, bactéries ou toxines.................................................82
1.2. Modulation du signal transmembranaire................................................................83 1.2.1 Régulation des récepteurs à tyrosine kinase ......................................................83 1.2.2 Modulation de la protéine kinase C ...................................................................86
2. Importance biologique / physiologique des gangliosides ..............................................87
2.1. Développement, différenciation cellulaire et tissulaire, embryogenèse.................87
LES AGE DIMINUENT LA PROLIFERATION DES PERICYTES ET DES CELLULES MESANGIALES: IMPLICATION DES GANGLIOSIDES .................................................119
I. EFFETS DES AGE SUR LA PROLIFERATION CELLULAIRE 119
II. EFFETS DES AGE SUR LE METABOLISME DES GANGLIOSIDES 121
1. Le profil basal en gangliosides ....................................................................................121
1.1. Effet des AGE sur la composition en gangliosides des péricytes ........................122
1.2. Effet des AGE sur la composition en gangliosides des cellules mésangiales......124
2. Effet des AGE sur l’activité des enzymes de biosynthèse des gangliosides................126
III. IMPLICATION DES GANGLIOSIDES DANS LA DIMINUTION DE LA PROLIFERATION CELLULAIRE CAUSEE PAR LES AGE 128
1. Effet d’un traitement par des gangliosides exogènes sur la prolifération des péricytes et des cellules mésangiales ..............................................................................................128
2. Effet d’un traitement avec les AGE en présence d’anticorps dirigés contre les gangliosides de la série-a .............................................................................................130
3. Effet d’un cotraitement AGE et PPMP........................................................................131
4. Effet de la transfection avec un SiRNA de GM3 synthase..........................................133
IV. DISCUSSION 134
L’ACTIVATION DE LA VOIE DES HEXOSAMINES DIMINUE LA PROLIFERATION DES PERICYTES ET DES CELLULES MESANGIALES : IMPLICATION DES GANGLIOSIDES.......................................................................................................................138
I. EFFETS DE LA GLUCOSAMINE SUR LA PROLIFERATION CELLULAIRE 139
II. EFFETS DE LA GLUCOSAMINE SUR LE METABOLISME DES GANGLIOSIDES 140
1. Effet de la glucosamine sur le profil en gangliosides des péricytes ............................141
2. Effet de la glucosamine sur le profil en gangliosides des cellules mésangiales ..........141
III. EFFET DE LA GLUCOSAMINE SUR L’ACTIVITE GM3 SYNTHASE 144
IV. IMPLICATION DES GANGLIOSIDES DANS LA DIMINUTION DE PROLIFERATION CELLULAIRE CAUSEE PAR LA GLUCOSAMINE 146
1. Effet d’un traitement par les gangliosides exogènes sur la prolifération des péricytes et des cellules mésangiales ..............................................................................................146
2. Effet d’un cotraitement glucosamine et PPMP............................................................148
V. ETUDE DES MECANISMES CONDUISANT A L’INHIBITION DE PROLIFERATION DES CELLULES MESANGIALES PAR LA GLUCOSAMINE 150
1. Effet de la glucosamine sur l’hypertrophie des RMC..................................................150
2. Effet de la glucosamine sur le cycle cellulaire ............................................................152
2.1. Analyse du cycle par FACS .................................................................................152
2.2. Effet de la glucosamine sur l’expression des inhibiteurs de kinase cycline-dépendante............................................................................................................153
3. Effet de la glucosamine sur le profil en gangliosides ..................................................155
4. Effet de GM2 et GM1 sur l’hypertrophie et le cycle cellulaire des RMC...................156
4.1. Effet des gangliosides sur l’hypertrophie.............................................................156
4.2. Effet des gangliosides sur le cycle cellulaire .......................................................157
VI. DISCUSSION 159
METABOLISME DES GANGLIOSIDES DU CORTEX RENAL DE SOURIS DB/DB...164
I. MESURE DES ACTIVITES GM3 ET GD3 SYNTHASE 164
II. MESURE DES TAUX DE GM3 165
III. DISCUSSION 166
CONCLUSION ET PERSPECTIVES .................................................................. 168
HPTLC est vaporisée avec un mélange de résorcinol/HCl/Cu2+ (10 ml de résorcinol à 1,5 % (w/v
111
dans de l'eau), 0,15 ml de sulfate de cuivre 1 %, 15 ml d'acide chlorhydrique concentré et 25 ml
d'eau) (Schnaar R.L. et al., 1994). Celle-ci est ensuite couverte par une plaque en verre et chauffée à
125 °C pendant 20 minutes. Les gangliosides apparaissent alors en bleu-violet sur la plaque
HPTLC. Le résorcinol, en présence de Cu2+, possède en effet la particularité de colorer
spécifiquement les acides sialiques en bleu-violet (SVENNERHOLM L., 1957). Les gangliosides
sont identifiés par comigration avec un standard et les quantifications sont faites par densitométrie
avec une caméra VDS et le logiciel Image Quant. Les valeurs sont rapportées à la quantité de
protéines de chaque échantillon et corrigées par quantification du standard interne.
La révélation colorimétrique par le résorcinol (Figure 31B) reflète la quantité absolue de chaque
ganglioside présent dans l'échantillon, qui peut alors être déterminée par utilisation d'un standard.
Par contre, le marquage métabolique des gangliosides par le 14C galactose et la révélation par
autoradiographie (Figure 31A) ne permet pas la détermination de la masse de chaque composé mais
plutôt la quantité du composé synthétisée pendant la période de marquage alors qu'elle est plus
sensible que le résorcinol et permet donc de visualiser des espèces de gangliosides même
minoritaires. Cette différence d'interprétation peut expliquer les variations parfois observées entre
les résultats obtenus par révélation colorimétrique et par marquage radioactif.
A B
origine
standards
standard interne (GT1b)
standards
A B
origine
standards
standard interne (GT1b)
standardsstandards
standard interne (GT1b)
standards
Figure 31 : Exemple de plaque HPTLC révélée par autoradiographie (A) puis par révélation colorimétrique au
résorcinol (B)
Les gangliosides GM2 et GM1 étant absents dans les RMC à l’état basal et apparaissant en
réponse à un traitement à la glucosamine, nous avons voulu confirmer leur identité. Nous avons tout
d’abord essayé d’identifier ces gangliosides par spectrométrie de masse suite à une séparation par
112
HPLC en utilisant une colonne LiChrosorb-NH2 par élution avec des gradients de mélanges
acétonitrile/tampon phosphate. Cependant, des problèmes de quantité de matériel et de pureté
d’échantillon n’ont pas permis d’obtenir des résultats concluants. L'identité du GM2 et du GM1 a
alors été confirmée par immunocytochimie en utilisant un anticorps spécifique dirigé contre GM2
(don généreux du Dr J. Portoukalian) et la sous-unité β de la toxine cholérique, spécifique du GM1.
• Les gangliosides des cellules mésangiales traitées ou non avec 5 mM de glucosamine sont
déposés en double de façon identique sur une plaque HPTLC à support en aluminium (Merck).
Après la séparation des gangliosides par migration, la plaque est découpée en deux aux ciseaux
pour donner deux parties identiques. Une partie est révélée par pulvérisation au résorcinol alors que
l'autre est utilisée pour l'immnuodétection. Celle-ci est tout d'abord rapidement immergée dans une
solution de polyisobutylmétacrylate à 0,4 % dans l'hexane afin de fixer la silice. La plaque est
ensuite bloquée dans du PBS-BSA 1 % pendant 2 heures puis incubée à température ambiante avec
l'anticorps primaire anti-GM2. Après rinçage, la plaque est incubée avec un anticorps secondaire
biotinylé pendant 1 heure puis un complexe streptavidine-peroxydase est ajouté après rinçage. Au
bout de 45 min, le signal peroxydase est visualisé avec une solution préparée en dissolvant 2 mg de
4-chloronaphtol dans 3 ml de méthanol, 7 ml de tampon et 5 µl de H2O2 à 30 %. Comme le montre
la Figure 32, cette expérience nous a permit de confirmer l'identité du GM2, en comparant les
parties de plaque révélées au résorcinol et par immunodétection.
Immunodétection (anticorps anti-GM2) révélation au résorcinol
GM2 standard
GM2 échantillon
Glucosamine (mM)0 50 5
GM2 standard
Immunodétection (anticorps anti-GM2) révélation au résorcinol
GM2 standard
GM2 échantillon
Glucosamine (mM)0 50 5
GM2 standard
Figure 32 : immunuodétection du GM2
113
• Les gangliosides des cellules mésangiales traitées ou non avec 5 mM de glucosamine,
marqués métaboliquement, sont séparés par migration sur une plaque HPTLC. La plaque est tout
d'abord révélé par autoradiographie. Elle est ensuite rapidement plongée dans un bain de PBS-acidé
actéique 0,5 % afin de fixer la silice puis rincée dans le PBS. Elle est ensuite bloquée dans du PBS-
BSA 2 % pendant 30 min puis incubée pendant une nuit à 4 °C et à l'obscurité avec la sous-unité B
de la toxine cholérique fluorescente (2,5 µg/ml dans la solution de blocage) (Molecular Probes). Le
signal est révélé par lecture sous UV à l'aide d'une caméra VDS. Cette manipulation nous a permis
de confirmer l'identité du GM1, comme le montre la Figure 33.
Plaque révélée à la choleratoxine Plaque autoradiographiée
Glucosamine (mM)0 50 5
GM1 standard
GM1 échantillon
Plaque révélée à la choleratoxine Plaque autoradiographiée
Glucosamine (mM)0 50 5
GM1 standard
GM1 échantillon
Figure 33 : détection du GM1 par la toxine cholérique
3. DOSAGE DES ACTIVITES ENZYMATIQUES Au terme de la période de traitement, les cellules sont rincées avec du PBS puis incubées pendant
20 min à 4 °C avec du tampon de lyse (50 µl pour une boîte de 10 cm) composé de cacodylate de
sodium 20 mM pH 6,6, de 0,2 % de Triton X-100, 1 mM EDTA et 10 µl/ml de cocktail
d'inhibiteurs de protéases. A l'issue de la lyse, les cellules sont collectées par grattage. 4 boîtes de
péricytes (~2-3 × 106 cellules) ou 3 boîtes de cellules mésangiales (~3-6 × 106 cellules) sont
combinées. Les lysats cellulaires sont centrifugés à 10,000g pendant 5 min à 4 °C et les protéines du
surnageant sont dosées et utilisées pour mesurer les activités enzymatiques.
Alternativement, les homogénats de cortex sont centrifugés à 1000g pendant 5 min à 4 °C et les
protéines sont dosées sur le surnageant.
Des quantités égales de protéines de chaque échantillon sont utilisées pour l'essai (environ 500 µg
pour les homogénats cellulaires et 200-400 µg pour les homogénats de cortex).
114
Les activités des sialyltranséfrases GM3 synthase et GD3 synthase sont déterminées grâce à
l'incorporation d'acide N-acétyl neuraminique marqué au 14C (CMP-[14C]-NeuAc) sur un substrat
accepteur. Celui-ci est le CDH (lactosylcéramide) pour le dosage de la GM3 synthase et le GM3
pour le dosage la GD3 synthase. Les activités enzymatiques sont estimées en fonction de la quantité
de produit radioactif formé (Figure 34).
CMP-[14C]-NeuAc CMP
(GM3) (GD3)
Gal Gluc CeramideNeuAc Gal Gluc CeramideNeuAc[14C]NeuAc
CMP-[14C]-NeuAc CMP
(CDH) (GM3)
Gal Gluc Ceramide Gal Gluc Ceramide[14C]NeuAcGM3 synthase
GD3 synthase
CMP-[14C]-NeuAc CMP
(GM3) (GD3)
Gal Gluc CeramideNeuAc Gal Gluc CeramideNeuAc Gal Gluc CeramideNeuAc[14C]NeuAc Gal Gluc CeramideNeuAc[14C]NeuAc
CMP-[14C]-NeuAc CMP
(CDH) (GM3)
Gal Gluc Ceramide Gal Gluc Ceramide[14C]NeuAcGM3 synthase
GD3 synthase
Figure 34 : principe du dosage des activités enzymatiques GM3 et GD3 synthases
Les échantillons sont mélangés à un volume égal de tampon de réaction contenant en concentrations
finales : 0,1 mM de lactosylcéramide ou de GM3 (Matreya, Biovalley, Marne la Vallée, France)
pour les activités GM3 et GD3 synthase, respectivement, 4 µCi/ml de [sialic-4,5,6,7,8,9-14C]CMP-
acide sialique (325.2 mCi/mmol) (PerkinElmer Life Sciences), 100 µM de CMP-acide sialique
(Sigma), 10 mM MgCl2, 0,2 % Triton X-100, et 100 mM de cacodylate de sodium pH 6,6. Les
mélanges réactionnels sont ensuite incubés à 37 °C pendant 150 min sous agitation. La réaction est
stoppée en déposant les échantillons sur une colonne de silice 60 (Merck) préalablement lavée au
méthanol puis équilibrée à l'eau, afin de séparer l'excès de substrats des produits de réaction. Le
substrat n'ayant pas réagi est éliminé avec 4 ml d'eau puis les gangliosides sont élués avec 2 ml de
chloroforme/méthanol (1:1, v/v). Le solvant est évaporé et les gangliosides sont repris dans 30 µl de
chloroforme/méthanol 2:1 puis déposés sur plaque de chromatographie sur couche mince, avec des
standards, pour être séparés par migration dans un mélange chloroforme/méthanol/CaCl2 0,2 %
(55:45:10, v/v/v). La révélation des produits se fait par autoradiographie après impression d'un
écran Phosphoscreen pendant 10 jours. Les gangliosides sont également révélés par pulvérisation de
résorcinol afin d'identifier les bandes par rapport aux standards. Les quantifications sont faites par
115
densitométrie avec le logiciel Image Quant. Les activités enzymatiques sont exprimées en pmoles
de produit formées par heure et par mg de protéines.
VII. ANALYSE STATISTIQUE DES RESULTATS
Les valeurs présentées correspondent aux moyennes ± SEM de n expériences indépendantes.
Dans les études menées sur culture cellulaire, le test non paramétrique pour valeurs appariées de
Wilcoxon a été choisi pour comparer les différences entre groupes. Pour les expériences réalisées
sur les souris, le test t de Student a été utilisé. Les résultats sont jugés statistiquement significatifs
pour p<0,05.
116
RESULTATS-DISCUSSION
117
CONTEXTE ET OBJECTIFS
L'hyperglycémie est à l'origine des complications, notamment microvasculaires, du diabète.
Le glucose exerce ses effets toxiques via un certain nombre de voies biochimiques décrites, dont la
formation des produits avancé de glycation (AGE) et la voie des hexosamines. L'utilisation
d'inhibiteurs de la formation des AGE permet en effet de limiter le développement de la rétinopathie
(Hammes H.P. et al., 1991)et de la néphropathie (Forbes J.M. et al., 2001) chez des animaux
diabétiques. De même l'utilisation d'un inhibiteur de la voie des hexosamines permet de prévenir
par exemple
La prolifération cellulaire est largement affectée au cours du diabète, particulièrement celle des
péricytes au niveau rétinien et celle des cellules mésangiales au niveau rénal.
Par ailleurs, les gangliosides sont connus pour jouer un rôle dans la régulation de la
prolifération cellulaire.
L’objectif de ce travail de thèse a été de déterminer les effets d’un environnement
diabétique sur la prolifération cellulaire et le rôle potentiel des gangliosides dans ces
processus.
La multiplicité des voies par lesquelles l'hyperglycémie peut générer des effets toxiques
amenuise l'efficacité des interventions ciblées contre une seule de ces voies. Dans cette étude,
l’environnement diabétique a été mimé à la fois par un traitement avec les AGE et avec la
glucosamine afin de mettre en parallèle les conséquences de la formation des produits avancés de
glycation et de l’activation de la voie des hexosamines et d'identifier ainsi des mécanismes
intracellulaires communs par lesquels ces deux voies biochimiques induites par l'hyperglycémie
exerceraient leurs effets.
De plus, chez les patients diabétiques, rétinopathie et néphropathie sont souvent associées et
plusieurs caractéristiques pathologiques sont communes à ces deux complications, qu'il serait
profitable de pouvoir traiter en même temps. C’est pourquoi nos travaux ont été menés à la fois sur
des péricytes rétiniens et sur des cellules mésangiales rénales, dans une optique comparative
rétinopathie-néphropathie et de recherche de mécanismes communs aux deux microcomplications.
118
LES AGE DIMINUENT LA PROLIFERATION DES
PERICYTES ET DES CELLULES MESANGIALES:
IMPLICATION DES GANGLIOSIDES
Les AGE ont été largement impliqués lors d'études in vitro et in vivo, dans le développement des
complications microvasculaires du diabète que sont la rétinopathie et la néphropathie. Leur
accumulation a été montrée notamment dans le rein et la rétine de patients diabétiques. Différentes
équipes ont montré que les AGE affectent la croissance et la viabilité à la fois des péricytes
(Chibber R. et al., 1997; Denis U. et al., 2002; Yamagishi S. et al., 2002a) et des cellules
mésangiales (Yamagishi S. et al., 2002b; Ziyadeh F.N. et al., 1993). Cependant, les mécanismes
d'action de la toxicité des AGE n'ont pas été totalement identifiés.
D'autre part, de précédents travaux réalisés dans le laboratoire ont révélé que les AGE peuvent agir
sur le métabolisme des glycoconjugués et notamment des gangliosides de cellules microvasculaires
rétiniennes (Natalizio A. et al., 2001).
L'objectif de cette première étude a été de déterminer l'effet des AGE sur la prolifération cellulaire
et le profil en gangliosides, ceci dans une approche comparative péricytes-cellules mésangiales.
Ensuite, nous avons étudié l’hypothèse d’un lien potentiel entre modifications de la croissance
cellulaire et métabolisme des gangliosides.
I. EFFETS DES AGE SUR LA PROLIFERATION
CELLULAIRE
Péricytes rétiniens et cellules mésangiales rénales ont été cultivés durant un passage (7 et 4 jours,
respectivement) en présence de 3µM de BSA contrôle ou d’AGE. Au terme de cette période de
traitement, la prolifération cellulaire a été évaluée par comptage des cellules et par dosage des
protéines totales.
La Figure 35A montre que, dans les péricytes, les AGE diminuent le nombre de cellules de
33 % par rapport au nombre de cellules témoin. Cet effet délétère des AGE se manifeste également
119
sur la quantité totale de protéines puisqu’elle est 42 % inférieure dans les cultures traitées
comparées aux cultures témoin.
Les AGE affectent également la croissance des cellules mésangiales de manière importante
puisque le nombre de cellules est diminué d’environ 45 % par rapport au nombre de cellules
témoin. La quantité totale de protéines est quant à elle, inférieure de 34 % dans les cultures traitées
comparées aux cultures témoin (Figure 35B).
BSA AGEs
0
20
40
60
80
100
120
%du
con
trôle
nombre de cellulesquantité de protéines
**
A BRP
BSA AGEs
0
20
40
60
80
100
120
%du
con
trôle
nombre de cellulesquantité de protéines
**
B RMC
BSA AGEs
0
20
40
60
80
100
120
%du
con
trôle
nombre de cellulesquantité de protéines
**
A BRP
BSA AGEs
0
20
40
60
80
100
120
%du
con
trôle
BSA AGEs
0
20
40
60
80
100
120
%du
con
trôle
0
20
40
60
80
100
120
%du
con
trôle
nombre de cellulesquantité de protéinesnombre de cellulesnombre de cellulesquantité de protéinesquantité de protéines
**
A BRP
BSA AGEs
0
20
40
60
80
100
120
%du
con
trôle
nombre de cellulesquantité de protéines
**
B RMC
BSA AGEs
0
20
40
60
80
100
120
%du
con
trôle
BSA AGEs
0
20
40
60
80
100
120
%du
con
trôle
0
20
40
60
80
100
120
%du
con
trôle
nombre de cellulesquantité de protéinesnombre de cellulesnombre de cellulesquantité de protéinesquantité de protéines
**
B RMC
Figure 35 : Les AGE inhibent la prolifération des péricytes et des cellules mésangiales. BRP (A) et RMC (B) ont été
traités durant un passage par 3µM de BSA contrôle ou d’AGE, collectés par tripsynation puis comptés à l’aide d’un
hématimètre. La quantité totale de protéines a également été mesurée. Les résultats sont exprimés en % du contrôle
BSA et représentent la moyenne ± SEM de 6-9 expériences indépendantes réalisées en duplicats. *p<0,05.
Les AGE exercent donc un effet anti-prolifératif sur les deux types de cellules étudiés, comme
indiqué à la fois par la baisse du nombre de cellules et par la diminution de la quantité totale
de protéines.
120
II. EFFETS DES AGE SUR LE METABOLISME DES
GANGLIOSIDES
1. LE PROFIL BASAL EN GANGLIOSIDES Les deux modèles cellulaires ont été traités pendant un passage avec 3 µM de BSA contrôle ou
d’AGE puis les gangliosides ont été extraits, purifiés, séparés par HPTLC et révélés à la fois au
résorcinol et par autoradiographie grâce à un marquage métabolique préalable au 14C-galactose.
L'analyse a permis de déterminer d'une part la composition en gangliosides des BRP et RMC à l'état
basal et d'autre part l'effet des AGE sur ce profil en gangliosides.
Comme l'illustre la Figure 36A, le profil basal en gangliosides est spécifique du type cellulaire. Les
gangliosides se présentent sous la forme de doublets, correspondant probablement à des différences
dans les chaînes hydrophobes formant le céramide pour une même chaîne glycosidique. Les
gangliosides sont ici identifiés par comigration avec un standard. Dans les péricytes, les
gangliosides majoritaires sont le GM3 (63 % de tous les gangliosides détectés) et le GM1 (9 %)
parmi les gangliosides de la série-a (Figure 36B), et le GD3 (28 %) parmi les gangliosides de la
série-b. Le profil en gangliosides des cellules mésangiales diffère par une faible proportion de GD3
(5 % de tous les gangliosides détectés) et parmi la série-a, par la présence de GD1a (20 %), le GM3
restant largement majoritaire (75 %). Ces résultats sont en accord avec la composition des cellules
microvasculaires déjà caractérisées, où le GM3 est prédominant.
121
Figure 36 : Profil en gangliosides des péricytes rétiniens et des cellules mésangiales rénales. Les gangliosides des
BRP et des RMC ont été extraits puis purifiés. Ils ont ensuite été séparés sur plaque HPTLC et révélés au résorcinol.
Les différentes espèces ont été identifiées par co-migration avec des standards.
1.1.Effet des AGE sur la composition en gangliosides des péricytes
Comme représenté sur la Figure 37A, les AGE induisent des modifications spécifiques du profil en
gangliosides présents dans les péricytes. Les quantités de GM3 et GM1 augmentent d’environ 40 %
par rapport au contrôle BSA, alors que celle de GD3 diminue de 24 %, en réponse aux AGE. Des
résultats similaires ont été obtenus par autoradiographie (Figure 37B).
GM3
GD3
GT1b(standard interne)
RMCBRP
GM1
GT1b(standard interne) standardsstandards
GD1a
GM2
A B
Laccer GM3 GT3
GM2 GD2 GT2
GM1 GD1b GT1c
GD1a GT1b GQ1c
GT1a GQ1b GP1c
GD3
série-a série-b série-c
GM3
GT1b(standard interne)
RMCBRP
GM1
GD3
GT1b(standard interne) standardsstandards
GD1a
GM2
GM3
GT1b(standard interne)
GT1b(standard interne)
RMCBRP
GM1
GD3
GT1b(standard interne) standardsstandards
GD1aGD1a
GM2
A B
Laccer GM3 GT3
GM2 GD2 GT2
GM1 GD1b GT1c
GD1a GT1b GQ1c
GT1a GQ1b GP1c
GD3
série-a série-b série-c
Laccer GM3 GT3
GM2 GD2 GT2
GM1 GD1b GT1c
GD1a GT1b GQ1c
GT1a GQ1b GP1c
GD3
série-a série-b série-c
122
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
% d
u co
ntrô
le
GM3 GM1GD3
BSA AGE0
20
40
60
80
100
120
140
160
BSA AGE
% d
u co
ntrô
le
GM3 GM1GD3
* *
*
A B
**
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
% d
u co
ntrô
le
GM3 GM1GD3GM3 GM1GD3
BSA AGE0
20
40
60
80
100
120
140
160
BSA AGE
% d
u co
ntrô
le
GM3 GM1GD3GM3 GM1GD3
* *
*
A B
**
Figure 37 : Les AGE modifient le profil en gangliosides des péricytes rétiniens. Les cellules ont été exposées à 3 µM
de BSA contrôle ou d’AGE durant 7 jours puis collectées. Les gangliosides, métaboliquement marqués par le 14C
galactose, ont alors été extraits, purifiés et analysés par HPTLC. Ils ont été révélés à la fois par pulvérisation de
résorcinol (A) et par autoradiographie (B) puis quantifiés par densitométrie. (A) En conditions contrôle, les quantités
de GM3, GM1 et GD3 étaient respectivement de 2.39 ± 0.19, 0.34 ± 0.03, et 1.05 ± 0.11 µg/mg de protéines. Les
résultats sont exprimés en % du contrôle BSA et représentent la moyenne ± SEM de 6 expériences indépendantes
réalisées en duplicats. *p<0,05.
Les gangliosides ont été métaboliquement marqués par ajout de 14C galactose à forte activité
spécifique dans le milieu de culture afin de pouvoir quantifier les taux de GM2, ganglioside de la
série-a quasiment indétectable par révélation au résorcinol ou faible marquage radioactif. Les
résultats présentés en Figure 38, indiquent que le GM2 est également augmenté de 55 % dans les
péricytes traités avec les AGE.
123
BSA AGE
%du
con
trôle
GM2
0
25
50
75
100
125
150
175
BSA AGE
%du
con
trôle
GM2GM2
0
25
50
75
100
125
150
175
0
25
50
75
100
125
150
175
Figure 38 : Les AGE augmentent la synthèse du GM2 dans les péricytes. Les cellules ont été traitées avec 3 µM de
BSA contrôle ou d’AGE durant 7 jours puis collectées. Les gangliosides ont été métaboliquement marqués par 1 µCi/ml
de 14C galactose et révélés par autoradiographie. Les résultats sont exprimés en % du contrôle BSA et représentent la
moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes. (tendance à la significativité p<0,1)
Les AGE induisent donc une augmentation de tous les gangliosides de la série a présents dans
les péricytes (GM3, GM2 et GM1) et une diminution du ganglioside de la série b, GD3.
1.2.Effet des AGE sur la composition en gangliosides des cellules mésangiales
De la même manière, le traitement par les AGE modifie le profil en gangliosides des
cellules mésangiales. Les résultats présentés dans la Figure 39A indiquent que le taux de GM3
augmente de 33 % alors que celui de GD3 diminue de 30 % en réponse aux AGE. Le taux de GD1a,
quant à lui, n'est quasiment pas affecté. Des résultats semblables ont été obtenus par analyse du
marquage radioactif des gangliosides (Figure 39B).
124
A B
0
20
40
60
80
100
120
140
160
BSA AGE
%du
con
trôle
GM3 GD1aGD3 *
*
0
20
40
60
80
100
120
140
BSA AGE
%du
con
trôle
GM3 GD1aGD3
*
A B
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0
20
40
60
80
100
120
140
160
BSA AGE
%du
con
trôle
GM3 GD1aGD3GM3 GD1aGD3 *
*
0
20
40
60
80
100
120
140
0
20
40
60
80
100
120
140
BSA AGE
%du
con
trôle
GM3 GD1aGD3GM3 GD1aGD3
*
Figure 39 : Les AGE modifient le profil en gangliosides des cellules mésangiales. Les cellules ont été exposées à 3
µM de BSA contrôle ou d’AGE durant 4 jours puis collectées. Les gangliosides, métaboliquement marqués par le 14C
galactose, ont alors été extraits, purifiés et analysés par HPTLC. Ils ont ensuite été révélés à la fois par pulvérisation
de résorcinol (A) et par autoradiographie (B), puis quantifiés par densitométrie. (A) En conditions contrôle, les
quantités de GM3, GD1 et GD3 étaient respectivement de 4.03 ± 0.28, 1.08 ± 0.11 et 0.27 ± 0.07 µg/mg de protéines.
Les résultats sont exprimés en % du contrôle BSA et représentent la moyenne ± SEM de 9 expériences indépendantes
réalisées en duplicats. *p<0,05.
Les gangliosides de la série-a, GM2 et GM1, étant difficilement détectables par révélation au
résorcinol ou faible marquage radioactif, un marquage métabolique plus élevé des gangliosides a
été réalisé par ajout de 14C galactose à forte activité spécifique. Les résultats obtenus par
autoradiographie, présentés en Figure 40, montrent que GM2 et GM1 sont augmentés de 25-35 %
en réponse aux AGE.
125
BSA AGE
%du
con
trôle
0
25
50
75
100
125
150
175GM2GM1
BSA AGE
%du
con
trôle
0
25
50
75
100
125
150
175GM2GM1GM2GM1
Figure 40 : Les AGE augmentent la synthèse du GM2 et du GM1 dans les cellules mésangiales. Les cellules ont été
traitées avec 3 µM de BSA contrôle ou d’AGE durant 4 jours puis collectées. Les gangliosides ont été métaboliquement
marqués par 1 µCi/ml de 14C galactose et révélés par autoradiographie. Les résultats sont exprimés en % du contrôle
BSA et représentent la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes. (tendance à la significativité p<0,1)
Les AGE induisent donc une augmentation des gangliosides GM3, GM2 et GM1 appartenant à la
série a et une diminution du ganglioside GD3 appartenant à la série b.
D'après ces résultats, les AGE semblent provoquer des effets similaires sur le
métabolisme des gangliosides dans les péricytes et les cellules mésangiales. On observe en effet
une augmentation des gangliosides de la série-a et une diminution des gangliosides de la série-
b dans les deux types cellulaires traités avec les AGE.
2. EFFET DES AGE SUR L’ACTIVITE DES ENZYMES DE BIOSYNTHESE DES
GANGLIOSIDES Dans le but de préciser les mécanismes responsables de ces variations dans les taux de gangliosides,
les activités des enzymes de biosynthèse, GM3 et GD3 synthase, ont été mesurées en réponse aux
AGE.
Les résultats présentés en Figure 41 indiquent que le traitement par les AGE augmente
l’activité GM3 synthase, de 80 % dans les péricytes et de 50 % dans les cellules mésangiales.
Parallèlement, les AGE induisent une diminution de l’activité GD3 synthase d’environ 60 % dans
les deux types cellulaires.
126
A%
du c
ontrô
le
*
*
0
50
100
150
200
250
BRP RMC
BSAAGE
GM3 synthase B
0
20
40
60
80
100
120
**
%du
con
trôle
BSAAGE
BRP RMC
GD3 synthaseA%
du c
ontrô
le
*
*
0
50
100
150
200
250
BRP RMC
BSAAGE
GM3 synthase B
0
20
40
60
80
100
120
**
%du
con
trôle
BSAAGE
BRP RMC
GD3 synthase%
du c
ontrô
le
*
*
0
50
100
150
200
250
BRP RMC
BSAAGE
GM3 synthase%
du c
ontrô
le
*
*
0
50
100
150
200
250
BRP RMC
BSAAGE
GM3 synthase B
0
20
40
60
80
100
120
**
%du
con
trôle
BSAAGE
BRP RMC
GD3 synthaseB
0
20
40
60
80
100
120
**
%du
con
trôle
BSAAGE
BRP RMC
GD3 synthase
Figure 41 : Les AGE augmentent l'activité GM3 synthase et diminuent l'activité GD3 synthase. BRP et RMC ont été
cultivés en présence de 3 µM de BSA contrôle ou d’AGE pendant un passage. Les activités enzymatiques GM3 (A) et
GD3 (B) synthase ont été mesurées sur les homogénats cellulaires comme décrit dans la partie Matériel et Méthodes.
En conditions contrôle, l’activité GM3 synthase était de 2.7 et 5.1 pmoles/h/mg de protéines et l’activité GD3 synthase
de 0.8 et 0.7 pmoles/h/mg de protéines, respectivement dans les BRP et RMC. Les résultats sont exprimés en % du
contrôle BSA et représentent la moyenne ± SEM de 4-5 expériences indépendantes. *p<0,05 comparé au contrôle BSA.
Ces observations suggèrent que les AGE exercent des actions communes dans les
péricytes et dans les cellules mésangiales. Ainsi, le traitement par les AGE modifie le profil en
gangliosides des deux types cellulaires, notamment en modulant les activités de leurs enzymes
de biosynthèse.
Ces résultats indiquent que les AGE induisent une diminution de la prolifération cellulaire,
concomitante à une augmentation des gangliosides de la série a, et ce dans les deux types cellulaires
BRP et RMC. Les gangliosides étant connus pour moduler la prolifération cellulaire,
l’augmentation des gangliosides de la série-a pourrait ainsi constituer un mécanisme commun par
lequel les AGE diminuent la prolifération des péricytes et des cellules mésangiales. Différentes
approches ont alors été mises en œuvre pour tester cette hypothèse.
127
III. IMPLICATION DES GANGLIOSIDES DANS LA
DIMINUTION DE LA PROLIFERATION CELLULAIRE CAUSEE
PAR LES AGE
1. EFFET D’UN TRAITEMENT PAR DES GANGLIOSIDES EXOGENES SUR LA
PROLIFERATION DES PERICYTES ET DES CELLULES MESANGIALES De nombreuses données de la littérature montrent que les gangliosides, et en particulier ceux de la
série-a, inhibent la croissance cellulaire. L’utilisation de gangliosides exogènes est courante dans
ces études et il a été rapporté qu’au moins une partie de ces gangliosides exogènes apportés aux
cellules dans le milieu de culture s’incorpore dans la membrane plasmique (Bremer E.G. et al.,
1984). L’effet sur la prolifération cellulaire des différents gangliosides de la série-a, augmentés en
réponse aux AGE, a donc été étudié.
Dans ce but, les cellules ont été traitées par des doses croissantes de GM3, GM2, GM1 ainsi que de
leurs précurseurs non sialylés, Glucosylcéramide et Lactosylcéramide, utilisés comme contrôles,
sous forme de complexe avec la BSA. La prolifération cellulaire a ensuite été évaluée par dosage de
la quantité totale de protéines et par mesure de la quantité d’ADN.
La figure 42 montre que les gangliosides testés inhibent la prolifération des BRP, de manière
dose-dépendante, alors que Glucosylcéramide et Lactosylcéramide sont sans effet. L’inhibition de
prolifération est observée à partir d’une concentration de 50 µM et semble plus efficace avec les
gangliosides GM2 et GM1, atteignant 25 % à une concentration de 100 µM. Les résultats obtenus
en utilisant le test du CyQuant (Figure 42B) sont conformes bien que plus modérés.
128
BA
% d
u co
ntrô
le
0
20
40
60
80
100
120
140
contrôle GM3 GM2 GM1 GlucCer LacCer
10µM 50µM 100µM
% d
u co
ntrô
le
0
20
40
60
80
100
120
140
contrôle GM3 GM2 GM1 GlucCer LacCer
10µM 50µM 100µM
** **
** *
**
BA
% d
u co
ntrô
le
0
20
40
60
80
100
120
140
contrôle GM3 GM2 GM1 GlucCer LacCer
10µM 50µM 100µM
% d
u co
ntrô
le
0
20
40
60
80
100
120
140
contrôle GM3 GM2 GM1 GlucCer LacCer
10µM 50µM 100µM
BA
% d
u co
ntrô
le
0
20
40
60
80
100
120
140
0
20
40
60
80
100
120
140
contrôle GM3 GM2 GM1 GlucCer LacCer
10µM10µM 50µM50µM 100µM100µM
% d
u co
ntrô
le
0
20
40
60
80
100
120
140
contrôle GM3 GM2 GM1 GlucCer LacCer
10µM 50µM 100µM10µM10µM 50µM50µM 100µM100µM
** **
** *
**
Figure 42 : L’ajout exogène de gangliosides de la série a diminue la prolifération des BRP. Différentes doses de
complexes glycolipides-BSA ont été ajoutées au milieu de culture pendant un passage. Les protéines totales (A) et
l'ADN (B) ont ensuite été mesurés. Les résultats sont exprimés en % du contrôle et représentent la moyenne ± SEM de 5
expériences indépendantes réalisées en triplicats. *p<0,05 comparé au contrôle.
Dans les cellules mésangiales, les gangliosides testés exercent également un effet anti-
prolifératif contrairement aux Glucosylcéramide et Lactosylcéramide qui restent sans effet (Figure
43). L’effet est observé à partir d’une concentration de 50 µM et l’inhibition de prolifération atteint
25-30 % à 100 µM. Les résultats obtenus par le test du CyQuant confirment cet effet d’inhibition de
la prolifération exercé par les gangliosides exogènes.
Figure 45 : L’utilisation de PPMP réduit l’inhibition de prolifération causée par les AGE dans les péricytes. Les
cellules ont été exposées à 3 µM d’AGE en présence de doses croissantes de PPMP pendant un passage. Après rinçage
et lyse des cellules, les protéines totales ont été mesurées. Les résultats sont exprimés en µg de protéines par puits et
représentent la moyenne ± SEM de 5 expériences indépendantes réalisées en triplicats. *p<0,05 comparé aux cellules
traitées avec AGE seul.
Par contre, aucun effet protecteur du PPMP n'a été observé dans les RMC. Une explication
potentielle à ces résultats pourrait être l'accumulation de produits en amont de la voie de
biosynthèse des gangliosides consécutivement au blocage de la glucosylcéramide synthase. Par
exemple, les céramides, n'étant plus utilisés pour la synthèse des gangliosides, peuvent s'accumuler
ou être utilisés par d'autres voies pour produire notamment de la sphingosine, connue pour son
caractère anti-prolifératif (Geoffroy K. et al., 2004). La mise en place de ces voies alternatives dans
les RMC pourrait contre-carrer l'effet protecteur d'une inhibition de la synthèse des gangliosides par
le PPMP. D’autre part, il est également possible que la captation du PPMP soit différente dans les
BRP et les RMC. Ces résultats suggèrent par ailleurs que l’effet d’un tel agent pharmacologique
peut varier en fonction du type cellulaire considéré.
132
4. EFFET DE LA TRANSFECTION AVEC UN SIRNA DE GM3 SYNTHASE Dans les cellules mésangiales, une dernière approche a été envisagée, consistant à inhiber la
biosynthèse des gangliosides à l’aide de la technique des SiRNA. L’activité GM3 synthase a donc
été inhibée par la transfection des cellules avec un SiRNA spécifique.
Dans un premier temps, l’activité GM3 synthase a été mesurée dans les cellules suite à une
transfection avec des doses croissantes de SiRNA (Figure 46A). Cette expérience de dose-réponse a
permis de montrer que le SiRNA utilisé inhibe effectivement l’activité de l’enzyme et ce, de façon
dépendante de la dose et à hauteur d’environ 50 % pour une dose de 400 nM. Cette dose a été
choisie afin d’éviter les effets aspécifiques ou toxiques qui pourraient survenir à une dose plus forte.
Ensuite, la prolifération des RMC transfectées a été mesurée en réponse au traitement avec la BSA
contrôle ou les AGE. Les résultats présentés en Figure 46B indiquent que l’inhibition de l’activité
GM3 synthase à l’aide des SiRNA protège partiellement les RMC des effets anti-prolifératifs des
AGE. L’inhibition partielle de l’activité GM3 synthase obtenue par la transfection (50 %) peut
contribuer à expliquer l’effet protecteur assez faible de cette transfection contre les effets des AGE.
De plus, il faut signaler que les effets des AGE sont plus faibles comparés aux expériences
précédentes car les cellules ont été traitées à un état de confluence plus fort pour améliorer
Figure 46 : La transfection avec un SiRNA spécifique de la GM3 synthase protège partiellement les RMC de
l’inhibition de prolifération causée par les AGE. (A) Les cellules ont été transfectées avec des doses croissantes de
SiRNA et l’activité GM3 synthase a été mesurée sur les lysats cellulaires après 72h. Ctr, cellules transfectées en
présence d’oligofectamine mais sans SiRNA. (B) 24h après transfection avec 400 nM de SiRNA, les cellules ont été
traitées avec 3 µM de BSA ou d’AGE. Au terme du traitement, les cellules ont été rincées, lysées et la quantité totale de
protéines mesurée. Les résultats sont exprimés en % du contôle BSA et représentent la moyenne ± SEM de 6
expériences indépendantes. *p<0,05 comparé aux cellules contrôle (Ctr) traitées avec AGE.
133
Ces observations confirment clairement l’implication de la GM3 synthase et des gangliosides
de la série-a dans l’inhibition de prolifération des cellules mésangiales causée par les AGE.
IV. DISCUSSION
Cette première partie du travail expérimental porte sur les AGE, produits s’accumulant dans un
environnement diabétique. Ces produits de glycation avancés se retrouvent notamment dans le rein
et la rétine de patients diabétiques et sont connus pour jouer un rôle important dans le
développement de la rétinopathie et la néphropathie diabétiques. Les AGE utilisés ont été préparés
par modification de l'albumine par le méthylglyoxal. Ces AGE-méthylglyoxal ont été observés dans
les protéines tissulaires chez le diabétique et sont donc représentatifs d'AGE s'accumulant in vivo au
cours du diabète (Degenhardt T.P. et al., 1998; Shamsi F.A. et al., 1998). Par ailleurs, le traitement
avec les AGE a été réalisé à une concentration déjà décrite pour induire des modifications du
métabolisme et de la prolifération cellulaire (Chibber R. et al., 1997; Yamagishi S. et al., 2002b;
Yamagishi S. et al., 2002a), notamment par notre équipe (Denis U. et al., 2002; Natalizio A. et al.,
2001).
Dans un premier temps, nous avons évalué l'effet des AGE sur la prolifération des BRP et
des RMC. Les résultats ont montré que le traitement avec les AGE inhibe la prolifération des deux
types cellulaires d'intérêt. Ces observations sont en accord avec celles de précédentes études
utilisant d'autres types d'AGE à la fois dans les péricytes (Chibber R. et al., 1997; Yamagishi S. et
al., 2002a) et les cellules mésangiales (Yamagishi S. et al., 2002b; Ziyadeh F.N. et al., 1993). Nous
n’avons pas exploré ici les mécanismes responsables de la diminution de prolifération mesurée.
Cependant, Denis et al. ont montré que les AGE sont capables d’induire l’apoptose des péricytes
rétiniens, même si ce processus n’est pas responsable à lui-seul de l’inhibition de prolifération
exercée par les AGE sur les péricytes (Denis U. et al., 2002).
Dans un deuxième temps, l'effet des AGE sur le profil en gangliosides a été étudié. Les
résultats indiquent que le traitement avec les AGE provoque une augmentation des gangliosides de
la série-a (GM3, GM2, GM1) parallèlement à une diminution des gangliosides de la série-b (GD3),
et ce dans les deux types cellulaires. Ces modifications peuvent s'expliquer par l'augmentation de
l'activité GM3 synthase et la diminution de l'activité GD3 synthase observées en réponse aux AGE.
134
L’augmentation de l’activité GM3 synthase se fait très certainement via une augmentation du Vmax
de la réaction plutôt que du Km (résultats non présentés). Ces résultats révèlent que les AGE sont
capables d’induire des effets opposés sur ces deux sialyltransférases et suggèrent qu’ils peuvent
réguler spécifiquement l'activité des enzymes de biosynthèse des gangliosides. Cependant ces
mécanismes de régulation n'ont pas encore été étudiés. Certaines données de la littérature nous
permettent tout de même de formuler une hypothèse. Il a en effet été montré que la liaison des AGE
au RAGE génère un stress oxydant capable d’activer des facteurs de transcription parmi lesquels
Sp1 (Du X.L. et al., 2000). Par ailleurs des analyses du promoteur du gène de la GM3 synthase
humaine ont révélé que sa transcription était positivement régulée par le facteur Sp1 (Zeng G. et al.,
2003). L'expression de RAGE ayant été décrite dans les BRP (Yamagishi S. et al., 2002a; Yonekura
H. et al., 2003) et dans les RMC (Vlassara H., 2001), il est envisageable que les AGE modulent
l'activité des enzymes GM3 et GD3 synthase en régulant leur expression génétique via la voie de
signalisation de RAGE.
Les investigations menées par la suite ont visé à vérifier si les gangliosides de la série-a,
dont les taux se trouvent augmentés en réponse aux AGE, peuvent être des médiateurs des effets
anti-prolifératifs de ces AGE.
Tout d'abord, nous avons étudié l’effet des gangliosides exogènes sur la prolifération des
deux types cellulaires. Le traitement des cellules par les gangliosides GM3, GM2 et GM1 induit une
diminution de la croissance des BRP et des RMC. Ces observations révèlent un effet anti-
prolifératif des gangliosides testés dans nos deux modèles cellulaires. L'inhibition de la prolifération
atteint un maximum de 25-30 % pour une dose de 100 µM. Cet effet relativement faible des
gangliosides exogènes peut s'expliquer par des données sur leur comportement au sein de la cellule.
Ainsi, même si l'addition exogène de gangliosides est utilisée dans de nombreuses études pour
déterminer leur rôle dans la régulation de la prolifération cellulaire, leur comportement dans la
cellule est assez mal connu. Cependant, un certain nombre de travaux anciens ont étudié leur
intégration dans la membrane cellulaire. Bremer et al. ont par exemple montré en utilisant des
gangliosides marqués au tritium, qu'environ 10-20 % des gangliosides ajoutés au milieu de culture
s'associent à la cellule et que, au bout de 48 h, 70 % de ces gangliosides associés sont effectivement
insérés dans la bicouche lipidique. Ces proportions n'étaient pas différentes quelque soit le
ganglioside testé (Bremer E.G. et al., 1984).
Une approche complémentaire a ensuite consisté à utiliser des anticorps dirigés contre les
gangliosides de la série a, GM3, GM2 et GM1, et destinés à bloquer leur action. Le traitement des
cellules avec les AGE en présence de ces anticorps s'est révélé protéger partiellement les BRP et les
RMC de la chute de prolifération causée par les AGE. Ces résultats supportent l'implication des
135
gangliosides dans les effets anti-prolifératifs des AGE. Le caractère partiel de la protection exercée
par les anticorps peut provenir du fait que ces anticorps n'accèdent pas complètement au
compartiment de gangliosides actifs. D'autre part, cela peut également signifier que d'autres voies
sont en cause. Par exemple, de précédents travaux menés au laboratoire ont permis de proposer une
cascade impliquant le stress oxydant, l'accumulation de céramides et les caspases pour expliquer
l'apoptose des péricytes en réponse aux AGE (Denis U. et al., 2002).
Par ailleurs, le PPMP, un inhibiteur de la glucosylcéramide synthase, a été utilisé pour
bloquer l'augmentation de la biosynthèse des gangliosides de la série-a qui s’opère en réponse aux
AGE. L’addition de PPMP a permis de protéger partiellement les BRP de la chute de prolifération
induite par les AGE. Là encore, ces observations soutiennent l’hypothèse du rôle de médiateurs des
effets des AGE des gangliosides. La protection partielle exercée par le PPMP suggère, comme déjà
évoqué, l'existence d'autres voies d'action des AGE sur la prolifération cellulaire.
Enfin, nous avons eu recours à la technique des SiRNA pour inhiber spécifiquement
l’activité GM3 synthase et donc l’augmentation de la biosynthèse des gangliosides observée en
réponse aux AGE. La transfection des cellules mésangiales avec un SiRNA spécifique de la GM3
synthase a partiellement protégé les cellules de la diminution de prolifération causée par les AGE.
Ce résultat confirme de manière plus directe l’implication des gangliosdies dans l’inhibition de
prolifération causée par les AGE.
L'ensemble des résultats obtenus par ces différentes approches, conforte l'hypothèse que les
gangliosides de la série-a peuvent effectivement participer à l'effet anti-prolifératif des AGE sur les
BRP et les RMC. Notons que les gangliosides ont déjà été décrits comme inhibiteurs endogènes de
la croissance de cellules mésangiales (Tsuboi N. et al., 2001). Ce rôle est en plus conforté par de
nombreux travaux montrant que les gangliosides, particulièrement de la série-a, diminuent la
prolifération de différents types cellulaires, en interagissant avec la signalisation de facteurs de
croissance. Par exemple, Bremer et al. ont montré que l'ajout exogène de GM3 et GM1 diminue la
prolifération de lignées cellulaires humaines de carcinome d’épiderme en inhibant la
phosphorylation du récepteur à l'EGF (Bremer E.G. et al., 1986). De plus, une croissance accélérée
et une autophosphorylation accrue du récepteur à l'EGF ont été montrées dans des lignées
cellulaires transfectées avec un gène codant une sialidase, diminuant le taux de GM3 (Meuillet E.J.
et al., 1999). Les mêmes observations ont été faites dans des lignées cellulaires issues d'ovaires de
hamster et présentant un défaut dans la biosynthèse des gangliosides (Weis F.M. et al., 1990). De la
même manière, différents travaux ont indiqué que GM1 et GM2 diminuent la croissance cellulaire
en inhibant la phosphorylation ou la dimérisation du récepteur au PDGF (Hynds D.L. et al., 1995;
Van Brocklyn J. et al., 1993). Enfin, des lignées cellulaires Swiss 3T3 surexprimant le GM1 ont
136
révélé une prolifération ralentie et une diminution de la phosphorylation du récepteur au PDGF
(Mitsuda T. et al., 2002).
En conclusion, les résultats de cette première partie suggèrent que les gangliosides de
la série-a sont des médiateurs de l’effet anti-prolifératif des AGE à la fois dans les péricytes et
dans les cellules mésangiales. De plus, l'augmentation des gangliosides de la série-a apparaît
comme un nouveau mécanisme d'action potentiel des AGE, commun aux deux types
cellulaires.
137
L’ACTIVATION DE LA VOIE DES HEXOSAMINES
DIMINUE LA PROLIFERATION DES PERICYTES
ET DES CELLULES MESANGIALES :
IMPLICATION DES GANGLIOSIDES
Un nombre grandissant de travaux suggère l'implication de la voie des hexosamines dans la
néphropathie diabétique. Précisément, cette voie semble jouer un rôle important dans les altérations
des cellules mésangiales, comme la surproduction de matrice extracellulaire. Cependant, son rôle
dans les perturbations de la prolifération de ces cellules a été peu étudié. Il existe également très peu
d'études, sinon aucune, s'intéressant à l'implication de la voie des hexosamines dans la rétinopathie
diabétique, bien qu'un grand nombre de caractéristiques pathologiques soient communes à la
néphropathie et à la rétinopathie.
Par ailleurs, l'addition d'un résidu monosaccharidique, la N-acétylglucosamine (GlcNAc), produit
de la voie de l'hexosamine, est connue pour modifier de façon covalente des protéines cytosoliques
ou nucléaires et réguler ainsi leur activité. Les cibles potentielles de cette O-glycosylation étant
nombreuses, la voie des hexosamines pourrait interférer avec de multiples voies biochimiques. De
plus, l’UDP-GlcNAc peut être utilisée comme précurseur du CMP-acide sialique ou de l’UDP-N-
acétylgalactosamine (UDP-GalNAc) qui sont des substrats pour la biosynthèse des gangliosides.
Ainsi, ces voies métaboliques soulèvent la possibilité d'une connexion entre la voie des
hexosamines et les gangliosides.
L'objet de cette deuxième partie expérimentale a été de déterminer l'effet d'une activation de la voie
des hexosamines, mimée par un traitement avec la glucosamine, sur la prolifération et le profil en
gangliosides des péricytes et des cellules mésangiales ainsi que d'éclaircir le lien potentiel entre ces
deux éléments.
138
I. EFFETS DE LA GLUCOSAMINE SUR LA
PROLIFERATION CELLULAIRE
Péricytes et cellules mésangiales ont été cultivés durant un passage (7 et 4 jours, respectivement) en
milieu contrôle ou en présence de 2 ou 5 mM de glucosamine. A l’issue de cette période de
traitement, la prolifération cellulaire a été évaluée par comptage des cellules ainsi que par dosage
des protéines totales.
Les résultats présentés en Figure 47A montrent que la glucosamine inhibe la prolifération
des péricytes de manière dose-dépendante. A une concentration de 5 mM, le nombre de cellules
traitées est diminué de 41 % par rapport au nombre de cellules témoin. De même, la quantité de
protéines est 47 % inférieure dans les cultures traitées à la glucosamine comparée aux cultures
témoin.
La glucosamine affecte encore plus fortement la prolifération des cellules mésangiales, de manière
dose-dépendante. Un traitement avec la glucosamine diminue le nombre de cellules de 62 % et 77
% par rapport au contrôle pour des concentrations respectivement de 2 mM et 5 mM. La quantité
totale de protéines diminue également de façon dose-dépendante puisqu’elle est inférieure de 43%
et 60 % avec 2 et 5 mM, respectivement, par rapport aux cultures contrôle (Figure 47B). Il faut par
ailleurs noter que la quantité de protéines est affectée dans des proportions moindres que le nombre
de cellules. Ces résultats suggèrent une hypertrophie des cellules mésangiales en réponse à la
glucosamine, point sur lequel nous reviendrons dans la suite de l'étude.
139
%du
con
trôle
nombre de cellulesquantité de protéines
* *
A BRP
%du
con
trôle
nombre de cellulesquantité de protéines
*
*
B RMC
0
20
40
60
80
100
120
140
0 2 5glucosamine (mM)
0
20
40
60
80
100
120
0 2 5glucosamine (mM)
*
*%du
con
trôle
nombre de cellulesquantité de protéinesnombre de cellulesnombre de cellulesquantité de protéinesquantité de protéines
* *
A BRP
%du
con
trôle
nombre de cellulesquantité de protéinesnombre de cellulesnombre de cellulesquantité de protéinesquantité de protéines
*
*
B RMC
0
20
40
60
80
100
120
140
0
20
40
60
80
100
120
140
0 2 5glucosamine (mM)
0 2 50 2 5glucosamine (mM)
0
20
40
60
80
100
120
0
20
40
60
80
100
120
0 2 5glucosamine (mM)
0 2 50 2 5glucosamine (mM)
*
*
Figure 47 : La glucosamine diminue la prolifération des péricytes et des cellules mésangiales. BRP (A) et RMC (B)
ont été traités durant un passage par 0, 2 ou 5 mM de glucosamine, collectés par tripsynation puis comptés à l’aide
d’un hématimètre. La quantité totale de protéines a également été mesurée. Les résultats sont exprimés en % du
contrôle et représentent la moyenne ± SEM de 3-5 expériences indépendantes réalisées en duplicats. *p<0,05 comparé
au contrôle en absence de glucosamine.
Le traitement avec la glucosamine exerce donc un effet anti-prolifératif à la fois sur les
péricytes et sur les cellules mésangiales, comme indiqué par la baisse du nombre de cellules et
par la diminution de la quantité totale de protéines.
II. EFFETS DE LA GLUCOSAMINE SUR LE METABOLISME
DES GANGLIOSIDES
BRP et RMC ont été cultivés en milieu contrôle ou traités par 2 mM ou 5 mM de glucosamine
pendant un passage. Les gangliosides ont alors été extraits puis analysés par séparation sur plaque
HPTLC, révélation au résorcinol et autoradiographie.
140
1. EFFET DE LA GLUCOSAMINE SUR LE PROFIL EN GANGLIOSIDES DES PERICYTES Comme le montre la Figure 48, des modifications importantes du profil en gangliosides surviennent
dans les BRP, en réponse au traitement avec la glucosamine. L’analyse des taux de gangliosides
(Figure 48A) révèle une diminution des quantités de GM3 d'environ 40 % par rapport au contrôle
aux deux concentrations de glucosamine, une augmentation des quantités de GM1 de 60 % à 2 mM
et de 70 % à 5 mM, ainsi qu'une augmentation de 70 % des quantités de GD3 ne survenant qu'à une
concentration de 5 mM de glucosamine. Les résultats obtenus par autoradiographie sont conformes,
avec cependant une dose-dépendance plus marquée (Figure 48B).
% d
u co
ntrô
le
GM3 GM1GD3
B
% d
u co
ntrô
le
GM3 GM1GD3
* *
*
A
0
50
100
150
200
250
0 2 5glucosamine (mM)
0
50
100
150
200
250
300*
0 2 5glucosamine (mM)
**
% d
u co
ntrô
le
GM3 GM1GD3
B
% d
u co
ntrô
le
GM3 GM1GD3
* *
*
A
0
50
100
150
200
250
0 2 5glucosamine (mM)
0
50
100
150
200
250
300*
0 2 5glucosamine (mM)
% d
u co
ntrô
le
GM3 GM1GD3GM3 GM1GD3
B
% d
u co
ntrô
le
GM3 GM1GD3GM3 GM1GD3
* *
*
A
0
50
100
150
200
250
0 2 5glucosamine (mM)
0 2 5glucosamine (mM)
0
50
100
150
200
250
300*
0 2 5glucosamine (mM)
0 2 5glucosamine (mM)
**
Figure 48 : La glucosamine modifie le profil en gangliosides des péricytes rétiniens. Les cellules ont été cultivées en
milieu contrôle ou en présence de 2 mM ou 5 mM de glucosamine durant 7 jours puis collectées. Les gangliosides,
métaboliquement marqués par le 14C galactose, ont alors été extraits, purifiés et analysés par HPTLC. Ils ont été
révélés à la fois par pulvérisation de résorcinol (A) et par autoradiographie (B) puis quantifiés par densitométrie. (A)
En conditions contrôle, les quantités de GM3, GM1 et GD3 étaient respectivement de 2.75 ± 0.30, 0.58 ± 0.20, et 1.27 ±
0.28 µg/mg de protéines. Les résultats sont exprimés en % du contrôle en absence de glucosamine et représentent la
moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes réalisées en duplicats. *p<0,05 comparé au contrôle en absence de
glucosamine.
2. EFFET DE LA GLUCOSAMINE SUR LE PROFIL EN GANGLIOSIDES DES CELLULES
MESANGIALES Le profil en gangliosides des RMC est également très affecté par le traitement avec la glucosamine
(Figure 49). La quantité de GM3 augmente en réponse à 2 mM de glucosamine mais semble rester
stable à 5 mM. La quantité de GD1a est augmentée en réponse au traitement d'environ 30 % par
141
rapport au contrôle à 2 mM et 50 % à 5 mM. Le GD3, quant à lui, devient indétectable dès 2 mM de
glucosamine. L'autoradiographie confirme la disparition du GD3 et indique en revanche une
diminution du GM3 radioactif par rapport au contrôle (Figure 49C). Ceci suggère qu’une quantité
moindre de GM3 a été synthétisée dans les cellules traitées pendant le "pulse" de marquage
métabolique, ce qui est d’ailleurs conforme à la diminution d’activité GM3 synthase mesurée en
réponse à la glucosamine (paragraphe suivant). Cette diminution de flux ne se manifeste cependant
pas immédiatement sur les quantités de GM3, probablement à cause de la masse importante que
représente ce ganglioside.
Les taux de gangliosides GM1 et surtout GM2 subissent des variations beaucoup plus
spectaculaires (Figure 49B). Ces espèces, quasiment indétectables dans les cellules témoin,
atteignent 2.37 et 0.70 µg/mg de protéines, représentant ainsi respectivement 24 % et 7 % de tous
les gangliosides détectés dans les cellules traitées avec 5 mM de glucosamine. Cette forte
augmentation de GM2 et GM1 est également nettement visible par analyse des gangliosides
marqués (Figure 49D). Etant donné que ces deux gangliosides sont absents dans les cellules
contrôle, nous avons voulu vérifier leur identité. Après séparation sur plaque HPTLC, les
gangliosides ont été révélés par immunocytochimie en utilisant un anticorps spécifique dirigé contre
GM2 (don généreux du Dr J. Portoukalian) et la sous-unité β de la toxine cholérique, spécifique du
GM1.
142
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 2 5glucosamine (mM)
%du
con
trôle
GM3 GD1aGD3
0 2 5glucosamine (mM)
GM2 GM1
GM3 GD1aGD3
0
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40
60
80
100
120
140
160
180
0 2 5glucosamine (mM)
%du
con
trôle
0
100
200
300
400
500
600
700
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0 2 5glucosamine (mM)
%du
con
trôle
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B D
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0
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3
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des
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s
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*
*
*
*
*
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0 2 5glucosamine (mM)
%du
con
trôle
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0 2 5glucosamine (mM)
GM2 GM1
GM3 GD1aGD3
0
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40
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140
160
180
0 2 5glucosamine (mM)
%du
con
trôle
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0 2 5glucosamine (mM)
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140
160
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0 2 5glucosamine (mM)
%du
con
trôle
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0 2 5glucosamine (mM)
GM2 GM1
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120
140
160
180
0 2 5glucosamine (mM)
%du
con
trôle
0
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0
100
200
300
400
500
600
700
800GM2 GM1GM2 GM1
0 2 5glucosamine (mM)
%du
con
trôle
0 2 5glucosamine (mM)
%du
con
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A C
B D
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2
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µg g
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des
/ mg
prot
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s
ND
*
*
*
*
*
Figure 49 : La glucosamine modifie le profil en gangliosides des cellules mésangiales. Les cellules ont été cultivées
en milieu contrôle ou en présence de 2 mM ou 5 mM de glucosamine durant 4 jours puis collectées. Les gangliosides,
métaboliquement marqués par le 14C galactose, ont alors été extraits, purifiés et analysés par HPTLC. Ils ont été
révélés à la fois par pulvérisation de résorcinol (A, B) et par autoradiographie (C, D) puis quantifiés par densitométrie.
En conditions contrôle, les quantités de GM3, GD3 et GM1 étaient respectivement de 3.96 ± 0.32, 0.27 ± 0.05, et 1.23 ±
0.16 µg/mg de protéines. Les résultats représentent la moyenne ± SEM de 5 expériences indépendantes réalisées en
duplicats. *p<0,05 comparé au contrôle en absence de glucosamine.
Nous pouvons déduire de ces résultats que la glucosamine affecte le métabolisme et modifie le
profil en gangliosides des péricytes et des cellules mésangiales. Les gangliosides de la série-a,
GM1 dans les BRP et GM1 et GM2 dans les RMC, sont augmentés en réponse à la
glucosamine. Cependant, le ganglioside de la série-b GD3 subit des modifications spécifiques
du type cellulaire, augmentation dans les BRP et diminution dans les RMC.
143
III. EFFET DE LA GLUCOSAMINE SUR L’ACTIVITE GM3
SYNTHASE
Les gangliosides de la série-a étant augmentés dans les deux types cellulaires en réponse à 5 mM de
glucosamine, l'activité GM3 synthase a été mesurée afin d'éclaircir les mécanismes sous-tendant ces
variations.
Les résultats présentés en Figure 50A montrent que le traitement avec la glucosamine induit
une augmentation de l'activité GM3 synthase d'environ 160 % dans les BRP. L'augmentation de
l'activité de cette enzyme limitante pour la biosynthèse de l’ensemble des gangliosides, est
compatible avec l'augmentation des taux de GM1 et de GD3 observée en réponse à la glucosamine.
En revanche, une diminution du taux de GM3 a été mesurée malgré cette augmentation de l'activité
GM3 synthase. GM3 étant le précurseur des gangliosides plus complexes, ceci suggère qu'il a été
métabolisé en GM1 et GD3, tous les deux fortement augmentés en réponse au traitement.
L'augmentation de la biosynthèse de GM3 consécutive à une augmentation de l'activité GM3
synthase ne suffirait pas à compenser sa consommation pour la biosynthèse accrue de GM1 et GD3.
Contrairement à ce qui est attendu, l'activité GM3 synthase est diminuée d'environ 50 %
dans les RMC traitées à la glucosamine (Figure 50B). On observe cette diminution d'activité malgré
une augmentation massive des taux de GM2 et de GM1, produits indirects de cette enzyme. Une
explication possible serait que ces produits, fortement augmentés, exercent un rétrocontrôle négatif
sur la GM3 synthase puisqu'un rétrocontrôle négatif de l’activité des enzymes de biosynthèse des
gangliosides a été décrite in vitro (Yusuf H.K. et al., 1987). Une analyse cinétique aurait été
nécessaire pour vérifier cette hypothèse. L’activité GD3 synthase n’a pas été mesurée en réponse à
la glucosamine. Les modifications des gangliosides des RMC étant similaires suite au traitement
avec la glucosamine et avec les AGE (augmentation des gangliosides de la série-a et diminution du
GD3), il est probable que l’activité GD3 synthase soit diminuée en réponse à la glucosamine
comme elle l’est en réponse aux AGE.
144
A BRP B RMC*
0
50
100
150
200
250
300
350%
du c
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le
0 5glucosamine (mM)
0
20
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trôle
0 5glucosamine (mM)
*
A BRP B RMC*
0
50
100
150
200
250
300
350%
du c
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le
0 5glucosamine (mM)
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0 5glucosamine (mM)
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20
40
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%du
con
trôle
0 5glucosamine (mM)
%du
con
trôle
0 5glucosamine (mM)
0 5glucosamine (mM)
*
Figure 50 : La glucosamine modifie l'activité GM3 synthase des péricytes et des cellules mésangiales. Les BRP (A) et
les RMC (B) ont été traitées avec 5 mM de glucosamine pendant un passage. L’activité GM3 synthase a été mesurée sur
les homogénats cellulaires comme décrit dans la partie Matériel et Méthodes. En conditions contrôle, l’activité GM3
synthase était de 2.7 et 5.1 pmoles/h/mg de protéines respectivement dans les BRP et RMC. Les résultats sont exprimés
en % du contrôle et représentent la moyenne ± SEM de 5-8 expériences indépendantes. *p<0,05 comparé au contrôle.
Les résultats présentés ci-dessus indiquent que le traitement avec la glucosamine inhibe la
prolifération des BRP et des RMC. Il occasionne parallèlement des modifications spécifiques
du profil en gangliosides dans les deux types cellulaires, dont certaines sont communes
(augmentation des gangliosides de la série-a) et d’autres opposées (GD3). Partant de ces
résultats, des expériences ont ensuite été menées afin de déterminer si ces modifications des
gangliosides pouvaient participer à l'inhibition de prolifération induite par la glucosamine.
145
IV. IMPLICATION DES GANGLIOSIDES DANS LA
DIMINUTION DE PROLIFERATION CELLULAIRE CAUSEE PAR
LA GLUCOSAMINE
1. EFFET D’UN TRAITEMENT PAR LES GANGLIOSIDES EXOGENES SUR LA
PROLIFERATION DES PERICYTES ET DES CELLULES MESANGIALES Les gangliosides ont été décrits comme des modulateurs, et le plus souvent des inhibiteurs, de la
croissance cellulaire. L’effet sur la prolifération cellulaire des différents gangliosides augmentés en
réponse à la glucosamine a donc été étudié.
Pour cela, des concentrations croissantes de gangliosides ainsi que de leurs précurseurs non sialylés,
Glucosylcéramide et Lactosylcéramide, utilisés comme contrôles, ont été ajoutées au milieu de
culture, sous la forme de complexe avec la BSA. La prolifération a ensuite été évaluée par dosage
de la quantité totale de protéines et par mesure de la quantité d’ADN.
La Figure 51 montre que les gangliosides testés inhibent la prolifération des BRP, de
manière dose-dépendante, alors que Glucosylcéramide et Lactosylcéramide sont sans effet.
L’inhibition de prolifération, dose-dépendante atteint environ 25 % à une concentration de 100 µM.
Les résultats obtenus par la technique du CyQuant sont conformes (Figure 51B) bien qu’atténués.
146
BA%
du
cont
rôle
0
20
40
60
80
100
120
140
contrôle GM1 GD3 GlucCer LacCer
10µM 50µM 100µM
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u co
ntrô
le
0
20
40
60
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100
120
140 10µM 50µM 100µM
contrôle GM1 GD3 GlucCer LacCer
* ** * * *
BA%
du
cont
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0
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contrôle GM1 GD3 GlucCer LacCer
10µM 50µM 100µM
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0
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140 10µM 50µM 100µM
contrôle GM1 GD3 GlucCer LacCer
BA%
du
cont
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0
20
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60
80
100
120
140
contrôle GM1 GD3 GlucCer LacCer
10µM 50µM 100µM10µM10µM 50µM50µM 100µM100µM
% d
u co
ntrô
le
0
20
40
60
80
100
120
140
0
20
40
60
80
100
120
140 10µM 50µM 100µM10µM10µM 50µM50µM 100µM100µM
contrôle GM1 GD3 GlucCer LacCer
* ** * * *
Figure 51 : Le traitement par le GM1 et le GD3 diminue la prolifération des BRP. Différentes concentrations de
complexes glycolipides-BSA ont été ajoutées au milieu de culture pendant un passage. Les protéines totales (A) et
l'ADN (B) ont ensuite été mesurés. Les résultats sont exprimés en % du contrôle et représentent la moyenne ± SEM de 4
expériences indépendantes réalisées en triplicats. *p<0,05 comparé au contrôle. Les histogrammes des GM1, GlucCer
et LacCer sont empruntés à la Figure 42.
Dans les cellules mésangiales, les gangliosides testés exercent également un effet anti-
prolifératif contrairement aux Glucosylcéramide et Lactosylcéramide qui restent sans effet (Figure
52). L’inhibition de prolifération apparaît maximale dès 50 µM et atteint environ 30 %. Cet effet est
confirmé par les résultats obtenus avec la mesure de la quantité d'ADN (Figure 52B).
Figure 52 : Le traitement par les GM2, GM1 et GD1a diminue la prolifération des RMC. Différentes doses de
complexes glycolipides-BSA ont été ajoutées au milieu de culture pendant un passage. Les protéines totales (A) et la
quantité d'ADN (B) ont ensuite été mesurées. Les résultats sont exprimés en % du contrôle et représentent la moyenne ±
SEM de 4-6 expériences indépendantes réalisées en triplicats. *p<0,05 comparé au contrôle. Les histogrames des
GM2, GM1, GlucCer et LacCer sont empruntés à la Figure 43.
Ces résultats révèlent un effet anti-prolifératif des gangliosides augmentés suite au traitement
avec la glucosamine dans les péricytes et les cellules mésangiales. Ils suggèrent ainsi qu'ils
pourraient être impliqués dans la diminution de prolifération cellulaire observée en réponse à
la glucosamine.
2. EFFET D’UN COTRAITEMENT GLUCOSAMINE ET PPMP Le PPMP, un inhibiteur de glucosylcéramide synthase, a été utilisé pour bloquer l’augmentation des
gangliosides causée par le traitement et vérifier ainsi leur implication dans les effets de la
glucosamine.
BRP et RMC ont été traités avec la glucosamine en présence de doses croissantes de PPMP puis la
prolifération a été évaluée par dosage des protéines totales.
Dans les BRP, l'ajout de PPMP permet de réduire l'inhibition de prolifération causée par la
glucosamine. En effet, la quantité de protéines est 36 % plus importante dans les BRP traités avec la
glucosamine en présence de 1 µM de PPMP que dans les BRP traités avec la glucosamine seule
148
(Figure 53). Le caractère partiel de la protection par le PPMP suggère, comme pour les AGE, que la
glucosamine agit également par d’autres voies pour diminuer la prolifération des péricytes.
prot
éine
s(µ
g/pu
its)
PPMP (µM)
0GlcN 5 mM
* **
*
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 0 0,1 0,25 0,5 1
prot
éine
s(µ
g/pu
its)
PPMP (µM)
0GlcN 5 mM0GlcN 5 mM
* **
*
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 0 0,1 0,25 0,5 10
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 0 0,1 0,25 0,5 1
Figure 53 : L’utilisation de PPMP réduit l’inhibition de prolifération causée par la glucosamine sur les péricytes.
Les cellules ont été exposées à 5 mM de glucosamine en présence de doses croissantes de PPMP pendant un passage.
Après rinçage et lyse des cellules, les protéines totales ont été mesurées. Les résultats sont exprimés en µg de protéines
par puits et représentent la moyenne ± SEM de 6 expériences indépendantes réalisées en triplicats. *p<0,05 comparé
aux cellules traitées avec la glucosamine seule.
Par contre, aucun effet protecteur du PPMP contre les effets anti-prolifératifs de la glucosamine n'a
été observé dans les RMC, comme il a déjà été observé avec les AGE. Nous avons discuté dans la
partie précédente que la mise en place de voies biochimiques suite à l’exposition au PPMP de ces
cellules pourrait contrecarrer l'effet protecteur d’un blocage de la synthèse des gangliosides. De
plus, il est possible que la captation du PPMP soit différente en fonction du type cellulaire.
L'ensemble des résultats de cette partie révèle que la glucosamine inhibe à la fois la
prolifération des BRP et des RMC mais occasionne des modifications des gangliosides
différentes en fonction du type cellulaire. Ils conduisent à l’hypothèse que l'inhibition de la
prolifération observée dans les BRP et les RMC en réponse à la glucosamine pourrait
impliquer les gangliosides. Notamment, nous avons noté dans les cellules mésangiales, une
augmentation massive des quantités de GM1 et GM2. Par la suite, nous avons choisi
149
d'explorer plus en détails les mécanismes spécifiques par lesquels la glucosamine inhibe la
prolifération des RMC et la place de ces deux gangliosides dans ces mécanismes.
V. ETUDE DES MECANISMES CONDUISANT A
L’INHIBITION DE PROLIFERATION DES CELLULES
MESANGIALES PAR LA GLUCOSAMINE
Pour préciser ces mécanismes, nous avons réalisé des études plus détaillées en utilisant deux
concentrations de glucosamine, une faible (0,5 mM) et une forte (5 mM).
1. EFFET DE LA GLUCOSAMINE SUR L’HYPERTROPHIE DES RMC L’hypertrophie des cellules mésangiales est un processus qui contribue à l’expansion mésangiale
caractéristique de la néphropathie diabétique. Nous avons étudié ici ce phénomène en réponse à un
traitement avec la glucosamine.
Dans un premier temps, les cinétiques de croissance des RMC ont été déterminées en réponse à un
traitement avec 0,5 ou 5 mM de glucosamine. Le nombre de cellules ainsi que la quantité de
protéines ont été mesurés, permettant ainsi le calcul du rapport protéines totales / nombre de
cellules. Ce rapport est un moyen bien établi de mesurer l'hypertrophie cellulaire.
Les résultats présentés en Figure 54 indiquent que la glucosamine diminue fortement la croissance
des RMC. L’effet, visible dès 48 h, correspond à une diminution du nombre de cellules de 56 %
pour une concentration de 0,5 mM et de 85 % pour une concentration de 5 mM au terme du
traitement (Figure 54A). Cet effet est également révélé par une baisse de la quantité totale de
protéines, mais dans une moindre mesure (Figure 54B). Par conséquent, l’augmentation du rapport
protéines totales/nombre de cellules semble indiquer que la glucosamine induit l'hypertrophie des
cellules mésangiales (Figure 54C).
150
A B
0
5
10
15
20
25
30
35
40
jours0 1 2 3 4
nom
bre
de c
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les
(10*
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0
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C
4
0
10
20
30
40
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100
0 1 2 3 4jours
prot
éine
s to
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s/n
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lule
s
contrôleGlcN 0,5 mMGlcN 5 mM
contrôleGlcN 0,5 mMGlcN 5 mM
A B
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10
15
20
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jours0 1 2 3 4
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nom
bre
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les
(10*
5)contrôleGlcN 0,5 mMGlcN 5 mM
contrôleGlcN 0,5 mMGlcN 5 mM
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100
0 1 2 3 4jours
prot
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cel
lule
s
contrôleGlcN 0,5 mMGlcN 5 mM
0
10
20
30
40
50
60
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80
90
100
0 1 2 3 4jours
prot
éine
s to
tale
s/n
ombr
ede
cel
lule
s
contrôleGlcN 0,5 mMGlcN 5 mM
contrôleGlcN 0,5 mMGlcN 5 mM
contrôleGlcN 0,5 mMGlcN 5 mM
44
Figure 54 : La glucosamine inhibe la croissance des cellules mésangiales. Les cellules ont été exposées à 0,5 ou 5
mM de glucosamine pendant 4 jours. Chaque jour, des cellules ont été collectées, comptées et les protéines totales ont
été mesurées. Des courbes de croissance représentatives correspondant au nombre de cellules (A) et à la quantité totale
de protéines (B) sont présentées. Le rapport quantité de protéines / nombre de cellules exprimé en µg par 105 cellules a
également été calculé (C). 2 expériences indépendantes ont été réalisées, une seule est ici représentée.
Les effets de la glucosamine étant nets dès 48 h, les expériences ultérieures ont été menées à ce
temps de traitement afin d'éviter l'inhibition de contact survenant à confluence et pouvant gêner
l'étude des mécanismes de régulation de prolifération. Tout d'abord, la mesure du rapport protéines /
cellules a été répétée à 48 h. Il s'est avéré 1.5 et 1.8 fois plus élevé dans les cellules traitées avec 0,5
et 5 mM de glucosamine, respectivement, que dans les cellules contrôle (Figure 55A). De plus, des
photos obtenues en microscopie photonique à contraste de phase montrent clairement une
augmentation de la taille des cellules traitées avec la glucosamine, caractéristique de l'hypertrophie
(Figure 55B).
151
*
*
0
50
100
150
200
250
contrôle
% d
u co
ntrô
le
0,5 mM 5 mM
GlcN
A B
cont
rôle
0,5
mM
5m
M
Glc
N
*
*
0
50
100
150
200
250
contrôle
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u co
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0,5 mM 5 mM
GlcN
0,5 mM 5 mM
GlcN
A B
cont
rôle
0,5
mM
5m
M
Glc
N
Figure 55 : Le traitement avec la glucosamine induit l’hypertrophie des cellules mésangiales. Les cellules ont été
traitées avec 0.5 ou 5 mM de glucosamine pendant 48 h. Au terme de cette période, elles ont été rincées, collectées puis
comptées à l’aide d’un hématimètre et la quantité totale de protéines a été mesurée. Le rapport protéines totales /
nombre de cellules a ensuite été calculé (A). Les résultats sont exprimés en % du contrôle et représentent la moyenne ±
SEM de 10 expériences indépendantes. (B) Images en microscopie de phase de cellules en condition contrôle ou
traitées avec la glucosamine. *p<0,05 comparé au contrôle.
Ces résultats indiquent que la glucosamine bloque la croissance des RMC dès 48h de
traitement et induit une hypertrophie cellulaire.
2. EFFET DE LA GLUCOSAMINE SUR LE CYCLE CELLULAIRE Le blocage de la croissance cellulaire exercé par la glucosamine contribue certainement à
l'hypertrophie observée. Cette hypertrophie étant la conséquence d'une augmentation de la quantité
de protéines associée à une division cellulaire ralentie ou absente, les effets de la glucosamine sur la
progression des RMC dans le cycle cellulaire ont ensuite été étudiés.
2.1.Analyse du cycle par FACS
L'analyse du cycle cellulaire des RMC traitées ou non avec 0,5 ou 5 mM de glucosamine a été
réalisée par cytométrie de flux. Les résultats résumés dans la Figure 56A montrent qu'un traitement
152
avec 0,5 mM de glucosamine augmente la proportion de cellules en phase G0/G1 du cycle cellulaire,
passant de 58 % pour les cultures contrôles à 71 % pour les cultures traitées. Ces observations
suggèrent qu'une faible concentration de glucosamine bloque la progression des RMC à travers le
cycle cellulaire en inhibant la transition de phase G1/S, arrêtant ainsi les cellules en phase G0/G1. De
façon assez surprenante, un traitement avec une forte concentration de glucosamine (5 mM) cause
un blocage du cycle cellulaire au niveau de la phase G2/M, augmentant de 10 % la proportion de
cellules dans cette phase.
Afin de préciser cette différence, une expérience de dose-réponse a été menée. Les résultats
présentés en Figure 56B indiquent qu'une dose de glucosamine inférieure ou égale à 1 mM arrête
les cellules en phase G0/G1 alors que des concentrations plus fortes (2-5 mM) bloquent le cycle des
RMC en phase G2/M.
0
50
60
70
80
90
100
0 0,5 1 2 5
% d
e ce
llule
s da
ns le
s di
ffére
ntes
pha
ses
GlcN (mM)
G2/MSG0/G1
A B
Phase du cycle
Control 58 ± 2 22 ± 1 19 ±1
GlcN 0,5 mM 71 ± 1 13 ± 1 16 ±1
GlcN 5 mM 54 ± 1 15 ± 1 ±2
Figure 56 : La glucosamine bloque le cycle cellulaire des RMC de façon dose-dépendante. (A) Les cellules ont été
traitées avec 0,5 ou 5 mM de glucosamine pendant 48 h. Les cellules ont ensuite été collectées pour être analysées en
cytométrie de flux. Les résultats sont exprimés en % de cellules dans chaque phase du cycle et représentent la moyenne
de 5 expériences indépendantes. (B) Les cellules traitées avec des doses croissantes de glucosamine pendant 48 h ont
été analysées en cytométrie de flux. Les résultats sont exprimés en % de cellules dans chaque phase du cycle.
2.2.Effet de la glucosamine sur l’expression des inhibiteurs de kinase cycline-dépendante
Dans le but de préciser les mécanismes de l'arrêt du cycle cellulaire observé, l'expression
d'inhibiteurs de complexes cycline-kinase cycline-dépendante a été étudiée. p21Waf1/Cip1 et p27Kip1
ont été ciblés car ils sont connus pour inhiber les transitions de phase G1/S et G2/M. De plus, ces
protéines ont été impliquées dans le blocage en G0/G1 et l'hypertrophie des cellules mésangiales
29
G0/G1 S G2/M
0
50
60
70
80
90
100
0 0,5 1 2 5
% d
e ce
llule
s da
ns le
s di
ffére
ntes
pha
ses
GlcN (mM)
G2/MSG0/G1
G2/MSG0/G1
A B
Phase du cycle
Control 58 ± 2 22 ± 1 19 ±1
GlcN 0,5 mM ± 1 13 ± 1 16 ±171
GlcN 5 mM 54 ± 1 15 ± 1 ±229
G0/G1 S G2/M
153
cultivées en présence de fortes concentrations de glucose ou dans des modèles d’animaux
diabétiques.
L'expression de p21Waf1/Cip1 et p27Kip1 a donc été évaluée dans les RMC cultivées en milieu contrôle
ou en présence de 0,5 ou 5 mM de glucosamine. Les résultats présentés en Figure 57 montrent que
les deux doses de glucosamine augmentent l'expression de p21Waf1/Cip1 alors qu'elles diminuent
l'expression de p27Kip1.
A B
β-actin
p21
contrôle 0,5 5GlcN (mM)
β-actin
p27
contrôle 0,5 5GlcN (mM)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
contrôle 0,5 5
% d
u co
ntrô
le
GlcN (mM)
0
20
40
60
80
100
120
140%
du
cont
rôle
contrôle 0,5 5GlcN (mM)
A B
β-actin
p21
contrôle 0,5 5GlcN (mM)
β-actin
p21
contrôle 0,5 5GlcN (mM)
β-actin
p27
contrôle 0,5 5GlcN (mM)
β-actin
p27
contrôle 0,5 5GlcN (mM)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
contrôle 0,5 5
% d
u co
ntrô
le
GlcN (mM)
0
20
40
60
80
100
120
140%
du
cont
rôle
contrôle 0,5 5GlcN (mM)
Figure 57 : La glucosamine augmente l’expression de p21Waf1/Cip1. Les cellules ont été traitées avec.0,5 mM ou 5 mM
de glucosamine pendant 48 h. Les cellules ont alors été lavées, collectées et lysées. Des quantités égales de protéines
ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide puis transférées sur membrane PVDF. Ces membranes
ont été révélées à l'aide d'anticorps monoclonaux anti-p21 (A) ou anti-p27 (B) puis par un anticorps anti-β actine
comme décrit dans la partie Matériel et Méthodes. Des immnunoblots représentatifs ainsi que les quantifications
obtenues par analyses densitométriques des bandes de 4 expériences indépendantes sont présentés. Les résultats sont
en exprimés en % du contrôle et représentent la moyenne ± SEM. (tendance à la significativité p<0,07)
La glucosamine arrête donc la progression des RMC dans le cycle cellulaire en augmentant
spécifiquement l’expression de la protéine p21Waf1/Cip1. D’autre part, les cellules sont arrêtées
dans des phases du cycle différentes en fonction de la concentration de glucosamine,
suggérant que des voies d'action distinctes sont mises en jeu.
154
3. EFFET DE LA GLUCOSAMINE SUR LE PROFIL EN GANGLIOSIDES Dans un deuxième temps, l'effet sur le profil en gangliosides d'un traitement de 48h avec la
glucosamine a été déterminé. Des modifications importantes des quantités de gangliosides ont été
observées, semblables à celles obtenues précédemment avec un traitement de 5 mM de glucosamine
pendant un passage (Figure 58). En particulier, le GM2 et le GM1 quasiment indétectables en
conditions contrôle, subissent une très forte augmentation pour atteindre environ 1,5 et 0,4 µg/mg
de protéines, ce qui correspond respectivement à 20 % et 5 % de tous les gangliosides détectés, et
ce aux deux doses de glucosamine testées.
GlcN (mM)stds50 0,5
GT1b(std interne) origine
GM1
GM2
GM3
GD3
GD1a
GD3
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
0 0,5 5
GlcN (mM)
µg g
angl
iosi
des
/ mg
prot
éine
s
GM2GM1
A B
ND
GlcN (mM)stds50 0,5
GT1b(std interne) origine
GM1
GM2
GM3
GD3
GD1a
GD3
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
0 0,5 5
GlcN (mM)
µg g
angl
iosi
des
/ mg
prot
éine
s
GM2GM1
A B
ND
Figure 58 : La glucosamine modifie le profil en gangliosides des RMC. Les cellules ont été traitées avec 0,5 ou 5 mM
de glucosamine pendant 48 h puis collectées. Les gangliosides ont été extraits, purifiés et analysés par migration sur
plaque HPTLC et révélation au résorcinol. Une plaque HPTLC représentative (A) ainsi que les quantifications de 3-5
expériences indépendantes chacune réalisée en duplicates (B) sont présentés. Les résultats sont exprimés en µg de
gangliosides par mg de protéines et représentent la moyenne ± SEM. ND, non détecté. Les résultats obtenus ici à 48 h
de traitement avec 5 mM de glucosamine sont similaires à ceux obtenus à 4 jours de traitement.
La glucosamine induit donc une augmentation massive des gangliosides GM2 et GM1 dans les
cellules mésangiales.
La suite de l'étude s'est focalisée sur ces deux gangliosides, subissant les modifications les plus
155
remarquables et a eu pour objet de vérifier si ces gangliosides pouvaient être impliqués dans les
effets exercés par la glucosamine sur l'hypertrophie et le blocage du cycle cellulaire des RMC.
4. EFFET DE GM2 ET GM1 SUR L’HYPERTROPHIE ET LE CYCLE CELLULAIRE DES
RMC
4.1.Effet des gangliosides sur l’hypertrophie
Les cellules ont été cultivées pendant 48h en présence de 60 µM de GM2 ou GM1. Le nombre de
cellules et la quantité de protéines ont alors été mesurés et le rapport protéines / cellules a été
calculé pour évaluer l'hypertrophie.
Les résultats de la Figure 59 indiquent que l'addition de gangliosides exogènes augmente le rapport
protéines / cellules d'environ 30 % suggérant que les RMC s'hypertrophient en réponse à une
exposition au GM2 et au GM1.
**
% d
u co
ntrô
le
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
contrôle GM2 GM1
**
% d
u co
ntrô
le
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
contrôle GM2 GM1
Figure 59 : GM2 et GM1 induisent l’hypertrophie des cellules mésangiales. Les RMC ont été cultivées en présence de
60 µM de GM2 ou GM1 complexés à la BSA pendant 48 h. Les cellules ont alors été lavées, collectées puis comptées à
l’aide d’un hématimètre et la quantité totale de protéines a été mesurée. Le rapport protéines totales / nombre de
cellules a ensuite été calculé. Les conditions contrôle correspondent au milieu complet avec 10 mM de BSA / Hepes pH
7.4. Les résultats sont exprimés en % du contrôle et représentent la moyenne ± SEM de 4-6 expériences indépendantes.
*p<0.05 comparé au contrôle.
156
4.2.Effet des gangliosides sur le cycle cellulaire
Les gangliosides semblant, comme la glucosamine, induire l'hypertrophie des RMC, nous avons
ensuite cherché à déterminer si les mécanismes mis en jeu sont similaires.
Tout d'abord, le cycle cellulaire de RMC cultivées en présence de GM2 et GM1 a été
analysé par cytométrie de flux. Les résultats présentés dans le tableau ci-dessous (Fig. 60) montrent
que les gangliosides induisent une accumulation de cellules en G0/G1, suggérant un blocage au
niveau de la transition de phase G1/S, comme il a été observé en réponse à 0,5 mM de glucosamine.
G0/G1 S G2/M
Control 58±2 22±1 19±1
GM2 79±2 9 ±1 12±1
GM1 1 8 ±1 12±1
Figure 60 : GM2 et GM1 bloquent le cycle cellulaire des RMC en phase G0/G1 Les RMC ont été cultivées en présence
60 µM de GM2 ou GM1 pendant 48 h. Les cellules ont ensuite été collectées pour être analysées en cytométrie de flux.
Les conditions contrôle correspondent au milieu complet avec 10 mM de BSA / Hepes pH 7,4. Les résultats sont
exprimés en % de cellules dans chaque phase du cycle et représentent la moyenne de 5 expériences indépendantes.
L'expression des inhibiteurs du cycle cellulaire p21Waf1/Cip1 et p27Kip1 a alors été étudiée dans
les cellules en réponse à une exposition aux gangliosides. Comme illustré en Figure 61, GM2 et
GM1 causent une augmentation de l'expression de p21Waf1/Cip1 et au contraire une diminution de
l'expression de p27Kip1.
79±
Phase du cycle G0/G1 S G2/M
Control 58±2 22±1 19±1
GM2 2 9 ±1 12±179±
GM1 1 8 ±1 12±179±
Phase du cycle
157
A B
β-actin
p21
contrôle GM2 GM1
0
50
100
150
200
250
contrôle GM2 GM1
% d
u co
ntrô
le
0
20
40
60
80
100
120
140
% d
u co
ntrô
lecontrôle GM2 GM1
β-actin
p27
contrôle GM2 GM1
A B
β-actin
p21
contrôle GM2 GM1
0
50
100
150
200
250
contrôle GM2 GM1contrôle GM2 GM1
% d
u co
ntrô
le
0
20
40
60
80
100
120
140
% d
u co
ntrô
lecontrôle GM2 GM1contrôle GM2 GM1
β-actin
p27
contrôle GM2 GM1
β-actin
p27
contrôle GM2 GM1
Figure 61 : GM2 et GM1 augmentent l’expression de p21Waf1/Cip1. Les RMC ont été cultivées en présence 60 µM de
GM2 ou GM1 pendant 48 h. Les cellules ont alors été rincées, collectées et lysées. Des quantités égales de protéines ont
été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide puis transférées sur membrane PVDF. Ces membranes ont
été révélées à l'aide d'anticorps monoclonaux anti-p21 (A) ou anti-p27 (B) puis par un anticorps anti-β actine comme
décrit dans la partie Matériel et Méthodes. Des immnunoblots représentatifs ainsi que les quantifications obtenues par
analyses densitométriques des bandes de 4 expériences indépendantes sont présentés. Les résultats sont exprimés en %
du contrôle et représentent la moyenne ± SEM. (tendance à la significativité p<0,07)
Ces observations indiquent que la glucosamine à faible dose et les gangliosides GM2 et GM1
induisent l'hypertrophie et inhibent la prolifération des RMC par des mécanismes similaires,
en augmentant l'expression de p21Waf1/Cip1 et en bloquant les cellules en phase G0/G1 du cycle
cellulaire. Elles suggèrent que les gangliosides GM2 et GM1, fortement augmentés en réponse
à la glucosamine, pourraient médier les effets de la glucosamine sur les cellules mésangiales.
158
VI. DISCUSSION
Cette deuxième partie a consisté à explorer la voie des hexosamines, une des hypothèses
biochimiques proposée pour expliquer les complications microvasculaires du diabète, en particulier
la néphropathie. Elle consiste à convertir le fructose-6-P issu du glucose en glucosamine-6-P
(GlcN-6-P) via une enzyme spécifique et limitante, activée en conditions hyperglycémiques, la
glutamine: fructose-6-P-amidotransférase (GFAT). La GlcN-6-P est ensuite rapidement convertie et
activée en UDP-N-acétylglucosamine (UDP-GlcNAc), précurseur des sucres aminés nécessaires à
la biosynthèse des glycoprotéines et glycolipides et résidu utilisé pour la O-glycosylation des
protéines.
L’expression de la GFAT a été décrite dans les cellules épithéliales et mésangiales glomérulaires de
reins de patients diabétiques atteints de néphropathie (Nerlich A.G. et al., 1998). Cette voie est
souvent mise en cause dans le développement des caractéristiques pathologiques de la néphropathie
diabétique comme par exemple l’augmentation de la production de TGFβ et consécutivement de
protéines de la matrice extracellulaire (Schleicher E.D. et al., 2000). Une activité GFAT a de plus
été mesurée dans la rétine, et les quantités d'hexosamines sont augmentées dans les tissus rétiniens
d'homme et de rat diabétiques, soulignant ainsi la possibilité d'un rôle de la voie des hexosamines
dans la rétinopathie (Heath H. et al., 1967; Mazlen R.G. et al., 1970).
L’UDP-N-acétylglucosamine est un des principaux métabolites issus de la voie des hexosamines.
La glucosamine exogène est rapidement captée par les cellules via les transporteurs au glucose et
phosphorylée par l'hexokinase, entrant ainsi sélectivement dans la voie des hexosamines an aval de
l'enzyme limitante GFAT (Schleicher E.D. et al., 2000). Pour ces raisons, la glucosamine est
utilisée expérimentalement pour mimer une suractivation de la voie des hexosamines. Cependant, la
quantité de glucosamine exogène effectivement captée par les cellules varie certainement en
fonction du type cellulaire considéré. Ainsi, des différences de concentration intracellulaire en
glucosamine peuvent exister entre deux types cellulaires cultivés en présence de concentrations
extracellulaires de glucosamine identiques. Dans cette optique, même si certains résultats ont été
observés dans les deux modèles cellulaires étudiés, il faut rester prudent sur les analogies entre BRP
et RMC. Par ailleurs, la glucosamine est un agent pharmacologique puissant pouvant être toxique à
forte dose ou à long terme. Il est donc important de garder à l'esprit, lors de l'interprétation des
résultats obtenus, que ces effets toxiques potentiels peuvent masquer, dans les cellules, les effets
spécifiques de la glucosamine.
Dans un premier temps, nous avons étudié les effets d’un traitement avec la glucosamine sur
159
la prolifération cellulaire. Les résultats ont montré que la glucosamine diminue la prolifération des
péricytes et encore plus fortement celle des cellules mésangiales, de manière dose-dépendante.
Ensuite, nous avons déterminé les effets de la glucosamine sur le métabolisme des
gangliosides. Dans les BRP, les taux de GM1 et de GD3 sont augmentés, au détriment du GM3,
dont le taux diminue en réponse au traitement. Dans les RMC, une augmentation du taux des
gangliosides de la série-a, et particulièrement une très forte augmentation du GM2 et du GM1, a été
mesurée, au détriment du GD3, dont le taux est nettement diminué en réponse à la glucosamine.
Les mécanismes par lesquels la glucosamine peut affecter le métabolisme des gangliosides n’ont
pas été précisément explorés. Cependant, il est connu que la N-acétyl glucosamine peut modifier,
par une O-glycosylation simple, l’activité d’une grande variété de protéines et d’enzymes. Par
exemple, il a été montré que l’activité du facteur de transcription Sp1 peut être positivement
modulée par la liaison d’un résidu GlcNAc (Goldberg H.J. et al., 2002). Plusieurs enzymes du
métabolisme des gangliosides, notamment GM3, GD3 et GM2 synthases, présentent des sites de
liaisons potentiels à ce facteur de transcription dans leur promoteur. Il est donc possible que la
glucosamine puisse modifier les activités d’enzymes de biosynthèse des gangliosides en régulant
leur expression. Par ailleurs, il semble que les enzymes du métabolisme des gangliosides puissent
être régulées par phosphorylation (Bieberich E. et al., 1998; Gu X. et al., 1995). Or, sur certaines
protéines, O-glucosamine et O-phosphate peuvent occuper les mêmes sites (Wells L. et al., 2001). Il
est donc envisageable que ces enzymes soient directement régulées par O-glycosylation. Ces modes
de régulation pourraient expliquer l’augmentation de l’activité de la GM3 synthase observée dans
les BRP en réponse à la glucosamine. D’autre part, la glucosamine peut être convertie en différents
métabolites, notamment en acide sialique, composant caractéristique de tous les gangliosides. De
plus, la GlucNAc peut être isomérisée en N-acétylgalactosamine (GalNAc), pouvant elle-même être
incorporée dans la structure de certains gangliosides, tels le GM2 et le GM1. Il est donc probable
que la glucosamine affecte le métabolisme des gangliosides par action de masse, en fournissant des
quantités importantes de précurseurs glycosidiques utilisés comme substrats pour leur biosynthèse.
La glucosamine affecte le métabolisme des gangliosides dans les deux types cellulaires d’intérêt.
Cependant, alors que le traitement inhibe à la fois la prolifération des BRP et des RMC, les
modifications du profil en gangliosides observées en réponse à la glucosamine se sont révélées
différentes en fonction du type cellulaire considéré. Il est possible que l’augmentation des
gangliosides de la série-a (GM1 dans les BRP et GM2 et GM1 dans les RMC), facteur commun aux
deux types cellulaires, soit en partie responsable de l’inhibition de prolifération induite pat le
traitement avec la glucosamine. Il est aussi envisageable que les différents gangliosides agissent,
éventuellement selon des mécanismes distincts, en fonction du type cellulaire pour concourir à la
diminution de prolifération observée. Il a déjà été évoqué dans la partie précédente qu’un certain
160
nombre de gangliosides exercent un effet anti-prolifératif via une interaction avec la voie de
signalisation de facteurs de croissance. Par ailleurs, le GD3 principalement, a été décrit comme un
médiateur intracellulaire de l’apoptose, plus précisément pour son rôle dans la transition de
perméabilité mitochondriale, le relarguage de cytochrome c et l’activation de caspase.
L’augmentation importante de GD3 observée dans les BRP pourrait ainsi jouer un rôle primordial
dans la diminution de prolifération causée par la glucosamine, en participant à l’induction d’un
processus apoptotique. Les résultats préliminaires que nous avons obtenus en mesurant l’apoptose
dans les péricytes traités à la glucosamine (mesure de l’activité caspase 3 et détection d’une
fragmentation de l’ADN) ne vont cependant pas dans ce sens. Enfin, les gangliosides ont déjà été
impliqués, bien que plus rarement, dans la régulation du cycle cellulaire. Nakatsuji et al. ont par
exemple montré que le GM3 induit un arrêt du cycle cellulaire des astrocytes en partie via une
augmentation de l’expression de p27Kip1 (Nakatsuji Y. et al., 2001).
Dans la suite de l’étude, nous avons choisi de nous intéresser plus en détail aux mécanismes
par lesquels la glucosamine, par l’intermédiaire des gangliosides, peut inhiber la prolifération
cellulaire. Ce travail, plus mécanistique, a été mené uniquement dans les RMC.
Premièrement, les courbes de croissance des RMC en réponse à la glucosamine ont montré
un blocage assez rapide de la prolifération cellulaire. Réalisées à la fois sur le nombre de cellules et
la quantité de protéines, elles ont également mis en évidence une hypertrophie des cellules traitées.
Cette hypertrophie a également été révélée par l’augmentation de taille des cellules, aisément
remarquable par simple observation au microscope. L’hypertrophie des cellules mésangiales est une
caractéristique pathologique typique de la néphropathie diabétique. Ce phénomène a été décrit à la
fois in vivo dans les reins de rats rendus diabétiques par injection de streptozotocine ou de souris
db/db et in vitro dans des cellules mésangiales cultivées en présence de fortes concentrations de
glucose (Wolf G., 2000). Il est particulièrement important car, associé à une hypersécrétion de
protéines de la matrice extracellulaire, il participe au grossissement puis à la sclérose du glomérule,
altérations majeures de la néphropathie diabétique, étroitement corrélées aux manifestations
cliniques comme l’albuminurie, l’hypertension ou la diminution du taux de filtration glomérulaire.
D’autre part, il a été montré que cette hypertrophie est consécutive à un arrêt des cellules
mésangiales en phase G1 du cycle cellulaire. C’est pourquoi nous avons ensuite étudié le cycle
cellulaire des RMC traitées avec la glucosamine. Les résultats ont montré qu’un traitement avec une
concentration de 0,5 mM de glucosamine induit un blocage des cellules en phase G0/G1 du cycle
cellulaire, en accord avec les observations déjà faites in vivo et in vitro. Ces résultats sont les
premiers, à notre connaissance, à montrer que la glucosamine peut bloquer le cycle cellulaire et
induire l’hypertrophie des cellules mésangiales. Par contre, il s’est avéré qu’un traitement avec 5
161
mM de glucosamine cause un blocage en phase G2/M. Ces observations montrent clairement qu’une
faible et une forte concentration de glucosamine exercent des effets différents sur les RMC. Ces
différences pourraient s’expliquer à la lumière de récents travaux de Marshal et al. dans les
adipocytes (Marshall S. et al., 2004). Ces auteurs ont en effet montré que des concentrations de
glucosamine assez élevées (>2 mM) causaient une accumulation massive de GlcN-6-P, un produit
intermédiaire de la voie de l’hexosamine, accompagnée par une chute du taux d’ATP. Au contraire,
ces effets n’étaient pas observés à de plus faibles concentrations de glucosamine (0,25 mM) ou bien
à des fortes concentrations de glucose (20 mM). Ces observations ont été faites avec des adipocytes
et il est délicat de les extrapoler aux cellules mésangiales. Cependant, nous pouvons émettre
l’hypothèse qu’à 5 mM de glucosamine, d’autres mécanismes absents à des doses plus faibles, se
mettent en place, tels la déplétion en ATP, exerçant des effets délétères sur les cellules et
conduisant au blocage en phase G2/M. Il est alors probable que l’utilisation de faibles
concentrations de glucosamine soit plus adaptée pour révéler les effets spécifiques de la
glucosamine et découvrir les effets de l’hyperglycémie médiés par la voie de l’hexosamine.
Pour préciser les mécanismes responsables de l’arrêt du cycle cellulaire observé suite aux
traitements avec la glucosamine, l’expression de deux inhibiteurs de kinases cycline–dépendantes
p21Waf1/Cip1 et p27Kip1 a été évaluée. Les résultats ont montré que l’expression de p21Waf1/Cip1 est
environ triplée en réponse à la glucosamine, suggérant ainsi son rôle dans l’arrêt du cycle cellulaire
des RMC. Par contre, l’expression de p27Kip1 est plutôt diminuée par le traitement avec la
glucosamine. Une expression diminuée ou inchangée de cette protéine a déjà été décrite dans les
glomérules de modèles d’animaux diabétiques (Griffin S.V. et al., 2003; Kuan C.J. et al., 1998),
ainsi que dans des cellules mésangiales cultivées en présence de fortes concentrations de
glucose(Griffin S.V. et al., 2003). Ces résultats suggèrent que les effets de la glucosamine sur le
cycle cellulaire des RMC sont spécifiquement médiés par p21Waf1/Cip1. D’autre part, p21Waf1/Cip1 a
été décrit comme un régulateur clé de l’hypertrophie. Fan et al. ont montré que l’inhibition de cette
protéine à l’aide d’oligonucléotides antisens permet de diminuer l’hypertrophie de cellules
mésangiales induites par l’hyperglycémie et l’IGF-I (Fan Y.P. et al., 2004). De plus, in vivo, des
souris diabétiques dont le gène de p21Waf1/Cip1 a été invalidé n’ont pas développé d’hypertrophie
glomérulaire (al Douahji M. et al., 1999). Ces travaux suggèrent que l’augmentation de l’expression
de p21Waf1/Cip1 pourrait également participer aux mécanismes conduisant à l’hypertrophie des
cellules mésangiales observée ici en réponse à la glucosamine. Par ailleurs, étant donné que les
effets de la glucosamine sur les RMC sont similaires à ceux de fortes concentrations de glucose déjà
décrits dans la littérature, nous pouvons penser que les effets de l’hyperglycémie sur la croissance et
l’hypertrophie des cellules mésangiales sont, au moins en partie, médiés par la voie de
l’hexosamine et p21Waf1/Cip1.
162
Deuxièmement, nous avons déterminé l’effet sur le profil en gangliosides d’un traitement de
48h avec une concentration faible ou une concentration forte de glucosamine. Les modifications se
sont révélées similaires à celles déjà observées suite à un traitement pendant un passage, avec en
particulier une augmentation massive de GM2 et GM1. Nous avons ensuite cherché à savoir si ces
gangliosides peuvent être des médiateurs de la glucosamine, en étudiant l’effet de GM2 et GM1 sur
l’hypertrophie et le cycle cellulaire des RMC. Le traitement avec ces deux gangliosides occasionne
en effet une augmentation du rapport protéines/cellules, marqueur de l’hypertrophie. De plus,
l’analyse du cycle cellulaire des RMC exposées à GM2 ou GM1 a révélé un blocage en phase
G0/G1, associé à une augmentation de l’expression de p21Waf1/Cip1. Ainsi, le GM2 et le GM1
exogènes reproduisent l’effet d’une faible concentration de glucosamine sur l’hypertrophie et l’arrêt
du cycle cellulaire des RMC. Ces observations suggèrent que ces gangliosides sont effectivement
en cause dans les effets de la glucosamine sur les RMC et proposent la modulation des taux de
gangliosides comme un nouveau mécanisme d’action de la voie de l’hexosamine. Comme il a déjà
été signalé, très peu d’études, à part celle de Nakatsuji et al. montrant l’effet du GM3 sur l’arrêt du
cycle cellulaire des astrocytes (Nakatsuji Y. et al., 2001), ont impliqué les gangliosides dans le
cycle cellulaire. Nos résultats suggèrent non seulement le rôle de GM2 et GM1 dans le blocage du
cycle cellulaire, mais indiquent également que les gangliosides pourraient participer aux
mécanismes conduisant à l’hypertrophie cellulaire.
163
METABOLISME DES GANGLIOSIDES DU
CORTEX RENAL DE SOURIS db/db
Les résultats précédemment obtenus in vitro suggèrent que les gangliosides sont impliqués dans les
perturbations de prolifération cellulaire causées par les AGE ou une activation de la voie de
l’hexosamine. Ils soulignent ainsi le rôle potentiel des gangliosides dans les complications
microangiopathiques du diabète. Nous avons donc cherché à déterminer si le métabolisme des
gangliosides pouvait également être affecté par un environnement diabétique in vivo. Pour cela, les
activités GM3 et GD3 synthase ont été mesurées et le profil en gangliosides a été analysé sur des
homogénats de cortex de souris contrôle db/m et de souris diabétiques db/db de 11 semaines. Ces
souris obèses développent un profil diabétique type II et présentent une complication rénale
importante, proche de celle observée chez l’Homme.
I. MESURE DES ACTIVITES GM3 ET GD3 SYNTHASE
Le cortex rénal a été isolé, fragmenté puis homogénéisé. Les activités enzymatiques ont été
mesurées sur ces homogénats comme décrit dans la partie Matériel et méthodes.
Les résultats de la Figure 62 montrent que l’activité GM3 synthase est augmentée d’environ 80 %
alors que l’activité GD3 synthase est diminuée d’environ 50 % dans le cortex rénal des souris
diabétiques comparées aux souris contrôle.
164
A GM3 synthase B GD3 synthase
%du
con
trôle
contrôle db/db0
50
100
150
200
250
% d
u co
ntrô
le
*
0
20
40
60
80
100
120
contrôle db/db
*
A GM3 synthase B GD3 synthase
%du
con
trôle
contrôle db/db0
50
100
150
200
250
0
50
100
150
200
250
% d
u co
ntrô
le
*
0
20
40
60
80
100
120
0
20
40
60
80
100
120
contrôle db/dbcontrôle db/db
*
Figure 62 : Les activités GM3 et GD3 synthase sont modifiées dans le cortex rénal de souris db/db. Les activités GM3
et GD3 synthases ont été mesurées sur des homogénats de cortex rénal de souris contrôle (db/m) et de souris db/db
comme décrit dans la partie Matériel et Méthodes. Chez les souris contrôle, les activités GM3 et GD3 synthases étaient
de 0,6 et 21 pmoles/h/mg de protéines, respectivement. Les résultats sont exprimés en % du contrôle et représentent la
moyenne ± SEM de 4-6 animaux. *p<0,05 comparé au souris contrôle.
II. MESURE DES TAUX DE GM3
Les gangliosides du cortex de souris contrôle et db/db ont été extraits, purifiés puis analysés par
HPTLC et révélation au résorcinol. Le profil du cortex s’est avéré différent de celui des cellules
mésangiales. Le cortex contient en effet d’autres types cellulaires comme les cellules épithéliales ou
les podocytes, ce qui explique probablement cette différence. Le profil contient plus d’espèces de
gangliosides, moins nettement séparées et plus difficiles à identifier. C’est pourquoi seul le GM3,
majoritaire et bien identifiable, a été quantifié.
Les résultats présentés en Figure 63 mettent en évidence une augmentation, bien que non
significative, du taux de GM3 dans le cortex des souris db/db comparé aux souris contrôle. Cette
observation est conforme à l’augmentation d’activité GM3 synthase et à la diminution d’activité
GD3 synthase précédemment mesurées.
165
% d
u co
ntrô
le
contrôle db/db
0
50
100
150
200
% d
u co
ntrô
le
contrôle db/db
0
50
100
150
200
contrôle db/dbcontrôle db/db
0
50
100
150
200
0
50
100
150
200
Figure 63 : Le taux de GM3 est augmenté dans le cortex rénal de souris db/db. Les gangliosides ont été extraits
d’homogénats de cortex rénal de souris contrôle db/m et de souris db/db, puis purifiés et analysés par migration sur
plaque HPTLC et révélation au résorcinol. Les taux de GM3 représentés correspondent à la moyenne ± SEM de 4-6
animaux et sont exprimés en % du contrôle. Dans les souris contrôle, le taux de GM3 était de 66 ± 9 ng/mg de
protéines.
L’ensemble de ces résultats indique que le métabolisme des gangliosides est affecté dans le
cortex rénal des souris db/db.
III. DISCUSSION
Ces résultats obtenus ex vivo confortent l’implication des gangliosides dans la pathogénèse des
complications microangiopathiques du diabète et renforcent la signification biologique des résultats
obtenus in vitro sur les péricytes et les cellules mésangiales. Il est intéressant de noter que
l’augmentation de la GM3 synthase et du taux de GM3 ainsi que la diminution de l’activité GD3
synthase observées ici dans le cortex rénal de souris db/db ont également été observées dans les
cellules mésangiales rénales en réponse aux AGE. Les deux approches mettent particulièrement en
cause la GM3 synthase, les gangliosides de la série-a et le GM3 dans les perturbations liées au
diabète.
Peu d’études ont déjà mis en cause les gangliosides dans la microangiopathie diabétique. Zador et
al. ont rapporté une accumulation de GM3 dans les reins hypertrophiés de rats STZ. De plus, ils ont
montré que l’inhibition de la synthèse des gangliosides, par l’utilisation d’un inhibiteur de
166
glucosylcéramide synthase, permet de ramener le poids des reins de ces animaux diabétiques à un
niveau contrôle (Zador I.Z. et al., 1993). Une augmentation des taux d’ARNm de la GM3 synthase
a par ailleurs été mesurée dans le tissu adipeux de rats Zucker fa/fa (Tagami S. et al., 2002). Ces
données de la littérature obtenues sur différents modèles d’animaux diabétiques ainsi que ceux que
nous avons obtenus chez des souris db/db associent la GM3 synthase et les gangliosides de la série-
a à l’état diabétique.
167
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
168
L’objectif de ce travail était de déterminer : i) les effets de deux voies biochimiques du
diabète, les AGE et la voie des hexosamines, sur la prolifération des péricytes rétiniens et des
cellules mésangiales rénales, ii) les effets des AGE et des hexosamines sur le métabolisme des
gangliosides et iii) le rôle des gangliosides dans les processus de régulation de prolifération exercés
par les AGE et la voie des hexosamines. Nos résultats ont permis de montrer que les AGE et la
glucosamine, produit de la voie des hexosamines, inhibent la prolifération et affectent le
métabolisme des gangliosides à la fois dans les péricytes rétiniens et dans les cellules mésangiales
rénales. De plus, ils suggèrent que ces modifications du métabolisme des gangliosides pourraient
médier en partie les effets anti-prolifératifs des AGE et de la glucosamine. Si les gangliosides sont
souvent associés à des pathologies comme le cancer ou certaines maladies neurodégénératives, ce
travail est un des premiers à suggérer leur implication dans les complications microvasculaires du
diabète que sont la rétinopathie et la néphropathie diabétiques. Il ouvre un certain nombre de
perspectives, notamment thérapeutiques, et soulève des questions appelant des travaux
complémentaires à la fois en terme de mécanismes et de pertinence physiopathologique.
La glycation et la voie des hexosamines sont deux hypothèses biochimiques proposées pour
expliquer les altérations cellulaires et tissulaires causées par l’hyperglycémie. Différents modes
d’action ont été mis en évidence qui peuvent occasionner un effet délétère sur les cellules. Les AGE
sont connus pour agir notamment selon une cascade de signalisation impliquant un récepteur
membranaire, RAGE, le stress oxydant et l’activation de différents facteurs de croissance ou
cytokines. De plus, la formation des AGE altère la fonction des protéines et, au niveau des protéines
matricielles, perturbe le comportement cellulaire. La glucosamine, produit majeur de la voie des
hexosamines, peut quant à elle servir de précurseur pour la biosynthèse de glycoconjugués
importants pour les fonctions cellulaires. De plus, le résidu UDP-Nacétylglucosamine est utilisé
pour O-glycosyler un grand nombre de protéines, de structure, nucléaires ou facteurs de
transcription, et ainsi réguler leur fonction. Nous avons observé lors de cette étude que les AGE et
la glucosamine inhibent la prolifération des péricytes rétiniens et des cellules mésangiales
rénales. De plus, nos observations ont révélé que la glucosamine bloque le cycle cellulaire et
induit l’hypertrophie des cellules mésangiales. Ces perturbations de croissance cellulaire sont en
accord avec celles observées in vivo sur les péricytes rétiniens et les cellules mésangiales rénales.
En effet, la perte des péricytes rétiniens est une des altérations précoces de la rétinopathie
diabétique qui participe largement aux dysfonctions liées à la pathologie et à leur évolution vers des
troubles de la vue. L’arrêt de croissance, l’hypertrophie et finalement la disparition des cellules
mésangiales rénales sont des caractéristiques de la néphropathie diabétique, en partie responsables
de la sclérose glomérulaire et de la perte de la fonction rénale. La prévention des altérations de ces
169
deux types cellulaires serait un moyen d’enrayer la progression de la rétinopathie et de la
néphropathie diabétiques. Ces résultats soutiennent ainsi l’implication des AGE et de la
glucosamine dans les altérations cellulaires caractéristiques de ces deux complications
microvasculaires.
Notre étude met pour la première fois en cause la glucosamine dans le blocage du cycle cellulaire et
l’hypertrophie des cellules mésangiales. In vivo, l’hyperglycémie caractéristique du diabète, ainsi
qu’une régulation de l’enzyme limitante GFAT, donnent lieu à une modulation de la quantité de
glucosamine effectivement formée. Dans notre étude en revanche, l’utilisation directe de la
glucosamine exogène permet de contourner cette enzyme et d’apporter la glucosamine aux cellules
de manière artificielle. Il serait à ce stade important de vérifier la spécificité et la pertinence
physiologique de nos résultats en déterminant notamment s’ils sont reproductibles par un traitement
avec une concentration élevée de glucose et reversés par l’utilisation d’un inhibiteur de la GFAT
comme l’azaserine. Ceci permettrait de savoir si la modification du métabolisme des gangliosides
observée est effectivement dépendante de la GFAT et d’une activation de la voie des hexosamines.
Nous avons montré lors de ce travail, dans deux modèles cellulaires différents, que les AGE et la
glucosamine sont capables d’affecter le profil en gangliosides en agissant sur les activités de
leurs enzymes de biosynthèse. La modification du métabolisme des gangliosides pourrait
constituer un nouveau mécanisme d’action potentiel des AGE et de la glucosamine. Les
mécanismes selon lesquels ces produits régulent les activités des enzymes de biosynthèse des
gangliosides n’a pas été explorée. Il s’agirait par exemple de déterminer si la modification du
métabolisme des gangliosides fait partie de voies déjà décrites. La régulation des enzymes de
biosynthèse des gangliosides par la glucosamine met-elle en jeu une O-glycosylation de facteurs de
transcription ou des enzymes elle-mêmes, ou bien se fait-elle par apport de substrats et action de
masse ? La régulation par les AGE passe-t-elle par RAGE ? Dans les cellules mésangiales, les AGE
et la glucosamine induisent des modifications des gangliosides similaires : une augmentation des
gangliosides de la série-a et une diminution du GD3. Il serait intéressant de déterminer comment
ces deux voies biochimiques activées lors du diabète, peuvent converger vers le métabolisme des
gangliosides, notamment si les AGE et la glucosamine agissent parallèlement et indépendamment
ou si au contraire les deux voies se chevauchent et empruntent les mêmes mécanismes. Les AGE et
la glucosamine peuvent activer différents facteurs de transcription, respectivement par suite d’une
interaction avec RAGE et d’une O-glycosylation, notamment NF-κB ou Sp1 (Du X.L. et al., 2000;
Goldberg H.J. et al., 2002; Lander H.M. et al., 1997), facteurs qui réguleraient la transcription de
différents gènes d’enzymes de biosynthèse des gangliosides (Furukawa K. et al., 1996; Zeng G. et
al., 1998; Zeng G. et al., 2003). Il est donc possible que la régulation du métabolisme des
170
gangliosides se déroule finalement à un niveau transcriptionnel. La mise en évidence de
mécanismes d’action communs entre la voie de la glycation et celle des hexosamines permettrait
d’envisager des actions thérapeutiques communes pour contrer les deux voies à la fois.
Un bon nombre des effets cellulaires des AGE semble être médié par une interaction avec des
récepteurs membranaires spécifiques. Les récepteurs aux AGE (R1, R2, R3) sont plutôt décrits
comme des voies de captation et d’élimination des AGE (Iacobini C. et al., 2003; Lu C. et al., 2004)
alors que le RAGE est avancé comme la première étape d’une voie de signalisation menant à des
altérations cellulaires variées. La présence de RAGE a été détectée dans les péricytes (Yonekura H.
et al., 2003) et les cellules mésangiales (Vlassara H., 2001). Le blocage de l’interaction entre les
AGE et RAGE dans nos modèles cellulaires, par l’utilisation d’anticorps spécifiques ou l’inhibition
de l’expression du récepteur par des olgonucléotides anti-sens ou des SiRNA par exemple
permettrait de déterminer si l’inhibition de prolifération et la modification du métabolisme des
gangliosides causées par les AGE sont dépendantes de RAGE. Par ailleurs, le stress oxydant est une
caractéristique générale de l’état diabétique, qui pourrait être un point commun entre toutes les
voies biochimiques menant aux microcomplications. Les AGE ont été décrits comme générateurs
de stress oxydant, notamment dans les péricytes rétiniens (Denis U. et al., 2002). Il serait intéressant
de vérifier par l’utilisation d’anti-oxydant par exemple, si le stress oxydant joue un rôle dans l’effet
anti-prolifératif des AGE et la perturbation du métabolisme des gangliosides dans les péricytes et
les cellules mésangiales.
Le métabolisme et le profil en gangliosides sont donc modifiés dans les péricytes et les cellules
mésangiales, en réponse aux AGE comme à la glucosamine. L’ensemble des résultats obtenus dans
cette étude suggère que les gangliosides pourraient être des médiateurs de l’effet anti-
prolifératif des AGE et de la glucosamine sur les péricytes et les cellules mésangiales mais les
mécanismes par lesquels les gangliosides affectent la croissance cellulaire n’ont pas été totalement
élucidés. Certaines modifications sont communes aux deux types cellulaires ou aux deux
traitements alors que d’autres sont spécifiques (Figure 64). C’est le cas par exemple pour le GD3
dont le taux diminue sauf dans les péricytes traités avec la glucosamine où il est augmenté. La
signification de ces différences n’est pas claire et nous ne savons pas précisément quel(s)
ganglioside(s) est (sont) responsable(s) de l’effet observé. Les effets de la modification du profil en
gangliosides doivent-ils être attribués à un ganglioside en particulier, à une série ou bien à la
perturbation de l’équilibre entre les différentes séries ? Par quels mécanismes les gangliosides
agissent-ils sur la prolifération cellulaire ? Il est envisageable que tel ou tel ganglioside augmenté en
réponse au traitement agisse selon un mécanisme propre. Nous avons montré que le GM2 et le GM1
sont capables de bloquer le cycle cellulaire des cellules mésangiales et de causer une hypertrophie
via l’augmentation d’une protéine inhibitrice du cycle cellulaire, p21Waf1/Cip1. Par ailleurs, le GD3 a
171
été décrit dans la littérature pour induire l’apoptose alors qu’un grand nombre de gangliosides de la
série-a ont été impliqués dans une interaction avec les récepteurs aux facteurs de croissance. Les
différents gangliosides augmentés en réponse aux traitements pourraient agir de concours pour
inhiber la prolifération cellulaire. Il serait dans un premier temps intéressant de définir le
mécanisme selon lequel la prolifération des péricytes et des cellules mésangiales est inhibée en
réponse aux AGE ainsi qu’à la glucosamine : apoptose, nécrose, ralentissement ou blocage du cycle
cellulaire… afin d’éclaircir le mode d’action des gangliosides.
↑ GM3, GM2, GM1
↓ GD3
↑ GM3 synthase
↓ GD3 synthase
↑ GM3, GM2, GM1
↓GD3
↑ GM3 synthase
↓ GD3 synthase
↓ GM3
↑ GM1, GD3
↑ GM3 synthase
↑↑ GM2, GM1
↓ GD3
↓ GM3 synthase
Glu
cosa
min
eAG
E
Péricytes Cellules mésangiales
↓ prolifération
Souris db/db
↑GM3
↑ GM3 synthase
↓ GD3 synthase
↑ GM3, GM2, GM1
↓ GD3
↑ GM3 synthase
↓ GD3 synthase
↑ GM3, GM2, GM1
↓GD3
↑ GM3 synthase
↓ GD3 synthase
↓ GM3
↑ GM1, GD3
↑ GM3 synthase
↑↑ GM2, GM1
↓ GD3
↓ GM3 synthase
Glu
cosa
min
eAG
E
Péricytes Cellules mésangiales
↓ prolifération↓ prolifération
Souris db/db
↑GM3
↑ GM3 synthase
↓ GD3 synthase
Figure 64 : Bilan des modifications du métabolisme des gangliosides dans les péricytes et les cellules mésangiales en
réponse aux AGE et à la glucosamine, et dans les souris db/db.
Cependant, dans les deux types cellulaires en réponse aux deux traitements, les modifications des
gangliosides semblent aller dans le sens d’une augmentation du flux vers les gangliosides de la
série-a : augmentation des gangliosides de la série-a et de l’activité GM3 synthase dans les péricytes
et les cellules mésangiales en réponse aux AGE, augmentation du GM1 et de l’activité GM3
synthase dans les péricytes et augmentation des gangliosides de la série-a dans les cellules
mésangiales traitées avec la glucosamine. De plus, une augmentation de l’activité GM3 synthase et
des taux de GM3 dans les cortex rénaux de souris db/db ont été mesurées (Figure 64). Les
gangliosides de la série-a et la GM3 synthase, enzyme limitante de leur biosynthèse, pourraient
constituer un dénominateur commun aux altérations de prolifération causées par les AGE et
la glucosamine dans les péricytes et les cellules mésangiales et par extension, commun à la
172
rétinopathie et à la néphropathie diabétiques. Là encore, il est nécessaire de vérifier la
pertinence physipathologique des observations faites en étudiant par exemple le métabolisme des
gangliosides au niveau des structures microvasculaires rétiniennes et rénales de patients diabétiques
notamment. La découverte de mécanismes communs aux deux microcomplications est
particulièrement attrayante car elle permettrait d’envisager des traitements efficaces sur les deux
microcomplications à la fois. L'inhibition de l'activité de la GM3 synthase et donc de l'augmentation
des gangliosides de la série-a pourrait permettre de limiter la chute de prolifération et/ou
l'hypertrophie des péricytes et des cellules mésangiales causées par l'environnement diabétique. La
GM3 synthase représenterait ainsi une cible thérapeutique commune contre les deux
microcomplications. L'intérêt des gangliosides, notamment de la série-a, et de la GM3 synthase
dans le cadre plus global du diabète est d’ailleurs vivement renforcé par de récents travaux
suggérant leur rôle dans les mécanismes de l'insulino-résistance (Sasaki A. et al., 2003; Tagami S.
et al., 2002; Yamashita T. et al., 2003).
173
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PUBLICATIONS
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a-series gangliosides mediate the effects of Advanced Glycation End-products on pericyte and mesangial cell proliferation A common mediator for retinal and renal microangiopathy ?
DIABETES, VOL. 54, JANUARY 2005
Running title: gangliosides as mediators of AGE effects
Elodie Masson, Lysiane Troncy, Daniel Ruggiero, Nicolas Wiernsperger, Michel Lagarde, and
Samer El Bawab
Diabetic Microangiopathy Research Unit, MERCK Santé-INSERM UMR 585, INSA-Lyon
Corresponding author: S. El Bawab, Diabetic Microangiopathy Research Unit, MERCK Santé-INSERM
U585, INSA-Lyon, Louis Pasteur Bldg, 69621 Villeurbanne Cedex, France.
Total proteins were finally measured using the BCA protein assay (Pierce) to assess cell
proliferation, as in our experiments cell number correlated with total protein concentrations (see
Fig. 1).
Treatment with anti-a-series ganglioside antibodies. In order to block the potential effects of a-
series gangliosides, cells were cultured in 96 wells plates and treated with 3 µM of AGE or control
BSA in the presence or absence of 50 µg/ml of polyclonal anti–GM2 (Calbiochem) or anti–GM1
(Matreya) antibodies. Rabbit IgG (Sigma) was used as a control. At the end of the treatment, cells
were washed twice with PBS, lysed in 50 µl Ripa lysis buffer and proteins were measured to assess
cell proliferation.
Transfection of RMC with GM3 synthase SiRNA. In order to block GM3 synthase activity,
RMC were grown in 6-wells plates to 30 % confluence and transfected with specific GM3 synthase
SiRNA designed against rat cDNA sequence (Ambion, Huntingdon, UK) using Oligofectamine
reagent (Invitrogen Corporation). The GM3 synthase antisense sequence used was
GGGUUAUUCUGAACAUGUUtt. In preliminary experiments, dose-response study was
performed by transfecting cells with increasing concentrations of SiRNA (0-800 nM). After 72 h of
transfection, GM3 synthase activity was measured on homogenates of transfected cells.
Proliferation was next assayed in SiRNA transfected cells. To this end, 24 h after transfection with
400 nM SiRNA, cells were treated with 3 µM of either control BSA or AGE (3 days). Cells were
then washed twice with PBS, lysed in Ripa lysis buffer and proteins were measured to assess cell
proliferation.
Statistical analysis. Data are expressed as means ± SEM and presented as percentage of controls.
In cell studies, the Wilcoxon signed-rank test was used to define the significance of the difference
between groups. For GM3 and GD3 synthase activity in mice experiments, the Student t-test was
used. p< 0.05 was considered as statistically significant.
RESULTS AGE inhibit pericyte and mesangial cell proliferation. To compare the effects of AGE on
pericyte and mesangial cell proliferation, cells were treated with either BSA or AGE 3 µM for 4-7
days. Cell counting revealed that AGE reduced pericyte and mesangial cell numbers by 33% and
40%, respectively (Fig. 1). Total proteins were also measured, found diminished, and correlated to
cell number. The results show similar adverse effects of AGE on both pericyte and mesangial cell
proliferation, and led us to investigate common mechanisms involved in the AGE response in these
two cell types.
AGE increase the a-series gangliosides in pericytes and mesangial cells. Previous results from
our laboratory suggested that AGE modulate gangliosides profile of retinal microvascular cells (17).
To this end, ganglioside patterns were analyzed in BRP and RMC in response to BSA control or
AGE. As shown in Figure 2A, ganglioside profile is cell type specific. Under control conditions,
main gangliosides in pericytes were GM3 (63% of all gangliosides detected) and GM1 (9%) of the
a-series gangliosides (Fig. 2B), and GD3 (28%) of the b-series gangliosides. Mesangial cell profile
differed by the very low amount of GD3 (5%), and in the a-series, by the presence of GD1a (20%),
with GM3 remaining the major ganglioside (75%).
An increase of the a-series gangliosides and a decrease of the b-series gangliosides were observed
in both AGE-treated cell types. In pericytes, the a-series gangliosides GM3 and GM1 were
increased by about 40% whereas the b-series ganglioside GD3 was decreased by 24% (Fig. 3A). In
mesangial cells, GM3 was increased by 33% whereas GD3 was decreased by 30%; GD1a levels
were not affected (Fig. 3B). Similar results were obtained by autoradiography analysis after
galactose labelling (data not shown). As the a-series GM2 in BRP, GM2 and GM1 in RMC were
hardly detectable by resorcinol staining, cells were labeled with [14C]D-Galactose at high specific
activity and gangliosides were then analyzed in control and AGE treated cells. Results revealed that
GM2 was also increased by 55% in BRP (Fig 3C) and that GM2 and GM1 were increased by 25-
35% in RMC (Fig 3D). These results indicate that AGE induce similar gangliosides pattern
modifications in both pericytes and mesangial cells. They also suggest that the increase of the a-
series gangliosides might be a common mechanism underlying the decrease of cell proliferation.
AGE modulate GM3 and GD3 synthase activities in pericytes and mesangial cells. To
investigate the mechanism responsible for the observed a-series ganglioside increase, GM3 and
GD3 synthase activities were measured in control and treated cells. Results presented in Figure 4A
show that AGE treatment increased GM3 synthase activity by about 80% in pericytes and 50% in
mesangial cells, most likely through increase of Vmax of the reaction (data not shown). In parallel,
AGE treatment decreased GD3 synthase activity by about 60% in both cell types (Fig. 4B). These
results suggest that AGE exert similar mechanisms in RMC and BRP leading to a-series
gangliosides accumulation.
A-series gangliosides inhibit pericyte and mesangial cell proliferation. Previous literature data
have described gangliosides as growth suppressors notably in mesangial cells (18) and implicated
the a-series gangliosides in inhibition of cell proliferation (18-23). Thus, we investigated whether
exogenous addition of the a-series gangliosides affects pericyte and mesangial cell proliferation.
Cells were treated during one passage with 50 µM gangliosides and, as a control, with the non-
sialylated precursors glucosylceramide and lactosylceramide. Figure 5A shows that GM2, GM1 and
GD1a inhibited most efficiently pericyte and mesangial cell proliferation by 15-30%. GM3 slightly
inhibited pericyte proliferation but had no significant effect on mesangial cells. Glucosylceramide
and lactosylceramide used as controls had no effect. Because GM2 and GM1 are increased in BRP
and RMC in response to AGE, and as they alter proliferation of both cell types, we hypothesized
that these a-series gangliosides might be common mediators of the AGE effect. Thus, cells were
treated with AGE in the presence of anti-GM1 and anti-GM2 antibodies and proliferation measured.
In the control BSA-treated cells, proliferation was not different in the presence or absence of anti-
gangliosides antibodies (data not shown), and addition of IgG as a control to the AGE treatment did
not affect the AGE response. Treatment of cells with AGE in the presence of anti-GM2 and anti-
GM1 antibodies partially prevented the proliferation decrease of pericytes and mesangial cells (Fig.
5B). Together these observations suggest that the a-series gangliosides, and in particular GM2 and
GM1, are common mediators of the AGE-induced inhibition of proliferation of pericytes and
mesangial cells.
GM3 synthase SiRNA partially protects against the AGE effects. To further support the role of
a-series gangliosides in mediating the AGE effects, RMC were transfected with GM3 synthase
SiRNA. Preliminary experiments showed that the designed SiRNA indeed inhibited GM3 synthase
activity in RMC (Fig. 6A). Next, proliferation was measured in the transfected and treated cells. As
shown in Figure 6B, the effects of AGE on RMC proliferation were partially reversed in cells
transfected with GM3 synthase SiRNA. These results clearly show the implication of gangliosides
in mediating the AGE effects. It must be indicated that the partial effects could be explained by: (i)
the AGE effects were less potent than in previous experiments as cells were treated at higher
confluency in order to improve transfection efficiency and (ii) GM3 synthase activity was inhibited
only by about 50%. In fact, SiRNA concentrations higher than 400nM were not used to avoid non-
specific and toxic effects.
GM3 and GD3 synthase activities, and GM3 levels are modified in renal cortex of diabetic
mice. To assess the effect of a diabetic environment on ganglioside biosynthetic pathway ex vivo,
GM3 and GD3 synthase activities were measured on homogenates of renal cortex of the diabetic
db/db mice model. Results presented in Figure 7A-B show that GM3 synthase activity was
increased by 80% whereas GD3 synthase activity was decreased by 50% in diabetic mice renal
cortex as compared to controls (db/m). Gangliosides were also analyzed and revealed an increase,
although not statistically significant, of GM3 levels in the renal cortex of diabetic db/db mice
(Figure 7C). Altogether these results support the pathophysiological significance of the results
obtained in RMC and BRP treated with AGE.
DISCUSSION
Numerous studies have pointed out the crucial role of pericytes and mesangial cells in the
development of diabetic retinopathy (DR) and nephropathy (DN), respectively. Indeed, retinal
pericytes loss is one of the earliest hallmarks of DR, and growth-arrest, hypertrophy, and loss of
renal mesangial cells are typical features of DN. Thus, regulation of these two cell type proliferation
appears to be a pivotal pathophysiological process in microvascular complications. AGE, glycated
protein derivatives that notably accumulate in kidneys (24) and retina (25) of diabetic patients, have
been widely involved in the development of microvascular complications (5). In the present study,
we investigated the effect of AGE on BRP and RMC proliferation. Results showed that AGE
treatment indeed inhibited both cell types proliferation. These findings are consistent with previous
results obtained with other types of AGE in pericytes (26,27) and mesangial cells (28,29), thus
highlighting their pathophysiological relevance.
The effects of AGE have been extensively studied. However, mechanisms leading to alteration of
cell function and viability remain incompletely understood. On the other hand, although
gangliosides play a major role in cell growth and apoptosis, their potential involvement in diabetic
microvascular complications has been poorly studied. In the present work, we show that treatment
of BRP and RMC with AGE resulted in an increase of the a-series gangliosides concomitant with a
decrease of the b-series in both cell types. This increase could be explained by the observed
concomitant activation of GM3 synthase and inhibition of GD3 synthase activities, suggesting that
AGE regulate activity of these enzymes through yet undefined mechanisms.
On the other hand, evidence that the a-series gangliosides are likely to be responsible for the
observed proliferation decrease has been provided in the present study. Exogenous a-series
gangliosides application, particularly GM2 and GM1, inhibited BRP and RMC proliferation.
Moreover, treatment of cells with AGE in the presence of anti-GM1 or anti-GM2 partially protected
BRP and RMC against the proliferation decrease caused by AGE. Finally, inhibition of GM3
synthase using specific SiRNA partially reversed the AGE effects on RMC proliferation. Together,
these results suggest that the a-series gangliosides, and in particular GM2 and GM1, are involved in
mediating the anti-proliferative effect of AGE on BRP and RMC. The partial protection observed
using anti-GM2 and anti-GM1 antibodies or SiRNA approach might suggest that other pathways
are also involved in mediating the AGE effect. For example, a cascade involving oxidative stress
and ceramide accumulation has been proposed to induce BRP apoptosis in response to AGE (16).
The role of the a-series gangliosides is further supported by numerous studies showing that a-series
gangliosides decrease cell proliferation by modulating growth factor receptors signaling. For
example, a-series gangliosides (GM3, GM2, GM1, GD1a) have been described to inhibit epidermal
growth factor and platelet-derived growth factor receptor phosphorylation and signaling in different
cell types (19-22,30-32).
The potential role of gangliosides in diabetic microvascular complications is also supported by ex
vivo observations. Indeed, the present results show that GM3 and GD3 synthase activities are
increased and decreased, respectively, and that GM3 tends to accumulate in renal cortex of diabetic
db/db mice. Moreover, GM3 has been shown to accumulate in kidney of streptozotocin-induced
diabetic rats, and kidney hypertrophy was inhibited when ganglioside biosynthesis was blocked,
suggesting a crucial role of gangliosides in diabetes-induced renal hypertrophy (33).
On the other hand, recent studies have suggested the involvement of GM3 synthase and a-series
gangliosides in insulin resistance. Thus, GM3 synthase activity and its mRNA have been shown to
be increased in adipocytes treated with low concentrations of tumor necrosis factor α, and GM3
synthase mRNA levels were found to be increased in adipose tissues of Zucker fa/fa rats (34).
Furthermore, GM3 synthase knock-out mice showed increased sensitivity to insulin by enhanced
insulin receptor phosphorylation and mice were protected against high fat diet-induced insulin
resistance (35). Finally, mice overexpressing the human sialidase NEU3 showed reduced insulin-
stimulated phosphorylation of the insulin receptor and the insulin receptor substrate, suggesting that
GM2 and GM1, the possible sialidase products in transgenic tissues, attenuate insulin signaling
(36).
In conclusion, our data suggest that the a-series gangliosides, and in particular GM2 and GM1, are
mediators of the adverse AGE effects on pericyte and mesangial cell proliferation. Further,
gangliosides pathway appears to be a new and common AGE mechanism of action in both BRP and
RMC. These data also raise GM3 synthase and a-series gangliosides as potential targets for the
treatment of both DR and DN.
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Legends :
Fig. 1. AGE inhibit pericyte and renal mesangial cell proliferation. Cells were exposed to 3 µM BSA or AGE for 4 (RMC) and 7 (BRP) days. Cells were then trypsinized and counted using haemocytometer and total proteins were measured. Results are presented as percentage of control BSA and represent means ± SEM of 6 (BRP) and 9 (RMC) independent experiments each performed in duplicates. * p < 0.05 vs control BSA. Fig. 2. Gangliosides pattern of pericytes and mesangial cells. (A) Gangliosides were extracted, separated by HPTLC, then detected by resorcinol staining and quantified. GT1b, absent in both cell types, was used as internal standard. (B) Scheme representing gangliosides biosynthesis pathway, modified from (12). Cer, ceramide; Glccer, glucosylceramide; Laccer, lactosylceramide. Fig. 3. AGE modulate gangliosides pattern in pericytes and mesangial cells. Pericytes (A) or mesangial cells (B) were exposed to 3 µM BSA or AGE for 7 and 4 days, respectively. Gangliosides were analyzed by HPTLC and revealed by resorcinol spraying as described under Research designs and Methods. In control conditions, GM3, GM1 and GD3 quantities in BRP were 2.39 ± 0.19, 0.34 ± 0.03 and 1.05 ± 0.11 µg/mg proteins, respectively. GM3, GD3 and GD1a quantities in RMC were 4.03 ± 0.28, 0.27 ± 0.07 and 1.08 ± 0.11 µg/mg proteins, respectively. Results are expressed as percentage of control BSA and represent means ± SEM of 6 (BRP) and 9 (RMC) independent experiments each performed in duplicates. * p<0.05 vs control BSA. (C) and (D) Gangliosides were metabolically labelled with 1 µCi/ml [14C]Galactose and analyzed by autoradiography. Results are expressed as percentage of control BSA and represent means ± SEM of 3 independent experiments.
Fig. 4. AGE increase GM3 synthase activity and decrease GD3 synthase activity in pericytes and mesangial cells. Cells were treated with 3 µM BSA or AGE. GM3 (A) and GD3 (B) synthase activities were measured on cell homogenates as described under Research design and Methods. Control activities were 2.7 and 0.8 pmoles/hour/mg proteins for GM3 and GD3 synthase, respectively, in BRP; 5.1 and 0.7 pmoles/hour/mg proteins for GM3 and GD3 synthase, respectively, in RMC. Results are expressed as percentage of control BSA and represent means ± SEM of 4-5 independent experiments. * p<0.05 vs control BSA. Fig. 5. A-series gangliosides inhibit cell proliferation. (A) Pericytes or mesangial cells were treated with gangliosides-BSA complexes for one passage. (B) Cells were treated with 3 µM BSA or AGE in the presence or absence of 5µg per well of IgG, anti-GM2 or anti-GM1 polyclonal antibodies. At the end of the treatment, total proteins were measured. Results are expressed as percentage of control and represent means ± SEM of 5-6 independent experiments each performed in triplicates. * p<0.05 vs control (A) or AGE treated cells (B).
Fig. 6. Transfection with GM3 synthase SiRNA protects RMC.
(A) TLC separation of GM3 product obtained from GM3 synthase activity in homogenates of RMC. Mesangial cells were transfected with increasing concentrations of GM3 synthase SiRNA and GM3 synthase activity was measured after 72 h. Ctr, cells transfected with oligofectamine without SiRNA. (B) 24 h after transfection with 400 nM GM3 synthase SiRNA, cells were treated with 3 µM BSA control or AGE. At the end of treatment, total proteins were measured. Results are expressed as percentage of control BSA and represent means ± SEM of 6 independent experiments. * p<0.05 vs AGE treated control cells.
Fig. 7. GM3 and GD3 synthase activities, and GM3 levels are modulated in renal cortex of diabetic mice. GM3 (A) and GD3 (B) synthase activities were measured on homogenates of renal cortex from control (db/m) and db/db mice. Control activities were 0.6 and 21 pmoles/hour/mg proteins for GM3 and GD3 synthase, respectively. (C) GM3 levels of control (db/m) and db/db mice renal cortex are represented. In control mice, GM3 levels were 66 ± 9 ng/mg proteins. Results are expressed as percentage of control and represent means ± SEM of 4-6 animals. * p<0.05 vs control mice.
Figure 1:
0
20
40
60
80
100
120
% o
f con
trol
cell number
total proteins
A BRP
B RMC
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f con
trol
BSA AGE
BSA AGE
cell number
total proteins
**
* *
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f con
trol
cell number
total proteins
A BRP
B RMC
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BSA AGE
BSA AGE
cell number
total proteins
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f con
trol
cell number
total proteins
cell numbercell number
total proteinstotal proteins
A BRP
B RMC
0
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f con
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BSA AGEBSA AGE
BSA AGEBSA AGE
cell number
total proteins
cell numbercell number
total proteinstotal proteins
**
* *
Figure 2:
GM3
GT1b
GD3
GM2
GM1
GD1a
BRP RMCstandards
A
Cer
GlcCer
LacCer
GT1a
GD2
GD1b
GT1b
GQ1b
GT3
a-series
GM3 synthase
c-series
b-series
o-series
GM3
GM1
GM2
GD3
GD1a
B
GD3 synthase
GM3
GT1b
GD3
GM2
GM1
GD1a
BRP RMCstandards
A
Cer
GlcCer
LacCer
GT1a
GD2
GD1b
GT1b
GQ1b
GT3
a-series
GM3 synthase
c-series
b-series
o-series
GM3
GM1
GM2
GD3
GD1a
B
GD3 synthase
Figure 3:
BSA AGE0
50
100
150
% o
f con
trol
GM3GM1GD3
A B
C D
BRP RMC
GM3GD1aGD3
0
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100
150
% o
f con
trol
BSA AGE
BSA AG E0
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150
% o
f con
trol
GM2 GM2GM1
* *
*
*
*
BSA AG E0
50
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f con
trol
BSA AGE0
50
100
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% o
f con
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GM3GM1GD3
BSA AGEBSA AGE0
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100
150
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trol
0
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f con
trol
GM3GM1GD3
GM3GM1GD3
A B
C D
BRP RMC
GM3GD1aGD3
0
50
100
150
% o
f con
trol
BSA AGE
GM3GD1aGD3
GM3GM3GD1aGD1aGD3GD3
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50
100
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% o
f con
trol
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f con
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0
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f con
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BSA AGEBSA AGE
BSA AG E0
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f con
trol
GM2GM2 GM2GM1GM2GM1
* *
*
*
*
BSA AG E0
50
100
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% o
f con
trol
0
50
100
150
% o
f con
trol
Figure 4:
0
50
100
150
200
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BRP RMC
% o
f con
trol
BSAAGE
*
*
A
B
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100
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BRP RMC
% o
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BSAAGE
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200
250
BRP RMC
% o
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BSAAGE
*
*
A
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150
200
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BRP RMC
% o
f con
trol
BSAAGE
*
*
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150
200
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BRP RMC
% o
f con
trol
BSAAGEBSAAGE
*
*
A
B
0
20
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BRP RMC
% o
f con
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BSAAGE
**
B
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100
120
BRP RMC
% o
f con
trol
BSAAGE
0
20
40
60
80
100
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BRP RMC
% o
f con
trol
BSAAGEBSAAGE
**
Figure 5:
A
B
BRP
contr
olGM3
GM2GM1
GD1a
Gluccer
Laccer
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100
% o
f con
trol
* * * *
RMC
contr
olGM3
GM2GM1
GD1a
Gluccer
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f con
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* * *
BRP
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BSAAGE
control anti GM2
anti GM1
IgG
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RMC
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BSAAGE
control anti GM2
anti GM1
IgG
A
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BRP
contr
olGM3
GM2GM1
GD1a
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contr
olGM3
GM2GM1
GD1a
Gluccer
Laccer
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* * * *
RMC
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olGM3
GM2GM1
GD1a
Gluccer
Laccer
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f con
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contr
olGM3
GM2GM1
GD1a
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* * *
BRP
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control anti GM2
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BSAAGEBSAAGE
control anti GM2
anti GM1
IgGcontrol anti GM2
anti GM1
IgG
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RMC
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BSAAGE
control anti GM2
anti GM1
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* *
BSAAGEBSAAGE
control anti GM2
anti GM1
IgGcontrol anti GM2
anti GM1
IgG
Figure 6:
A
B
Ctr + GM3synthaseSiRNA
*
% o
f con
trol
BSAAGE
0
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60
80
100
+ GM3 synthase SiRNA (nM)
200 400 800Ctr 100
fold change 1 0.82 0.66 0.54 0.52
A
B
Ctr + GM3synthaseSiRNA
*
% o
f con
trol
BSAAGEBSAAGE
0
20
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100
0
20
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80
100
+ GM3 synthase SiRNA (nM)
200 400 800Ctr 100
fold change 1 0.82 0.66 0.54 0.52
Figure 7:
control db/db0
50
100
150
200
250
% o
f con
trol
A
*%
of c
ontr
ol
0
20
40
60
80
100
120
control db/db
B
*
C
% o
f con
trol
control db/db0
50
100
150
200
control db/db0
50
100
150
200
250
% o
f con
trol
A
*%
of c
ontr
ol
0
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Involvement of gangliosides in glucosamine-induced
proliferation decrease of retinal pericytes
GLYCOBIOLOGY ADVANCE ACCESS PUBLISHED DECEMBER 29, 2004
Elodie Masson, Nicolas Wiernsperger, Michel Lagarde, and Samer El Bawab
Diabetic Microangiopathy Research Unit, MERCK Santé-INSERM UMR 585, INSA-Lyon
Corresponding author: S. El Bawab, Diabetic Microangiopathy Research Unit, MERCK Santé-INSERM
U585, INSA-Lyon, Louis Pasteur Bldg, 69621 Villeurbanne Cedex, France.
Pharmacia Biotech). Gangliosides were identified by comigration with standards. GM2 and GM1
identities were confirmed after HPTLC separation using anti-GM2 antibody (generous gift from Dr.
J. Portoukalian, Lyon, France) and fluorescein-labelled choleratoxin B subunit that interact
specifically with GM1. Quantification was performed by densitometry analysis using Image Quant
(Molecular Dynamics). As GT1b is absent in RMC ganglioside profile, it was added as an internal
standard in the samples before lipid extraction. Results were then adjusted for extraction efficiency
and total proteins of the sample.
Radiolabelling with 14C glucosamine To investigate the hypothesis that glucosamine treatment can affect ganglioside profile by providing
substrates for the ganglioside biosynthesis, cells were labeled with 14C-glucosamine. Control cells
were incubated with 0.2 µCi/ml D-[1-14C]glucosamine for 48 h. Glucosamine-treated cells were
incubated with 2 mM glucosamine at a much higher specific activity of 0.5 mCi/ml D-[1-14C]glucosamine. After the incubation, cells were washed and the radioactivity associated to
gangliosides was then analyzed to test the ability of glucosamine to incorporate into ganglioside
structures.
Treatment with exogenous gangliosides Exogenous gangliosides GM2 and GM1 were added to the culture complete medium at a final
concentration of 60 µM. This concentration was used as it induces inhibition of RMC proliferation
close to the effects observed with 0.5 mM GlcN treatment. Gangliosides were added in the form of
complexes with BSA at a ratio of 1:1 in DMEM–10 mM Hepes, pH 7.4 to facilitate their
incorporation within the cell.
Western blot analysis At the end of the treatment period, cells were washed and collected in Ripa lysis buffer (PBS 10
mM, NP40 1 %, sodium deoxycholate 0.5 %, SDS 0.1 %, 10 µl/ml proteases inhibitors). To remove
insoluble materials, lysates were centrifuged at 10 000 g for 5 min. Samples (20 µg of lysates) were
then boiled for 5 min, loaded onto a 12 % SDS-polyacrylamide gel, electrophoresed, and transferred
to a PVDF membrane. The membranes were blocked with 5 % milk in PBS containing 0.05 %
Tween (PBST), and blotted with monoclonal antibodies (p21, 1 µg/ml; p27, 1:2000) in the blocking
solution. After extensive washing, the membranes were blotted with secondary anti-mouse antibody
at a dilution of 1:2000. The signal was visualized by enhanced chemiluminescence.
Statistical analysis Data are expressed as means ± SEM. The Wilcoxon signed-rank test was used to define the
significance of the difference between groups. p<0.05 was considered as statistically significant.
RESULTS
Glucosamine decreases mesangial cell proliferation and induces hypertrophy The effect of glucosamine on RMC proliferation and hypertrophy was investigated in this study.
Glucosamine was used to mimic HP activation because of its demonstrated ability to selectively
enter the hexosamine biosynthetic pathway and to bypass the rate-limiting enzyme GFAT [25]. To
this end, mesangial cells were treated with either 0.5 or 5 mM glucosamine, collected and cell
number and total proteins were measured. As shown in Figure 1, time-course experiments revealed
that glucosamine potently decreases proliferation. Glucosamine effect was evident starting from 48
h and, at the end of the treatment period, cell number in RMC treated with 0.5 mM and 5 mM
glucosamine represented only 41 % and 12 % of control, respectively (Figure 1A). This adverse
effect on cell proliferation was also measurable by a decrease of total proteins content (Figure 1B).
In addition, as the ratio of total protein content to cell number is a well-established measurement of
cellular hypertrophy, this parameter was used to determine whether the alteration of cell growth was
accompanied by cell hypertrophy. As shown in Figure 1C, glucosamine indeed induced an increase
of the proteins to cell number ratio. At the end of the treatment period, protein to cell number ratio
increased by 1.6- and 2-fold for cells treated with 0.5 mM and 5 mM glucosamine, respectively.
The increase of cell size, characteristic of cellular hypertrophy, was also obvious by microscopy, as
illustrated in Figure 1D. These observations indicate that glucosamine triggers a decrease of
proliferation as well as hypertrophy of mesangial cells. As these effects were evident at 0.5 mM
GlcN, and to avoid potential cytotoxicity with the relatively high concentration of 5 mM, the
following experiments were carried out using 0.5 mM GlcN. Moreover, as the glucosamine effects
were evident at 48 h, and to avoid contact inhibition at confluence (4 days), the subsequent
experiments were performed at this time of treatment.
Glucosamine arrests cell-cycle progression Results from previous experiments showed that glucosamine treatment blocks very early cell
proliferation and may thus contribute to cellular hypertrophy. Therefore, the mechanisms
responsible for cell growth inhibition in response to glucosamine were investigated next. Cell cycle
analysis by flow cytometry was performed on control and cells treated with either 0.5 mM or 5 mM
glucosamine. Results summarized in Table 1 indicate that 0.5 mM glucosamine increased the
proportion of cells in the G0/G1 phase of the cell cycle as compared to control cells. This suggests
that 0.5 mM glucosamine blocks the progression of RMC through the cell cycle by inhibiting the
G1/S transition phase, arresting cells at G0/G1 phase. Surprisingly, treatment of cells with higher
glucosamine concentration (5 mM) resulted in cell cycle blockade at the G2/M phase. To further
investigate this discrepancy, a dose-response study was performed. As shown in Fig. 2,
glucosamine concentrations lower than 1 mM arrested cells in G0/G1 phase, whereas higher
concentrations of glucosamine (2-5 mM) induced G2/M phase arrest. These observations suggest
that at high glucosamine concentrations (>1 mM), additional pathways are involved.
Glucosamine increases p21Waf1/Cip1 expression
P21Waf1/Cip1 and p27Kip1 are inhibitors of cyclin-cyclin dependent kinase complexes known to inhibit
the G1/S phase transition. Moreover, it has been shown that p21Waf1/Cip1 and p27Kip1 proteins are
involved in growth arrest at the G1/S phase transition and hypertrophy of RMC in response to high
glucose concentrations [2]. Therefore, the expression of p21Waf1/Cip1 and p27Kip1 proteins was
measured. As shown in Figure 3, p21Waf1/Cip1 expression in cells treated with glucosamine was about
3-fold higher than in control cells. These data are consistent with the cell cycle arrest shown by
flow cytometry analysis. In contrast however, p27Kip1 expression was decreased by glucosamine
treatment. These results suggest that unlike high ambient glucose effects on RMC, GlcN-induced
cell-cycle arrest is likely p21Waf1/Cip1-dependent.
Glucosamine increases GM2 and GM1 levels The hexosamine pathway has been implicated in the regulation of numerous enzyme and protein
activities and as a consequence may regulate several pathways. Moreover, because the HP provides
intermediates for the synthesis of glycoconjugates such as glycolipids, glucosamine treatment could
affect ganglioside pattern of mesangial cells. To investigate this possibility, ganglioside pattern was
analyzed by HPTLC in control and cells treated with either 0.5 mM or 5 mM glucosamine for 48 h.
Under control conditions, the main gangliosides observed in RMC were GM3 (70 % of all
gangliosides detected), GD1a (24 %) and GD3 (5 %). When cells were treated with glucosamine,
important modifications of the ganglioside profile were observed (Figure 4A). Thus, gangliosides
GM2 and GM1, hardly detectable in control cells, were strongly increased to reach about 1.5 and
0.4 µg/mg of proteins that corresponded to 20 % and 5 % of all gangliosides detected, respectively
(Figure 4B). Similar results were obtained by autoradiography analysis after galactose labelling
(data not shown). GM3 and GD1a levels were only slightly affected whereas GD3 was undetectable
in the glucosamine-treated cells. These results suggest a shift into a-series ganglioside biosynthesis
in response to glucosamine. To further investigate whether HP affects ganglioside biosynthesis,
control cells were labelled with exogenous radioactive glucosamine and gangliosides were extracted
and analyzed for radioactivity content. Results show that indeed glucosamine or its metabolites
incorporate into ganglioside biosynthesis pathway (Figure 4C). Next, cells were treated for 48 h
with 2 mM glucosamine at a specific activity of 0.5 mCi/ml. Ganglioside analysis revealed
radioactive GM3, GM2, GM1 and GD1a (Figure 4C). These results support the hypothesis of a
connection of the HP and ganglioside biosynthesis pathways.
GM2 and GM1 gangliosides induce mesangial cell hypertrophy Gangliosides are known to play a role in a variety of important cellular functions including
proliferation and differentiation. As GM2 and GM1 were massively increased concomitantly to
RMC hypertrophy in response to glucosamine, we further investigated the possibility that
gangliosides would be involved in mediating the glucosamine effects. Proteins to cell number ratio
was measured in control cells and in cells treated with exogenous gangliosides. Results presented in
Figure 5 show that exogenous addition of GM2 and GM1 decreases mesangial cell proliferation as
measured by cell number counting and increases proteins to cell number ratio by about 30 %,
suggesting that RMC undergo hypertrophy in response to GM2 and GM1 exposure. GM3, GD3,
GD1a and lactosylceramide, a non-sialylated precursor of gangliosides, were also tested. Whereas
GM3, GD3 and GD1a also induced mesangial cell hypertrophy similar to GM2 and GM1,
lactosylceramide had no effect (data not shown). These results suggest that sialic acid is part of the
active structure.
GM2 and GM1 gangliosides block cell-cycle progression by increasing p21Waf1/Cip1 expression As GM2 and GM1 induced RMC hypertrophy as observed for glucosamine, we next investigated
whether similar mechanisms were involved. First, cell-cycle of cells treated with exogenous GM2
and GM1 was analysed by flow cytometry. As shown in Table 1, gangliosides induced an
accumulation of cells in the G0/G1 phase, suggesting a blockade in cell-cycle progression at the
G1/S transition. Next, p21Waf1/Cip1 and p27Kip1 expression was measured. Results indicate that
p21Waf1/Cip1 expression tended to increase in response to GM2 and GM1 exposure whereas p27Kip1
expression was diminished (Figure 3). Altogether, these results suggest that glucosamine and
exogenous gangliosides (GM2 and GM1) inhibit RMC proliferation likely through similar
mechanisms, by increasing p21Waf1/Cip1 expression and blocking cells at the G0/G1 phase. They also
suggest that gangliosides GM2 and GM1 are, at least partly, mediators of the glucosamine effects.
DISCUSSION
Several lines of evidence indicate that the flux through the hexosamine pathway may be causally
involved in the development of diabetic nephropathy. Activation of the HP has been implicated in
signaling pathways that lead to matrix proteins overproduction [25], a major cause of glomerular
enlargement in the early stages of DN. For example, GlcN in particular has been shown to increase
the production of the known matrix-stimulating growth factor, TGFβ [26-28]. However, the
potential role of the HP in growth perturbation and hypertrophy of mesangial cells has been poorly
studied. Therefore, these hypotheses have been investigated in the present study.
Treatment of RMC with GlcN potently inhibited cell growth and induced hypertrophy as assessed
by the proteins to cell number ratio, in a time-dependent manner. Hypertrophy is the consequence
of increased protein content combined to absence of cell division. Thus, the effect of GlcN
treatment on cell-cycle progression of RMC was investigated next. Flow cytometry analyses
indicated that low concentration of GlcN (0.5 mM) arrested RMC cycle progression at the G0/G1
phase. On the other hand, 5 mM GlcN caused an accumulation of cells at the G2/M phase,
suggesting that high concentrations block mesangial cell-cycle at the G2/M transit. These
observations clearly show that low and high concentrations of GlcN exert different actions on
RMC. These differences could be explained when taking into account recent observations from
Marshall et al. in adipocytes [29]. Indeed, these authors showed that a high concentration of GlcN
(2 mM) causes massive accumulation of the hexosamine intermediate product GlcN-6-P that was
accompanied with ATP depletion. In contrast, these effects were not observed in response to low
concentrations of GlcN (0.25 mM) or to high glucose concentrations (20 mM). In RMC treated with
GlcN, ATP depletion or alternatively high GlcN concentrations through other unknown
mechanisms, could result ultimately to DNA damage leading to the arrest of cells in G2/M. Thus,
treatment of RMC with low GlcN concentration (0.5 mM) is likely to be more physiologically
relevant.
To gain better insight into the mechanisms responsible for cell-cycle arrest caused by GlcN, the
expression of cyclin-dependent kinase inhibitors (CDKI) p21Waf1/Cip1 and p27Kip1 was studied. Our
studies focused on p21Waf1/Cip1 and p27Kip1 as these proteins have been involved in G0/G1 arrest of
mesangial cells in different diabetic animal models as well as of cultured mesangial cells exposed to
high ambient glucose concentration [2]. Results indicated that p21Waf1/Cip1 expression was about 3-
fold increased by GlcN treatment as compared to control levels, suggesting that p21Waf1/Cip1 is
involved in the blockade of the cell-cycle progression observed in RMC exposed to GlcN. On the
contrary, p27Kip1 expression was found rather diminished in response to GlcN treatment. A
decreased or unchanged p27Kip1 expression has also been shown in glomeruli of diabetic animal
models [3,30] and in RMC treated with high glucose concentrations [3]. Thus, the effect of GlcN on
RMC cell-cycle arrest is most likely p21Waf1/Cip1-dependent. In addition, p21Waf1/Cip1 has been
described as a pivotal regulator of hypertrophy. Fan et al. showed that exogenous attenuation of
p21Waf1/Cip1 using antisense oligonucleotides, decreased hypertrophy of mesangial cells induced by
hyperglycemia and insulin growth factor-1 [31]. Moreover, in vivo, p21Waf1/Cip1 knockout diabetic
mice did not develop glomerular hypertrophy [32]. These observations suggest that the increased
p21Waf1/Cip1 expression may also be involved in the mechanisms leading to hypertrophy of RMC in
response to GlcN. Because glucosamine effects on RMC are similar to high ambient glucose
effects, one might speculate that the high glucose effects on RMC growth and hypertrophy are, at
least in part, mediated through a HP-induced p21Waf1/Cip1 pathway.
On the other hand, gangliosides are glycosphingolipids that have been involved in the regulation of
proliferation of various cell types. Further, it has been shown that when GlcN is added to cells, even
at low concentrations, marked elevation of UDP-GlcNAc levels is observed [7,29]. This glycosidic
precursor can be incorporated into ganglioside structures such as GM2 and GM1, after
isomerization to UDP-N-Acetyl-galactosamine. Therefore, we investigated whether ganglioside
pattern was affected in RMC submitted to GlcN treatment. Analyses revealed modification of
ganglioside pattern with a massive increase of gangliosides GM2 and GM1. These results suggest
that GlcN increases GM2 and GM1 levels by mass action by providing high amounts of precursors
such as UDP-GalNAc. Radiolabelling experiments with 14C glucosamine also supported a
connection of the HP and ganglioside biosynthesis pathways. However, other mechanisms
regulating ganglioside biosynthesis in response to GlcN should not be excluded. For example, GM2
synthase presents putative binding sites for Sp1, a transcription factor whose activity is up regulated
by GlcN [33].
Next, we assessed whether GM2 and GM1 were involved in the hypertrophy and cell-cycle arrest of
RMC in response to GlcN. Exogenous application of GM2 and GM1 resulted in an increase of the
proteins to cell number ratio. Further, cell-cycle analysis of RMC exposed to GM2 and GM1
showed an accumulation of cells at the G0/G1 phase that was associated to an increase of p21Waf1/Cip1
expression. Thus, exogenous GM2 or GM1 application reproduced the effects of 0.5 mM GlcN on
RMC hypertrophy and cell-cycle arrest. Few studies implicated gangliosides in cell-cycle arrest.
Nakatsuji et al. showed that ganglioside GM3 induces cell-cycle arrest and apoptosis of astrocytes
in part through CDKI p27Kip1 increased expression [34]. Our results further suggest that
gangliosides might also contribute to mechanisms leading to cell hypertrophy. However and as
gangliosides showed similar effects on p27Kip1 expression, results from the present study can not
rule out a role of p27Kip1 decrease in cell cycle arrest induced by glucosamine and gangliosides.
In conclusion, our results show that 0.5 mM GlcN induces cell-cycle arrest at the G0/G1 phase and
hypertrophy of RMC. Moreover, results suggest that gangliosides GM2 and GM1 are involved in
mediating GlcN effects in RMC. Observations from the present study raise new hypothesis into the
potential involvement of the HP in the development of diabetic nephropathy, and add on new
mechanism of action of the HP such as modulation of ganglioside levels in cells. Interestingly,
gangliosides have recently been implicated in insulin-resistance [35,36] and, as discussed earlier,
HP has been shown to induce insulin-resistance in vitro and in vivo. It would be of interest to
investigate whether gangliosides are involved in the HP-induced insulin-resistance.
26 Roos, M. D., Han, I. O., Paterson, A. J., and Kudlow, J. E. (1996) Role of glucosamine
synthesis in the stimulation of TGF-alpha gene transcription by glucose and EGF.
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expression and protein synthesis in murine mesangial cells by high glucose is mediated by
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FIGURE LEGENDS
Figure 1 Glucosamine decreases RMC growth and induces hypertrophy Mesangial cells were exposed to 0.5 mM or 5 mM glucosamine for 4 days. Every day, cells were collected, cell number was counted and total proteins were measured. Growth curves corresponding to cell number expressed in 105 cells (A) and total proteins expressed in µg (B) are shown. Total proteins to cell number ratio is presented in (C) expressed in µg proteins per 105 cells. Results represent means ± SEM of 4 independent experiments. (D) Microscopy phase images of cells under control conditions or cells treated with glucosamine. * p < 0.05 vs control.
Figure 2 Dose-dependent effects of glucosamine on cell-cycle arrest RMC were treated with increasing concentrations of GlcN for 48 hours. Cells were then collected and analysed by flow cytometry as described under Materials and Methods. Results are expressed as the percentage of cells in G0/G1, S, and G2/M.
Figure 3 Glucosamine, GM2 and GM1 gangliosides increase p21Waf1/Cip1 expression RMC were exposed to glucosamine (0.5 or 5 mM), GM2 or GM1 (60 µM) for 48 hours. Cells were then lysed and equal amounts of proteins immunobloted with monoclonal anti-p21Waf1/Cip1 (A) or anti-p27Kip1 (B)
antibodies. Membranes were immunobloted next with anti-β-actin to control for equal protein loading and
transfer. Representative immunoblots and quantification obtained by densitometric analysis of the bands are
shown. Results were corrected to β-actin signal and are expressed as fold change compared to control.
Results represent means ± SEM of 4 independent experiments.
Figure 4 Effect of glucosamine on ganglioside profile (A and B) RMC were treated with glucosamine (0.5 or 5 mM) for 48 hours and then collected. Gangliosides were extracted, purified and analysed by HPTLC and resorcinol staining. Representative HPTLC (A) and densitometric quantitation (B) are shown. Results are expressed as µg of gangliosides per mg of proteins and represent means ± SEM of 4 independent experiments each performed in duplicates. Under control
conditions, gangliosides quantities were 4.62 ± 0.37, 1.65 ± 0.11 and 0.30 ± 0.05 µg/mg proteins for GM3,
GD1a and GD3, respectively. ND, not detectable. * p < 0.05 vs control. (C) RMC were labelled for 48 h in the presence of 0.2 µCi/ml 14C glucosamine for control cells and 2 mM of glucosamine at a specific activity of 0.5 mCi/ml for treated cells. At the end of incubation, cells were washed extensively and gangliosides were extracted, purified, and separated by HPTLC as described under
Experimental procedures. Radioactivity associated to gangliosides was then analyzed by autoradiography of the HPTLC plates.
Figure 5 GM2 and GM1 gangliosides induce mesangial cells hypertrophy RMC were cultured in the presence of GM2 or GM1 (60 µM) for 48 hours. Control conditions were complete medium with BSA-10 mM Hepes pH 7.4. Cells were then harvested and counted using haemocytometer, and total proteins measured. Cell number expressed in 105 cells (A) and total proteins expressed in µg (B) are presented. Total proteins to cell number ratio, used to assess hypertrophy is expressed in µg proteins per 105 cells (C). Results represent means ± SEM of 4-6 independent experiments. * p < 0.05 vs control.
Table 1 Glucosamine, GM2 and GM1 gangliosides block cell-cycle of mesangial cells RMC were treated with glucosamine (0.5 or 5 mM) or cultured in the presence of GM2 or GM1 (60 µM) for 48 hours. Cells were then collected and analysed by flow cytometry as described under Experimental methods. Results are expressed as the percentage of cells in each phase of the cell-cycle G0/G1, S and G2/M. Results represent means ± SEM of 5 independent experiments.
Figure 1
C
A
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0
20
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105 )
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D
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*
*
*C
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tota
l pro
tein
s / c
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r controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM
0
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0 1 2 3 4 5days
cell
num
ber (
105 )
controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM
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200
400
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800
1000
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tein
s (µg
)
0 1 2 3 4 5days
controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM
D
control
GlcN 0.5 mM
GlcN 5 mMC
A
B
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20
40
60
80
100
0 1 2 3 4days
tota
l pro
tein
s / c
ell n
umbe
r controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM
controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM
0
10
20
30
40
0 1 2 3 4 5days
cell
num
ber (
105 )
controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM
0
10
20
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0 1 2 3 4 5days
0 1 2 3 4 5days
cell
num
ber (
105 )
controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM
controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM
0
200
400
600
800
1000
1200
tota
l pro
tein
s (µg
)
0 1 2 3 4 5days
0 1 2 3 4 5days
controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM
controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM
D
controlcontrol
GlcN 0.5 mMGlcN 0.5 mM
GlcN 5 mMGlcN 5 mM
*** *
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*
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Figure 2
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0 0.5 1 2 5GlcN (mM)
G2/MSG0/G1
G2/MSG0/G1
% o
f cel
ls
Figure 3
p27
GM2 GM1control 0.5 5GlcN (mM)
β-actin
B
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
fold
cha
nge
control 0.5 5 GM1 GM2GlcN (mM)
β-actin
p21
control 0.5 5 GM2 GM1GlcN (mM)
A
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
fold
cha
nge
control 0.5 5 GM1 GM2GlcN (mM)
p27
GM2 GM1control 0.5 5GlcN (mM)
β-actin
B
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
fold
cha
nge
control 0.5 5 GM1 GM2GlcN (mM)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
fold
cha
nge
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
fold
cha
nge
control 0.5 5 GM1 GM2GlcN (mM)
control 0.5 5 GM1 GM2GlcN (mM)
β-actin
p21
control 0.5 5 GM2 GM1GlcN (mM)
A
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
fold
cha
nge
control 0.5 5 GM1 GM2GlcN (mM)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
fold
cha
nge
control 0.5 5 GM1 GM2GlcN (mM)
control 0.5 5 GM1 GM2GlcN (mM)
Figure 4
A
B
0 50.50
1
2
3
4
5
6
GlcN (mM)
µg /
mg
prot
eins
GM3 GD1a GD3
µg /
mg
prot
eins
ND
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8 GM2
GM1
0 50.5GlcN (mM)
*
ND ND
GT1b (internal
std)
GlcN (mM)stds50 0.5
origin
GM1GM2
GM3
GD3
GD1aGD3
C
control cells
GlcN-treated cells
GM1GM2GM3
GD1aGD3
A
B
0 50.50
1
2
3
4
5
6
GlcN (mM)
µg /
mg
prot
eins
GM3 GD1a GD3
µg /
mg
prot
eins
ND
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8 GM2
GM1
0 50.5GlcN (mM)
*
ND ND
0 50.50
1
2
3
4
5
6
GlcN (mM)
µg /
mg
prot
eins
GM3 GD1a GD3
µg /
mg
prot
eins
ND
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8 GM2
GM1
0 50.5GlcN (mM)
*
ND ND
GT1b (internal
std)
GlcN (mM)stds50 0.5
origin
GM1GM2
GM3
GD3
GD1aGD3
C
control cells
GlcN-treated cells
GM1GM2GM3
GD1aGD3
control cells
GlcN-treated cells
GM1GM2GM3
GD1aGD3
Figure 5
A
control GM1 GM2
cell
num
ber (
105 )
B
tota
l pro
tein
s (µg
)
control GM1 GM2
C
prot
ein
to c
ell n
umbe
r rat
io
control GM1 GM2
* *
* *
02468
10121416
050
100150200250300350400450
0
51015202530
35
A
control GM1 GM2 control GM1 GM2
cell
num
ber (
105 )
B
tota
l pro
tein
s (µg
)
control GM1 GM2 control GM1 GM2
C
prot
ein
to c
ell n
umbe
r rat
io
control GM1 GM2 control GM1 GM2
* *
* *
02468
10121416
02468
10121416
050
100150200250300350400450
050
100150200250300350400450
0
51015202530
35
0
51015202530
35
Table 1
G0/G1 S G2/M
Control ±58 2 22±1 19±1
GlcN 0.5 mM 71±1 13±1 16±1
GlcN 5 mM 54±1 15±1 29±2
GM2 79±2 9±1 ±12 1
GM1 79±1 8±1 12±1
Cell-cycle phase G0/G1 S G2/M
Control ±58 2 22±1 19±1
GlcN 0.5 mM 71±1 13±1 16±1
GlcN 5 mM 54±1 15±1 29±2
GM2 79±2 9±1 ±12 1
GM1 79±1 8±1 12±1
G0/G1 S G2/M
Control ±58 2 22±1 19±1±58 258 2 22±122±1 19±119±1
GlcN 0.5 mM 71±1 13±1 16±171±171±1 13±113±1 16±116±1
GlcN 5 mM 54±1 15±1 29±254±154±1 15±115±1 29±229±2