UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE „GR. T. POPA” IAŞI FACULTATEA DE MEDICINĂ TEZĂ DE DOCTORAT - REZUMAT - BIOCOMPATIBILITATEA UNOR BIOMATERIALE DESTINATE INGINERIEI TISULARE – MODALITĂŢI DE EVALUARE – Conducător științific PROF.UNIV. DR. ELENA CARMEN COTRUTZ Doctorand ANA MARIA MANOILESCU (HOLICOV) IAȘI - 2015
27
Embed
Rezumat Teza - BIOCOMPATIBILITATEA UNOR BIOMATERIALE
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE „GR. T. POPA” IAŞI
FACULTATEA DE MEDICINĂ
TEZĂ DE DOCTORAT
- REZUMAT -
BIOCOMPATIBILITATEA UNOR BIOMATERIALE
DESTINATE INGINERIEI TISULARE
– MODALITĂŢI DE EVALUARE –
Conducător științific
PROF.UNIV. DR. ELENA CARMEN COTRUTZ
Doctorand
ANA MARIA MANOILESCU (HOLICOV)
IAȘI - 2015
2
CUVINTE CHEIE:
Testarea biocompatilității
Teste de viabiliate/citotoxicitate/proliferare celulară
Inginerie tisulară
3
4
5
6. APLICAREA TESTELOR DE VIABILITATE CELULARĂ / CITOTOXICITATE
ÎN PENTRU EVALUAREA BIOCOMPATIBILITĂȚII BIOMATERIALELOR CU
APLICAȚII MEDICALE – STUDIU BIBLIOGRAFIC
Motivația studiului
Pentru a evidenția importanța studiului comparativ al metodelor de evaluare a
biocompatibilității materialelor cu potențiale aplicații medicale, am efectuat un scurt studiu
bibliografic din care să reiasă numărul de articole publicate în domeniu precum și numărul de
articole care studiază aspecte ale biocompatibilității in vitro și care utilizează diferite metode,
unele dintre ele aplicate sau comparate în prezenta teză de doctorat. Scopul acestui studiu
bibliografic a fost de a releva tipurile de teste de evaluare a biocompatibilității cel mai
frecvent utilizate în publicațiile de profil. Un scop secundar al acestui studiu a fost acela de a
evidenția modul în care testele utilizate pentru evaluarea biocompatibilității (tipul de test,
subcategoria de test) sunt adaptate cerințelor prezentului. Termenii au fost căutați în titlu și
rezumat.
Rezultate
Termenul MTT este în general mai utilizat în literatura de specialitate pentru a defini
testele pe bază de săruri de tetrazoliu. Astfel, pentru termenul „biomaterial tetrazolium” am
obținut 616 rezultate față de 1443 pentru termenul „biomaterial MTT”, ceea ce demonstrează
utilizarea mai frecventă a termenului MTT pentru testele pe bază de săruri de tetrazoliu. În
același timp, căutarea defalcată după clasificarea biomaterialelor pentru termenul „biomaterial
tetrazolium” a determinat valori care, însumate, ajung la valoarea de 499, o diferență notabilă
față de căutarea cu termenul generic.
Explorând subcategoriile de teste metabolice pe bază de săruri de tetrazoliu, am
remarcat utilizarea aproape exclusivă a testului MTT (1437 rezultate) față de celelalte
variante, mai performante sau mai puțin toxice pentru celule (așa cum am demonstrat într-un
experiment ulterior). Majoritatea testelor MTT au fost aplicate materialelor polimerice (935
rezultate), urmate la egală distanță de materialele metalice (263 rezultate) și compozite (160
rezultate). Pentru materialele ceramice, căutarea pentru testul MTT a adus numai 79 rezultate.
Astfel, rezultatele globale per subcategorie de test care utilizează săruri de tetrazoliu
au arătat dominația absolută a testului MTT (1437/1443 în funcție de tipul de căutare pe
terminologie „însumate în funcție de clasificarea biomaterialelor” / „biomaterial MTT”), la
mare distanță se situează rezultatele evaluării biocompatibilității prin alte teste cum ar fi MTS
2. Testele care utilizează celule aderente sunt, în mod evident, cele mai utile pentru
evaluarea biocompatibilității unor materiale care au potențial de utilizare în contact direct
cu țesuturile umane.
3. Testul MTT deși este cel mai frecvent utilizat în testarea biocompatibilității
biomaterialelor, deoarece prezintă un cost redus de utilizare, prezintă inconvenientul unui
timp de incubare de 1-4 ore )cu creșterea toxicității compusului asupra celulelor) și al
dependenței de variațiile pH. De asemenea, testul MTT este un marker al intensității
metabolice a celulelor vii și doar indirect (sau aproape deloc) un marker al proliferării
celulare.
4. Testele pe bază de resazurină-resorufină utilizate pentru determinarea biocompatibilității
pun probleme la citirea și interpretarea viabilității celulare. Incubarea peste 4 ore
determină efecte citotoxice, existând, de asemenea, inconvenientul unor
manipulări/incubări care impietează asupra unei eventuale proceduri de screening.
5. Testele de evaluare a viabilității prin determinarea cantității de ATP sunt fiabile dar
influențate de o serie de factori. La un număr de 2 - 4 recongelări, compusul reconstituit
pierde din fiabilitatea răspunsului și rezultatele sunt alterate. Compoziția mediului de
cultură și prezența roșului-fenol influențează interpretarea rezultatelor biocompatibilității.
Tipurile de plăci utilizate la interpretarea rezultatelor sunt esențiale pentru validitatea
datelor prin prezența diferitelor tipuri de interferențe.
6. Din testele de evaluare a biocompatibilității pe baza integrității membranare, testul cu PI
nu este recomandat nici pentru materiale metalice nici pentru cele polimerice, testul cu
albastru tripan realizează o supraevaluare a viabilității, fiind util numai pentru numărarea
celulelor care vor fi aplicate pe materialele de studiu.
7. Testele de aderență și migrare beneficiază de kiturile fluorescente Cell Tracker care pot
extinde durata testului pe 4 maxim 5 zile, pentru o menținere a fluorescenței în limitele
unei interpretări corecte, interpretare care nu trebuie să influențeze efectul eventual toxic
al biomaterialului de studiat. Testele cu cell tracker nu sunt utile pentru materiale care ar
putea elimina amine si tioli.
8. Pentru testarea biocompatibilității unor pulberi (metalice, metalice acoperite, particule,
nanoparticule) este necesar ca aceste eșantioane de testat să fie adăugate după obținerea
subconfluenței celulare în godeurile de test.
9. Evaluarea citotoxicității prin utilizarea metodei indirecte (cu utilizarea lichidului de
extracție) nu dă rezultate mulțumitoare, mai exact viabilitatea celulară este supraevaluată.
Pentru testele de aderență și migrare celulară se recomandă a renunța la efectuarea testului
de cicatrizare prin zgâriere în cazul testelor care explorează migrarea celulară pe suprafețe
polimerice ale unor biomateriale cu potențiale aplicații biomedicale. Testul cu opritor este
mult mai fiabil și oferă rezultate de acoperire mai bune și mai apropiate de realitate.
Constructul artizanal realizat în cadrul tezei este netoxic pentru perioada relativ scurtă de
incubare cu celulele, este ușor customizabil dimensional, se poate autoclava și prezintă un
preț de producție extrem de redus în raport cu produsele existente pe piață.
10. S-ar recomanda aplicarea unui test de citotoxicitate combinat cu explorare imagistică și
cuantificare. Eventual explorare imagistică SEM.
25
11. Un studiu personal s-a finalizat cu obținerea unui material bazat pe un polimer
biodegradabil, cu o structură poroasă demonstrată, util ca de suport pentru proliferarea
celulară a celulelor cu fenotip osteoblastic. Materialul descris a fost caracterizat fizico-
chimic și biologic și testat după metodele considerate cele mai fiabile ca urmare a
studiului precedent. Rezultatele au arătat o bună biocompatibilitate a spumei produse și un
potențial de dezvoltare pentru un scaffold destinat ingineriei tisulare.
12. Nu există o metodă unică, rapidă, ieftină, cantitativă de evaluare a viabilității la interfața
cu biomaterialul. Este necesară o selectare a metodologiei nu numai în raport cu
rezultatele urmărite ci și cu tipul materialului și costurile estimate ale investigațiilor de
urmat. Soluția ideala rămâne transfecția GFP sau utilizarea unor metode fizice care evită
transfecția.
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ 1. Wiese KG, Heinemann DE, Ostermeier D, Peters JH. Biomaterial properties and biocompatibility in cell culture of a
novel self-inflating hydrogel tissue expander. J Biomed Mater Res. 2001;54(2):179-88. 2. Lu J, Laudinet J, Williams S. Mechanical stimulation and evaluation of hydrogel biomaterial. Bio-medical materials and
engineering. 2008;18(4-5):335-7.
3. Nishi C, Nakajima N, Ikada Y. In vitro evaluation of cytotoxicity of diepoxy compounds used for biomaterial
modification. J Biomed Mater Res. 1995;29(7):829-34. 4. Kawagoishi N, Nojiri C, Senshu K, Kido T, Nagai H, Kanamori T, et al. In vitro evaluation of platelet/biomaterial
interactions in an epifluorescent video microscopy combined with a parallel plate flow cell. Artificial organs.
1994;18(8):588-95.
5. Ciapetti G, Cenni E, Pratelli L, Pizzoferrato A. In vitro evaluation of cell/biomaterial interaction by MTT assay. Biomaterials. 1993;14(5):359-64.
6. Cenni E, Ciapetti G, Pratelli L, Pizzoferrato A. [In vitro and in vivo evaluation of the blood-biomaterial interaction].
Minerva cardioangiologica. 1992;40(9):297-316.
7. Jacker HJ, Meyer R, Gruttner S. [The toxicologic evaluation of biomaterials. 1. Results of biomaterial tests in cultures of human amnion epithelial cells and human fibroblasts]. Die Pharmazie. 1985;40(7):472-5.
8. Park JB, Lakes RS. Introduction to Biomaterials. Biomaterials: Springer; 1992. p. 1-6.
9. Narayan RJ, Bhaduri SB, Fischman G, Michael Rigsbee J, Zhang X. Next generation biomaterials. Materials Science and Engineering: C. 2007;27(3):345-6.
10. Lakes RS. Biomaterials: an introduction: Springer; 2007.
11. Park JB, Bronzino JD. Biomaterials: principles and applications: crc press; 2002.
12. Park JB, Lakes RS. Metallic implant materials. Biomaterials. 2007:99-137. 13. Lakes R. Composite biomaterials. JD Bronzino, ed. 1995:598-610.
14. Williams D. The relationship between biomaterials and nanotechnology. Biomaterials. 2008;29(12):1737-8.
15. Colvin VL. The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature biotechnology. 2003;21(10):1166-
70. 16. Collet D, Lefebvre F, Quentin C, Rabaud M. In vitro studies of elastin-fibrin biomaterial degradation: preservative
effects of protease inhibitors and antibiotics. Biomaterials. 1991;12(8):763-6.
17. Cehreli M. Biomechanics of dental implants : handbook of researchers. Hauppauge, N.Y.: Nova Science; 2011. p. p.
18. McKinney RV, Lemons JE, American Academy of Implant Prosthodontics. The Dental implant : clinical and biological response of oral tissues. Littleton, Mass.: PSG Pub. Co.; 1985. xv, 205 p. p.
19. Caswell CW, Clark AE. Dental implant prosthodontics. Philadelphia: Lippincott; 1991. xvii, 331 p., 2 p. of plates p.
20. Garg AK. Implant dentistry : a practical approach. 2nd ed. Maryland Heights, Mo.: Mosby/Elsevier; 2010. xii, 338 p. p.
21. Pivodova V, Frankova J, Ulrichova J. Osteoblast and gingival fibroblast markers in dental implant studies. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czechoslovakia. 2011;155(2):109-16.
22. Steflik DE, Parr GR, Sisk AL, Lake FT, Hanes PJ, Berkery DJ, et al. Osteoblast activity at the dental implant-bone
interface: transmission electron microscopic and high voltage electron microscopic observations. Journal of
periodontology. 1994;65(5):404-13. 23. Boyd WD, Johnson WE, 3rd, Sultan PK, Deering TF, Matheny RG. Pericardial reconstruction using an extracellular
matrix implant correlates with reduced risk of postoperative atrial fibrillation in coronary artery bypass surgery patients.
The heart surgery forum. 2010;13(5):E311-6.
24. Romanos GE, Schroter-Kermani C, Weingart D, Strub JR. Health human periodontal versus peri-implant gingival tissues: an immunohistochemical differentiation of the extracellular matrix. The International journal of oral &
maxillofacial implants. 1995;10(6):750-8.
25. Zhu Q, Safavi KE, Spangberg LS. Integrin expression in human dental pulp cells and their role in cell attachment on
extracellular matrix proteins. Journal of endodontics. 1998;24(10):641-4. 26. Charoenpanich A, Wall ME, Tucker CJ, Andrews DM, Lalush DS, Loboa EG. Microarray analysis of human adipose-
derived stem cells in three-dimensional collagen culture: osteogenesis inhibits bone morphogenic protein and Wnt
signaling pathways, and cyclic tensile strain causes upregulation of proinflammatory cytokine regulators and angiogenic
factors. Tissue engineering Part A. 2011;17(21-22):2615-27. 27. Meyer U, Meyer T, Schlegel W, Scholz H, Joos U. Tissue differentiation and cytokine synthesis during strain-related
bone formation in distraction osteogenesis. The British journal of oral & maxillofacial surgery. 2001;39(1):22-9.
Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg,; 2009. Available from: http://dx.doi.org/10.1007/978-3-540-77782-3.
29. Black J. Biological performance of materials : fundamentals of biocompatibility. 3rd ed. New York: Marcel Dekker;
1999. xii, 463 p. p. 30. Silver FH, Christiansen DL. Biomaterials science and biocompatibility. New York: Springer; 1999. x, 342 p. p.
31. Biocompatibility and performance of medical devices. Philadelphia, PA: Woodhead Pub.; 2012.
32. Ducheyne P. Comprehensive biomaterials. Amsterdam ; Boston: Elsevier; 2011.
33. Williams DF. Biocompatibility of clinical implant materials. Boca Raton, Fla.: CRC Press; 1981. 34. Lamhaut L, Apriotesei R, Combes X, Lejay M, Carli P, Vivien B. Comparison of the accuracy of noninvasive
hemoglobin monitoring by spectrophotometry (SpHb) and HemoCue(R) with automated laboratory hemoglobin
measurement. Anesthesiology. 2011;115(3):548-54.
35. Liddington RC. Structural Aspects of Integrins. I Domain Integrins: Springer; 2014. p. 111-26. 36. Daniel LL, Joyner WL, Singh M, Singh K. Integrins: Implications for Aging in Heart Failure Therapy. Aging and Heart
Failure: Springer; 2014. p. 401-10.
37. Koivisto L, Heino J, Häkkinen L, Larjava H. Integrins in Wound Healing. Advances in Wound Care. 2014.
38. Sun C-C, Qu X-J, Gao Z-H. Integrins: players in cancer progression and targets in cancer therapy. Anti-cancer drugs. 2014;25(10):1107-21.
39. Ruoslahti E, Pierschbacher MD. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science. 1987;238(4826):491-7.
40. Kishimoto TK, Larson RS, Corbi AL, Dustin ML, Staunton DE, Springer TA. The leukocyte integrins. Advances in
immunology. 1989;46:149-82. 41. McEver RP. Rolling back neutrophil adhesion. Nat Immunol. 2010;11(4):282-4.
42. Bromley SK, Luster AD. Turning up the heat on HEVs. Nature immunology. 2006;7(12):1288-90.
43. Pu F, Williams R, Markkula T, Hunt J. Effects of plasma treated PET and PTFE on expression of adhesion molecules by
human endothelial cells in vitro. Biomaterials. 2002;23(11):2411-28. 44. Klokkevold PR, Vandemark L, Kenney EB, Bernard GW. Osteogenesis enhanced by chitosan (poly-N-acetyl
glucosaminoglycan) in vitro. Journal of periodontology. 1996;67(11):1170-5.
45. Muzzarelli R, Zucchini C, Ilari P, Pugnaloni A, Mattioli Belmonte M, Biagini G, et al. Osteoconductive properties of
methylpyrrolidinone chitosan in an animal model. Biomaterials. 1993;14(12):925-9. 46. Lewinski N, Colvin V, Drezek R. Cytotoxicity of nanoparticles. Small. 2008;4(1):26-49.
47. Nafee N, Schneider M, Schaefer UF, Lehr C-M. Relevance of the colloidal stability of chitosan/PLGA nanoparticles on
their cytotoxicity profile. International journal of pharmaceutics. 2009;381(2):130-9.
48. Strober W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology: John Wiley & Sons, Inc.; 2001.
49. Altman SA, Randers L, Rao G. Comparison of trypan blue dye exclusion and fluorometric assays for mammalian cell
50. Brana C, Benham C, Sundstrom L. A method for characterising cell death in vitro by combining propidium iodide staining with immunohistochemistry. Brain research Brain research protocols. 2002;10(2):109-14.
51. Newbold A, Martin BP, Cullinane C, Bots M. Detection of apoptotic cells using propidium iodide staining. Cold Spring
Harbor protocols. 2014;2014(11):pdb prot082545.
52. Hezel M, Ebrahimi F, Koch M, Dehghani F. Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain. Micron. 2012;43(10):1031-8.
53. Fotakis G, Timbrell JA. In vitro cytotoxicity assays: comparison of LDH, neutral red, MTT and protein assay in
hepatoma cell lines following exposure to cadmium chloride. Toxicology letters. 2006;160(2):171-7.
54. Han X, Gelein R, Corson N, Wade-Mercer P, Jiang J, Biswas P, et al. Validation of an LDH assay for assessing nanoparticle toxicity. Toxicology. 2011;287(1):99-104.
55. Jones LJ, Gray M, Yue ST, Haugland RP, Singer VL. Sensitive determination of cell number using the CyQUANT®
cell proliferation assay. Journal of immunological methods. 2001;254(1):85-98.
56. Meffert RM, Langer B, Fritz ME. Dental implants: a review. Journal of periodontology. 1992;63(11):859-70. 57. Brånemark P, Adell R, Albrektsson T, Lekholm U, Lundkvist S, Rockler B. Osseointegrated titanium fixtures in the
treatment of edentulousness. Biomaterials. 1983;4(1):25-8.
58. Roth BL, Poot M, Yue ST, Millard PJ. Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic
acid stain. Applied and environmental microbiology. 1997;63(6):2421-31. 59. Vohra S, Hennessy KM, Sawyer AA, Zhuo Y, Bellis SL. Comparison of mesenchymal stem cell and osteosarcoma cell
adhesion to hydroxyapatite. Journal of materials science Materials in medicine. 2008;19(12):3567-74.
60. Tenstad E, Tourovskaia A, Folch A, Myklebost O, Rian E. Extensive adipogenic and osteogenic differentiation of
patterned human mesenchymal stem cells in a microfluidic device. Lab on a chip. 2010. 61. Ridley AJ, Schwartz MA, Burridge K, Firtel RA, Ginsberg MH, Borisy G, et al. Cell migration: integrating signals from
front to back. Science. 2003;302(5651):1704-9.
62. Liang CC, Park AY, Guan JL. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration
in vitro. Nature protocols. 2007;2(2):329-33. 63. Sreenivasan K. Enhanced drug uptake and retention by surface phosporylated polyvinyl alcohol. Journal of applied
polymer science. 2004;94(2):651-6.
64. Kokubo T, Takadama H. How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity? Biomaterials. 2006;27(15):2907-15.
65. Noe DA, Weedn V, Bell WR. Direct spectrophotometry of serum hemoglobin: an Allen correction compared with a three-wavelength polychromatic analysis. Clinical chemistry. 1984;30(5):627-30.
66. Datta P, Chatterjee J, Dhara S. Phosphate functionalized and lactic acid containing graft copolymer: synthesis and
evaluation as biomaterial for bone tissue engineering applications. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition.
2013;24(6):696-713.
27
Lista lucrărilor publicate sau acceptate la publicare din subiectul tezei de doctorat
1. Comparative assessment of biocompatibility of NiCr and CoCr alloys used in metal-