Indri Kusharyanti, M.Sc., Apt REVIEW BIOANALISIS
Jan 16, 2016
Indri Kusharyanti, M.Sc., Apt
REVIEW BIOANALISIS
A bioanalytical method consists of two main components:
1. Sample preparation – extraction of the drug from the biological fluid usually including a concentration step to enhance sensitivity of the method
2. Detection of the compound – ususally following chromatographic separation from other components present in the biological extract. The detector of choice is a mass spectrometer.
BIOANALISIS
Secara umum proses analisis minimal mempunyai 5 langkah :1. sampling (pengambilan sampel), 2. preservasi sampel (penyimpanan sampel),3. preparasi sampel (penyiapan sampel),4. analisis (pengukuran), 5. interpretasi data (analisis data), dan6. pembuatan laporan analisis.
SAMPEL BIOLOGISDARAH
Whole BloodPlasmaSerum
URINESALIVASPUTUMSPERMACAIRAN
SEREBROSPINAL
FESESJARINGAN
LIVERPANKREASBRAINRAMBUTPLACENTA
METHOD VALIDATION
Any method is valid as long as it is validated
Procedures that demonstrate that a method is reliable and reproducible for the intended use.
Types:– Full validation: first time, new drug, or addition of
metabolites– Partial validation: modifications of a validated method– Cross-validation: comparison between methods
PRE-STUDY VALIDATION
Fundamental parameters for validation
Method used for the determination of drugs and/or metabolites should be:
Selective Sensitive
Accurate Precise
Stable
Analysis of drugs and their metabolites in a biological matrix is carried out using samples spiked with calibration (reference) standards and using quality control (QC) samples
The purity of the reference standard used to prepare spiked samples can affect study data
For this reason, an authenticated analytical reference standard of known identity and purity should be used to prepare solutions of known concentrations
Reference standard
The source and lot number, expiration date, certificates of analyses when available, and/or internally or externally generated evidence of identity and purity should be furnished for each reference standard
If possible, the reference standard should be identical to the analyte
When this is not possible, an established chemical form (free base or acid, salt or ester) of known purity can be used
Reference standard
Three types of reference standards are usually used:(1) certified reference standards (e.g., USP
compendial standards);(2) commercially supplied reference standards
obtained from a reputable commercial source;(3) other materials of documented purity
custom-synthesized by an analytical laboratory or other noncommercial establishment
Reference standard
proses yang harus dilakukan untuk menyiapkan sampel sehingga siap untuk dianalisis menggunakan instrumentasi yang sesuai.
Preparasi Sampel
Sample preparation for DNA Extraction
Potential interfering substances in a biological matrix include endogenous matrix components, metabolites, decomposition products, and in the actual study, concomitant medication and other exogenous xenobiotics
14AnFar.S2-08
Metode yang paling umum digunakan :- Pengendapan protein sebagai garam yang tidak larut
Deproteinisasi
Protein
pH rendah ( asam kuat ) pH tinggi ( basa kuat )
muatan positif muatan negatif
16AnFar.S2-08
Pengaturan pH
Sampel (protein) Sampel (protein)
pH larutan < pH larutan >
titik isoelektrik titik isoelektrik
protein sbg kation protein sbg anion
bereaksi dng anion ttt.
membentuk garam tak larut
bereaksi dng kation ttt. membentuk garam tak larut
Precipitating Agents
Anionik Kationik
• pikrat Ion-ion logam berat spt. :
• molibdat• tungstat• sulfosalisila
t• metafosfat• perklorat• trikloroaset
at
-------
seng merkuri Kadmiu
muraniumbesitembag
atimbal
(Zn)(Hg)(Cd)(U)(Fe)(Cu)(Pb)
--
ZnSO4
ZnSO4/Ba(OH)2
Bila sejumlah tertentu air
dihilangkan dari protein
Protein akan mengendap
AnFar.S2-08
Deproteinisasi dgn dehidrasi
SENTRIFUGASI
Deproteinisasi dgn cara dehidrasi
“ Solvent “( suhu rendah )
AsetonitrilAsetonMetanolEtanol
“ Salting out ”( protein pada
titik isoelektrik )+
Garam( Na sulfat, Na
sulfit )
Protein mengendap
20AnFar.S2-08
Untuk menghasilkan supernatan yang jernih dan berisi komponen yang diinginkan.
Pemisahan dilakukan berdasar sifat partikel dalam medan gaya senrifugal.
Tingkat pemisahan biasanya: 1. Sel utuh dan pengotor2. Inti sel, kloroplas, mitokondria, lisosom3. Mikrosom, ribosom
SENTRIFUGASI
22AnFar.S2-08
Concentrate analyte(s) to improve limits of detection and/or quantitation
Exchange analyte from a non-compatible environment into one that is compatible with chromatography and mass spectrometric and/or other instrumental analytical techniques
Remove unwanted matrix components that may interfere with the analysis of the desired compound
Perform selective separation of individual components from complex mixtures, if desired
Detect toxins in human system or in environment (air, drinking water, soil)
Identify stereochemical effects in drug activity and/or potency Follow drug binding to proteins Determine stability and/or absorption of drugs and follow their
metabolism in human body
tujuannya
Liquid-Liquid Extraction (LLE)
Partitioning of analytes between water phase and organic phase
Kurang cocok untuk :
- sampel komplek (sampel
biologis)
- presisinya rendah
Cocok untuk :
- water insoluble compound
dalam water-soluble matrix
SPE retains analyte from a flowing liquid sample on solid sorbent, analyte is recovered via elution from the sorbent
Phase types:Reverse phaseNormal phaseIon exchangeAdsorption
Solid Phase Extraction (SPE)
27AnFar.S2-08
The Four Basic Steps of A Solid-Phase Extraction
Nonpolar: Reverse phase C18 (octadecyl bonded
silica) and C8 (octyl bonded silica) are most commonly used for hydrophobic analytes
Polar: Normal phase SPE uses cyanopropyl
bonded, diol bonded, or amino propyl bonded silica (used for polar analytes such as cationic compounds and organic acids)
Electrostatic: Ionic Exchange SPE is based on
electrostatics uses quaternary amine, sulfonic acid, or carboxylic acid bonded silica
Adsorption type SPE uses unmodified materials such as alumina, Florosil, resins
Solid Phase Extraction (SPE)
SPE uses a cartridge or discMay be performed a one time use syringe or a
multiple cartridge unit
Solid Phase Extraction (SPE)
SPE uses a cartridge or disc May be performed a one time use syringe or a multiple
cartridge unit
Solid Phase Extraction (SPE)
31AnFar.S2-08
Various SPE Phases and Conditions
Mekn.pmsh Tipe fase Struktur Eluting solv.Tipe analit Loading solv.
32AnFar.S2-08
A 5 step process Advantages over L-L include: smaller volume solvent used, no emulsions,
automation results in reduced time and cost Based on a solvent-free sorption-desorption process SPME is a fused silica fiber coated with solid adsorbent Organic analytes absorb to the fiber, released by heating in GC port Combines extraction, concentration, and injection in one process
Solid Phase Microextraction (SPME)
34AnFar.S2-08
35AnFar.S2-08
36AnFar.S2-08
37AnFar.S2-08
KhromatografiHPLC, GC, TLC
SpektroskopiUV-Vis, Spektrofluorometri, IR, NMR, MS, AAS
ElektroforesisImmunoassay
EIA, ELISA, Western Blot, Soutern Blot,
Instrumen Bioanalisis
39
Merupakan teknik pemisahan senyawa dengan cara melewatkan senyawa melalui fase diam (stationary phase)
Senyawa dalam kolom tersebut akan dielusi dengan fase gerak (mobile phase)
Senyawa dalam kolom akan keluar dari kolom atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi kekuatan interaksi senyawa dengan fase diam dan fase gerak
DKS-09
HPLC
40
Senyawa yang keluar dari kolom akan dideteksi dengan detektor yang sesuai dan dilaporkan sebagai kromatogram
Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak
Untuk analisis kualitatif digunakan informasi tR, sedangkan untuk analisis kuantitatif digunakan informasi luas area/tinggi puncak kromatogram
DKS-09
HPLC
41
Metode hplc dipilih bila akan menganalisis senyawa dalam sampel:
- yang tercampur dengan matriks yang sangat komplek
- dengan kadar sangat kecil
Metode hplc dipilih bila akan menganalisis beberapa senyawa sekaligus (secara simultan)
DKS-09
HPLC
42
Senyawa polar:- terelusi belakangan (tR panjang)- semakin non-polar fase gerak, tR senyawa
polar makin panjang
Solven: - campuran metilen klorid, dietileter, kloroform
Eluent strength: - dimodifikasi dengan n-heksanDKS-09
Normal-Phase HPLC[ Fase diam lebih polar dibanding fase
gerak ]
43
Senyawa polar: - terelusi lebih dahulu Semakin polar fase gerak, senyawa non-polar lebih kuat tertahan
Solvent: Campuran metanol, asetonitril, tetra- hidrofuran Eluent strength: - dimodifikasi dengan air
(Kellner dkk., 1998)
DKS-09
Reversed-Phase HPLCReversed-Phase HPLC[ Fase diam lebih nonpolar dibanding fase gerak ]Reversed-Phase HPLC[ Fase diam lebih nonpolar dibanding fase gerak ]
44DKS-09
HPLC
45DKS-09
wadah untuk sampel yang siap diinjeksikan[ jumlah kecil ]
46
Derivatisasi adalah reaksi suatu senyawa dengan pereaksi (agen) penderivat untuk menghasilkan derivat (turunan) senyawa ybs
Menghasilkan senyawa yang tadinya tidak bisa dideteksi menjadi bisa dideteksi (senyawa non-kromofor senyawa berkromofor)
Meningkatkan daya deteksinya (senyawa berkromofor UV senyawa berkromofor fluorescensi)
DKS-09
Tujuan Derivatisasi
metode pemisahan yang mendasarkan partisi cuplikan antara fase gerak dan fase diam
mempunyai kecepatan yang tetap dan aliran fase gerak ( gas ) sangat terkontrol,
sangat mudah terjadi pencampuran uap sampel ke dalam aliran fase gerak,
pemisahan fisik terjadi di dalam kolom yang jenisnya banyak sekali, panjang dan temperaturnya dapat diatur.
mempunyai banyak macam detektor yang dapat dipakai dan tanggap detektor (proporsional dengan jumlah tiap komponen yang keluar dari kolom),
kemudahan kromatografi gas yang digabungkan dengan instrumen fisiko kimia yang lainnya seperti GC-MS, GC-FTIR.
Gas Chromatography
DKS-09 48
DERIVATISASI
DKS-09 49
DERIVATISASI
Jenis Dasar Penggunaan Utama
Spektrofotometri UV-Vis
Perpindahan energi dari elektron luar yg terikat maupun tidak dlm molekul
Analisa biokimiawi kualitatif & kuantitatif secara rutin lewat uji kolorimetri, uji enzim dari kinetika reaksi
Spektrofluorometri Radiasi yang terserap dipancarkan lagi dalam gelombang yg lebih panjang
Analisis kuntitatif rutin, analisa enzim dan kinetika dan perubahan konformasi protein. Lebih peka dr Spek.UV-Vis
Spektrofotometri infra-merah (IR)
Vibrasi Atom karena perbedaan gerak dua kutub
Analisa kualitatif pengenalan molekul murni dengan ukuran sedang. Dipakai dlm penelitian.
TEKNIK-TEKNIK SPEKTROSKOPI
Jenis Dasar Penggunaan Utama
Spektrofotometri Nyala (pancaran & serapan, AAS)
Perubahan energi dari elektron terluar suatu atom setelah penguapan menjadi nyala
Analisa kualitatif & kuantitatif untuk metal, biasanya dlm biokimiawi klinis.
Spektrometri magnet inti
Penentuan tenaga magnetis yang berhubungan dengan proton ganjil pada inti atom
Penelitian struktur molekul organik dengan berat molekul kurang dari 20.000 dalton
Spektrometri massa (MS)
Penentuan jumlah molekul dan pecahannya yang terionisasi bermuatan positif
Analisa kualitatif denagn bahan sedikit (10-4 – 10-6 g), dapat dihubungkan dengan GC.
TEKNIK-TEKNIK SPEKTROSKOPI
ELISA (Enzyme-linked immuno-sorbent assay)
antigens are immobilized on a solid support, either coated directly or through specific capture antibodies. Primary detection antibodies are then applied, forming a complex with the antigen. If conjugated with an enzyme, the detection antibody can directly be used to quantify the antigen, or can itself be quantified by another enzyme-conjugated secondary antibody
•DNASouthern Blot
•RNANorthen Blot
•PROTEINWestern Blot
Blotting
Terminologies..A Southern blot is a method routinely used in
molecular biology for detection of a specific DNA sequence in DNA samples.
The northern blot is a technique used in molecular biology research to study gene expression by detection of RNA.
The Western blot (alternatively, protein immunoblot) is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.
Southwestern blotting, based along the lines of Southern blotting (which was created by Edwin Southern) and first described by B. Bowen and colleagues in 1980, is a lab technique which involves identifying and characterizing DNA-binding proteins (proteins that bind to DNA).
..Western Blot
Kebutuhan metode yang cepat & biaya ekonomis.Pengetahuan dasar komposisi bahan yang akan
dianalisis sehingga dpt dipilih metode dan cara penyiapan yg tepat.
Tingkat ketelitian yang dikehendaki Jika metode yg singkat dan biaya rendah sdh cukup
memadai, tidak perlu melakukan metode yg rumit dg tingkat ketelitian yg tinggi.
Berapa banyak sampel yang tersedia Jika sampel sedikit, sulit didapat & mahal, maka
perlu dipilih metode yg mampu mendeteksi sampel yg sedikit
PEMILIHAN METODE BIOANALISIS
etBon COURAGE