REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN PROCARIOTAS ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE LACZ
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REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN
GÉNICA EN PROCARIOTAS
ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE LACZ
Para conocer la organización del ADN se desarrollaron métodos que permitieron conocer
la secuencia exacta de nucleótidos, primeramente de regiones seleccionadas de un gen,
luego de un gen completo, y más recientemente de un genoma completo.
Tecnología del ADN recombinante
Hibridación de ácidos nucleicos, hace posible la localización de secuencias
determinadas de ADN o ARN.
Rotura especifica del ADN mediante “nucleasas de restricción”
Las moléculas de ADN de diferentes tamaños pueden separarse por
Electroforesis en gel.
Secuenciación de todos los nucleótidos de un fragmento purificado de ADN.
Amplificación de un fragmento de ADN mediante “Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR)”
Cuando una solución de
ADN se calienta se
rompen las uniones de
puentes de Hidrogeno que
mantienen unidas a las
dos hebras.
Cuando esta solución se
enfría las cadenas
complementarias forman
nuevamente la doble
hélice Renaturalización o
Hibridación.
Es un método sensible que permite la detección de secuencias especificas de nucleótidos.
Una sonda es un fragmento de ADN de cadena simple, generalmente de tamaño
pequeño, usado como herramienta para detectar la presencia de ADN o ARN de
secuencia complementaria igual o similar.
Entre las Técnicas que utilizan este principio podemos encontrar:
Northern blot (ARN)
Southern blot (ADN)
Western blot (proteínas)
Dot blot
En la década del 70´ se descubrieron enzimas bacterianas con
actividad ADNasa que reconocían una secuencia palindrómica particular y
la cortaban.
Estas nucleasas reconocen una secuencia específica de 4 a 8
nucleótidos de longitud, y producen un clivaje del ADN en el sitio
reconocido.
Las bacterias las utilizan como mecanismo de defensa contra virus
bacteriófagos, ya que reconocen sitios presentes en esos virus, que están
ausentes en el genoma de la bacteria, o que se encuentran modificados
por Metilación.
Se nombran con una sigla a partir del nombre de la especie bacteriana que
la presenta.
Un ejemplo de enzima de restricción lo ofrece la EcoRI, que proviene de
Eschericha coli, y reconoce la secuencia palindrómica:
Establece el número, el orden y la distancia entre los sitios de corte de
enzimas de restricción a lo largo de una secuencia de ADN.
En un genoma, una enzima de restricción puede producir un gran número de cortes
en los lugares donde reconozca la secuencia específica para hacerlo. Pequeños
cambios en la secuencia de ADN entre distintos individuos pueden modificar los
patrones de corte de las endonucleasas de restricción, dando lugar a la aparición de
los Polimorfismos de longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP).
Enzima MspI
No corta
Corta
a
A
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Esta técnica permite amplificar más de mil millones de veces un fragmento de ADN
obtenido a partir de una región seleccionada del genoma (Taq Polimerasa (Thermus
aquaticus), diseño de cebadores específicos, dNTPs).
PLÁSMIDOS BACTERIANOS
Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se
replican y transcriben independientes del ADN cromosómico.
En general, no contienen información esencial, sino que confieren diferentes ventajas
al hospedador. Ej: plásmidos que contienen genes de resistencia a un determinado
antibiótico.
Resistencia a
Ampicilina
Esta región Polylinker nos
permite incorporar un
fragmento de interés en el
plásmido, el cual sirve como
vector
Si se corta el plásmido y el fragmento de interés con la misma enzima de restricción,
luego los extremos generados por las Enzimas de Restricción pueden ser sellados por
una ADN ligasa. Esto permite la incorporación de fragmentos de ADN de cualquier
origen (animal, vegetal, etc.) dentro de un plásmido bacteriano.
El plásmido resultante es un híbrido que contiene ADN de dos especies diferentes, y
se denomina plásmido recombinante.
PLÁSMIDOS RECOMBINANTES
Existen tres procesos por los que el material genético exógeno se puede
introducir en una célula bacteriana:
TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO EN
BACTERIAS
Transformación
Transducción
Conjugación
La Conjugación es el proceso de transferencia de material genético entre
una célula procariota donadora y una receptora mediante el contacto directo o una
conexión que las una (pili sexuales en los Gram negativos, y contacto íntimo en
los Gram positivos).
Es un mecanismo de transferencia horizontal de genes como la transformación y
la transducción, con la diferencia de que estos últimos no involucran contacto
intercelular.
Conjugación
La transducción es un proceso mediante el cual el ADN es transferido desde
una bacteria a otra mediante la acción de un virus.
También se utiliza para designar al proceso mediante el cual ADN exógeno es
introducido en una célula mediante un vector viral.
Transducción
La transformación bacteriana es un proceso por el cual el material genético
exógeno se puede introducir en una célula bacteriana.
La transformación ocurre de forma natural en algunas especies de bacterias, aunque
también se puede efectuar por medios artificiales.
La tecnología del ADN recombinante reproduce esta transformación in vitro.
Transformación Bacteriana
Bacterias Competentes
Para introducir plásmidos en bacterias hay que lograr que las mismas se vuelvan
receptoras a elementos genéticos. Esto se hace mediante un procedimiento de
permeabilización que “afloja” la pared bacteriana. Estas bacterias “sensibilizadas” se
denominan bacterias competentes.
Bacterias Competentes
La competencia se produce a través de distintas técnicas, que aumentan la
permeabilidad de la pared bacteriana para permitir el ingreso de ADN exógeno.
Incluyen
• tratamiento con Cl2Ca
• cambios bruscos de temperatura
• electroporación
Transformación Bacteriana y Selección de transformantes
ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE
LACZ
PARTE 1: Preparación de una cepa bacteriana que exprese el operón
lac.
PARTE 2: Crecimiento e inducción de bacterias para el análisis de
expresión de lacZ. Toma de muestras para medición de actividad de β-
galactosidasa.
Trabajo Práctico
Análisis de la expresión de LacZ
Se utilizará una cepa bacteriana desprovista del gen lacZ.
PREPARACIÓN DE BACTERIAS PORTADORAS DEL
OPERÓN LAC
TRANSFORMACIÓN BACTERIANA
1- CEPA BACTERIANA (tiene una deleción que inactiva el gen lacZ)
lacI P O lacZ lacY lacA
Mediante el proceso de transformación bacteriana se introducirá un
plásmido portador del gen faltante, restableciéndose la expresión del
operón Lac en las células transformadas.
PREPARACIÓN DE BACTERIAS PORTADORAS DEL
OPERÓN LAC
TRANSFORMACIÓN BACTERIANA
1- CEPA BACTERIANA (tiene una deleción que inactiva el gen lacZ)
2- PLÁSMIDO (produce β-galactosidasa activa, aun sin ser una proteína
completa)
lacI P O lacZ lacY lacA
P O lacZ
PREPARACIÓN DE BACTERIAS PORTADORAS DEL
OPERÓN LAC
Selección de Transformantes
Resistencia a Ampicilina
Gen LacZ
1° SELECCIÓN DE TRANSFORMANTES
1° Selección de Transformantes
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