Aus der Klinik und Poliklinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe – Innenstadt - der Ludwig-Maximilians-Universität München Direktor: Prof. Dr. Friese Prognostische Bedeutung der Expression von p53, KI67, HER2, Topoisomerase IIα, nm23 und EGFR sowie Disseminierter Tumorzellen im Knochenmark (DTZ-KM) bei Patientinnen mit Ovarialkarzinom Dissertation zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität zu München vorgelegt von Maryam Zerzer aus Teheran im Jahre 2008
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Prognostische Bedeutung der Expression von p53, KI67, HER2 ... · 5 1 Einleitung 1.1 Das Ovarialkarzinom 1.1.1 Epidemiologie Das Ovarialkarzinom ist das gynäkologische Malignom mit
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Aus der Klinik und Poliklinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe – Innenstadt - der
Ludwig-Maximilians-Universität München
Direktor: Prof. Dr. Friese
Prognostische Bedeutung der Expression von p53, KI67, HER2, Topoisomerase IIα,
nm23 und EGFR sowie Disseminierter Tumorzellen im Knochenmark (DTZ-KM) bei
Patientinnen mit Ovarialkarzinom
Dissertation
zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin
an der Medizinischen Fakultät der
Ludwig-Maximilians-Universität zu München
vorgelegt von
Maryam Zerzer
aus Teheran
im Jahre 2008
Mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität München
Berichterstatter: Prof. Dr. Harald Sommer
Mitberichterstatter: Priv. Doz. Dr. Peter Nelson
Priv. Doz. Dr. Florian May
Mitbetreuung durch den
promovierten Mitarbeiter:
Dekan: Prof. Dr. med. D. Reinhardt
Tag der mündlichen Prüfung: 03.04.2008
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Danksagung
Herrn Prof. Dr. Harald L. Sommer danke ich für die Bereitstellung des interessanten
Dissertationsthemas und die Möglichkeit in der immunhistologischen Abteilung der
I. Frauenklinik der Ludwig Maximilians Universität diese Arbeit erstellen zu können.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Christian Schindlbeck, für ausführliche Beratung
und hervorragende Betreuung, sowie Unterstützung bei der statistischen Auswertung
dieser Dissertation.
Herrn Dr. Peer Hantschmann möchte ich für die Beurteilung der immun-
histologischen Präparate danken.
Allen Mitarbeitern des immunhistologischen Labors der I. Frauenklinik danke ich für
die Hilfe bei der Bereitstellung der Präparate in einer sehr freundlichen Atmosphäre,
und vor allem bei Frau C. Kühn, die mit ihrer beispielhaften Fleiß und Engagement
1.2 Tumorcharakterisierung / Theorien zur Entstehung des Ovarialkarzinoms............... 13 1.3 Metastasierung und hämatogene Disseminierung der Tumorzellen............................. 14
1.4 Zielsetzung.......................................................................................................................... 25 2 Methodik und Material ................................................................................................... 28
2.1 Patientenkollektiv und Follow-up..................................................................................... 28 2.2 Das Tumormaterial............................................................................................................ 29 2.3 Immunhistochemische Untersuchung des Ovarialgewebes ........................................... 29
2.3.1 Theoretische Grundlagen: ............................................................................................................. 29 2.3.2 Die immunhistochemischen Nachweismethoden.......................................................................... 30
2.3.3 Herstellung der histologischen Schnitte ........................................................................................ 32 2.3.4 Praktische Durchführung der ABC-Methode zum immunhistochemischen Nachweis von Ki-67 (MIB-1), p53, Topoisomerase II sowie HER-2/neu ................................................................................... 33 2.3.5 Praktische Durchführung der ABC-Methode zum immunhistochemischen Nachweis von EGFR und nm23..................................................................................................................................................... 35 2.3.6 Die Materialien.............................................................................................................................. 36
2.4 Knochenmarkaspiration.................................................................................................... 38 2.5 Aufbereitung des Knochenmarkaspirates und Detektion Zytokeratin-positiver Zellen. ............................................................................................................................................. 38
2.5.1 Herstellung der Zytospins ............................................................................................................. 39 2.5.2 Die immunzytochemische Färbung............................................................................................... 40
2.6 Beurteilung immunhistologischer Ovarialkarzinom-Schnitte ....................................... 42 2.7 Statistik ............................................................................................................................... 43
Aszites, Peritonealkarzinose und systemische Therapie.
Endpunkte für das rezidivfreie Überleben waren das Auftreten der Lokalrezidive,
Fernmetastasen oder der Tod in Folge des Ovarialkarzinoms.
Das Follow-up erfolgte bis zum Tode oder bis zum Endpunkt im Mai 2003 über die
Nachsorgeuntersuchungstermine in der I. UFK. Diese Daten wurden aus den
Krankenjournalen entnommen. Von Patientinnen, die nicht mehr zur
Nachsorgeuntersuchungen in der I. UFK erschienen, wurden Daten über Rezidive,
Fernmetastasen und Überleben durch telefonischen Kontakt mit den Hausärzten
oder den Patientinnen selbst gewonnen.
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2.2 Das Tumormaterial Das Tumormaterial bestand aus Gewebeblöcken, die in den Jahren 1991 bis 2001
im Rahmen der Primäroperation von den Patientinnen gewonnen, für die
histologische Untersuchung formalinfixiert und paraffineingebettet und anschließend
archiviert wurden. Zu der immunhistochemischen Bestimmung der Tumorantigene
MIB-1 (Ki-67), p53, Topoisomerase, HER-2/neu, nm23 und EGFR wurden die
archivierten Gewebeblöcke erneut aufgearbeitet.
2.3 Immunhistochemische Untersuchung des Ovarialgewebes
2.3.1 Theoretische Grundlagen:
Grundsätzlich ist ein Proteinnachweis im Tumorgewebe mit verschiedenen
Analysemethoden, wie z.B. ELISA (enzym-linked immunosorbent assay), RIA
(Radioimmunoassay) oder immunhistochemischen Verfahren möglich. In der
vorliegenden Studie wurde das immunhistochemische Färbeverfahren zur
Charakterisierung der Tumorzellen im Ovarialgewebe und zum Nachweis der
Tumorzellen im Knochenmark verwendet. Der Vorteil dieses Verfahrens ist im
Gegensatz zu den ELISA- und RIA-Analysemethoden die spezifische Lokalisation
der Tumorproteine, die durch Einsatz der monoklonalen Antikörper gegen diese
Proteine ermöglicht wird.
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2.3.2 Die immunhistochemischen Nachweismethoden
2.3.2.1 Direkte Methode Der spezifische Antikörper ist direkt mit einem Fluorochrom oder einem Marker-
enzym, z.B. alkalische Phosphatase oder Peroxidase, konjugiert.
Vorteil dieser Methode ist die kurze Bearbeitungszeit. Sie besitzt jedoch mehrere
Nachteile. Für jedes nachzuweisende Antigen muss ein spezifisches Konjugat zur
Verfügung stehen. Das erzielte Farbsignal ist sehr schwach. Es ist keine längere
Archivierung bei Fluorochromen möglich, da das Signal durch Lichteinwirkung
verblasst. Der Primärantikörper muss speziell konjugiert werden, was aufwendig und
teuer ist. Um zu einer guten Markierung zu gelangen, müssen die Antikörper in
hohen Konzentrationen eingesetzt werden. Dieses Vorgehen verursacht zum einen
meist starke Hintergrundfärbung, und zum anderen ist es sehr teuer (Noll et al.,
2000).
2.3.2.2 Indirekte Methode Bei dieser Methode bindet ebenfalls ein spezifischer, aber unkonjugierter Primär-
antikörper an das Antigen der Probe. Im nächsten Schritt gibt man einen so
genannten Sekundärantikörper zu einem bereits gebundenen Primärantikörper. Der
Sekundärantikörper ist spezifisch gegen die Tierspezies des Primärantikörpers
gerichtet und ist mit einem Markerenzym oder Fluorochrom konjugiert. Bei Nachweis-
methoden mit einem Markerenzym benötigt man einen gegen den Sekundär-
antikörper gerichteten Komplex, welcher das gewünschte Markerenzym trägt. Bei
einer anschließenden Enzym-Substrat-Reaktion erhält man ein farbiges Endprodukt.
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Vorteil dieser Methode gegenüber der direkten Methode ist die höhere Sensitivität
(Noll et al., 2000).
2.3.2.3 Doppelt indirekte Methode Bei dieser Methode wird ein weiterer gleichartig konjugierter Tertiärantikörper
eingesetzt, um z.B. das Farbsignal bei Nachweisen mit Fluorochromen zu
verstärken. Zu dieser Methode zählen PAP (Peroxidase-Anti-Peroxidase) und APAP
(Alkalische Phosphatase Anti-Alkalische Phosphatase) (Noll et al., 2000).
2.3.2.4 ABC-Methode Die ABC-Methode (Avidin-Biotin-Complex) macht sich die Affinität von Avidin, ein
aus Hühnereiweiß gewonnenes Glykoprotein (Tetramer) mit vier Bindungsstellen für
Biotin (ein wasserlösliches Vitamin) zunutze, welches sich gut an den Brücken-
antikörpern verschiedener Tierspezies (z.B. Maus, Kaninchen usw.) koppeln lässt
und somit die Verbindung zum ABC-Komplex herstellt. An den Komplex ist ein
Enzym gekoppelt, wobei es sich sowohl um Peroxidase als auch um alkalische
Phosphatase handeln kann. Der immunologische Nachweis mit dieser Methode ist
sehr sensitiv (Noll et al., 2000).
Abbildung 1 – Schema der ABC-Methode mit Darstellung von Primärantikörper, biotinyliertem Brückenantikörper und ABC-Komplex (Noll, Schaub-Kuhnen, Praxis der Immunhistochemie, 2000)
2.3.3 Herstellung der histologischen Schnitte Ausgangsprodukt zur Herstellung der Schnitte sind formalinfixierte und in Paraffin
eingebettete Gewebeblöcke eines Ovarialkarzinoms.
Das Operationsmaterial wird sofort in 4%ig gepuffertem Formalin 24 Stunden lang
fixiert um eine Zerstörung der Proteine (Antigene) zu verhindern, und danach in
Paraffin eingebettet. Dadurch kann man die Gewebeblöcke ohne Verlust ihrer
Antigenstruktur über Jahre aufbewahren. Für die immunhistochemische Färbung
wird anhand der H&E-Schnitte der geeignetste Block für jeden Fall ausgesucht. An
einem Schlittenmikrotom werden 2-3 µm dicke Schnitte aus den Paraffinblöcken
gewonnen, auf Superfrost-plus Objektträger (Firma Menzel-Gläser) aufgezogen und
über Nacht bei 56 ˚C getrocknet, um ein gutes Anhaften der Präparate zu
gewährleisten.
32
33
2.3.4 Praktische Durchführung der ABC-Methode zum immunhistochemischen Nachweis von Ki-67 (MIB-1), p53, Topoisomerase II sowie HER-2/neu
Das Protokoll besteht aus folgenden Schritten:
1. 2-3 µm dicke Gewebeschnitte erstellen und auf Objektträger (OT) aufziehen
2. Entparaffinisieren der Objektträger in Xylol (10 min) Danach werden die OT in der folgenden Reihe in verschiedenen Medien von Xylol und absteigender Alkoholreihe bis Aqua dest. kurzfristig eingetaucht. Dadurch werden die OT schrittweise von einem fettlöslichen Medium (Xylol) zu einem wasserlöslichen Medium (Aqua dest.) überführt (rehydriert). 1 x Xylol 2 x Ethanol 100%ig 2 x Ethanol 96%ig 2 x Ethanol 70%ig 1 x Aqua dest.
3. Hitzedemaskierung im Dampfdruckkochtopf zum Aufheben der durch Formalin-Fixierung entstandenen Proteinvernetzung in einer kalzium-präzipitierenden Lösung. So kann der Antikörper sein spezifisches Epitop wieder erkennen. In einen handelsüblichen Schnellkochtopf werden die Lösungen A und B in Aqua dest. eingefüllt und die Kochplatte auf die höchste Stufe eingestellt. Wenn der Puffer sprudelnd kocht, werden die OT hineingestellt. Nach 3 Minuten wird die Temperatur auf die mittlere Stufe eingestellt. Nach weiteren 2 Minuten werden die OT aus dem Kochtopf herausgenommen. Lösung A: 0,1M Zitronensäure 21,01g (Merck #244) auf 1 l Aqua dest. Lösung B: 0,1M Na-Citrat 29,41g (Merck #6448) auf 1 l Aqua dest. Puffer: 18ml Lösung A + 82ml Lösung B + 900ml Aqua dest.
4. Öffnen des Deckels unter langsam fließendem Leitungswasser
5. Im Aqua dest. abkühlen (2x10 min)
6. Waschen im PBS-Puffer (Waschpuffer für Methoden mit Peroxidase, pH 7,2) (2x2min)
7. Blockierung endogener Peroxidase in 6%igen H2O2, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden (100ml 30%ige H2O2-Lösung + 400ml Aqua dest.) (10 min)
8. Waschen im PBS-Puffer (2x2 min)
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9. Inkubation mit Blockierungsserum von Vectastain Maus-IgG-Kit (Firma DAKO,
Dänemark) in der feuchten Kammer (20 min)
10. Abschütteln der Lösung
11. Inkubation mit Primärantikörper in der feuchten Kammer für die verschiedenen Färbungen mit jeweils entsprechendem Antikörper MIB-1 monoklonal IgG1 Maus Anti-Human Ki-67 Antigen, Verdünnung 1:50 mit PBS, 30 min bei Raumtemperatur (Rt) P53 monoklonal IgG2 Maus Anti-Human Antigen, Verdünnung 1:100 mit PBS, 45 min bei Rt. Topoisomerase II monoklonal IgG1k Maus Anti-Human Antigen,Verdünnung 1:50 mit PBS, 45 min bei Rt. HER-2/neu IgG1 Maus Klon:CB11 , Verdünnung 1:40 mit PBS, 30 min bei Rt.
12. Waschen im PBS-Puffer (2x2 min)
13. Inkubation mit Sekundärantikörper in der feuchten Kammer (30 min)
14. Waschen im PBS-Puffer (2x2 min)
15. Inkubation mit ABC-Komplex (Avidin-Biotin-Complex) in der feuchten Kammer (30 min)
16. Waschen im PBS-Puffer (2x2 min)
17. Substratfärbung mit DAB (Diaminobenzidin) (8 min)
18. Waschen im Aqua dest. (2x2min)
19. Gegenfärbung mit Hämatoxylin (5min)
20. Wässern in Leitungswasser (10min)
21. Aufsteigende Alkoholreihe (umgekehrte Konzentrationsreihenfolge wie im Schritt 2), anschließend Xylol (10min)
22. Eindeckeln mit Eukitt
Tabelle 1 – Protokollschritte zur immunhistochemischen Färbung des Ovarialgewebes
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2.3.5 Praktische Durchführung der ABC-Methode zum immunhistochemischen Nachweis von EGFR und nm23
Beim immunhistochemischen Nachweis des EGFR (Epidermal Growth Factor
Receptor) wird der erste und zweite Schritt wie im oben aufgeführten Protokoll
durchgeführt. Der einzige Unterschied besteht im dritten Schritt, währenddessen
keine hitzeinduzierte sondern eine enzymatische Vorbehandlung der Objektträger
zur Demaskierung der Antigene notwendig wird.
Die antigendemaskierende enzymatische Lösung, die Pronase (Protease gewonnen
aus Streptomyces griseus), gelagert bei -20 °C, wird aus dem Gefrierfach
herausgenommen und 10 Minuten bei Raumtemperatur aufgetaut. In jedem
Eppendorfbehälter befindet sich 0,1 ml Pronase, die mit 1,9 ml TBS-Puffer (pH 7,6)
in einem Röhrchen gemischt und gut geschüttelt wird.
Die OT werden 15 Minuten mit der Lösung bei der Raumtemperatur in der feuchten
Kammer inkubiert.
Danach werden die OT 2x 2 Minuten mit Aqua dest. gespült.
Ab Schritt 6 wird wie im Protokoll weiter verfahren.
Der Primärantikörper ist ein monoklonaler IgG1-Mouse Anti-Human Epidermal
Growth Factor Receptor Antikörper, Verdünnung 1:100 mit PBS, Inkubationszeit: 45
min bei Raumtemperatur in der feuchten Kammer.
Bei dem immunhistologischen Nachweis der nm23 wird ebenfalls eine enzymatische
Lösung, die Trypsin-Lösung zur Demaskierung der nachzuweisenden Antigene
verwendet. Die OT werden 15 Minuten mit 0,1%ig Trypsin-Lösung bei 37 °C
inkubiert. Die Inkubation mit dem Primärantikörper, monoklonaler IgG1-Maus-
Antikörper Verdünnung: 1:30 mit PBS, erfolgt in der feuchten Kammer für 23
Stunden bei 4 °C.
Die folgende Tabelle stellt die Eigenschaften und Färbeverfahren der verwendeten
Antikörper dar.
Faktor Reagenz Antikörper Firma Verdün. Inkub.- zeit
Inkub.- temp.
Cutoff
MIB-1
Maus IgG1 Ki 67, Klon MIB-1 Dako 1:50 30 Min RT >50%
• im Phasenkontrast Bestätigung der Färbung und gut erkennbarer Zellkern
• Positivfärbung in gleicher Ebene mit den umgebenden Zellen
Abbildung 3 - Positivfärbung einer isolierten Tumorzelle im Knochenmarkaspirat (mit Detailansicht)
Positivfärbung einer isolierten Tumorzelle mit dem Antikörper A45B/B3 und der Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase (APAAP)-Technik; zu beachten ist vor allem die fehlende Anfärbung der im Hintergrund erkennbaren Knochenmarkszellen
Diese Kriterien gelten für alle isolierten Tumorzellen, von einzelnen bis hin zu
Zellclustern, bestehend aus zwei, meist mehreren positiven Zellen. Die Präparate
werden immer von zwei Gutachtern beurteilt, die jedoch nicht den Status der
Patientin kennen. Nur wenn beide zu einem einstimmigen und positiven Urteil
kommen, sind die gefärbten Zellen als Tumorzellen zu klassifizieren.
2.6 Beurteilung immunhistologischer Ovarialkarzinom-Schnitte Alle Färbungen wurden von einem erfahrenen Untersucher ohne Kenntnis der
klinischen und immunhistochemischen Daten lichtmikroskopisch in standardisierter
Weise beurteilt. Die Ki67-Expression wurde nur nach Prozentsatz gefärbter Zellen
beurteilt. Die Färbungen von p53, Topoisomerase IIα, nm23 und EGFR wurden nach
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dem Immuno-Reaktiven Score nach Remmele und Stegner beurteilt. Hierbei
Metastasen 1,3 Monate und Knochenmetastasen 4 Monate (Dauplat et al., 1987).
Bei Patientinnen mit Mammakarzinom metastasiert im weiteren Verlauf etwa ein
Drittel der nodal-negativen Patientinnen, obwohl zum Zeitpunkt der Primärdiagnose
kein Tumorbefall der axillären Lymphknoten nachgewiesen werden kann (Gerber et
al., 2001). Der Ursprung dieser Metastasierung wird von einer frühzeitig in der
Erkrankung auftretenden, okkulten hämatogenen Streuung von Tumorzellen
vermutet. Hämatogene Tumorzelldissemination ist definitionsgemäß ein Auftreten
von Zellen des Primärtumors über den Systemkreislauf in tumorfernen
Körperkompartimenten. Diese disseminierten Tumorzellen sind dann z.B. in einem
Lymphknoten immunhistochemisch nachweisbar. Auf dem hämatogenen Weg finden
sich DTZ im Knochenmark wieder, hier sind sie ebenfalls immunhistochemisch
nachweisbar (Janni et al. 2004).
Seit Mitte der achtziger Jahre können einzelne disseminierte Tumorzellen im
Knochenmark über den immunzytochemischen Nachweis des epithelialen
Zytokeratins auch bei klinisch metastasen-freien Patienten gefunden werden (Kufer,
82
2000). Da epitheliale Zellen im Knochenmark natürlicherweise nicht vorkommen, ist
ihr Nachweis ein Indikator einer hämatogenen Streuung des Primärtumors. Die
Genfamilie der Zytokeratine (CK), die als Marker für disseminierte Karzinomzellen im
Knochenmark, Blut und Lymphknoten eingesetzt werden, besteht aus mehr als 20
Mitgliedern (Janni et al., 2004). In der vorliegenden Studie wurde der monoklonale
Antikörper A45-B/B3, der unter anderem gegen Heterodimere aus CK-8/18 und CK-
8/19 gerichtet ist, eingesetzt. In umfangreichen Kontrollexperimenten an
Knochenmarkproben von fast 200 Patienten ohne nachweisbares Karzinom wurde
belegt, dass normale Knochenmarkzellen zu 99 Prozent nicht mit A45-B/B3
reagieren (Janni et al., 2004).
Beim Mammakarzinom wurde ein Zusammenhang zwischen isolierten Tumorzellen
im Knochenmark mit der Tumorgröße, dem axillären Lymphknotenbefall, dem
Tumorgrading (Braun et al., 2000), einer Hämangiosis carcinomatosa und zum Teil
negativem Hormonrezeptorstatus nachgewiesen, also ungünstigen Eigenschaften
des Primärtumors (Janni et al., 2004). Ebenso wurde ein Zusammenhang mit
Progesteronrezeptoren, aber keine Korrelation zu Östrogenrezeptoren festgestellt
(Diel et al., 1992). Die Präsenz disseminierter Tumorzellen im Knochenmark gilt als
unabhängiger Prognosefaktor für das Rezidiv freie, Metastasen freie und
Gesamtüberleben in allen Stadien dieser Erkrankung (Braun et al., 2000b).
Während die prognostische Relevanz des Nachweises isolierter Tumorzellen im
Knochenmark von Brustkrebspatientinnen zum Zeitpunkt der Primärdiagnose mit der
späteren Metastasierung des Tumors als gesichert gilt (Braun et al., 2001,
Solomayer et al., 2001, Janni et al., 2004, Fehm et al., 2006), wird die klinische
Relevanz dieser Befunde bei anderen Karzinomentitäten wie dem Ovarialkarzinom
noch untersucht.
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Obwohl gynäkologische Malignome wie Zervix- oder Ovarialkarzinom ein vorwiegend
lokoregionäres Wachstumsmuster aufweisen, ist bei Patientinnen, bei denen DTZ im
Knochenmark nachgewiesen wurden, eine kürzere Überlebenszeit beschrieben
(Braun et al., 2001, Janni et al., 2003). Dadurch, dass diese Malignome relativ selten
ins Knochenmark metastasieren, ist die Persistenz von Zytokeratin-positiven Zellen
im Knochenmark bei Patientinnen mit Ovarial- (37%), Zervix- (26%) und
Endometriumkarzinom (17%) ein Hinweis dafür, dass die Tumorzelldissemination ein
generalisiertes Phänomen bei epithelialen Tumoren darstellt (Fehm et al., 2006).
Auch bei anderen Karzinomentitäten wie Ösophagus- sowie Lungenkarzinom ist der
Nachweis von DTZ im Knochenmark mit einer schlechteren Prognose für die
Patienten korreliert (Passlick et al., 2000).
Ebenso legt das Auftreten von Rezidiven trotz kurativer lokoregionärer Therapie bei
gleichzeitiger Abwesenheit von Fernmetastasen in über 30% beim Magenkarzinom
(Kerner et al., 2004) und 44% beim Ovarialkarzinom, von denen über 40%
extraperitoneal lokalisiert sind (Rubin et al., 1991), nahe, dass eine generalisierte
okkulte Tumorzelldissemination und dementsprechend eine systemische
Tumorerkrankung schon zum Zeitpunkt der Operation vorliegen kann.
Diese Ergebnisse deuten auf die Möglichkeit hin, Patientinnen mit hohem
Rezidivrisiko zum Zeitpunkt der Primärdiagnose durch Nachweis disseminierter
Tumorzellen im Knochenmark zu identifizieren.
In unserem Patientinnenkollektiv war das Auftreten von Fernmetastasen signifikant
mit der Präsenz von DTZ korreliert. Während nur 32% der Patientinnen ohne DTZ
eine Fernmetastasierung erlitten, war der Anteil bei Patientinnen mit positivem
Knochenmarkbefall mit 52% signifikant höher.
In der vorliegenden Studie waren alle Patientinnen im Rahmen der Primäroperation
auf hämatogen disseminierte Tumorzellen im Knochenmark untersucht worden. Die
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Präsenz dieser Zellen könnte als ein Prognoseindikator im Bezug auf
Krankheitsverlauf sowie Metastasierungspotential des Primärtumors eine klinische
Relevanz finden.
Eine wesentliche Fragestellung hierbei ist, welche Faktoren des Primärtumors eine
hämatogene Streuung begünstigen. Aus diesem Grunde wurden die Primärtumoren
auf verschiedene biologische Faktoren untersucht.
Die immunhistochemische Färbung der Präparate mit dem MIB-1 Antikörper zeigte
Expressionsraten zwischen 5-95%. Bei der MIB-1 Färbung, die die Zellen in der
Proliferationsphase gegenüber der Ruhephase nachweist, ist die Intensität der
Färbung kein aussagekräftiges Merkmal. Aus diesem Grund wurde bei der
Auswertung der Präparate die Färbeintensität nicht berücksichtigt.
Bei einem Medianwert von 30%, der als cut-off übernommen wurde, gab es bei der
MIB-1 Färbung insgesamt 53 positive Fälle. Dieser Wert liegt im Bereich anderer
Studien, wie Garzetti et al. mit 27% und Schindlbeck et al. 2005 mit 28% MIB-1
Positivitätrate zeigten.
Im Vergleich mit den tumorbiologischen Parametern zeigte sich eine Korrelation
zwischen MIB-1 Expression und Tumorgröße sowie Peritonealkarzinose. Die
Patientinnen mit negativem MIB-1 Tumorgewebe hatten tendenziell öfters einen
Knochenmakbefall als Patientinnen mit positivem MIB-1 Tumorgewebe. Der
Unterschied des Knochenmarkbefalls in den zwei Gruppen war statistisch nicht
signifikant. Wie einleitend erwähnt, ist MIB-1 ein monoklonaler Antikörper, der das
nukleare Ki-67 detektiert, welches nur in der proliferativen Phase der Zelle
expremiert ist. Dieses Antigen hat sich in zahlreichen Studien als
Proliferationsmarker erwiesen. In einer Studie, die 80 Patientinnen mit benignem,
Borderline- sowie malignem Ovarialtumor umfasste, haben Darai et al. 1998 gezeigt,
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dass die MIB-1 Expression dem Anteil an wachsenden Tumorzellen entspricht. Sie
registrierten proliferative Aktivität (Ki-67 Expression) bei 12% der benignen Tumore.
Der prozentuale Anteil der Ki-67-positiven Zellen der Borderline Tumore war mit 40%
nicht signifikant höher als bei den Benignen, wohl aber signifikant niedriger als bei
Karzinomen mit 70% Ki-67 positiven Zellen. Dieses Ergebnis wurde auch von
Garzetti et al. berichtet.
Hinsichtlich des Metastasen freien Intervalls sowie Gesamtüberlebens ergaben sich
signifikante Korrelationen zur KI-67 Expression. Dieses Ergebnis stimmt mit der
Studie von Layfied et al. 1997 überein, in der bei den Ovarialkarzinompatientinnen in
fortgeschrittenem Tumorstadium mit hoher MIB-1 Expression (≥15%) das Median der
Überlebenszeit 16 Monate und mit niedriger MIB-1 Expression (<15%) 30 Monate
betrug. Das kürzere Gesamtüberleben der Ovarialkarzinompatientinnen mit MIB-1
Überexpression wird auch in der Studie von Terlikowski et al. 1999 präsentiert.
Die Mutation des p53-Gens trägt zur Entstehung von 50-60% aller menschlichen
Malignome bei (Nijman et al., 1999), und Veränderungen des Tumorsuppressorgens
p53 sind das am häufigsten erforschte molekulare Ereignis beim Ovarialkarzinom.
Studien zeigten den positiven Einfluss des Wildtyps von p53 bei Reduktion des
metastatischen Potentials und Invasionsfähigkeit vieler Tumore und Tumorzelllinien.
Chen et al. haben 2003 in einem Versuch gezeigt, dass die Induktion von
endogenem oder Injektion von exogenem p53-Protein in die Tumorzellen mit
Reduzierung des Metastasierungspotentials verschiedener Tumore korreliert ist. Sie
berichten, dass die Akkumulation des Wildtyp-p53 im Magenkarzinom mit niedrigerer
Metastasierung vergesellschaftet ist und die Applikation von p53 als Aerosol das
Wachstum der Metastasen in der Lunge verhindern kann. Im Gegensatz dazu gibt es
auch Veröffentlichungen über den negativen Effekt des mutierten p53 bei der
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Tumorprogression und Metastasenbildung (Patel et al., 1997, Nijman et al., 1998,
Yang et al., 2001).
Wenham et al. haben 2002 in einem Versuch gezeigt, dass die Häufigkeit der
Überexpression von mutiertem p53 in fortgeschrittenen Ovarialkarzinomstadien III/IV
mit 40-60% signifikant höher ist im Vergleich zu dem Stadium I mit 10-20%. Diese
Korrelation der p53-Überexpression hat sich in unserer Studie nicht bestätigen
lassen. Die p53-Färbung konnte bei allen Präparaten durchgeführt werden. Zwei
Präparate waren bei dieser Färbung komplett negativ. Skirnisdottir et al., berichten
2004 über eine p53-Expression von 36% der Fälle beim Ovarialkarzinom und
Coronado et al., 2007 von 25%. Dieser Wert variiert zum vorliegenden
Patientinnenkollektiv, in dem nur zwei Präparate keine Färbung darstellten. Der
Medianwert der IRS lag bei 6, womit 50% der Präparate als positiv zur Geltung
kamen und die Ergebnisse mit einer Positivitätsrate von 50% ausgewertet wurden.
Bei anderen Studien, z.B. von Lee et al. zum Magenkarzinom, wird eine p53-
Positivität bei einer Expression von über 15% gefärbter Zellen angenommen. Bei der
Studie von Schindlbeck et al. werden die immunhistologischen Präparate von
Mammakarzinomen abgesehen von der Färbeintensität und nur nach dem Kriterium
„Median der positiven Zellzahlen“ für p53, Ki-67 und Topoisomerase IIα ausgewertet.
Die Ergebnisse vieler Veröffentlichungen über die schlechtere Prognose der
Patienten mit p53-Überexpression wie bei Ovarialkarzinom- (Becker et al., 2006,
Levesque et al., 1995) oder Magenkarzinompatienten (Lee et al., 2003) haben sich in
unserer Studie nicht bestätigen lassen. Es hat sich keine signifikanten Korrelationen
zwischen p53-Expression mit histologischen und klinischen Parameter wie
Tumorstadium sowie Gesamtüberleben der Patientinnen ergeben. Die Anzahl von
disseminierten Tumorzellen im Knochenmark war bei den positiven p53-Fällen
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höher, eine signifikante Korrelation zwischen p53-Expression mit DTZ im
Knochenmark bestand aber nicht.
Die Topoisomerase IIα-Färbung war problemlos auswertbar. Bei einem IRS-Median
von 4 gelten insgesamt 47% der Präparate als positiv. Depowsky et al. berichten
2000 von einer Topoisomerase IIα-Positivitätsrate von 32% bei
Mammakarzinompatientinnen und signifikante Korrelationen zwischen
Topoisomerase IIα-Überexpression mit reduziertem Gesamtüberleben,
fortgeschrittenem Tumorstadium, positivem Nodalstatus sowie einer HER-2/neu-
Genamplifikation. Diese Korrelationen wurden auch von Rosenthal et al. 2000
berichtet, die sich jedoch in unserer Patientinnenkollektiv nicht bestätigten.
Topoisomerase IIα spielt eine Schlüsselrolle bei der DNA-Replikation. Veränderte
Expression der Topoisomerase IIα wurde bei vielen Krebserkrankungen wie AML,
CLL, kleinzelligem Bronchialkarzinom, Kolon-, Mamma- und Ovarialkarzinom
beobachtet (Oncogen Research Products, spec. Sheet, 2000).
In der Studie von Rosenthal et al. mit 184 Mammakarzinompatientinnen war die
Topoisomerase II-Expression mit Verkürzung des Überlebens sowie
fortgeschrittenem Tumorstadium und Lymphknotenmetastasen korreliert. In der
Studie von Costa et al. 2000 sowie Schindlbeck et al 2005 bei einer Kollektiv von 265
Mammakarzinompatientinnen wurde eine Korrelation zwischen Topoisomerase II mit
MIB-1 und Tumor S-Phasenfraktion beobachtet. In dem vorliegenden Kollektiv haben
wir eine Tendenz zur gemeinsamen Expression von MIB-1 und Topoisomerase II
(p=0,06) beobachtet. Da Topoisomerase II in der Replikationsphase der Zelle
vorhanden ist, kann man die beiden Faktoren als prognostisch relevante
Proliferationsmarker für mitotische Aktivität der Tumorzellen bezeichnen.
Topoisomerase IIa-Überexpression ist in einer Bandbreite von 30% - 70% der
epithelialen Ovarialkarzinome nachweisbar (Mano et al. 2004). Diese Autoren
88
berichten in ihrer Studie von 21,4% Positivitätsrate und einem cut-off von 10%
gefärbter Zellen durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung. Da in dieser Studie von
Topoisomerase IIa-Genamplifikationen und Protein-Überexpression in ausschließlich
fortgeschrittenem Tumorstadium (FIGO III/IV) berichtet wird, könnte dieses Ergebnis
laut den Autoren so interpretiert werden: Topoisomerase II hat eine prognostische
Signifikanz beim Ovarialkarzinom und die Ansprechrate von Topoisomerase II-
Inhibitoren sollte bei Patientinnen in diesen Karzinomstadien höher sein.
Obwohl die Gene von Topoisomerase II und HER-2/neu beide auf dem Chromosom
17 und nahe beieinander lokalisiert sind (Oncogen Research Products, Spec. Sheet,
2000) und bei vielen Studien (Rosenthal et al., 2000, Depowski et al., 2000, Cardoso
et al., 2004) auf eine signifikante Korrelation zwischen HER-2/neu -Amplifikation und
erhöhter Topoisomerase II-Expression hingewiesen wird, hat sich diese Korrelation
in der vorliegenden Studie nicht bestätigen lassen.
Die HER-2/neu-Färbung war bei 89 Präparaten gelungen. Ein Präparat war nicht
auswertbar. In der Literatur wird die HER-2/neu-Expression in einer Bandbreite von
5-66% beobachtet (Crijns et al., 2006). Slamon et al. berichteten 1989 von einer
Überexpression des HER-2/neu Proto-Onkogens in maximal 30% der Mamma- und
Ovarialkarzinome. Bei Auswertung nach dem 0- 3+ Score berichten Bookman et al.
2003 über 66% 2+positive und 34% 3+positive HER-2 Fälle. Coronado et al.
berichten 2007 von einer HER2-Färbung in 24,2% der Fälle beim Ovarialkarzinom. In
dem vorliegenden Patientinnenkollektiv war die HER-2-Überexpression in 37 / 89
(41,9%) der Fälle zu beobachten.
HER-2/neu hat sich inzwischen beim Mammakarzinom als ein prognostischer Faktor
bewährt, aber seine Rolle bei anderen Karzinomen wird noch diskutiert. Meden et al.
berichten, dass in vielen Studien zum Ovarialkarzinom sich die Überexpression des
p185 Proteins als ein neuer Prognosefaktor bewiesen hat. In dieser Studie haben die
89
statistischen Analysen gezeigt, dass die Überexpression von p185 mit einer
ungünstigen Tumorbiologie verbunden ist und diese Fälle eine signifikant schlechtere
Prognose gegenüber den normalen Fällen aufweisen. Dieses Ergebnis stimmt mit
den Studien von Slamon et al. sowie Berchuck et al. überein. Im Gegensatz dazu
haben Haldane et al. keinen statistisch signifikanten Unterschied ermittelt. Coronado
et al. bezeichnen 2007 HER-2 als einen unabhängigen Prognosefaktor beim
Ovarialkarzinom.
In der Studie von Chuang et al. 2002 wurde die Progression des Malignoms und die
Metastasierung infolge einer HER-2/neu-Überexpression in vivo und in vitro
dargestellt. Außerdem haben die klinischen Daten gezeigt, dass die Überexpression
des HER-2/neu-Gens mit der Reduktion des Östrogen-Rezeptors korreliert ist.
Patientinnen mit HER2-Überexpression sprachen weniger auf die Therapie mit
Tamoxifen an (Gabriel et al. 2002). In der Studie von Lee et al. bei
Magenkarzinompatienten wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den
Fünfjahres-Überlebensrate von HER2-neu positiven (62,9%) und negativen (68,9%)
Fällen beobachtet.
In unserer Studie hat sich zwischen HER-2/neu- und p53-Überexpression eine
signifikante Korrelation (p=0,02) ergeben, was den Ergebnissen vieler Studien in
dieser Hinsicht entspricht (Tomic et al., 2003, Yamashita et al., 2004). Caduff et al.
haben bei 7% der Ovarialkarzinome und Wenham et al. bei 20% eine
Überexpression von HER-2/neu beobachtet.
Der höhere HER2-score bei den gut differenzierten (G I) im Vergleich zu den
schlecht differenzierten (G III) Tumorzellen in unserem Kollektiv widerspricht den
Ergebnissen der Studien von Tomic et al. 2003 und Coronado et al. 2007, bei denen
eine HER-2-Überexpression mit höherem Grading der Tumorzellen assoziiert war.
Zwischen anderen histologischen und klinischen Parameter und diesem Faktor hat
90
sich keine signifikante Korrelation ergeben. Ebenso war der Befall des
Knochenmarks nicht mit einer HER-2-Überexpression korreliert.
Die Färbung der Präparate gegen das nm23-Antigen gestaltete sich am
sensibelsten. Die Präparate mussten sehr sorgfältig und präzise bearbeitet werden.
Die gefärbten Präparate waren zu 43% schwach, 35% moderat und nur ein einziges
Präparat war stark gefärbt. Von den insgesamt 90 untersuchten Gewebeschnitten
waren 83% nm23-positiv, wobei in anderen Studien von einer nm23-Expression von
29% bei Ösophaguskarzinom (Patel et al., 1997) oder 48% beim Mammakarzinom
(Gonzales et al., 1995) berichtet wird. Baekelandt et al. haben 1999 bei
immunhistochemischer Färbung des Ovarialkarzinoms eine Expressionsrate von
72%, mit 41% moderaten und 31% stark gefärbten Gewebeschnitten, erzielt. Mit
einem IRS-Median von 2 gab es in dem vorliegenden Patientinnenkollektiv 40%
nm23-positive Fälle.
Es wurde beobachtet, dass die Expression von nm23 auf der mRNA- oder
Proteinebene beim Mammakarzinom umgekehrt korreliert ist mit dem Stadium und
Differenzierungsgrad des Primärtumors (Bei et al., 1998). Bei Tumoren im späteren
Stadium mit schlechtem Differenzierungsgrad wurde nm23 mit niedrigerer
Expression beobachtet. Gleichzeitig war die Rezidivrate höher und das Überleben
der Patientinnen kürzer (Bei et al., 1998). Bei vielen Neoplasien wie Mamma-,
Ovarial-, Zervix- sowie Hepatozellularkarzinom wurden niedrige Expression von
nm23 im Zusammenhang mit höherem Metastasierungspotential sowie kürzerem
Gesamtüberleben der Patienten beobachtet (Bazan et al., 2002). Gonzalez et al.
haben 1995 gezeigt, dass die Transfektion der nm23-H1 Gene in Mammakarzinom-
und Melanomzellen mit einer signifikant niedrigeren Metastasierungskapazität in den
transfizierten Tumorzellen im Vergleich zu der Kontrollgruppe verbunden ist. Nach
der Transfektion des nm23 Gens in die metastasierenden MDA-MB-435
91
Mammakarzinomzelllinie konnten die Tumorzellen die Bildung von duktalen
Strukturen, die Synthese der Basalmembran und der Sialomucine reaktivieren.
Ebenso zeigte ein Versuch von Charpin et al. 1997, dass die Transfektion der nm23-
1 cDNA in die Maus K-1735-Melanomzellen bzw. humane nm23-H1 cDNA in die
MDA-MB-435-Mammakarzinomzellinie, ein reduziertes Metastasierunspotential der
Tumorzellen in vivo zur Folge hat und die Migrationsfähigkeit der Zellen als Antwort
auf verschiedene Zytokine abnimmt. Li et al. haben 2006 über teilweise andere
Ergebnisse als die bisherigen berichtet. In ihrer Studie zum Ovarialkarzinom setzten
sie andere Nachweismethoden wie RT-PCR, Northern Blot und In-situ-Hybridisierung
ein und wiesen eine höhere nm23-mRNA Konzentration in den ovariellen Tumoren
nach als in normalem Gewebe. Die Expression in den frühen Tumorstadien war aber
höher als in den fortgeschrittenen Stadien. Dieses Ergebnis entspricht den meisten
Studien, die nm23 als einen Antimetastasierungsfaktor identifizierten. In den frühen
Stadien war die nm23-Expression mit der Differenzierung der Tumorzellen korreliert,
wobei die gut differenzierten Zellen eine höhere Expression dargestellt haben.
Die antimetastatische Wirkung des nm23 Faktors wurde von Gao et al. 2004 in
einem Experiment nachgewiesen. Nach der subkutanen Transplantation von
humanen Ovarialkarzinomzelllinien mit unterschiedlich hohem Metastasierungs-
potential in die Flanken von Versuchsmäusen wurde die Entwicklung der fokalen
Lungenmetastasen in verschiedenen Zeitintervallen untersucht. Hohe
Expressionslevel der nm23-mRNA und des Proteins in den transplantierten
Ovarialkarzinomzellen war mit niedrigerer Metastasenbildung in den
Versuchsmäusen korreliert.
In der vorliegenden Studie haben wir eine signifikante inverse Korrelation zwischen
nm23-Expression und Aszitesbildung beobachtet. Der IRS-Mittelwert der Fälle mit
Aszitesbildung war signifikant niedriger (2,70) als derjenige ohne Aszites (3,44).
92
Dieses Ergebnis kann die positive Wirkung von nm23 auf die Tumorcharakteristik
bestätigen. In zahlreichen Studien wurde nm23 als ein Antimetastasierungsfaktor
nachgewiesen (Granberg et al., 2000, Tomic et al., 2003). Im Gegensatz zu der
Studie von Gonzales et al. beim Mammakarzinom hat jedoch in unserem Kollektiv
die nm23-Expression keinen positiven Einfluss auf die Lymphknoten- oder
Fernmetastasierung ergeben. Eine signifikante Korrelation der nm23-Expression zu
anderen histologischen oder klinischen Faktoren, sowie zur hämatogenen
Disseminierung der Tumorzellen in das Knochenmark haben wir nicht beobachtet.
Zahlreiche Studien unterstützen die Hypothese, dass das p53-Protein einen
regulatorischen Effekt auf die nm-23-Expression hat und die Änderung seines
Expressionslevels abhängig vom p53-Protein ist. Mammakarzinomzellen mit hohem
P53-Protein-Level haben auch eine höhere nm23-Expression dargestellt (Chen et al.,
2003, Gonzales et al,. 1995, Kim et al., 1995). Chen et al. fanden einen positiven
regulatorischen Effekt von p53-Protein auf das nm23-Gen. In unserem
Patientinnenkollektiv wurde diese Korrelation nicht bestätigt. Die Diskrepanz der
Ergebnisse könnte, wie von Chen et al. auch erwähnt, daran liegen, dass nur der
Wildtyp-p53 ein Upregulator für nm23 darstellt. Dadurch, dass in unserer Studie der
immunhistochemische Nachweis des Tumorgewebes mit dem verwendeten
monoklonalen Antikörper sowohl den Wildtyp als auch den mutierten p53-Protein mit
seiner wesentlich längeren Halbwertszeit zur Darstellung brachte, haben wir keine
Korrelation zwischen den beiden Faktoren nachweisen können.
Bei einem Drittel der epithelialen Karzinome, wie kleinzelligem Bronchialkarzinom,
Kopf-Hals-Tumoren, Mamma-, Magen-, Prostata-, Ovarial- und Kolorektalkarzinom,
sowie Glioblastom ist eine Überexpression von EGFR zu beobachten (Firma Dako,
Spec. Sheet).
93
In einer Studie von De Jong et al. 1998 wurden Patienten mit primärem
Leberzellkarzinom sowie Lebermetastasen auf EGFR untersucht. Eine positive
EGFR-Expression wurde in 30% der primären Lebertumore und 13% der
Lebermetastasen registriert. Keine signifikanten Korrelationen wurden zwischen
immunhistologischen Ergebnissen von EGFR mit anderen Parametern beobachtet.
In der Studie von Berchuck et al. mit 79% positiven Fällen (58/73) war die
Überlebensdauer der Ovarialkarzinompatientinnen mit positivem EGFR signifikant
kürzer als die mit EGFR-negativen Tumoren. Crijns et al. berichten 2006 auch von
der Verkürzung der Fünfjahres-Überlebensrate der EGFR-positiven Fälle im
Vergleich zu den negativen Fällen. Meden und Kuhn haben in ihrer Studie mit 266
Ovarialkarzinompatientinnen keine signifikante Korrelation zwischen EGFR positiven
und negativen Fällen im Hinblick auf die Überlebensdauer nachweisen können. Sie
haben auch berichtet, dass nur in 3% der Fälle eine gemeinsame Überexpression
von EGFR (HER-1) und HER-2/neu zu finden ist. In der vorliegenden Studie bestand
zwischen den Expression der genannten Rezeptoren keine Korrelation.
Nielsen et al. berichteten 2004 in einer Studie mit 783 Ovarialkarzinomen von einer
EGFR-Expressionsrate von 62% der Fälle im Vergleich zu 67% bei
Borderlinetumoren. Sie fanden keine Korrelation zwischen der EGFR-
Überexpression und dem Gesamtüberleben der Patientinnen. Skirnisdottir et al.
dagegen berichten 2004 in ihrer Studie mit 226 Ovarialkarzinompatientinnen im
Tumorstadium FIGO IA-IIC von einer EGFR-Überexpression in über 50% der Fälle
und des onkogenen Effekts von EGFR mit Induktion der DNA-Synthese, vermehrtem
Zellwachstum, Invasion und Metastasierung des Tumors. Dieser Effekt hat eine
signifikante Korrelation zwischen EGFR und schlechterer Prognose für die
Patientinnen zur Folge. Sie berichten auch von einer signifikanten Korrelation der
EGFR-Überexpression und erhöhter Rezidivrate bei diesen Patientinnen sowie
94
Verkürzung des metastasierungsfreien Überlebens. Eine signifikante Korrelation
zwischen EGFR und p53 bestand nicht, aber die Kombination von p53- und EGFR-
Überexpression, die in 15,6% der Fälle zu beobachten war, war mit einem signifikant
reduzierten Überleben der Patientinnen verbunden und der Anteil rezidivfreier
Patientinnen war von 67,4% auf 39,4% gesunken.
In unserer Studie haben wir lediglich bei 26 (29%) Gewebeschnitten eine positive
Färbung von EGFR beobachtet. Die Färbeintensität der Gewebeschnitte war
entweder moderat oder schwach. Keine der Präparate hatte eine starke Färbung.
Dieses Färbeergebnis entspricht etwa der Studie von Stadlmann et al. Sie berichten
von einer positiven EGFR-Immunexpression bei 28% der primären und 33% der
Rezidivtumore bei Ovarialkarzinompatientinnen im fortgeschrittenen Tumorstadium.
Bei unserem Patientinnenkollektiv hat sich eine Tendenz (p=0,07) zwischen hoher
EGFR-Expression und negativem Lymphknotenbefall ergeben. Dieses Ergebnis
widerspricht den Studien, wie auch oben genannt von Skirnisdottir et al. im Hinblick
auf den metastasierungsfördernden Effekt von EGFR. Im Hinblick auf den Einfluss
von EGFR auf den Knochenmarkbefall oder anderen Tumorcharakteristika hat sich in
unserer Kollektiv keine Korrelationen ergeben.
Wie aus den Ergebnissen verschiedener Untersuchungen festzustellen ist, variieren
die Expressionsraten für die einzelnen Biomarker zum Teil stark untereinander. Als
Ursache für diese erheblichen Abweichungen der Ergebnisse in der Literatur sind
unter anderem die unterschiedlichen Nachweisverfahren zu nennen. Stadlmann et al.
haben 2006 die Ergebnisse einer Studie, die 80 seröse Ovarialkarzinome mittels
Immunhistochemische- und Fluoreszenz In-situ-Hybrisierung (FISH)-Verfahren
untersucht hatte, veröffentlicht. Dabei war die EGFR-Proteinexpression mit 28% im
Primärtumor und 33% im entsprechenden Rezidivtumor durch immunhistochemische
Nachweisverfahren höher als die Ergebnisse des FISH-Verfahrens mit 20% EGFR-
95
Genamplifikation im Primärtumor und 22% im Rezidivtumor. Als zweiter wesentlicher
Punkt ist die mikroskopische Beurteilung der Präparate zu nennen, die von der
Subjektivität des Untersuchenden abhängig ist. Der Positivitätskriterium und
Auswertungsmethode sind andere wesentlichste Punkte, die für die starke
Diskrepanz der Ergebnisse verantwortlich sind. Stadlmann et al haben z.B. die
Präparate als positiv bewertet, wenn ≥1% der Tumorzellen EGFR-positiv waren, und
Skirnisdttir et al. haben 2004 eine Positivitätsgrenze von >10% gefärbter Zellen in
ihrer Studie festgelegt. Zusätzlich sind das Ausmaß der Antikörperverdünnung, die
Inkubationszeit, Temperatur, das Einhalten der Kühlkette, sowie die geringe Fallzahl
als weitere Ursachen dieser Diskrepanz zu nennen.
Wie an den Ergebnissen der vorliegenden Studie zu sehen ist, sind die klassischen
Prognosefaktoren immer noch die aussagekräftigsten Parameter, die den
Krankheitsverlauf, wie das Rezidiv- und Metastasen freie Intervall und das Überleben
der Patientinnen beeinflussen.
Von den sechs untersuchten Faktoren haben insgesamt vier Korrelationen mit der
Tumorgröße, Lymphknotenbefall, Aszitesbildung, Peritonealkarzinose, des
Metastasen freien Intervalls und dem Gesamtüberleben der Patientinnen
aufgewiesen. Der bedeutendste Faktor war MIB-1, der mit Tumorgröße,
postoperativem Tumorrest, Peritonealkarzinose, Metastasen freiem Intervall und
Gesamtüberleben korreliert war. HER-2/neu war mit p53-Expression korreliert und
bei nm23 negativen Fällen gab es häufiger Aszitesbildung. Patientinnen mit
positivem Knochenmarkbefall waren signifikant häufiger von Fernmetastasen
betroffen als diejenigen ohne Befall des Knochenmarks mit DTZ und benötigen daher
eine strengere Überwachung des Krankheitsverlaufs und entsprechende Therapie.
Auf dem Weg zur Definition neuer Prognoseindikatoren, die das unterschiedliche
biologische Verhalten der Ovarialkarzinome erklären könnten, haben wir einige
96
zusammenhängende Faktoren beobachtet. Diese Ergebnisse rechtfertigen die
Entwicklung und Einsatz biologisch aktiver Medikamente in der Karzinomtherapie.
Diese neuen Medikamente können anhand des biologischen Verhaltens des Tumors
individuell an das Ziel angepasst eingesetzt werden.
Hemmstoffe der Topoisomerase II, wie Etoposide, führen zu Brüchen in beiden DNA-
Strängen und haben sich daher als geeignete antineoplastische Chemotherapeutika
für die Behandlung des Mammakarzinoms erwiesen. Hemmstoffe der
Topoisomerase I brechen einen der beiden DNA-Stränge auf. Topotecan, ein
Topoisomerase I Inhibitor, wird zur Therapie des rezidivierenden, metastasierenden
Ovarialkarzinoms (Herzog, 2002), sowie fortgeschrittenem Zervixkarzinoms
eingesetzt (Fiorica, 2003). HER-2/neu hat sich zum geeigneten Ziel bei der
Behandlung des Mammakarzinoms bewährt. Trastuzumab, ein rekombinanter
monoklonaler Antikörper, ist ein HER-2/neu-Rezeptorenblocker. Genistein, ein
Inhibitor der Tyrosin Kinase Aktivität für EGFR, und Gefitinib, ein EGFR-
Rezeptorenblocker, werden bei nicht-kleinzelligen Karzinomen der Lunge eingesetzt.
Außer dem Hormonrezeptorstatus und der HER2-Expression sind bisher als
Routineuntersuchung keine weiteren Parameter etabliert, um Patientinnen innerhalb
identischer Prognosegruppen zu identifizieren, die von einer systemischen Therapie
besonders profitieren können. Die Untersuchungen des Knochenmarks bei
Mammakarzinompatientinnen vor und nach der adjuvanten Chemotherapie haben
gezeigt, dass bei einem Teil (24%) der Patientinnen keine Elimination der
Zytokeratin-positiven Zellen im Knochenmark der Patientinnen erfolgt (Becker et al.,
2006). Da sich die Mehrzahl der DTZ in einer G0 Phase des Zellzyklus befindet, ist
der Effekt der üblichen zytotoxischen Chemotherapeutika, die normalerweise auf die
Zellen im proliferativen Zustand wirken, auf DTZ fraglich. Dies kann auch zum Teil
die ineffektive Wirkung der Standard-Chemotherapeutika auf diese Zellen erklären
97
(Pantel et al., 1999). Die Suche nach Zellzyklus-unabhängigen Substanzen zur
Elimination von DTZ scheint hierzu viel versprechend.
Als primär lokoregionärer Erkrankung besitzen beim Ovarialkarzinom weiterhin die
klassischen Prognosefaktoren wie Tumorstadium, postoperativer Tumorrest und
Peritonealkarzinose die größte Bedeutung. Die Mehrzahl der Patientinnen versterben
im Verlauf an intraabdominellen Komplikationen, wie Ileus, Aszites oder sekundärem
Pleuraerguß, so dass das Auftreten von Fernmetastasen klinisch oftmals nur eine
untergeordnete Rolle spielt. Dennoch identifiziert die Präsenz von DTZ-KM
unabhängig von Tumorstadium eine Subgruppe von Patientinnen, die ein erhöhtes
Fernmetastasenrisiko aufweisen und deshalb möglicherweise einer intensivierten
Nachsorge und Therapie bedürfen. Die Untersuchung tumorbiologischer Faktoren
einschließlich DTZ-KM könnte somit zur Risikostratifizierung beitragen und die
Etablierung zielgerichteter Therapien ermöglichen. Aufgabe zukünftiger Studien wird
es sein, diese Zusammenhänge an größeren Fallzahlen unter standardisierten
Bedingungen zu bestätigen. Die direkte Charakterisierung von DTZ ist ebenso
Gegenstand laufender Forschung und könnte zukünftig die Therapie weiter
individualisieren.
98
5 Zusammenfassung Das Ovarialkarzinom ist nach wie vor eines der prognostisch ungünstigsten
Malignome der Frau. 70-80% der Frauen überleben ihre Krankheit nicht. Die
malignen Erkrankungen kann man bei der Diagnosestellung klinisch in drei
Kategorien unterteilen. Die erste Gruppe sind Patienten mit manifesten Metastasen.
Die Zweite umfasst Patienten mit okkulten Metastasen und die Dritte sind Patienten
ohne Metastasierung. Eine frühzeitige Diagnose und Therapie kann die Anzahl der
Patienten zu Gunsten der dritten Gruppe verschieben (Heimann et al., 2000).
Viele Autopsiestudien bei Patientinnen, die an fortgeschrittenem Ovarialkarzinom
gestorben sind, haben gezeigt, dass okkulte hämatogene Fernmetastasen viel
häufiger in fernen Organen wie Leber, Lunge und Knochen auftreten als man es
bisher basierend auf den klinischen Rezidivmustern vermutet hat (Braun et al.,
2001).
Da die verspätete Diagnose und Therapie die Anzahl der Patienten mit früher
Tumorzelldisseminierung und nachfolgender manifester Metastasierung erhöhen
kann, ist die Etablierung weiterer Prognosefaktoren, die den Krankheitsverlauf bzw.
das Metastasierungspotential des Primärtumors rechtzeitig charakterisieren können
von enormer Bedeutung.
Für das Überleben einer malignen epithelialen Erkrankung wie dem Ovarialkarzinom,
sind mehrere Faktoren entscheidend. Die radikale Resektion des Tumors mit
erweiterter Lymphknotendissektion oder en-bloc Resektion infiltrierter
Nachbarorgane spielen hier die wichtigste Rolle. Das Auftreten von Tumorzellen im
Knochenmark, teilweise in sehr frühem Tumorstadium, ist ein Hinweis darauf, dass
99
das Ovarialkarzinom als eine systemische Tumorerkrankung betrachtet werden
kann.
Zur individuellen Risikoabschätzung sowie zur Planung adjuvanter Therapien wäre
die Kenntnis über die systemischen Komponente dieser malignen Erkrankung
notwendig und eine Charakterisierung disseminierter Tumorzellen könnte im Hinblick
auf die Expression metastasierungsrelevanter Faktoren zu einem besseren
Verständnis tumorbiologischer Vorgänge und einer verbesserten individuellen
Therapieplanung beim Ovarialkarzinom führen. Die Effizienz einer systemischen
Therapie könnte wiederum durch Analyse der Tumorzelldissemination überprüft
werden.
Die vorliegende Studie umfasst 90 Patientinnen, die im Zeitraum 1991 bis 2001
wegen eines Ovarialkarzinoms in der I. Universitätsfrauenklinik der LMU operiert
wurden. Von allen Patientinnen wurde im Rahmen der Primäroperation das
Knochenmarksaspirat auf hämatogen disseminierte Tumorzellen untersucht und die
Ergebnisse in der Knochenmark-Datenbank archiviert. Wir haben in dieser
retrospektiven Studie die Expression von sechs Faktoren im Tumorgewebe
immunhistologisch untersucht, die das biologische Verhalten der Tumorzellen
charakterisieren können. Bei den Faktoren handelt es sich um die zwei
Proliferationsmarkern MIB-1 und Topoisomerase IIα, die Tumorsuppressor- und Anti-
metastasierungsfaktoren p53 und nm23, sowie HER-2/neu und EGFR, die das
Zellwachstum beeinflussen. Nachfolgend wurden die Präparate hinsichtlich des
Anteils immunhistologisch gefärbter Zellen und Intensität der Färbung semiquantitativ
ausgewertet. Darauf hin wurden die Korrelationen zwischen diesen biologischen
Markern mit histologischen und klinischen Parametern, Rezidiv- und Metastasen
freien Intervall, dem Gesamtüberleben der Patientinnen sowie dem
Knochenmarkbefalls mit Tumorzellen ermittelt.
100
Bei vier von den sechs immunhistologisch untersuchten tumorbiologischen Faktoren
wurden signifikante Assoziationen mit den histologischen und klinischen Parametern
nachgewiesen. Der Nachweis Zytokeratin-positiver Tumorzellen im Knochenmark der
Patientinnen war mit einer Erhöhung der Metastasierungsrate assoziiert.
Die Detektion disseminierter Tumorzellen beschränkt sich nicht nur auf das
Knochenmark, sondern auch der Nachweis zirkulierender Tumorzellen im peripheren
Blut und Lymphknoten sind Gegenstand intensiver Untersuchungen (Pantel et al.,
2003).
Neben den bisher bekannten Prognoseparameter wie Tumorgröße, -stadium, -typ
und postoperativer Tumorrest, deren Einfluss auf den Krankheitsverlauf in unserer
Studie nochmals bestätigt wurde, zeigen die resultierenden Ergebnisse, dass der
immunhistologische Nachweis bestimmter tumorassoziierte Marker, vor allem MIB-1,
und Detektion Zytokeratin-positiver Tumorzellen im Knochenmark einen
prognostischen Wert bei Ovarialkarzinompatientinnen haben können. Daher
scheinen weitere Untersuchungen mit größerer Patientenzahl in diesem Bereich
sinnvoll und hilfreich.
101
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