INSTITUTO POLITCNICO NACIONALEscuela Nacional de Ciencias
BiolgicasCARACTERIZACIN FENOTPICA Y FSICA DE ADN
RECOMBINANTEGonzlez Judd Pablo MiguelHernndez Acatitla Edwin
ArturoGrupo: 5QV1 Seccin: 1Equipo: 5
Objetivos: Obtener ADN de doble cadena de cualquiera de los
plsmidos pUC19, pBS o pCR2.1TOPO (recombinantes y no
recombinantes). Obtener clulas competentes de Escherichia coli y
transformarlas. Diferenciar un vector recombinante de uno no
recombinante por pruebas fenotpicas y por pruebas de
restriccin.
Materiales y mtodos:Confrntese el manual de laboratorio
EXPERIMENTOS EN GENTICA MICROBIANA, para revisar el protocolo
seguido en la realizacin de la prctica, el cual se sigui como se
cita (cfr. Referencias bibliogrficas) excepcin hecha de la obtencin
de clulas competentes, que por motivos de tiempo, fue realizada por
los profesores del laboratorio de gentica microbiana, quienes, cabe
sealarse proporcionaron tambin todos los cultivos y soluciones con
las que se trabaj.El ADN plasmdico recombinante aislado, fue del
plsmido pCR2.1TOPO y el no recombinante del plsmido
pCR2.1TOPO-ape.
Resultados:Habiendo realizado la extraccin de ambos plsmidos;
recombinante y no recombinante, individualmente, a partir de clulas
de Escherichia coli DH10 por el mtodo de la lisis alcalina, segn el
protocolo indicado, el ADN obtenido se utiliz para la transformacin
de E. coli. y para el anlisis por restriccin del mismo, obtenindose
los resultados expuestos a continuacin:Cuadro n 1: Efecto de la
transformacin de clulas de E. coli DH10 con plsmidos recombinantes
y no recombinantes sobre el desarrollo y el fenotipo del
cultivo.MedioCepa sembradacrecimientoColor de las colonias*
Luria DH10 competentes++++Blancas
L-APDH10 competentes+Blancas
L-APDH10+pCR2.1-TOPO++Azules
L-APDH10+pCR2.1-TOPO+++Azules
L-APDH10+pCR2.1-TOPO-ape+Blancas
L-APDH10+pCR2.1-TOPO -ape++Blancas
Tras la transformacin del cultivo con el ADN plasmdico, se
adicion al cultivo bacteriano IPTG y X-gal, para evidenciar la
naturaleza de las clulas transformadas, lo cual se puso de
manifiesto cultivando stas, en placas con medio rico. *El color de
las colonias se refiere al color, que en su caso se produjo por la
reaccin cromognica entre en cultivo y el complejo IPTG/X-gal, en
las colonias de un cultivo, esto referente a la mayora de las
colonias, no a su totalidad.
Para el anlisis por restriccin, tras la digestin, con las
enzimas de restriccin BamH1 Y EcoR1, se corri una electroforesis en
gel de agarosa al 1%, en el que se corri simultneamente, a las
muestras, un marcador de peso molecular (ADN del bacterifago ,
digerido con HindIII), cuya relacin, tamao-corrimiento en el gel,
se muestra en el cuadro n 2 y que fue usado como marco de
referencia para la determinacin del tamao de los fragmentos del ADN
plasmdico tras la restriccin.
Cuadro n 2: Tamao y distancias recorridas por los fragmentos de
restriccin (con Hind III) del bacterifago en electroforesis en gel
de agarosa al 1%BandaTamao (pb)Log del tamaoDistancia (cm)
123,1304.364
29,4163.974.5
36,5573.815
44,3613.636
52,3223.367.2
62,0273.307.5
7564
8125
De acuerdo a la bibliografa, el ADN del bacterifago tratado con
Hind III, exhibe 8 bandas, correspondientes a 8 fragmentos de ADN,
de distintos tamaos, sin embargo, se detectaron en el anlisis por
electroforesis, solo 6 de estos, cuyos resultados son los que se
exponen.Respecto al anlisis propiamente, de los fragmentos
obtenidos por restriccin de los plsmidos aislados, se muestran los
resultados en el cuadro n 3, el gel resultante del anlisis por
electroforesis, se ilustra, como tal, en la figura 1. Aunque cabe
resaltarse, que el obtenido por nuestro equipo no pudo ser
utilizado, por lo que se exponen resultados facilitados por el
equipo 6 del mismo grupo de trabajo (el electroferograma obtenido
por nuestro equipo, se adjunta en el anexo 1).
Cuadro n 3. Tamao y distancias recorridas por cada plsmido y sus
respectivos fragmentos de restriccin (con EcoR1 y
BamH1)ADN/TratamientoFragmentosDistancia (cm)Log del tamaoTamao del
fragmento (pb)
pCR2.1-TOPO/BamH116.53.553548
pCR2.1-TOPO/Eco R116.53.553548
pCR2.1-TOPO163.634265
27.33.382398
pCR2.1-TOPO-ape/ BamH1163.634265
pCR2.1-TOPO-ape/ EcoR115.93.553548
pCR2.1-TOPO-ape14.14.31995
25.33.75011
36.63.53162
Figura n 1. Gel obtenido en el anlisis por electroforesis, de
los plsmidos y los plsmidos tratados con enzimas de restriccin.El
llenado de los pozos se hizo, en el orden siguiente:
1.pCR2.1Topo/BamH1 2.pCR2.1Topo/EcoR1 3.pCR2.1Topo. 4.Marcador de
peso molecular 5.pCR2.1Topo-ape/BamH1 6.pCR2.1Topo-ape/EcoR1 7.
pCR2.1Topo-ape. Para el revelado de trat el gel con bromuro de
etidio, en el regulador de corrimiento, para luego exponerlo a luz
ultravioleta.
El tamao de los fragmentos de restriccin obtenidos de cada
plsmido se obtuvo por interpolacin sobre un grfico construido por
correlacin Log. del tamao-Distancia recorrida en el gel con
respecto a los fragmentos del bacterifago (cfr. Cuadro n 2), este
constituye la figura n 2.
Figura n 2.Relacin tamao-corrimiento por cada plsmido y sus
respectivos fragmentos de restriccin (con EcoR1 y BamH1), respecto
al digerido de , con HindIII.
Discusin de resultados:Con los datos anteriores puede analizarse
el trabajo realizado respecto al trabajo mismo, segn la
concordancia de los datos obtenidos y con respecto a los objetivos,
es decir respecto a la posibilidad de obtener ADN, de los plsmidos
y a diferenciarlos fenotpica y fsicamente, como recombinante y como
no recombinante, as como a la transformacin de E. coli, todas
operaciones que se concretaron y que de una u otra forma podran
hablar de una prctica exitosa.Sin embargo de manera particular
conviene hacer algunas consideraciones, por ejemplo, respecto a la
obtencin del ADN, donde la tcnica siempre que sea comprendida y por
lo tanto aplicada al pie de la letra no presenta gran dificultad
operativa, por lo que los errores que pudieran presentarse
difcilmente pudieran achacarse al operario, a menos claro, que este
no se hubiera familiarizado de antemano con la tcnica, no la
comprendiera o fuese en extremo descuidado. Lo cual parece haberse
cumplido, dado que, al analizar por electroforesis las muestras
correspondientes al plsmido estas, exhibieron ms de una banda que
era lo esperado, al no haberse tratado con enzimas de restriccin,
lo que permite pensar o en su degradacin o en la formacin de
isoformas durante la extraccin, opcin ms factible porque el ADN
siempre se manipul con guantes para evitar su contacto con
nucleasas y se trabaj en general en frio, para que an ante una
enzima, esta estuviera inactivada por las bajas temperaturas., as
la fuerza mecnica durante la extraccin puede considerarse, fue
demasiada, por lo que parte de los plsmidos extrados, pasaron de su
forma superenrrollada a una circular laxa y para el caso particular
de la muestra de pCR2.1-Topo-ape, incluso a una lineal (presencia
de 3 bandas).Esto pudiera corregirse una vez identificado el error,
repitiendo en el futuro la extraccin con precauciones mucho
mayores. Respecto a la cantidad de ADN obtenida, si bien, no se
determin con exactitud, esta fue suficiente, como para procesar las
muestras, tanto por restriccin como por transformacin, respecto a
la pureza que tampoco se determin con exactitud se apreciaba la
presencia, casi constante de ARN, como bandas muy ligeras y de gran
corrimiento, con una marcada fluorescencia en el UV, este ARN, si
bien no interfiri, casi nunca (vase adelante) con los resultados,
habla de deficiencias en la extraccin. Misma que dado lo anterior,
podra hacerse siguiendo algn otro mtodo, como el Quick Gene
(Desarrollado por Fujifilm Ltd, para su uso en el llamado Kit S),
en el que se usen RNAsas, para obtener ADN de alta pureza.Otros
factores de variacin que pudieran introducirse en la tcnica sera la
preparacin y el manejo de los reactivos de la extraccin, algunos de
los cuales son lbiles o sensibles como el SDS (solucin II BD) que
no debe de almacenarse a bajas temperaturas porque en tales
condiciones precipita, igualmente si el pH o la concentracin de los
reactivos no se ajustara, se introduciran variaciones que podran
hacer de la extraccin ineficiente, dejando protenas que al
asociarse con el ADN, interferirn en su corrimiento
electrofortico.Respecto a la transformacin de las bacterias los
resultados obtenidos son congruente con lo esperado puesto que las
clulas competentes por si solas, crecen considerablemente (control
positivo), mientras que con el plsmido crecen en menor medida, pero
en medios con ampicilina., lo que habla en 1 lugar de una
transformacin exitosa, puesto que para que la cepa utilizada
creciera en tales medios debera adquirir una resistencia ante la
ampicilina, la cual estaba contenida tambin en el plsmido.Aqu
conviene mencionarse que el control negativo, las clulas
competentes sobre medio con ampicilina, crecieron, aunque en mucho
menor medida que cualquier otro cultivo, lo cual es un resultado
anmalo, atribuible a una contaminacin ambiental, o por parte del
operario con bacterias resistentes a la ampicilina y al menos en
apariencia de la misma especie, otra posibilidad que explique estos
resultados es una mutacin, por la que algunas de las clulas del
cultivo original, a lo largo de las resiembras o de manipulaciones
inadecuadas, haya adquirido una resistencia, cuestin, no tan poco
probable dado que la cepa en cuestin Es F- RecA1, por lo que es
capaz de adquirir por conjugacin o por recombinacin genes ajenos,
aunque para afirmar esto debieran de conducirse algunas pruebas
adicionales dado que si esto ocurri sera esperable que otro equipo
exhibiera estos resultados, as que por el momento la conclusin ms
factible, habla de una contaminacin.Los dems resultados permanecen
congruentes a lo esperado puesto que las clulas con pCR2.1-TOPO
exhiben su carcter de recombinantes al generar color fruto de la
degradacin del X-gal, (favorecido por el falso inductor de la
galactosidasa el IPTG, vase el mecanismo de la reaccin cromognica
en el anexo 2.), mientras que las clulas conteniendo a
pCR2.1-TOPO-ape, no lo hacen al estar en medio de gen de la
galactosidasa el inserto -ape-, correspondiente al gen de la
aminopeptidasa de Ustilago maydis. Igual congruencia con un proceso
de transformacin, exhibe el hecho de que se aprecien ms colonias
donde se inocul ms ADN, es decir a mayor ADN agregado, hubo un
mayor nmero de clulas transformadas.Esto habla adems de la adecuada
formacin de competentes, por tratamiento con cloruro de calcio y
choque trmico, lo que valida la metodologa utilizada, al menos en
este punto.Ahora bien, con respecto a la restriccin no se
obtuvieron resultados como los esperados, en todas las
determinaciones, primero por que como equipo de trabajo las
condiciones de electroforesis fueron inadecuadas y el ADN, fue
expulsado del gel, tras un tiempo prolongado de corrimiento,
cuestin que se puede corregir, siguiendo la banda del regulador de
carga de color azul en su primera porcin, la menos densa, en lugar
de la segunda, que puede ir por arriba del ADN, en el corrimiento.
Con respecto al gel que se analiz a falta del nuestro aparecieron,
como se dijo ya bandas respectivas a las isoformas del plsmido,
mientras que para las muestras tratadas con ECOR1 donde se
esperaban 2 bandas, no se apreci, ms que una salo que sugiere que
en las condiciones de trabajo, la enzima no realiz ms que un corte,
que linealiz al ADN, este corte que es el mismo se espera de BamH1,
permite corroborar que el plsmido en cuestin es el de inters
pCR2.1-Topo porque su tamao calculado, se aproxima a las 3.9Kb
reportadas para el mismo, donde el tamao calculado fue de 3.5 Kb.,
sin embargo, para la muestra de pCR2.1-Topo-ape, se esperaba un
tamao de unas 5Kb, que no fue exhibido, lo que puede deberse a que
el fragmento ms corto del inserto, que si pudo haber sido cortado
se sali del gel o fue enmascarado por el ARN abundante (no se
muestra en la imagen). Solo las muestras tratadas con BamH1,
corroboran parcialmente los datos esperados al mostrar en el gel
una sola banda, correspondiente a que BamH1, solo realiza un corte
en el ADN, que lo linealiza y que para pCR2.1-Topo muestra el tamao
de casi 4 Kb del plsmido mientras que para pCR2.1-Topo muestra
tambin un solo fragmento pero de mayor tamao 4.2Kb.Con los tamaos
aproximados debe de tenerse cuidado, de hacer conclusiones
categricas pues la conducta del digerido de , no es adecuada para
usarse como una curva tipo, pues sus fragmentos no crecen a
intervalos constantes de tamao, ni se comportan en la grfica de
forma lineal (el ajuste a la linealidad, tampoco es adecuado, pues
al hacerlo el coeficiente de correlacin R es igual a 0.9339, cuando
analticamente se recomienda, que para hacer correlaciones R sea
igual o mayor a 0.995), as es que se mantienen los tamaos como
aproximaciones, y si se quisiera determinar estos con exactitud
convendra utilizar marcadores sintticos de peso molecular o
recurrir a tcnicas fisicoqumicas.En general, este anlisis debiera
de repetirse prestando especial cuidado a las condiciones del
corrimiento entre ellas el voltaje aplicado, su homogeneidad sobre
el gel y el tiempo de corrimiento.A este mismo respecto la
electroforesis esta aparecer como una tcnica poderosa de anlisis,
siempre que se elijan las condiciones ptimas para cada anlisis, por
lo que tanto la concentracin de agarosa en el gel, como el voltaje
y el tiempo sean adecuados y estos aunque se refieran en la
literatura se comprueben experimentalmente, algunas acotaciones se
han hecho ya, al hablar de la restriccin.Por lo dems, los errores
introducidos en las determinaciones, por los instrumentos y equipos
seran muy difciles de detectar dado que las magnitudes de medida
utilizadas escapan a la percepcin humana, sin embargo, estos
errores pudieran evitarse dando al equipo su mantenimiento
preventivo y cuidando al mximo las condiciones de trabajo, para
usarlo de la mejor manera.Como perspectivas de este trabajo sera
interesante el aislar plsmidos distintos y caracterizarlos de la
misma forma en que se hizo en la prctica, para saber si todo el ADN
recombinante se comporta de la misma manera, aqu mismo sera
importante el poder aplicar la metodologa de extraccin de ADN
plasmdico en otras prcticas, pues como se dijo ya, reviste algunos
problemas como la obtencin de isoformas del mismo, por lo que la
prctica permitira mejorar la tcnica y con el tiempo proponer una
tcnica modificada, que permita obtener ADN plasmdico, de alta
calidad y en las mximas concentraciones posibles. Igualmente sera
conveniente el repetir los experimentos de restriccin con una
mezcla de BamH1 y EcoR1 y con enzimas distintas a las probadas,
para construir un perfil de restriccin ms completo e incluso hacer
un mapeo de los genes de inters o del inserto en el caso de
pCR2.1-Topo-ape. Igualmente el expresar todos los resultados de la
transformacin en trminos cuantitativos permitira hacer
comparaciones fiables y conclusiones de tipo estadstico. Lo mismo
aplica para la extraccin de ADN, que convendra, para comparar,
expresar en trminos de pureza y cantidad obtenida.Finalmente:La
presente prctica puede verse como el culmine del curso experimental
de gentica microbiana, pues para su realizacin, se integraron
muchos de los conocimientos y tcnicas revisadas a lo largo del
curso, en ella se pretendi aislar y caracterizar el ADN
recombinante, molcula quimrica que si bien basada en ADN natural,
ha sido modificada por el hombre, y que en la actualidad goza de
una importancia enorme, por permitir, al insertarse en otros
organismos el obtener mltiples productos de inters industrial
(especialmente farmacutico), as mismo, el manejo de las tcnicas de
trabajo con esta molcula ha permitido, avances enormes en las
ciencias de la vida y la salud al permitir la caracterizacin de las
especies biolgicas y la descripcin detallada de muchas de sus
funciones genticas y metablicas, sin embargos y aunque no es
objetivo de la prctica, cabe sealarse, las precauciones que en el
futuro y desde el presente se habr de adoptar, para evitar la
liberacin al medio ambiente de ADN y/o organismos genticamente
modificados, lo cual podra causar graves daos ecolgicos al alterar
la biodiversidad por introduccin de nuevas especies y
desplazamiento de otras, quizs an no conocidas por el hombre.As los
conocimientos experimentales aqu adquiridos, no sern suficientes a
menos que cuenten con un respaldo terico-metodolgico, fundamentado
en la biotica, que permita el decidir el mejor aprovechamiento de
los conocimientos actuales en materia de gentica (en palabras de
Santiago Ramn y Cajal: Para la ciencia los medios son casi nada y
el hombre, lo es casi todo).
Conclusiones: Se obtuvo ADN de doble cadena de pCR2.1TOPO y
pCR2.1TOPO-ape (plsmidos recombinantes y no recombinantes). Esto
por el mtodo de lisis alcalina y con la generacin de isoformas. Se
obtuvo y trabaj con clulas competentes de Escherichia coli, mismas
que fueron transformadas a bacterias ampicilina resistentes con el
ADN del plsmidos, igualmente para las transformadas con
pCR2.1TOPO-ape se comprob la presencia de un inserto que inhabilita
la capacidad de degradar la galactosa. Con lo anterior se pudo
diferenciar un vector recombinante, en este caso pCR2.1TOPO de uno
no recombinante pCR2.1TOPO-ape por pruebas fenotpicas y por pruebas
de restriccin.
Referencias bibliogrficas:
1) Espinoza Lara A. et. Al. EXPERIMENTOS EN GENTICA MICROBIANA,
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2) Gonzlez de Buitrago TCNICAS Y MTODOS DE LABORATORIO CLNICO, 2
ed. Ed. Masson, 2005, Espaa.
3) Molina N. et. Al. COMPARACIN DE MTODOS DE LISIS Y EXTRACCIN
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61:133-137 2006, FLAP, en
http://www.scielo.cl/pdf/parasitol/v61n3-4/art06.pdf, sitio pblico
en internet consultado el 24/VII/11 a las 23:55 hrs.
4) J.G. y N. Sherman.: MICROBIOLOGY A LABORATORY MANUAL.
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7) Lodish et Al. BIOLOGA CELULAR MOLECULAR Ed. Mdica
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8) Sigma life sciences. MICROBIOLOGY MANUAL. Sigma-Aldrich
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9) Tortora MICROBIOLOGY AN INTRODUCCIN. Ed. Benjamin Cummings,
9th edition, 2006, U.S.A.
10) Watson JD et Al. BIOLOGA MOLECULAR DEL GEN. Ed. Mdica
Panamericana, 5 edicin 2006. Argentina.
11)
http://www.unicartagena.edu.co/librose/LABORATORIO%20N%C2%BA7%20AISLAMIENTO%20E%20IDENTIFICACION%20DEL%20DNA.pdf
sitio pblico en internet consultado el 1/IX/11 a las 23:55 hrs.
ANEXO N 1. Gel de electroforesis obtenido por el equipo 5.
Figura n 3. Gel obtenido en el anlisis por electroforesis, de
los plsmidos y los plsmidos tratados con enzimas de restriccin.El
llenado de los pozos se hizo, en el orden siguiente:
1.pCR2.1Topo/BamH1 2.pCR2.1Topo/EcoR1 3.pCR2.1Topo. 4.
pCR2.1Topo-ape/BamH1 5.pCR2.1Topo-ape/EcoR1 6.pCR2.1Topo-ape
7.Marcador de peso molecular.
ANEXO N 2.Reaccin cromognica del X-gal
Figura n 4. Reaccin cromognica entre el X-gal y la beta
galactosidasa, cuando esta es inducida por el IPTG.EL X-gal, anlogo
a la galactosa, es degradado por la beta-galactosidasa, cuando esta
es inducida por el IPTG, quien no reacciona con estas, generando al
compuesto 1, que copula con otra molcula del mismo compuesto,
generando al compuesto 2, de color azul. As puede evaluarse la
sntesis de beta-galactosidasa, en un cultivo de clulas con un
operon lac funcional o su no sntesis si alguno de los genes de
dicho operon estn interrumpidos por algn inserto como es el caso
del inserto ape- en pCR2.1-TOPO-ape.