Pokusni modeli - labanim.hr¡olić_Pokusno-modeli.pdf · Cjepiva-načelo aktivne imunizacije • Načelo aktivne imunizacije protiv velikih boginja uveo Edward Jener prije 200 god.

Prof. dr. sc. Nada Oršolić

Zavod za animalnu fiziologiju

Pokusni modeli

Nužnost uporabe pokusnih životinja

• U istraživanju fizioloških procesa • U mikrobiološkim istraživanjima • U istraživanja rasta tumora i metastaza • U proizvodnja cjepiva protiv zaraznih bolesti • U istraživanje lijekova • U istraživanjima u području toksikologije • U istraživanju imunotoksičnost • U istraživanju karcinogena i mutagena • U neurofiziologiji i ponašanju životinja

• http://www.nih.gov/science/models/mouse/resources/hcc.html

• Emice website: http://emice.nci.nih.gov/

• Cancer Models Database: http://cancermodels.nci.nih.gov/

• Cancer Images Database: http://cancerimages.nci.nih.gov/

• http://www.jax.org/

Mišji modeli za tumore ljudi

Nužnost uporabe pokusnih životinja u biomedicinskim istraživanjima

• U biologiji, veterini i agronomiji znanstvena istraživanja uz uporabu pokusnih životinja temelje se na prikupljanju informacija za životinju ili životinjsku vrstu.

• Biomedicinska istraživanja pokusne životinje rabe u istraživanju: – lijekova (20-25%), – provjere valjanosti cjepiva (15-20%), – istraživanju toksičnosti različitih pripravaka (15-20%), – istraživanju karcinoma (10-15%) – 30% za druge svrhe: bazična medicinska istraživanja,

genetička istraživanja, dijagnoza, pokusne operacije, edukacija i dr.

Cjepiva-načelo aktivne imunizacije • Načelo aktivne imunizacije protiv velikih boginja uveo

Edward Jener prije 200 god.

• “živa atenuirana vakcina” prema uputama WHO (World Health Organisation)

• Cjepivo protiv brojnih bolesti

• Pojava “davnih” iskorjenjeni bolesti i pojava novih bolesti

• Pogodujući čimbenici: promjena ljudskog ponašanja, povećano kretanje ljudi, demografske promjene, iskorištavanje okoliša, smanjena pozornost na mogućnost zaražavanja, smanjen opseg istraživanja i nadzora zaraznih bolesti te mutacija virusa.

• broj životinja smanjen ali životinje su nezamjenjive u istraživanju kakvoće, valjanosti i neškodljivosti cjepiva (dobra laboratorijska praksa-rekombinantne vakcine)

Cijepljenje- aktivna imunizacije stečena umjetnim načinom

• Osnovni oblici specifične imunosti • Prema izvršnim (efektornim) mehanizmima djelovanja

– Humoralna imunost (posredovana protutijelima)

– Stanična imunost (posredovana stanicama)

• Prema načinu stjecanja – Aktivna imunost (stečena djelovanjem organizma)

• Stečena prirodnim načinom (preboljenje bolesti, izloženost infekciji

• Stečena umjetnim načinom (cjepljenje)

– Pasivna imunost (stečena prijenosom seruma) • Stečena prirodnim načinom (putem posteljice, kolostrum)

• Stečena umjetnim načinom (imunosni serumi)

– Adoptivna imunost (stečena prijenosom limfocita

Glavne komponente obrambenog

odgovora kralješnjaka

Napad patogenih

mikro-organizama

STEČENA (SPECIFIČNA) IMUNOST

Sporiji odgovor na specifične patogene mikroorganizme;

treća linije obrane

PRIROĐENA (NESPECIFIČNA) OTPORNOST Brzi odgovor na niz mikrobnih patogena

Vanjska obrana; prva linija obrane

Koža Mukozne membrane Izlučevine (sekreti)

Fagocitne stanice Antimikrobni proteini Upalna reakcija Stanice prirođene ubojice (NK stanice)

Humoralni odgovor (protutijela) Stanična imunost (citotoksični)

Unutrašnja obrana; druga linija obrane

Zajednički sastojak različitih sojeva bakterija

Epitopi karakteristični za pojedine sojeve bakterija

ADAPTIVNA IMUNOST

UROĐENA IMUNOST

Bakterija A Bakterija B Bakterija C Bakterija D

Precizno prepoznaje

bakterije pomoću

membranskih

receptora na

limfocitima koji se

specifično vežu na

epitope

karakteristične za

pojedine sojeve

bakterija

Grubo prepoznaje

bakterije pomoću

membranskih

receptora koji se vežu

na neke zajedničke

molekularne obrasce

tipične za različite

sojeve

mikroorganizama

Komunikacija stanica prirođene i stečene imunosti

IL5

IL13

IL2

IFNg

TNFb

IL4 IL10

IL10

IFNg

IL4

TH2 limfocit

IL12

IL18

TH1 limfocit

Prvenstveno reguliraju i potiču staničnu imunost

Prvenstveno reguliraju

i potiču humoralnu

imunost

B7.1 B7.2

CD40

TCR

CD4

TH0

CD40L

CD28 CTLA-4

MHC APC

Tpat

regulacija putem citokina

regulacija doticajem (kontaktom)

CTLA-4 IL-10 TGF-b

Treg

CD80/86

TCR MHC Treg

?

?

Tef

APC

?

?

IFNg IL2 Rast i diferencijacija u citotoksički T

Aktivacija

IL2 IFNg TNFb Aktivacija

EOZINOFIL

ENDOTEL

NEUTROFIL

CD8T

NK

B

MONOCIT

MAKROFAG IFNg IL2 TNFb

Fagocitoza

Stvaranje reaktivnih radikala kisika i dušik oksida

Ubijanje intracelularnih bakterija

Iskazivanje MHC molekula klase II

Iskazivanje FcR receptora

Prezentacija antigena

IFNg TNFb

Stvaranje reaktivnih kisikovih intermedijera i dušik oksida

Stvaranje katjonskih proteina i hidrolaza

Iskazivanje adhezijskih molekula

Mobilizacija i aktivacija leukocita

Iskazivanje MHC molekula klase II

IL5

Rast i diferencijacija

Aktivacija

Stvaranje IgA

IL4 IL13

Rast i diferencijacija

Aktivacija

Stvaranje IgE

ADCC sa IgE posredovan eozinofilima

TNFb IFNg

IL2

IFNg

TNFb

IFNg

TH1 limfocit

IL4

IL5

IL10

IL13

TH2 limfocit

IL10

polimorfonuklearni

neutrofili

MHC

+ Ag

IFN-g

Prirođena

imunost

antigen/

mz

Th0

makrofag

Humoralni

odgovor

IgE

imunokompleksi

citotoksičnost

medijatori

aktivacija

komplementa

B

IL-4

IL-4

IL-5

mastocit

Stečena

imunost

NK

stanica

Th2

Th1

eozinofil

mastocit

Stanični

odgovor makrofag

IFN-g

plazma B stanica

citotoksična

T stanica

IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13

IFN- g

Istraživanje lijekova

• uvođenje “meta“ dobivenih biotehnološkim inžinjeringom

• Završni dio postupka istraživanja novih lijekova i njegove

učinkovitosti i neškodljivosti mora biti proveden in vivo –rezultati in vitro nisu vjerodostojni

• De Boer i sur. (1997) istraživanje lijekova kroz krvno-moždanu barijeru

• Istraživanja na području toksikologije- in vitro modeli ne zadovoljavaju

• Imunotoksične tvari- prema učinku na imunološki sustav čovjeka i životinja djele se na: imunosupresivne, imunostimulativne ili imunosenzibilizirajuće

Istraživanje lijekova

• Combes (1997) –istraživanja in vivo na glodavcima-jedini prikladni model za prepoznavanje negenotoksični i genotoksični kancerogena

• Draizeov očni test (Draize rabbit eye irritation test) nezaobilazni je postupak u provjeri svih kozmetičkih proizvoda -složenost mehanizama koji uzrokuju iritaciju

• valjanost proizvoda u kozmetičkoj industriji, njihovu sigurnost i neškodljivost nemoguće potvrditi bez istraživanja in vivo.

Kemijska karcinogeneza

Indukcija

Aktivacija

Inicijacija

Stanica

Zloćudni tumor

Okoliš

Sustav P-450

Prekarcinogenik Karcinogenik

Zloćudni tumor

ORGANIZAM

Promotori Endogeni promotori

Glodavci (Rodentia)

Red Podred Porodica Rod Vrsta

Rodentia

Myomorpha

Muridae

Mus

Ratus

M. Musculus

R. Norvegicus (Norwegian rat)

Critcetidae

Mesocricetus

Meriones

M. Auratus (Syrian hamster)-hrčak

M. Unguculatus (gerbil)

Hysrticomorpha

Caviidae Cavia

C. Porcellus (guinea pig)-zamorac

Uporaba velikog broja životinja

• Sisavci 1800 vrsta (glodavci, kunić, pas, mačka, svinja, ovca, koza, primati).

• Glodavci čine 75-80% laboratorijskih životinja (miš, štakor, hrčak, zamorac, gerbil).

• Osim sisavaca rabe se i: ptice, gmazovi, vodozemci i ribe.

• Miš (Mus musculus) – više od 1000 genetički definirani srođenih miševa

Miš-kao pokusni model

Prednosti uporabe miša kao pokusnog modela: Mala životinja Dobro podnose život u

zatočeništvu Ima veliko leglo i kratko

generacijsko razdoblje Troškovi uzgoja relativno niski Brojni srođeni sojevi,

rasprostranjeni po cijelom svijetu, rezultati usporedivi

Dobivanje rezultati usporedivi, bez velikih varijabilnosti (stalna genetska podloga)

Nedostaci Mala veličina Kratki životni ciklus Fiziologija

Zašto uporabiti miša kao pokusni model

• Prednosti – Model za proučavanje sisavaca,

posebice njihovih specifičnih procesa kao što su: • Inaktivacija X kromosoma • Genomski ispis

– Mala veličina – Pripitomljenost – Kratki životni ciklus – Dobro proučena biologija – Jednostavna manipulacija i

stvaranje velikog broja potomaka – Mogućnost planiranja – Sekvencioniran genom i dobro

poznat – Mogućnost stvaranja

visokosrodnih sojeva

– Široki rang genetičke raznolikosti • Podsojevi • Srođeni sojevi

– a/kada se grane odvoje prije 40 generacije (između 20-40)-ostatak herterozigotnosti)

– b/razlike nastale mutacijom – c/genska razlika između grana

• Podlinije

– a/procesima rukovanja:hranjenja putem majke, presađivanje jajne stanice, umjetnim hranjenjem, presađivanjem jajnika ili pohranjivanjem u smrznutom stanju

– b/prenošenjem skupine drugom istraživaču

• Koizogeni, kongeni ili segregirajući srođeni sojevi

Pokusne životinje

• 1.Čisti sojevi životinja – visokosrođene životinje (sparivanje braće i sestara iz istog

legla kroz najmanje 20 generacija

– Singenične životinje

– Kongenični miševi- životinje koje se razlikuju samo u jednom kromosomskom lokusu ili regiji-dragocjen model za proučavanje tog gena

• 2. Životinje s posebnim genskim obilježjima

– Transgenični miševi

– Knock-out miševi (miševi s izbačenim genom)

• 3. Imunodeficijentni miševi

Neki visokosrođeni sojevi miševa primjenjeni u imunologiji

Soj Podsoj Osobitost

A A/ He A/J A/WySn

Visoka pojavnost tumora mliječne žlijezde

AKR AKR/J AKR/N AKR/Cum

Visoka pojavnost leukemija (Thy 1.2 alel u AKR/Cum, i Thy 1.1 alel u drugim podsojevima (ovi geni kodiraju površinske proteine stanica T)

BALB/c BALB/cj BALB/cAnN BALB/cBy

Osjetljivi na zračenje Uporaba u tehnologiji svaranja hibridoma Mnoge mijeloidne stanične linije su proizvedene u ovim miševima

CBA

CBA/J CBAH CBA/N

Gen (rd) uzrokuje oštećenje retine u CBA/J Gen (xid) uzrokuje imunodeficijenciju vezano za X kromosom u CBA/N miševa

Neki visokosrođeni sojevi miševa primjenjeni u imunologiji (nastavak)

C3H C3H/He

C3H/HeJ

C3H/HeN

Gen (rd) uzrokuje oštećenje retine

Visoka pojavnost tumora mliječne žlijezde u mnogim podsojevima (nositelji virusa koji prouzrokuje tumor mliječne žlijezde, prijenos preko mlijeka majke u potomstvo

C57BL/6 C57BL/6J

C57BL/6By

C57BL/6N

Visoka pojavnost hepatoma (tumor jetre) poslije zračenja

Visoka aktivnost komplementa

C57BL/10 C57BL/10J

C57BL/10ScSn

C57BL/10N

Bliski s C57BL/6 ali se razlikuju u najmanje 2 lokusa

Česti partner u pripremi kongenični miševa

Neki visokosrođeni sojevi miševa primjenjeni u imunologiji (nastavak)

C57BR C57BR/cdj

Učestali tumori hipofize i jetre

Rezistentan na x-zračenje

C57L C57L/J

C57LN

Osjetljivi na eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis (EAE)

Visoka frekvencija tumora hipofize i stanica mrežnice

C58 C58/J

C58/LwN

Visoka pojavnost leukemija

DBA/1 DBA/1J

DBA/1N

Visoka pojavnost tumora mliječne žlijezde

DBA/2 DBA/2J

DBA/2N

Slabi imunosni odgovor na neke antigene

Slabi imunosni odgovor na pneumokokne polisaharide tipa III

Neki visokosrođeni sojevi miševa primjenjeni u imunologiji (nastavak)

HRS HRS/J

Hairless (hr)gen obično u heterozigotnom stanju

NZB NZB/BINJ NZB/N

Visoka pojavnost autoimunih hemolitičkih anemija i nefritisa sličnom sistemskom lupusu eritematozusu (SLE) autoimune bolesti slične SLE u F1 generaciji križanih s NZW

NZW NZW/N SLE-tip autoimunostiu F1 generaciji križanih s NZW

P P/J

Visoka pojavnost leukemija

SJL SJL/J Visoka razina agresije i borbe to smti, posebice mužjaci

SWR SWR/J

Naginju razvoju autoimuni bolesti, posebice EAE

129 129/J 129/SvJ

Visoka pojavnost spontanih teratokarcinoma

NOD

C57BL/6

CBA

Agouti coat

Goli miš (nude mouse)

Genetički promjenjeni “zeleni miševi”

Dodatne kopije gena mogu nositi biljege genske aktivnosti, primjerice fluorofori koji svijetle u vidljivom dijelu spektra pod ultraljubičastim svjetlom; GFP-green fluorescent protein ili bakterijski protein lacZ čiji proizvod β-galaktozidaza mijenja boju supstrata x-gal u plavu

Zašto transgenične životinje

Za otkrivanje uloge pojedinih gena

Povećana ekspresija ciljnog gena, knock –out, knock-in, mutageneza

Za proučavanje genskih mutacija in vivo

Za razumjevanje kontrole genske ekspresije

Za proučavanje bolesti Transgenične životinje kao modeli

bolesti

Za genetičko obilježavanje organizma

Zeleni flourocentni protein

Za proizvodnju biofarmaceutika –Pharm animals

Primjerice, inzulin u kravljem mlijeku

Hormona rasta, interleukina, laktoferina……

Usporedba transgeničnih i knock-out miševa

Osobitosti Transgenični miševi Knockout miševa

Stanice koje primaju DNA

zigote Embrionalne matične stanice (ES)

Uporabljeni DNA konstrukti

Prirodni geni ili cDNA Mutirani geni

Način dostave Mikroinjekcija unutar zigote i implantacija unutar lažno gravidne majke

Transfer embrionalne matične stanice do blastocite i implantacija unutar lažno gravidne majke

Ishod Unos gena Gubljenje gena

Imunodeficijentni miševi-

• U imunolologiji su posebice zanimljivi različiti imunodeficijentni miševi, upravo zbog svojih nedostataka:

– nedostatne imunoreaktivnosti na određene antigene

– zbog nedostatka, T, B, NK stanica ili citokina

– neadekvatnog stromalnog okoliša.

• Primarna imunodeficijencija

– -životinje s urođenim nedostatkom određeni imunosnih stanica ili čimbenika imunosti (primjerice, goli miševi, SCID, CBA/N)

– -genetski modificirane životinje (trangeni ili knouck-out)

• Induciranoj imunodeficijenciji

– (obrada životinja s određenim protutijelima, toksičnim lijekovima, zračenjem, timektomija…)

• Koristi se kao modeli u imunološkim i onkološkim istraživanjima.

– Razumjeti ulogu imunološkog sustava u nekoj bolesti.

– Održavanje tumorskih staničnih linija

Gdje se koriste imunodeficijentni miševi?

Osobitosti imunodeficijentni miševa

Soj Osobitost CD-1 goli miš Dobiven prenosom gena golih miševa u CD-1

miša. Bez timusa, nedostatak stanica T. NU/NU Porijeklom od NIH, kongeničan s BALB/c

Bez timusa, nedostatak stanica T.

BALB/c goli miš Bez timusa, nedostatak stanica T. NIH-III miš Deficijentan u stanicama T, NK (bg mutacija), te B-

stanicama-neovisnim o stanicama T(xid mutacija) Fox chase SCID mouse Podrijetlo od SCID miša, posjeduje genetičku

autosomalnu mutaciju PrkdcSCID.

Imunodeficijencija u stanicama T i B. Fox chase SCID beige mouse Posjeduje genetičku autosomalnu mutaciju scid i

beige.

NOD SCID miš Životinje homozigotne za SCID mutaciju na NOD osnovi,oštećenu T i B limfocitnu funkciju i nedostatak NK funkcije i sposobnosti aktivacije aktivnosti komplementa. Ovaj model ne razvija tip 1 dijabetesa.

Osobitosti imunodeficijentni miševa Soj Osobitost

CNA/N B-imunodeficijentni miš, mutacija na kromosomu x, neadekvatna odgovornost na timus-neovisne antigeneTh-1, Th-2, nedostatak prekursora za proizvodnju IgG3 i IgM, broj C3 stanica manji u slezeni

W/Wv Genetički anemični miševi za praćenje ontogeneze i diferencijacije eritrocita, hematološki mikrookoliš normalan, matične stanice defektne

Sl/Sld Genetički defekt u mikrookolišu (stromi), važnom čimbeniku za diferencijaciju matičnih stanica, posebice proteoglikanske sastavnice stromalnog vanstaničnog matriksa.

NZB Spontano razvijaju autoimunosnu bolest sličnu sistemskom lupusu eritromatozosu. Imaju manjak supresorskih stanica T, nedostatak faktora rasta T i B stanica i IL-3

Nude-xid Imunodeficijencija u zrelim stanicama T i B.Normalan broj CFU-S ali nedostaju 2 rana pre B-stanična markera, osjetljivost na transformaciju sa Abelsonovim virusom leukemije i proizvodnja µ lanca (cµ)

Beige mouse

Komparacija imunodeficijentnih sojeva

Imunodeficijentni

sojevi Osobitosti

Dlaka Timus T-

stanice B-

stanice NK-

stanice Fiksacija

komplementa

CD-1 goli miš - - - + + +

NU/NU goli miš - - - + + +

BALB/c goli miš - - - + + +

NIH-III goli miš - - - - - +

Fox chase SCID

mouse + + - - + +

Fox chase SCID

beige mouse + + - - - +

NOD SCID miš + + - - - -

Goli štakor (Nude

rat) - - - + + +

Pokusni modeli

• I ako znanstveno istraživačka djelatnost nosi stupanj individualne slobode i kreativnosti, svaki istraživač nosi i stupanj osobne odgovornosti prema metodama rada i predmetu istraživanja. Točnije, svatko je u svom djelokrugu rada dužan raditi u sukladu s profesionalnim i etičkim normama i svojom

savješću!!!

Shematski prikaz pitanja

koja si svaki znanstvenik

mora postaviti prije nego

se odluči koristiti pokusne

životinje u svom

istraživanju.

Istraživanje na životinjama je temeljeno na metodama kritičke provjere teoretskih

počela i načela medicinske prakse!!!

• Istraživanja i rad s životinjama treba provesti u sukladu sa etičkim principima, koji su važeći u Republici Hrvatskoj (Pravilnik o uvjetima držanja pokusnih životinja, posebnim uvjetima za nastambe i vrstama pokusa, Narodne Novine br. 19/1999; Zakon o zaštiti životinja, Narodne novine br. 135/06) i prema Vodiču za držanje i korištenje laboratorijskih životinja (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, DHHS Publ. (NIH) # 86–23 1985).

Prilikom izbora modela treba voditi računa o:

• -pogodnosti modela kao analoga, • -mogućnosti transfera informacija • -genetskoj uniformnosti modela • -dosadašnjim saznanjima • -cijeni i pristupačnosti životinja • -mogućnosti generalizacije dobivenih rezultata • -lakoći i mogućnosti prilagodbe pokusnih tehnika • -ekološkim posljedicama pokusa • -etičkim posljedicama pokusa • -mogućnostima smještaja životinja • -veličini životinja • -potrebnom broju životinja • -spolu životinja • -dužini životnog vijeka životinja • -količini podataka koje je potrebno pokusima prikupiti • -starosti životinja broju potrebnih potomaka koje je moguće dobiti • -mogućim bolestima ili fiziološkim stanjima odabranih životinja koje bi mogle

utjecati na rezultate pokusa

Animal Models of Cardiovascular Disease

Miševi Štakori Hrčci

Okolišni zahtjevi

Temperatura (°C) 20-24 20-24 20-24

Relativna vlažnost (%) 50-60 60 50-60

Ventilacija /(promjene/sat) 15 10-15 10-15

Svjetlo/mrak (sati) 14/10 12-14/12-10 12-14/12-10

Minimalna veličina dna kaveza (cm2)

-jedna odrasla jedinka

-rasplodna životinja s mladima

-grupa (cm2/odrasla jedinka)

180

200

80

350

800

250

180

650

n/a

Minimalna visina kaveza (cm) 12 14 12

Okolišni zahtjevi i fiziološki parametri miševa, štakora i hrčkova

Miševi Štakori Hrčci

Opći fiziološki parametri

Težina odrasli (g)

-mužjak

-ženka

20-40

25-40

300-500

250-300

120-140

140-160

Životni vijek (godine) 1-2 2-3 2-3

Frekvencija srca (/min)

300-800 300-500 250-500

Frekvencija disanja (/min) 100-200 70-110 40-120

Tjelesna temperatura (°C)

36.5-38.0 37.5-38.5 37-38

Broj kromosoma (2n) 40 42 44

Površina tijela (cm2) 20 g:36 50 g:130

130 g:250

200 g:325

125 g:260

Okolišni zahtjevi i fiziološki parametri miševa, štakora i hrčkova

Miševi Štakori Hrčci

Opći fiziološki parametri

Unos vode (ml/100 g) 15 10-12

8-10

Pubertet (tjedni)

-Ženke

-mužjaci

5

-

6-8

-

4-6

7-9

Plodno doba (tjedni)

-Ženke

-mužjaci

8-10

8-10

12-16

12-16

6-8

10-12

Oestrus ciklus (dani) 4 (2-9) 4-5 4

Trajanje oestrusa (sati)

14 14 2-24

Trajanje trudnoće 19 (18-21) 21-23 15-17

Veličina legla

6-12 6-12 6-8

Težina kod rođenja (g)

Težina kod sisanja (g)

Prestanak sisanja (dani)

0.5-1.5

10

21-28

5

40-50

21

2-3

30-40

20-22

Miševi Štakori Hrčci

Krvni parametri

Krvni volumen (ml/kg) 70-80 60 80

Hemoglobin (g/100 ml) 10-17 14-20 10-18

Hematokrit (vol %) 39-49 36-48 36-60

Leukociti (x 1000/mm3) 5-12 6-17 3-11

Glukoza (mg/100 ml) 124-262 134-219 60-150

Okolišni zahtjevi i fiziološki parametri miševa, štakora i hrčkova

Pretvorba doze za životinje prema dozi za čovjeka na temelju površine tijela

Vrsta Težina (kg) Površina tijela

(m2)

Km

faktor

Čovjek

Odrasli

dijete

60

20

1,6

0,8

37,5

25

Pavijan 12 0,6 20

Pas 10 0,5 20

majmun 3 0,24 12

zec 1,8 0,15 12

zamorčić 0,4 0,05 8

Štakor 0,15 0,025 6

hrčak 0,08 0,02 5

miš 0,02 0,007 3

Vrijednosti na temelju podataka

iz FDA (nacrt smjernica ). Za

pretvaranje doza u mg / kg do

doze u mg/m2, pomnožite Km

vrijednosti

Doza ekvivalentna za čovjeka (mg/kg) = animalna doza (mg/kg) x (Animal Km/Čovjek Km)

1. Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologics Evaluation and Research. (2002) Estimating the safe starting dose in clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers, U.S. Food and Drug Administration, Rockville, Maryland, USA

2. Reagan-Shaw S, Nihal M, Ahmad N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB J. 2008 ;22(3):659-61.

3. Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers (U.S. Department of Health and Human Services,Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research -CDER), 2005,Pharmacology and Toxicology

4. STICKLER GB, PINKEL D.Calculation of nutritional allowances for infants and children on the basis of body surface. J Pediatr. 1958;53(4):464-6.

5. PINKEL D.The use of body surface area as a criterion of drug dosage in cancer chemotherapy. Cancer Res. 1958 18(7):853-6.

Doze: odnos čovjek -životinja

Animalni modeli koji se danas rabe u biomedicinskim istraživanjima

• S obzirom na način razvijanja promjenjene homeostaze/bolesti, animalni modeli koji se danas rabe u biomedicinskim istraživanjima podjeljeni su kako slijedi:

• 1. Inducirani (pokusni) modeli

• 2. Spontani (genetski) modeli

• 3. Modeli bolesti stvoreni ciljanom genetskom modifikacijom (transgenične i knock-out životinje)

• 4. Negativni modeli bolesti

• 5. “Orphan” model bolesti

Inducirani (pokusni) modeli

• Takvi modeli dobiju se primjenom kemijskih, fizičkih i bioloških tvari na zdrave životinje u cilju prouzrokovanja neke bolesti sličnih značajki bolesti nazočnih u ljudima.

• Smatra se da mali broj induciranih animalnih modela u potpunosti oponaša etiologiju (podrijetlo), tijek i patologiju ciljane bolesti u ljudi.

• Inducirani model dijabetesa

• Inducirani model osteoporoze

• Inducirani model psorijaze

• Inducirani model upalnih bolesti crijeva

Inducirani model dijabetesa

inducirani model dijabetesa I može se prouzročiti:

odstranjivanjem gušterače (pankreatektomijom)

injiciranjem preko 300 različitih dijabetogenih kemijskih spojeva

(aloksan, streptozotocin, vakor, ditizon, i 8-hidroksikvinolon).

različiti lijekovi (jatrogenI dijabetes).

Za dijabetes melitusa tipa II:

prekomjerno opterećenje organizma glukozom i masnim kiselinama (stvaranje slobodnih

kisikovih radikala i oštećenje stanica, te u konačnici njihovu neosjetljivost

na inzulin; hiperglikemija potiče pojačano lučenje inzulina i postupno

iscrpljenje β-stanica što rezultira njihovim propadanjem

Klasifikacija dijabetesa

• -oštećenje b-stanica vodi nedostatku inzulina (10-15%) Tip I dijabetesa

• -heterogen >85% ljudi Tip II

dijabetesa

• -šećerna bolest u trudnoći Gestacijski dijabetes

• primjerice, genetički, lijekovi, operacije infekcije

Drugi specifični oblici,

Inducirani animalni modeli bolesti za diabetes mellitus -tip 1

Tip

diabetesa Animalni

modeli bolesti Stvaranje

animalnih modela Primjeri

Tip 1

Inducirani

(pokusni

životinjski)

modeli

Dijabetes

prpouzročen u

zdravim

životinjama

Tvari s dijabetogenim

učinkom u eksperimentalnim

životinjama:

Aloksan

Streptozotocin

Vakor

Ditizon

8-hidroksikvinolon

Animalni model hiperglikemije; pankreaktomija, diabetogene tvari

Animalni model glikozurije (florizin, prirodni flavonoid ,sc) vezuje se za Na/glukoza

prijenosnike u proksimalnim tubulima bubrega i inhibira resorpciju glukoze-masivna

glikozurija i poliurija

Mehanizmi djelovanja aloksana i streptozotocina na β-stanica gušterače

Mehanizam aloksan-induciranih

reaktivnih kisikovih radikala u β-stanicama

gušterače štakora. GKa, GKi - glukokinaze

aktivna i neaktivna, HA • - aloksan radikali, [Ca2

+] unutarstanična koncentracija kalcija

Mehanizam streptozotocinom (STZ)-induciranog

oštećenja β-stanica gušterače štakora. MIT -

mitohondrije; XOD – ksantin oksidaze

Inducirani animalni modeli bolesti za diabetes mellitus –tip 2

Model Obese Non obese Dietom/prehranom inducirani

Pustinjski štakor (Sand rat)

C57/BL 6J miš

Ježasti miš (spiny mouse)

Kemiski inducirani GTG obrađeni obese miš (gold thioglukoza)

Male doze aloksana ili streptozotocina u odraslog štakora miša ili dr.

Neonatalni štakor induciran s STZ

Operacijski inducirani lezija ventromedialnog hipotalamusa dietom induciranog obese miša

Parcijalno ostranjivanje gušterače (pankreatomija) u psa, primata, svinje i štakora

Doze kemijski diabetogenih tvari u različitih vrsta

Diabetogena tvar Vrsta Doza (mg/kg)

Aloksan Štakor 40-200 (iv; ip)

Miš 50-200 (iv; ip)

Zec 100-150 (iv)

Pas 50-75 (iv)

Streptozotocin Štakor 35-65 (iv; ip)

Miš 100-200 (iv; ip)

Hrčak 50 (ip)

Pas 20-30 (iv)

Svinja 100-150 (iv)

Primati 50-150 (iv)

ß-st.

MHC-I

citoliza

Tip 1 dijabetesa

ß-Ag

ß-Ag

APC

-

+

+

+ +

T-Ly

Th2

Th1 Mø IL-2

IFN-g

IL-4 IL-10

IL-12 B7

ß-Ag

MHC-II

O2-

H2O2 NO

IL-1 TNF- TNF-b IFN-g

“imunološki signali"

Općenite značajke dijabetesa

Osmotski simptomi -žeđ i suha usta -učestalo uriniranje -učestalo uriniranje tijekom noći, -nedostatak sna -gubljenje na težini -malaksalost, -umor i smanjena proizvodnja energije -zamućeni vid -infekcije

Komplikacije nazočne kod dijabetesa

-oštećenja krvnih žila -srčani udar -smanjeni dotok kisika -oštećenje bubrega -gubitak osjetljivosti na podražaje -komplikacije s očima -ponavljjuće infekcije -slabo i sporo zacjeljivanje rana

Mikrovaskularne komplikacije

Komplikacije s očima Retinopatija Makulopatija Oštećenja bubrega Dijaliza Uzročnik smrti Smanjena provodljivost živaca Gubljenje osjeta Nastajanje čira (ulceracija)

Makrovaskularne komplikacije

-Miokardijalni infarkt -Hipertenzija -Srčani udar -Periferne vaskularne bolesti (ishemija donjih udova; nedostatak kisika zbog loše obskrbe krvlju) -Slabo zacjeljivanje rana -Visoka razina kolesterola

Druge komplikacije

• Akutne komplikacije-sekundarna hipoglikemija kao posljedica uzimanja lijekova

• Dijabetična ketoacidoza –tip I šećerne bolesti

• Drugi čimbenici

Inducirani model osteoporoze

ovarijektomijom,

primjenom agonista gonadotropin otpuštajućeg

hormona

antagonista estrogenskih receptora

inhibitora aromataze;

primjenom glukokortikoida

retinoične kiseline

tiroidni hormone,

antikonvulzivni lijekovi,

lijekovi u liječenju šećerne bolesti (Tiazolidinedioni),

lijekovi za liječenje gastointestinalnih bolesti

(inhibitori protonski pumpi),

inhibitori kalcineurina

Izravni i neizravni učinak glukokortikoida u indukciji

osteoporose i lomljivosti kosti

Osteoporoza i oksidativni stres

oksidativni stres potiskuje diferencijaciju osteoblasta,

Spojevi s aktivnim kisikom uključeni su u svaranje osteoklasta

Oksidativni stres uključen u potiče patogenezu metaboličkih koštani bolesti

Oksidativni stres smanjuje zacjeljivanje kostiju nakon frakture

Inducirani model psorijaze

Kemijski iritanati:

dekanol,

propionaldehid,

bromoheksan,

di-n-propil disulfid,

heksil salicilat i

Heptaldehid

primjenom TLR7/8 agonista imikvimoda .

Prednosti i nedostaci mišjih modela za psoriazu

• Pozitivna strana životinjskog modela je i izbjegavanje svih čimbenika koji mogu utjecati na patološke pokazatelje psorijaze, primjerice, dob, spol, životni uvjeti, životne navike, izloženost stresnim čimbenicima, uzimanje lijekova, klimatske i temperaturne promjene i drugo.

• Negativna strana: većina modela na miševima ne odražava kompleksnu patogenezu psorijaze, djelomično i zbog razlika između ljudske i mišje kože, poput debljine epidermisa, gustoće folikula dlaka, programa diferencijacije keratinocita i drugo

Danilenko D M Vet Pathol 2008;45:563-575

Ključni događaji u patogenezi psorijaze

Primjena termografije u procjeni upale

Filename: FLNM0033.SIT

Emissivity: 1,00

Background: 23,0

Date: 19.01.2011

Time: 1:52:14 PM

Circle 1

Emissivity 1,00

Avg Temp °C 35,8

Min Temp °C 34,3

Max Temp °C 36,5

Delta Ref. °C

Filename: FLNM0169.SIT

Emissivity: 1,00

Background: 23,0

Date: 21.01.2011

Time: 9:03:57 AM

Circle 1

Emissivity 1,00

Avg Temp °C 37,4

Min Temp °C 36,2

Max Temp °C 38,1

Delta Ref. °C

Di-n-Propil Disulfid + Kurkumin –

I-mjerenje

Di-n-Propil Disulfid + Kurkumin –

II-mjerenje

Di-n-Propil Disulfid + Kurkumin –

I-mjerenje

Di-n-Propil Disulfid + Kurkumin –

II-mjerenje

Inducirani model upalnih bolesti crijeva

Većina modela temelji se na:

• kemijskoj indukciji,

• prenosu imunoloških stanica

• ili ciljanju gena

• samo u nekim modelima bolest se javlja bez egzogene manipulacije.

Prema grešci u mukoznoj imunosti mišje modele možemo svrstani u tri kategorije najvažnije za početak bolesti:

• (1) nedostaci u epitelnoj cjelovitosti / propusnosti,

• (2) nedostaci u stanicama urođene imunosti I

• (3) nedostatci u stanicama adaptivnog imunosnog sustava.

Indukcija kolitisa na štakorskom modelu pomoću kemijskog iritanta:

• octena kiselina (AA),

• trinitrobenzen sulfonska kiselina (TNBS) i/ili

• natrij dekstran sulfata (DSS).

Upalne bolesti crijeva (engl. Inflammatory bowel disease, IBD)

Upalne bolesti obuhvaća dva različita patološka područja:

Crohnova bolest (engl. Crohn's disease, CD) i ulcerozni kolitis (engl. Ulcerous colitis, UC)

Inducirani pokusni modeli u autoimunim bolestima

Životinjski model Moguća bolest-ljudi Antigen Prenos

bolesti (T-

stanice)

Pokusno prouzročene autoimune bolesti

Miastenia gravis Miastenia gravis Acetilkolinski

receptor Da

Encefalomijelitis Multipla skleroza Mijelinski bazični

protein

Proteolipidni

protein

Da

Autoimuni artritis Reumatoidni artritis Mycobacterium

tuberculosis

(proteoglikan)

Da

Autoimuni

tiroiditis Hašimotov tiroiditis Tiroglobulin Da

Povezanost nekih autoimunoloških bolesti s prisutnošću određenih antigena MHC

Autoimuna bolest Povezana s prisutnošću

HLA-alela

Addisonova bolest DR3

Gravesova bolest B8/DR3

Pemphigus DR4

Hashimotova bolest DR5

Dijabetes ovisan o inzulinu DR3 i DR4

Myasthenia gravis DR3

Reumatoidni artritis DR4

Sjögrenov sindrom Dw3

Sustavni lupus erythematosus DR3

Spontani (genetski) modeli bolesti

• Spontani (genetski) modeli jesu najbolji pokazatelji razvoja patogeneze određene bolesti u životinjskim modelima a slični su ili se podudaraju s razvojem bolesti u ljudi.

• ovakvi sojevi imaju urođene poremećaje; nose genetske varijacije (mutacije) koje su podloga nizu bolesti u ljudi i životinja.

• Doberman Pincher - von Willebrands bolest NZW x NZB F1 - autoimuna bolest Hrčak, miš, zlatni retriver - mišićna distrofija BB štakor i NOD miš - šećerna bolest

Spontani Modeli (Prirodni)-model u kojem životinja naravno stječe bolest koja oponaša ljudsku bolest

Spontani (genetski) modeli za dijabetes tipa 1

Tip

diabete

sa

Animalni

modeli

bolesti

Stvaranje

animalnih

modela Primjeri

Tip 1 Spontani

(genetski)

modeli

Nasljedni

poremećaji slični

uvjetima

nastanka

dijabetesa u ljudi

Animalni modeli Tipa 1 diabetes

mellitus:

NOD (non-obese diabetic) mouse

BB (bio breeding) rat

LETL (Long Evans Tokushima

lean) štakor

New Zealand white rabbit

Keeshond pas (engl. Keeshond dog)

Kineski hrčak (engl.Chinese

hamster)

Celebes black ape (Macacca nigra)

Razaranje b-stanica Langerhansovih otočića gušterače u NOD miševa pomoću autoreaktivnih stanica T

Spontani (genetski) modeli za dijabetes tipa 2

Tip

diabetesa

Animalni

modeli

bolesti

Stvaranje animalnih

modela Primjeri

Tip 2 Spontani

(genetski)

modeli

Nasljedni poremećaji

slični uvjetima

nastanka dijabetesa u

ljudi

Animalni modeli of Tipa 2 diabetes mellitus:

Ob/Ob miš—monogenski model pretilosti

(nedostatak leptina),

db/db miš—monogenetski model pretilosti

(leptin resistentan),

Zucker (fa/fa) štakor—monogenetski model

pretilosti (leptin resistentan),

Goto Kakizaki štakor

KK miš

NSY miš

OLETF štakor

Israeli sand štakor

Mastima-hranjeni streptozotocin-obrađeni

štakor,

CBA/Ca miš

Diabetični Torri štakor

New Zealand obese miš

Spontani kolitis u knock-out (KO) i transgeničnih glodavaca

• Spontani kolitis u knock-out (KO) i transgeničnih glodavaca omogućuju pokusni modeli za proučavanje razvoja mukozne upale i upalnih bolesti crijeva.

• Genetski i okolišni čimbenici, osobito normalna crijevna flora, važni su čimbenici u razvoju upale

sluznice.

• Normalna homeostaza mukoze je poremećena – citokinskom neravnotežom, – ukidanjem oralne tolerancije, – promjenama u epitelnoj barijeri i – funkciji ili gubitaku imunoregulacijskih stanica.

1. Metabolička Sinteza vitamina

Stvaranje kratkolančanih masnih kiselina

2. Trofička Stimulacija epitelne proliferacije

angiogeneze i obnavljanja epitela

Citoprotektivni učinak

Stimulacija razvoja imunološkog sustava

3. Zaštitna Regulacija prirođene imunosti

Regulacija stečene imunosti

Kompetitivni učinak za patogene

Uloga crijevne flore

Utjecaj probiotika na:

• 1. Infektivni proljev • 2. Infekcija Helicobacterom pylori • 3. Upalne bolesti crijeva • 4. Karcinomi • 5. Opstipacija • 6. Alergije • 7. Kardiovaskularne bolesti • 8. Vaginitis uzrokovan bakterijama • 9. Vaginitis uzrokovan gljivicama • 10. Infekcije mokraćnih putova

Mehanizam kemopreventivnog učinka Laktobacilusa

Upalne bolesti crijeva u geneskih modificiranih (transgeničnih i knock-out) miševa

Mutant Abnormalnosti Organi zahvaćeni upalom

Transgenični štakor s genom za

ljudski HLA-B27/ β2m

Ag predočavanje Kolon, tanko crijevo, želudac,

zglobovi, koža

IL-2 i IL-2Rα KO miševi

Imunoregulacija, pogrešna

timusna selekcija Kolon

IL-10 KO miševi Imunoregulacija, (Th1 put) Kolon, tanko crijevo

TGF-β1 KO miševi

Imunoregulacija, Gastrointestinalni sustav i drugi

organi

TCR- KO miševi

Imunoregulacija, pogrešna

timusna selekcija Kolon

Gi2-deflcientni miševi G-proteinska transmembranska

signalizacija Kolon

N-kadherin transgenični miševi

Epitelna barijera

Tanko crijevo

Upalne bolesti crijeva u geneskih modificiranih (transgeničnih i knock-out) miševa

Mutant Abnormalnosti Organi zahvaćeni upalom

N-kadherin transgenični miševi

Epitelna barijera

Tanko crijevo

Keratin-8 KO miševi Epitelna barijera Kolon

IL-7 transgenični miševi Limfo-hematopoetske promjene Kolon

gp39 transgenični miševi Limfo-hematopoetske promjene,

pogrešna timusna selekcija Kolon, želudac i drugi organi

Višestruko otporni na lijek

(MDR) 1a KO miševi Narušena epitelna barijera Kolon

Wiskott-Aldrich sindrom protein

KO miševi Limfo-hematopoetske promjene

vezane za X gen Kolon

Stat3 (makrofagi i neutrofili) KO

miševa Th1 put Kolon

Transgenski miš s tirozin

kinazom virusa Herpes simplex

(ciljane astroglialne stanice)

Ablacija enteričkih glija stanica Tanko crijevo

Spontani pokusni modeli u autoimunim bolestima

Životinjski

model Moguća bolest-ljudi Antigen Prenos

bolesti (T-

stanice)

Spontane autoimune bolesti

Nonobese

dijabetični miš

(NOD)

Inzulin –ovisni

dijabetes Nepoznat Da

(NZBxNZW)F1

miš Sistemski lupus

eritematosuz (SLE) Nepoznat Da

Obese -pilići Hašimotov tiroiditis Tiroglobulin Da

Modeli bolesti stvoreni genetskom modifikacijom

• Zašto su potrebne transgenične životinje? • Za otkrivanje uloge pojedinih gena: a) knock–out (inaktivacija gena u

genomu ugradnjom strane DNA ili zamjena postojećeg gena mutiranom varijantom, b) knock-in mutageneza (uvođenje nove funkcije)

• Za proučavanje fenotipskih učinaka ekspresije transgena – proučavanja hormonskih gena, onkogena, gena uključenih u razvoj embrija i fetusa, gena važnih u imunosnom sustavu, virusnih gena, itd.

• Za proučavanje genskih mutacija in vivo • Novi modeli za testiranje mutagena • Pročavanje sposobnosti kloniranih gena da komplementiraju mutacije u

mišu • Za razumjevanje kontrole genske ekspresije • Za proučavanje bolesti (transgenične životinje kao modeli za razne ljudske

bolesti • Za genetičko obilježavanje organizma (zeleni flourocentni protein) • Za proizvodnju biofarmaceutika –Pharm animals (primjerice, inzulin u

kravljem mlijeku, hormona rasta, interleukina, laktoferina i dr.)

Modeli dijabetesa stvoreni genetskom modifikacijom

Tip 1 i Tip

2

‘knockout’ životinje

Tehnika ciljanog razaranja

gena (engl. Gene

targeting); proces u kojem

jedan gen može biti

poremećen u embrionalnoj

matičnoj stanici, a zatim

prenesen u liniju zametnih

stanica- „knockout”

životinje.

Genetičke „knockout” životinje za:

inzulinski receptor, PPARγ, GLUT4, IGF1

Tip 1 i Tip

2

Transgenične

životinje

Transgenične tehnike;

transgenik znači

uključivanje modificiranih

gena (transgenea) u

pronukleus zigote.Trans-

gen se nasumce ugrađuje u

genom domaćina, a neki

potomci će iskazati

promjenjeni gen.

Ugradnja novih gena kao što su inzulinski

receptori, IRS1, IRS2, glukokinaze, GLUT4,

c-mic, TNF i drugi.

Uloga ROS-a u aloksanom induciranom

uništenju β-stanica je potkrijepila zaključak

da su transgenični miševi s prekomjernom

ekspresijom antioksidansa zaštićeni od

aloksan induciranog dijabetesa.

Transgenične životinje kao modeli bolesti

• Miš glavni odabir

– Fiziologija slična ljudskoj

– Razvijena tehnologija

• Onkomiš-sadrži onkogen c-myc i dijelove mišjeg tumorskog virusa mliječnih žlijezda

– Model bolesti za rak dojke

• Transgenični miševi kao model za rak prostate

• Transgenični miševi kao model za Alzheimerovu bolest

• Transgenični miševi kao model teški kombinirani sindrom imunodeficijencije

Knock-out i transgenični miševi pomažu u razumjevanju genoma ljudi i njihove uloge u bolesti

Disease Mode Gene Technique

Cystic Fibrosis CFTR Gene-Targeted

Atherosclerosis Apo E, apo (a), Apo A-II Gene-targeted, Transgentic

anti-Atherosclerosis Gene Therapy Apo AI, Ape E, LDLR Transgenic

B-Thalassemia ß -globin Gene-Targeted

Sickle Cell Anemia ßs (and variants) Transgenic

Inflammatory Bowel Disease Interleukine-2, Interleukin-10 and T-cell Receptor ,ß ; MHC II Gene-Targeted

Severe Combined Immunodeficiency Disease Rag-1, Rag-2 Gene-Targeted

Muscluar dystrophy Gene Theraphy Dystrophin Transgenic

Alzheimers disease ß -amyloid Transgenic

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) neurofilament heavy chain Transgenic

Insulin Dependent Diabetes Mellitus interferon- Transgenic

Cancer many oncogenes and tumor supressor genes Transgenic

Transgenični ili delecijom izazvani mutanti u patogenezi psorijaze

• Najčeće rabljeni mišji modeli: • K5-Tie2 (prekomjerna izražajnost endotelial specifičnih

receptora tirozin kinaze u bazalnim keratinocitima), • imiquimod (topikalna primjena agonistaTLR receptora

imiquimod (IMQ) •

K14-AREG (prekomjerna izražajnost ljudskog amfiregulina u bazalnom epidermalnom sloju)

• K5-Stat3C (mutant s konstitutivno aktivnim prijenosom signala i aktivacijom transkripcijskog čimbenika 3 u bazalnim keratinocitima

• K5-TGFbeta1 (pojačana ekspresija latentnog oblika transformacijskog čimbenika rasta beta 1 u bazalnim keratinocitima

Psorijazne lezije u laboratorijskim miševima

Svaki model miša pokazuje crvenilo, pokrivenost s ljuskastim nakupinama kože s

makroskopskim značajkama sličnim s kliničkim oblikom psorijaze kod ljudi.

12-O-tetradekanoilforbol-13-acetatom–inducirana epidermalna hiperplazia u uhu K5.Stat3C transgeničnog miša

IL-23/Th17 igra važnu ulogu u patogenezi psorijaze; točni doprinosi IL-23 i IL-17

in vivo nejasni

K Stat3C transgenični miševi konstitutivno izražavaju aktivirani Stat3 unutar

keratinocita; životinje razvijaju oštećenja kože s histološkim i citokinskim profilom

sličnim psorijazi u ljudi. 5.Stat3C transgeničnog

Kontrola IgG Anti-IL-17A Anti-12/23p40 Anti-IL-23p19

Hipoteza citokinske hijerarhije za razvoj psorijaze

IL23

Th17

NK-22

X

Keratinocite Psoriatičke

promjene

Drugi članovi

IL-20 obitelji

(IL-20, 19,

22, 24, 26)

IL-22

IL-17

?

J Immunol 2011; 186:4481-4489

• U ovom modelu rabe se određene vrste, soj ili pasmina životinja u kojih se određena bolest ne pojavljuje.

• Ovakvi modeli se rabe u istraživanjima mehanizma otpornosti na određene bolesti.

Negativni modeli bolesti

• Oposum otporan na bjesnoću

• Rhesus majmuna otporne na hepatitis B

• Štakor (wood) imun na ugriza zmija

• Morski psi su otporni na rak

• Gerbili su otporni na zračenja

• zec ne može biti inficiran s gonorejom.

Negativni Modeli (non-model)-modeli gdje

određeni bolest ne može biti proizvedena

„Orphan“ model bolesti

• “Orphan“ model bolesti rabi se u opisu funkcionalnih

poremećaja koji se javlaju u životinja a nisu opisani u ljudi.

• Primjerice, spongiformna encefalopatija goveda (engl. Bovine spongiform encephalophaty, BSE) te virusna leukemija mačke (engl.Feline immunodeficientncy virus, FIV).

• Ukoliko se i u ljudi otkriju bolesti slične ovim opisanim u životinjama, spoznaje prikupljene u veterinarskoj medicine pomoći će u rasvjetljavanju etiologije, patogeneze i liječenja novootkrivene bolesti u ljudi.

Nespecifična otpornost – upalna reakcija

Ozljeda tkiva Fizička tvar

Kemijska tvar

Povećava kapilarna propusnost

(permeabilnost)

Oslobađanje tekućine

Povećan protok krvi

Širenje kapilare (dilatacija)

Privlačenje leukocita

Migracija leukocita na mjesto ozljede

Patogeni mikroorganizam

Sustavni odgovor

Groznica

Proliferacija leukocita

Temperatura Otok Osjetljivost Bol Crvenilo

Posrednici (medijatori) upalne reakcije

Bakterijska invazija

Ili oštećenje tkiva

Oslobađanje

histamina od

mastocita

Lokalna arterijska

vazodilatacija

Povećanje lokalne

propusnosti kapilara

Povećanje

krvnog dotoka u

Oštećeno tkivo

Lokalna

akumulacija

tekućina

crvenilo toplina otok bol

Povećanje plazmatskih

proteina; čimbenika

koagulacije u tkivu

Povećanje

fagocitoze

u tkivu

Fagocitna

sekrecija

Obrana protiv

stranih napadača;

popravak tkiva

Sustavni odgovori,

kao što je povećanje

temperature

Upala; shematski prikaz

Patogeni

Kemijski

signali

Krvna

kapilara

U tkivo ulaze

fagociti,

tekućina, i

faktori

grušanja krvi

Fagociti

Ozljeda tkiva, ispuštanje biološki

aktivnih tvari (histamina,

prostaglandina, itd)

Vazodilatacija, povećana

propusnost krvnih žila, migracija

fagocita u ozlijeđeno područje

Fagociti (makrofagi i neutrofili)

uklanjaju patogene i ostatke

oštećenog tkiva fagocitozom,

tkivo zacjeljuje

Podjela upalnih reakcija s obzirom na vremensko trajanje upale, vrstu etiološkog čimbenika, patološke značajke upalne reakcije i zahvaćenost tkiva upalom

Klasični životinjski upalni modeli

Kronična upala Pojavnost upalnih

medijatora Akutna upala

Model odgođenog tipa

preosjetljivosti (ovalbumin,

pikril klorid)

Arthusov tip neposredne preosjetljivosti (ovalbumin)

Model pasivne kožne anafilakse (ovalbumin)

Schultz-Daleova reakcija

Model akutne sustavne anafilakse (ovalbumin)

Model granuloma izazvanog potkožnom implantacijom (vata,

spužva, stakleni štapić)

Model propusnosti krvnih žila

Model upale poplućnice (histamin, bradikinin,

karagenin,prostaglandin, dekstran, turpentin)

Model kožnog granuloma

(krotonsko ulje, karagenin)

UV-eritem

Model adjuvantnog artritisa (Freudov adjuvant)

Model edema uške (oksazolon, krotonsko ulje, kantaridin, IL-1,

arahidonska kiselina, forbolni esteri)

Model edema šape (karagenin,formaldehid, dekstran,

albumin, kaolin)

Primjeri upalnih reakcija

akutne upala uške izazvana s PMA (forbol 12-miristat 13 acetat

pokusa oksazolonom izazvanog odgođenog tipa preosjetljivosti

kronične upale uške izazvane višestrukim nanošenjem oksazolona

pokusa liposaharidom (LPS) izazvane plućne neutrofilije

pokusa liposaharidom (LPS) izazvane endotoksemije

pokusa liposaharidom (LPS) izazvanog septičkog šoka

Adjuvants:

• tvari koje pomješane s antigenom i injicirane pojačavaju imunogeničnost antigena (lat. adjuve-pomoći)

• produžavaju vrijeme otpuštanja antigena

• pojačavaju kostimulatorne signale

• stvaraju formiranje granuloma

• stimuliraju nespecifičnu proliferaciju limfocita

Suvremeni životinjski upalni modeli

Atopičkog dermatitisa

KOBP-a Psorijaza

Model endotoksemije (LPS)

Model kroničnog dermatitisa (različite

vrste haptena)

Transplantacija psorijatične kože imunodeficijentnim

AGR129 miševima

Sepse

Modeli bronhitisa (sumporni dioksid,

virusi, bakterije)

Model dermatitisa u golokožih zamoraca izazvan

superantigenom

Modeli psorijaze nastali genetskim

injženjeringom

Model kroničnog iritantnog kontaktnog

dermatitisa (TPA)

Model odgođenog tipa preosjetljivosti

(ovalbumin)

Model dermatitisa u štakora izazvanog

nedostatkom magnezija

Model NC/Nga miševa

Model odgođenog tipa preosjetljivosti

(ovalbumin)

Modeli plućne hipertenzije (monokrotalin, kronična

hipoksija

Modeli atopičkog dermatitisa nastali

genetskim injženjeringom

Model pasivne kožne anafilakse (ovalbumin)

Modeli plućne fibroze (bleomicin, mikroorganizmi,

pesticid, azbest)

Modeli plućne neutrofilije (LPS, dim

cigarete)

Model emfizema pluća nastali genetskim

injženjeringom

Modeli emfizema pluća (elastaza, papain, dim

cigarete, dušični dioksid, endotoksini)

Model iakutne ozljede pluća (LPS, sadržaj

crijeva)

Modeli septičkog šoka (LPS, mikroorganizmi, feces,

crijevni sadržaj, zimozan)

Inducirani

Inducirani toksinima, virusima ili

zagađenjem

Injiciranje tumorskih stanica

u životinje

Topička primjena kemikalija koje

prouzrokuju tumor

Transplantacija spontanih tumora

Animalni modeli u tumorskoj imunologiji

Animalni modeli u tumorskoj

imunologiji

S obzirom na nastanak tumora, tumori mogu biti:

Spontani tumori

• idiopatski

• karcinogenom inducirani

• transgeni/knock-out životinje: p53, Rb, …

Transplantirani tumori

• Animalni tumori: Lewis-ov karcinom pluća, karcinom mliječne žlijezde miša, S 180 sarkom, Ehrlichov solidni i/ili asctični tumor

• Ljudski „ksenograft“ model: ljdske tumorske stanične linije imlantirane u imunodeficijentne životinje (primjerice, SCID miševa kao nositelja leukemijskih stanica ljudi)

• Transplantacija tkiva tumora ljudi u šupljine ili tkiva miševa

Ostali tumorski animalni modeli

Orthopic animalni modeli

• dobiju se implantacijom tumorskih stanica u ciljne organe.

• reproducira aspekte mikrookoliša tumora i oponaša niz važnih bioloških značajki progresije tumora, angiogeneze, metastaziranja i otpornosti stanica tumora na terapiju (rezistencija).

transgenični tumorski modeli,

• primjerice knock out miševi za p53 ili neki drugi tumor supresor gen kao i razvoj endogenih tumorskih stanica.

izlaganje životinja kroničnom stresu može potaknuti rast tumora i angiogenezu.

• Neuroendokrini stres

• utječe na rast i aktivnost malignog tkiva putem receptora za hormone na stanicama tumora (karcinom ovarija)

Različiti oblici upale i njena uloga u tumorogenezi

b i o c h e m i c a l pharma c o logy 7 2 ( 2 0 0 6 ) 1 6 0 5– 1 6 21

Veza između upale i razvoja karcinoma

Molekularni mehanizmi kemoprevencije kolorektalnog tumora prirodnim hranidbenim komponentama

Slijed pojava premalignih promjena

u intestinalnom tipu karcinoma

Karcinogeneza je stupnjevit proces nastanka tumora

Supresija metastaza

ISTRAŽIVANJE SPONTANOG METASTAZIRANJA

Supresija tumora

Proces metastaziranja

Primary malignant neoplasm

Angiogenesis Invasion/ transport

Tumor cell emboli (interactions with thrombocytes and other blood cells)

Transport

Adherence to capillary endothel

Extravasation

Establishment of

microenvironment

Proliferation

Metastases Design by dr. Zoran Tadić

Proizvodnja tumorskih stanica u plućima

Tumorska angiogeneza

Tumorska angiogeneza

Usporedba normalnih i

angiogeničnih krvnih žila

Normalno krvožilje s organiziranim venulama, arteriolama i kapilarima (A)

Tumorska mikrovaskulatura s nedostatkom konvencionalne hijerarhije

krvnih žila (B). Preuzeto iz: McDonald and Choyke, 2003

A B

Peritonealna karcinomatoza

Višestruko modulatorni učinak kemoterapeutski spojeva na imunološki sustav

Menard et al. Cancer Immunol Immunother (2008)57:1579-1587)

Proizvodnja monoklonskih protutijela

Antigen

Kultura stanica mijeloma

Izolacijastanicaslezene

Uzgoj stanica uselekcijskom mediju

Selekcija hibridnihstanica (hibridoma)

Selekcija stanica kojeproizvode željeno antitijelo

Uzgoj ustaničnojkulturi

Poticanjenastankatumora

M o n o k l o n s k aa n t i t i j e l a

Pokus o porijeklu limfocita

Test na odgovor limfocita T

Dani u kulturi1 3 5

Imunizacija antigenom A

Izolacija stanica izlimfnog čvoranakon 5 - 10 dana

Uzgojstanica santigenimaA i B

Mjerenjeproliferacijelimfocita T

bezantigena antigen A antigen B

antigen A

antigen B

bez antigena