SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-5 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO TERHADAP ENZIM MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9) SEBAGAI KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi Diajukan oleh : Reynaldo Tiara NIM : 158114097 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2019 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
Embed
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI SINTESIS TURUNAN … · penyertaan dan cinta kasih-Nya, skripsi yang berjudul Sintesis Turunan Arilamida-5 dan Uji Aktivitas In Vitro Terhadap
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-5 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO
TERHADAP ENZIM MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9)
SEBAGAI KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Diajukan oleh :
Reynaldo Tiara
NIM : 158114097
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
i
SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-5 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO
TERHADAP ENZIM MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9)
SEBAGAI KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Diajukan oleh :
Reynaldo Tiara
NIM : 158114097
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
2 Korintus 10:4
Karena senjata kami dalam perjuangan bukanlah senjata duniawi, melainkan
senjata yang diperlengkapi dengan kuasa Allah, yang sanggup untuk meruntuhkan
benteng-benteng.
KARYA INI KUPERSEMBAHKAN UNTUK:
Allah Bapa, Tuhan Yesus Kristus, dan Roh Kudus yang telah menuntunkan
dalam setiap perjalanan kehidupanku dengan semua hikmat dan kasih setiaNya.
Papah Tersayang Andry Yatti dan Mamah Tercinta Linda Sunarto atas cinta,
kasih sayang, dan senantiasa mendoakan kesuksesanku.
Kedua adik kesayanganku, Figo Stefanus Tiara dan Varel Tiara. You are my
best brothers ever.
dan tentunya,
Almamaterku terkasih Universitas Sanata Dharma
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PRAKATA
Puji Tuhan penulis panjatkan pada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas
penyertaan dan cinta kasih-Nya, skripsi yang berjudul Sintesis Turunan
Arilamida-5 dan Uji Aktivitas In Vitro Terhadap Enzim Matrix
Metalloproteinase-9 (MMP-9) Sebagai Kandidat Anti-Kanker Payudara dapat
diselesaikan dengan baik dan tepat waktu. Penelitian ini merupakan bagian dari
penelitian Maywan Hariono, Ph.D., Apt. yang didanai oleh Indonesia Toray
Science Foundation (ITSF) Periode 2017-2018 dengan judul “Synthesis,
Enzymatic Assay, and Molecular Modelling of Purine Derivatives Targeting
Hemopexin Domain of Matrix Metalloproteinase-9 (PEX-9) in The Discovery of
Novel Anti-Breast Cancer”. Skripsi ini disusun sebagai syarat untuk memperoleh
gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Penyelesaian naskah skripsi ini tidak lepas dari dukungan berbagai pihak,
baik langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu, dengan kerendahan hati
penulis mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada:
1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt. selaku Ketua Program Studi Farmasi
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
penulis berterima kasih karena telah bersedia menanggung beban kehidupan
bersama dan bertahan hingga akhir.
8. Kelompok “Unknown” Bryant, Tommy, Vani, Alicia, Pipit, Siska, Epen,
Elsa, dan Tata, selaku sahabat seperjuangan dan sepermainan selama
menjalani aktivitas perkuliahan dari awal hingga akhir. Penulis mengucapkan
terima kasih atas persahabatan yang dijalani.
9. Kelompok “Dolan Squad” Wisnu, Krisna, Retha, Lina, Inge, dan Mas Rudi,
selaku teman kelas yang berjuang melewati dunia perkuliahan. Penulis
mengucapkan terima kasih atas persahabatan yang dijalani.
10. Denny, Chintya, Davor, Beben, dan Alen, selaku sahabat terbaik. Penulis
mengucapkan terima kasih atas persahabatan yang dijalani.
11. Bapak Parlan, Mas Kunto, Pak Wagiran, dan Mas Bimo, selaku laboran yang
telah membantu penulis dalam pelaksanaan penelitian.
12. Seluruh anggota Drug Discovery Research Group, terutama Tito, Diana, Eko,
Pandu, Jason, Try, Angel, dan Wiwy, serta Divisi Penelitian dan
Pengembangan BEMF Farmasi 2018 penulis berterima kasih atas kerjasama
dan dukungan moralnyaselama perjalanan ini.
13. Kak Donny dan Kak Resti, selaku teman Divisi Pengabdian Masyarakat
BEMF Farmasi yang selalu memberikan dukungan bagi penulis.
14. Teman-teman FSM C 2015 serta Angkatan 2015 Farmasi yang telah
memberikan banyak kenangan dalam masa perkuliahan.
15. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah mendukung
dalam penyelesaian penyusunan naskah skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa naskah penelitian ini masih jauh dari kata
sempurna dan masih memiliki banyak kekurangan. Oleh karena itu, penulis sangat
mengharapkan kritik dan saran yang dapat membangun. Terima kasih.
Yogyakarta, 30 Januari 2019
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
ABSTRAK
Salah satu indikator kanker payudara tipe triple negative dan HER2-positive adalah terjadinya over ekspresi enzim Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9). Enzim ini mendegradasi matriks ekstraseluler yang mengawali terjadinya migrasi sel kanker dan proses metastasis. Penghambat enzim MMP-9 yang telah dirancang selama ini hanya untuk menghambat MMP pada sisi catalytic domain sehingga gagal pada tahap uji klinik, karena bersifat non-selektif terhadap salah satu jenis MMP dan menyebabkan efek samping yang merugikan seperti contohnya nyeri muskuloskeletal dan inflamasi. Penelitian ini bertujuan untuk mensintesis senyawa turunan arilamida-5 serta menguji aktivitasnya sebagai penghambat MMP-9 secara selektif, karena dirancang untuk berikatan dengan hemopexin domain. Sintesis telah dilakukan dengan mereaksikan sulfamerazin dan 3-bromopropionil klorida dengan katalisator piridin pada suhu kamar. Senyawa hasil sintesis yang terbentuk berupa serbuk kuning, negatif terhadap DAB-HCl, larut dalam DMSO, dan memiliki titik lebur 193-200°C dengan rendemen sebesar 67,13%. Senyawa hasil sintesis berhasil dipastikan strukturnya dengan metode spektrofotometri inframerah, spektrometri resonansi magnetik inti, dan kromatografi gas-spektrometri massa. Senyawa hasil sintesis diuji aktivitasnya terhadap MMP-9 secara in vitro dan didapatkan nilai persentase penghambatan terhadap enzim MMP-9 sebesar 93% pada 200 µg/mL dan nilai IC50 sebesar 199 µM. Kesimpulannya senyawa turunan arilamida-5 aktif menghambat MMP-9, sehingga poten sebagai kandidat obat kanker payudara. Kata kunci: arilamida-5, hemopexin domain, kanker payudara, MMP-9, uji aktivitas in vitro
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
ABSTRACT
One of indicators in triple negative and HER2-positive breast cancer is the overexpression of the Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) enzyme. This enzyme degrades the extracellular matrix which initiates cancer cell migration and metastasis. To date, MMP-9 enzyme inhibitors have been designed only to inhibit MMP on the catalytic domain which unfortunately fails at the clinical trial, due to the non-selective inhibition across MMP subfamilies while causing adverse side effects such as musculoskeletal pain and inflammation. This study aims to synthesize arylamide-5 and test its activity as MMP-9 inhibitors. The synthesis was carried out by reacting sulfamerazine and 3-bromopropionyl chloride using pyridine as the catalyst at room temperature. The physical appearance of the synthesized compound (yield 67,13%) is yellow powder, which negatively reacts with DAB-HCl, soluble in DMSO, and having melting range: 193-200°C. The synthesized compound was successfully confirmed its structure by FTIR, NMR, and GC-MS. The synthesized compound was tested for its activity against MMP-9 in vitro showing percentage inhibition of the MMP-9 enzyme being 93% at 200 µg/mL while the IC50 value was equal to 199 µM associating with its potency as breast cancer drug candidate.
Keywords: arylamide-5, hemopexin domain, breast cancer, MMP-9, in vitro
assay
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ................................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN ..................................................................... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................. iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..................................................... v
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ....................................... vi
PRAKATA .................................................................................................. vii
ABSTRAK .................................................................................................. ix
ABSTRACT ................................................................................................ x
DAFTAR ISI ............................................................................................... xi
DAFTAR TABEL ....................................................................................... xii
DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xiii
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xiv
10%, akuades, n-heksana, etil asetat, dimetilsulfoksida (DMSO), plat silika gel
GF254 (Merck 7730), dan dimetilaminobenzaldehid HCl (DAB-HCl). Bahan untuk
elusidasi struktur yaitu pellet kalium bromida untuk spektrofotometri inframerah
dan pelarut DMSO-D6 untuk spektrometri resonansi magnetik inti. Bahan untuk
uji aktivitas in vitro yaitu kit enzim MMP-9 yang didapatkan dari Biovision terdiri
dari enzim MMP-9 yang terliofilisasi, substrat peptida Fluorescence Resonance
Energy Transfer (FRET)-based MMP-9, dapar Tris HCl, peptida NNGH inhibitor
(Asparagin-Asparagin-Glisin-Histidin) sebagai kontrol positif, gliserol untuk
mengencerkan enzim, dan dimetilsulfoksida sebagai pelarut sampel.
Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain timbangan analitik
(Mettler Toledo®), pompa vakum (GAST model DOA-P504-BN), oven
(Memmert GmbH+Co.KG), labu alas bulat (Pyrex), pengaduk magnetik, lempeng
panas, bejana (chamber) kromatografi lapis tipis (KLT), lampu UV254, alat uji titik
lebur (Mettler Toledo®), dan alat gelas pada umumnya. Alat untuk elusidasi
struktur digunakan spektrofotometer inframerah (Shimadzu), spektrometer
nuclear magnetic resonance (Bruker 176 dan 700MHz), kromatografi gas-
spektrometer massa (GC-MS QP2010S Shimadzu). Alat untuk uji aktivitas in
vitro digunakan pipet mikro (Eppendorf), micro well plate 96, pipet tips,
inkubator, vortex, dan ELISA microplate reader fluorescence (Tecan Infinite 200
PRO).
Prosedur Penelitian
Sintesis Senyawa Turunan Arilamida-5 (Diadaptasi dari Arifiyanto, 2001)
Dalam labu alas bulat, dimasukkan sulfamerazin sebanyak 3,59 mmol
(0,95 g) dan ditambahkan piridin sebagai katalisator sebanyak 7,18 mmol (0,58
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
mL). Campuran diaduk selama 10 menit pada suhu kamar lalu ditambahkan 3-
bromopropionil klorida tetes demi tetes sebanyak 5,39 mmol (0,61 mL).
Campuran diaduk kembali selama 30 menit pada suhu kamar. Hasil sintesis
disaring kemudian dinetralkan dengan Na2CO3 10% hingga pH netral dan dicuci
dengan akuades serta dikeringkan di oven pada suhu 40ºC.
Uji Pendahuluan dan Elusidasi Struktur
Produk hasil sintesis yang terbentuk dilakukan uji pendahuluan dengan
menggunakan DAB-HCl. Kemudian dilanjutkan pengujian dengan KLT
menggunakan fase diam plat silika gel GF254 dan fase gerak n-heksana : etil asetat
(1:3). Kemudian produk hasil sintesis diuji secara organoleptis (bentuk dan
warna), kelarutan, titik lebur, dan perhitungan rendemen senyawa hasil sintesis.
Elusidasi struktur dilakukan dengan metode spektrofotometri inframerah,
spektrometri resonansi magnetik inti (1H dan 13C), dan kromatografi gas-
spektrometri massa yang dilakukan di Fakultas MIPA Universitas Gadjah Mada
dan Institut Farmasetikal dan Nutrasetikal Malaysia.
Uji Aktivitas In Vitro
Uji aktivitas in vitro dilakukan di Universitas Padjadjaran. Enzim yang
terliofilisasi direkonstitusi dengan 110 µL gliserol 30% dalam deionised water.
Enzim yang telah terekonstitusi dilarutkan dalam 550 µL dapar dan siap
digunakan untuk pengujian. Senyawa sampel disiapkan dengan cara dilarutkan
dalam DMSO dengan konsentrasi akhir 200 µg/mL di dalam 96-microwell plate.
Konsentrasi akhir DMSO dalam wellplate tidak lebih dari 2%. Sampel sebanyak 1
µL dicampurkan dengan dapar (44 µL) dan enzim (5 µL) pada setiap sumuran.
Sebanyak 2 µL inhibitor NNGH (2mM) dipipet dan dimasukkan ke dalam
sumuran lainnya dan ditambahkan 5 µL enzim MMP-9 dan 43 µL dapar sebagai
kontrol positif. Kemudian sebanyak 5 µL enzim MMP-9 dipipet dan dimasukkan
ke dalam sumuran lainnya dan ditambahkan 45 µL dapar sebagai kontrol negatif.
Dapar dipipet sebanyak 100 µL dan dimasukkan ke dalam sumuran lainnya
sebagai blanko. Kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Setelah
inkubasi selesai, masing-masing sumuran ditambahkan dengan 50 µL larutan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
substrat dan diinkubasi kembali pada suhu 37°C selama 60 menit. Rancangan
microwell plate secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 11.
Setelah inkubasi selesai, fluorosensi dari masing-masing sumuran dibaca
dengan menggunakan Tecan Infinite 200 Pro Microplate Reader pada panjang
gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 393 nm. Hasil
fluorosensi senyawa sampel, kontrol positif, dan kontrol negatif dikurangi dengan
blanko dan akan didapatkan persentase aktivitas enzim dengan rumus
(����������� �������������
����������� ������� �������������� x 100%). Persentase penghambatan enzim
MMP-9 didapatkan dengan rumus (100% - persentase aktivitas enzim (%)). Pada
perhitungan IC50, dibuat seri larutan dengan 4 konsentrasi 50 µg/mL, 100 µg/mL,
200 µg/mL, dan 300 µg/mL. IC50 dihitung dengan menggunakan persamaan non-
regresi linier polinomial y = ax2 + bx + c yang didapatkan dari kurva hasil
pengukuran seri larutan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Sintesis Senyawa Turunan Arilamida-5
Senyawa turunan arilamida-5 disintesis dengan mengadaptasi farmakofor
berupa cincin arilamida dengan perpanjangan rantai alkil. Pada posisi para cincin
arilamida ditambahkan gugus sulfonamid-4-metilpirimidin yang bertujuan untuk
mengeksplorasi fungsi gugus -OCF2 pada Compound 2 berdasarkan karakternya
yang bersifat penarik elektron sekaligus pendonor elektron. Pada penelitian ini,
kedua karakter tersebut diwakili oleh gugus sulfonamid-4-metilpirimidin sehingga
diharapkan memiliki kontribusi dalam aktivitas penghambatan terhadap MMP-9 .
Dalam tahap sintesis senyawa turunan arilamida-5, berlangsung reaksi
substitusi nukleofilik asil (SNA) antara sulfamerazin sebagai nukleofil karena
memiliki amina primer dan 3-bromopropionil klorida yang memiliki gugus asil
dengan menggunakan katalisator piridin yang berfungsi untuk mempercepat
reaksi. Piridin akan mensubstitusi gugus klorida, karena gugus klorida masih
bersifat elektronegatif yang terikat kuat dengan C karbonil yang bersifat
elektropositif dengan membentuk 3-bromopropionil piridin. Piridin sebagai gugus
pergi sangat reaktif, karena N positif cenderung tolak-menolak dengan C karbonil
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
yang elektropositif, sehingga amina primer dari sulfamerazin akan lebih mudah
menyerang. Gugus amida dapat disintesis melalui beberapa metode, salah s
dengan mereaksikan amina primer dengan asil klorida sehingga Cl pada C
karbonil akan tersubstitusi oleh amina.
(amina primer (-NH2
menyerang C karbonil
sebagai gugus pergi
et al., 2016). Mekanisme reaksinya
Gambar 2. Mekanisme reaksi substitusi nukleofilik asil sulfamerazin dan 3
Uji Pendahuluan
Produk awal sintesis yang dihasilkan berupa semisolid berwarna kuning.
Produk masih berada
berupa asam klorida (HCl)
cincin arilamida, sehingga perlu dinetralkan dengan Na
membentuk NaCl, H
kemudian dikeringkan dan menjadi
pada Gambar 3. Serbuk sulfamerazin berwarna putih dan serbuk senyawa turunan
arilamida-5 berwarna kuning,
dilakukan. Perubahan
oleh perpanjangan kromofor
berwarna.
6
yang elektropositif, sehingga amina primer dari sulfamerazin akan lebih mudah
Gugus amida dapat disintesis melalui beberapa metode, salah s
dengan mereaksikan amina primer dengan asil klorida sehingga Cl pada C
karbonil akan tersubstitusi oleh amina. Reaksi SNA berlangsung ketika nu
2) yang memiliki pasangan elektron bebas dari sulfamerazin)
ang C karbonil pada 3-bromopropionil piridin dan gugus piridin
yang menghasilkan senyawa turunan arilamida
Mekanisme reaksinya ditunjukkan pada Gambar 2.
Mekanisme reaksi substitusi nukleofilik asil (SN
sulfamerazin dan 3-bromopropionil klorida menggunakan katalisator piridin
Produk awal sintesis yang dihasilkan berupa semisolid berwarna kuning.
berada dalam pH asam, karena produk samping yang dihasilkan
asam klorida (HCl). HCl dapat menghidrolisis gugus C karbonil pada
cincin arilamida, sehingga perlu dinetralkan dengan Na2CO
membentuk NaCl, H2O, dan CO2 yang dapat dicuci dengan akuades.
kemudian dikeringkan dan menjadi serbuk berwarna kuning seperti ditunjukkan
Serbuk sulfamerazin berwarna putih dan serbuk senyawa turunan
5 berwarna kuning, sehingga sintesis dinyatakan telah berhasil
Perubahan warna antara hasil sintesis dengan bahan awal
oleh perpanjangan kromofor (ikatan rangkap yang terkonjugasi) sehingga menjadi
yang elektropositif, sehingga amina primer dari sulfamerazin akan lebih mudah
Gugus amida dapat disintesis melalui beberapa metode, salah satunya
dengan mereaksikan amina primer dengan asil klorida sehingga Cl pada C
berlangsung ketika nukleofil
dari sulfamerazin)
gugus piridin akan lepas
senyawa turunan arilamida-5 (Koltunov
NA) antara bromopropionil klorida menggunakan katalisator piridin
Produk awal sintesis yang dihasilkan berupa semisolid berwarna kuning.
dalam pH asam, karena produk samping yang dihasilkan
. HCl dapat menghidrolisis gugus C karbonil pada
CO3 10% dengan
yang dapat dicuci dengan akuades. Senyawa
kuning seperti ditunjukkan
Serbuk sulfamerazin berwarna putih dan serbuk senyawa turunan
sehingga sintesis dinyatakan telah berhasil
warna antara hasil sintesis dengan bahan awal disebabkan
sehingga menjadi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
(a) (b)
Gambar 3. Produk hasil sintesis senyawa turunan arilamida-5 setelah dilakukan proses penetralan pH dan pengeringan (a) dan sulfamerazin (b)
Senyawa hasil sintesis diuji dengan DAB-HCl untuk identifikasi awal
bahwa senyawa turunan arilamida-5 telah berhasil disintesis. Senyawa yang
mengandung gugus amina primer akan bereaksi dengan DAB-HCl untuk
membentuk basa Schiff yang berwarna jingga, sedangkan jika senyawa amina
primer sudah tersubstitusi, maka tidak dapat bereaksi dengan DAB-HCl
(Adegoke, 2011). Senyawa turunan arilamida-5 tidak menghasilkan basa Schiff
jingga karena gugus amina primernya sudah tersubstitusi. Senyawa hasil sintesis
sudah berwarna kuning sehingga perubahan intensitas warnanya tidak terlalu
tampak ketika ditambahkan DAB-HCl. Hal ini telah berbeda dengan sulfamerazin
yang berwarna jingga ketika bereaksi dengan DAB-HCl sehingga untuk sementara
dapat disimpulkan produk sintesis sudah terbentuk. Mekanisme reaksi DAB-HCl
dengan sulfamerazin ditunjukkan pada Lampiran 2 dan hasil reaksinya berupa
produk berwarna jingga ditunjukkan pada Lampiran 3.
Pengujian dilanjutkan dengan KLT untuk melihat bahwa senyawa baru
telah terbentuk beserta kemurniannya. Gambar 4 merupakan profil KLT dengan
fase gerak n-heksana : etil asetat (1:3) yang menunjukkan bahwa senyawa hasil
sintesis mempunyai noda yang berbeda dari bahan baku yang digunakan untuk
sintesis (sulfamerazin). Hal tersebut juga ditunjukkan dengan nilai Rf (Retention
Factor) yang berbeda antara sulfamerazin dengan 0,51 dan senyawa hasil sintesis
dengan 0,55. Perbedaan Rf antara sulfamerazin dan senyawa hasil sintesis sebesar
0,04 disebabkan oleh kemiripan polaritas dari kedua sampel. Pada senyawa hasil
sintesis meskipun terjadi penambahan gugus etilen yang bersifat non polar namun
diimbangi dengan C karbonil dan atom Br yang bersifat polar.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
Hasil rendemen dari senyawa turunan arilamida-5 yang terbentuk adalah
sebanyak 67,13%. Perhitungan rendemen ditunjukkan pada Lampiran 4.
Rendemen yang dihasilkan sudah lebih dari 50% namun masih dapat dioptimasi
dengan cara melakukan variasi metode sintesis seperti mol reaktan, suhu reaksi,
dan waktu pengadukan pada penelitian selanjutnya.
Gambar 4. Hasil KLT sintesis senyawa turunan arilamida-5 yang menunjukkan 2 noda yang berbeda, yaitu sulfamerazin (A) dan senyawa turunan arilamida-5 (B)
Setelah diperoleh senyawa turunan arilamida-5, produk diuji titik
leburnya yang bertujuan untuk mengetahui titik lebur senyawa hasil sintesis dan
mendukung kualitas kemurniannya. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa
titik lebur produk hasil sintesis adalah 193-200ºC yang sudah berbeda dengan
sulfamerazin yang memiliki titik lebur 234-238ºC (O’Neil et al., 2001). Sehingga
dapat disimpulkan bahwa produk hasil sintesis berbeda dari senyawa awalnya
yang dilihat dari perbedaaan jarak leburnya. Suatu senyawa dinyatakan murni jika
jarak leburnya adalah 0,5-1,5ºC (Mohrig et al., 2014). Jarak lebur produk hasil
sintesis adalah sebesar 7ºC, sehingga dapat disimpulkan bahwa masih terdapat
impurities pada produk hasil sintesis. Hal ini disebabkan karena tidak dilakukan
proses pemurnian kembali untuk mendapatkan senyawa hasil sintesis yang murni.
Selain organoleptis, uji warna, dan titik lebur juga dilakukan uji kelarutan
senyawa, terutama untuk kepentingan pengujian secara spektroskopi. Uji
kelarutan senyawa turunan arilamida-5 ditunjukkan pada Tabel I. Dari hasil uji
kelarutan, senyawa turunan arilamida-5 bersifat semipolar karena larut dalam
pelarut semipolar, seperti DMSO.
B A
Rf= 0,55 Rf= 0,51
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
Tabel I. Hasil uji kelarutan senyawa turunan arilamida-5 Pelarut Senyawa Turunan Arilamida-5
n-heksana tidak larut Kloroform tidak larut Etil asetat tidak larut
Aseton agak sukar larut (1:80) Etanol tidak larut
Air tidak larut DMSO larut (1:20)
Elusidasi Struktur Terhadap Senyawa Turunan Arilamida-5
Spektrofotometri Inframerah
Elusidasi struktur yang dilakukan dengan menggunakan spektrofotometri
inframerah (IR) bertujuan untuk mengidentifikasi keberadaan gugus-gugus
fungsional pada senyawa hasil sintesis. Gugus fungsional dengan momen dipol
yang tinggi sangat efektif dalam menyerap radiasi IR, sehingga menyebabkan
ikatannya bervibrasi secara mengulur (stretching) maupun menekuk (bending)
(Supratman, 2010).
Hasil elusidasi struktur senyawa turunan arilamida-5 dan keberadaan
gugus-gugus fungsionalnya dengan menggunakan spektrofotometri IR
ditunjukkan pada Gambar 5. Berdasarkan spektrum yang dihasilkan, terdapat pita
pada daerah dengan bilangan gelombang (ῡ) 1500 cm-1 yang menunjukkan gugus
karbonil (C=O). Gugus karbonil tersebut diprediksi sebagai gugus C=O amida
pada daerah dengan ῡ 1597 cm-1. Keberadaan gugus amida tersebut juga diperkuat
dengan adanya pita yang melebar pada daerah dengan ῡ 3387–3479 cm-1 yang
diduga sebagai gugus -NH amida. Senyawa turunan arilamida-5 diprediksi telah
terbentuk dengan dukungan pada daerah sidik jari dengan ῡ 500-1500 cm-1 yang
berbeda dengan daerah sidik jari sulfamerazin sebagai starting material yang
ditunjukkan pada Gambar 6. Pada spektrum IR sulfamerazin tidak dijumpai pita
ulur tajam pada daerah dengan ῡ 1500 cm-1. Pada daerah dengan bilangan
gelombang 3300 cm-1, pita gugus NH terlihat sebagai pita kembar yang tidak
melebar, hal ini dikarenakan gugus amina pada sulfamerazin tidak tersubstitusi
(Vollhardt dan Schore, 2014). Hasil ini menandakan bahwa produk hasil sintesis
sudah sesuai pada aspek gugus fungsionalnya.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
Gambar 5. Spektrum IR senyawa turunan arilamida-5
Gambar 6. Spektrum IR sulfamerazin (diadaptasi dari Prajapat et al., 2018)
Spektrometri Resonansi Magnetik Inti 1H dan 13C
Berdasarkan hasil uji kelarutan, senyawa turunan arilamida-5 larut dalam
dimetilsufoksida (DMSO), sehingga digunakan DMSO-d6 sebagai pelarut pada
pengujian dengan spektrometri resonansi magnetik inti 1H dan 13C. Elusidasi
struktur yang dilakukan dengan menggunakan spektrometri resonansi magnetik
inti 1H dan 13C bertujuan untuk mengetahui kerangka hidrokarbon dari senyawa
hasil sintesis (Supratman, 2010). Spektrum resonansi magnetik inti 1H senyawa
turunan arilamida-5 ditunjukkan pada Gambar 7.
Sinyal pada geseran kimia 2,00–3,00 ppm merupakan daerah proton alkil
(Vollhardt dan Schore, 2014). Sinyal pada geseran kimia 2,31 ppm (integrasi= 3)
menunjukkan sinyal dari proton HG. Proton HG merupakan proton rantai alkil
Daerah sidik jari
Daerah sidik jari
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
yang berada pada gugus metil yang berdekatan dengan cincin pirimidin. Sinyal
pada geseran kimia 2,31 ppm menunjukkan sinyal singlet (tunggal). Hal ini telah
sesuai dengan teori, karena tidak memiliki proton tetangga dalam lingkungan
kimia yang berbeda.
Sinyal pada geseran kimia 3,72 ppm (integrasi= 2) (J= 6,3 Hz) dan 3,87
ppm (integrasi= 2) (J= 6,3 Hz) menunjukkan sinyal dari proton HA, sedangkan
sinyal yang terdapat pada geseran kimia 2,85 ppm (integrasi= 2) (J= 7 Hz) dan
2,98 ppm (integrasi= 2) (J= 7 Hz) menunjukkan sinyal dari proton HB. Dengan
munculnya set proton HA dan HB yang merupakan rantai etilen, menegaskan
bahwa senyawa turunan arilamida-5 telah terbentuk. Proton HA merupakan proton
pada rantai etilen yang berdekatan dengan atom halogen (Br), sedangkan proton
HB merupakan proton pada rantai etilen yang berdekatan dengan gugus karbonil.
Proton HA terdapat pada geseran kimia yang lebih jauh daripada proton HB,
karena berdekatan dengan atom Br yang bersifat lebih elektronegatif
dibandingkan dengan gugus karbonil pada amida sehingga proton HA kurang
terlindungi dari medan magnet luar (de-shielded). Kedua sinyal tersebut
seharusnya menunjukkan pola splitting masing-masing satu triplet, karena kedua
set proton tersebut memiliki jumlah proton yang tidak ekuivalen secara magnetik
sebanyak dua. Namun hasil penelitian menunjukkan adanya dua sinyal triplet
pada jarak yang berdekatan untuk masing-masing proton HA dan HB. Hal ini
kemungkinan disebabkan oleh efek ikatan tunggal pada rantai etilen bersifat
rotatable, sehingga pada sudut tertentu proton yang terikat pada atom C yang
sama dapat memiliki lingkungan kimia yang berbeda. Hal ini menyebabkan setiap
proton mengenali tetangganya sebanyak dua kali sehingga muncul dua sinyal
triplet. Fenomena ini dipastikan dengan jumlah integrasi dua triplet tersebut
sebanding dengan dua proton. Nilai J coupling constant untuk kedua sinyal triplet
tersebut adalah 6,3 dan 7 Hz, yang menunjukkan bahwa kedua set proton tersebut
bertetangga secara langsung. Perbesaran spektrum proton HA dan HB ditunjukkan
pada Lampiran 5 dan 6.
Sinyal pada geseran kimia 7,00–8,00 ppm merupakan daerah proton
aromatik (Vollhardt dan Schore, 2014). Pada geseran kimia tersebut ditemukan 4
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
sinyal yang berbeda, yaitu pada 7,62 ppm (integrasi= 1) (J= 8,4 Hz); 7,76 ppm
aktif). IC50 yang terhitung adalah 199 µM sehingga aktivitas dari senyawa turunan
arilamida-5 termasuk dalam kategori aktivitas rendah. Namun Zhu et al., (2013)
juga menyebutkaan dalam review-nya bahwa terdapat 56 publikasi penelitian yang
menyatakan bahwa IC50 100-500 µM sudah dapat dikatakan aktif untuk studi
pendahuluan seperti yang dilakukan dalam penelitian ini. Sintesis dan uji aktivitas
in vitro senyawa turunan arilamida-5 merupakan studi pendahuluan yang belum
pernah dilakukan sebelumnya. Sehingga dapat disimpulkan bahwa senyawa
turunan arilamida-5 aktif dalam menghambat enzim MMP-9 secara in vitro. Tabel
II menyajikan pengolahan data uji aktivitas in vitro arilamida-5.
Tabel II. Perhitungan %penghambatan turunan arilamida-5 terhadap MMP-9 Sampel Reading 1 Reading 2 Reading 3 Purata
Blanko 9683 9349 9217 9416
Kontrol Negatif 32989 33687 30321 32332
Kontrol Positif 5946 5946 7898 6597
Senyawa Turunan
Arilamida-5
10903 11453 10444 10933
Sampel Purata –
Blanko
Aktivitas
Enzim (%)
Inhibisi
Enzim (%)
Blanko (B)
Kontrol Negatif (KN) 22916 100 0
Kontrol Positif (KP) -2819 -12 112
Senyawa Turunan Arilamida-
5 (S)
1517 7 93
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
Gambar 11. Kurva hubungan log konsentrasi turunan arilamida-5 dengan %penghambatan
KESIMPULAN
Hasil penelitian menunjukkan bahwa senyawa turunan arilamida-5 dapat
disintesis dengan mereaksikan sulfamerazin dan 3-bromopropionil klorida dengan
katalisator piridin melalui mekanisme reaksi substitusi nukleofilik asil (SNA).
Senyawa turunan arilamida-5 memiliki aktivitas penghambatan terhadap enzim
MMP-9 setelah melalui uji in vitro. Pada uji aktivitas in vitro menunjukkan
persentase penghambatan sebesar 93% pada konsentrasi 200 µg/mL dan nilai IC50
sebesar 199 µM dalam menghambat aktivitas enzim MMP-9 sedikitnya 50%.
SARAN
Berdasarkan hasil dari uji aktivitas in vitro senyawa turunan arilamida-5
dalam menghambat enzim MMP-9, dapat dilakukan penelitian lebih lanjut yaitu
uji aktivitas in vitro senyawa turunan arilamida-5 pada sel kanker payudara MDA
MB-231.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis berterima kasih kepada Indonesia Toray Science Foundation
(ITSF) Periode 2017-2018 dan Divisi Penelitian & Pengembangan BEMF
Farmasi USD 2018 atas dukungan dana untuk penelitian ini.
Log konsentrasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
DAFTAR PUSTAKA
Adegoke, O.A., 2011. Analytical, Biochemical, and Synthetic Applications of Para-Dimethylaminobenzaldehyde. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 11 (2), 17-29.
Adhipandito, C.F., 2017. Sintesis Analog Purin (FFUSD-001) dan Studi In Silico Terhadap Matrix Metalloproteinase-9 Hemopexin Domain sebagai Kandidat Anti-Kanker Payudara. Skripsi. Universitas Sanata Dharma.
Arifiyanto, A., 2001. Pengaruh Penambahan Basa Natrium Hidroksida dan Piridin dalam Sintesis Benzoilanilida. Skripsi. Universitas Sanata Dharma.
Alford, V.M., Kamath, A., Ren, X., Kumar, K., Gan, Q., Awwa, M., et al., 2017. Targeting the Hemopexin-like Domain of Latent Matrix Metalloproteinase-9 (proMMP-9) with a Small Molecule Inhibitor Prevents the Formation of Focal Adhesion Junctions. ACS Chemical Biology, 12, 1-44.
Bauvois, B., 2012. New facets of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 as cell surface transducers: Outside-in signaling and relationship to tumor progression. Biochimica et Biophysica Acta, 1825, 29-36.
Cathcart, J., Pulkoski-Gross, A., dan Cao, J., 2015. Targeting matrix metalloproteinases in cancer: Bringing new life to old ideas. Genes & Diseases, 2, 26-34.
Dirjen POM RI. 2014. Farmakope Indonesia. Edisi V. Kementerian Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta.
Dona, A.C., Kyriakides, M., Scottb, F., Shephardb, E.A., Varshavic, D., Veselkov, K., dan Everettc, J.R., 2016. A guide to the identification of metabonomics/metabolomics experiments. Computational and Structural Biotechnology Journal, 19.
Dufour, A., Zucker, S., Sampson, N.S., Kuscu, C., dan Cao, J., 2010. Role of Matrix Metalloproteinase-9 Dimers in Cell Migration: Design of Inhibitory Peptides. Journal of Biological Chemistry, 285 (46), 35944-35956.
Dufour, A., Sampson, N.S., Li, J., Kuscu, C., Rizzo, R.C., DeLeon, J.L., et al., 2011. Small-Molecule Anticancer Compounds Selectively Target the Hemopexin Domain of Matrix Metalloproteinase-9. Cancer Research, 71 (14), 4977-4988.
Koltunov, K.Y., Sobolev, V.I., dan Bondareva, V.M., 2016. Oxidation, oxidative esterification and ammoxidation of acrolein over metal oxides: Do these reactions include nucleophilic acyl substitution?. Catalysis Today, 279, 1-5.
Ludji, D.P.K.S., 2017. Sintesis Analog Purin (FUSD-002) dan Studi In Silico Terhadap Matrix Metalloproteinase-9 Hemopexin Domain sebagai Kandidat Anti-Kanker Payudara. Skripsi. Universitas Sanata Dharma.
Mehner, C., Hockla, A., Miller, E., Ran, S., Radisky, D.C., dan Radisky, E.S., 2014. Tumor cell-produced matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) drives malignant progression and metastasis of basal-like triple negative breast cancer. Oncotarget, 5 (9), 2736-2749.
Merdad, A., Karim, S., Schulten, H.J., Dallol, A., Buhmeida, A., Al-Thubaity, F., et al., 2014. Expression of Matrix Metalloproteinases (MMPs) in Primary Human Breast Cancer: MMP-9 as a Potential Biomarker for Cancer Invasion and Metastasis. Anticancer Research, 34, 1355-1366.
Mohrig, J.R., Alberg, D.G., Hofmeister, G.E., Schatz, P.F., dan Hammond, C.N., 2014. Laboratory Techniques in Organic Chemistry: Supporting Inquiry-Driven Experiments. 4th Edition. W.H. Freeman and Company. USA.
Nicolotti, O., Catto, M., Giangreco, I., Barletta, M., Leonetti, F., Stefanachi, A., et al., 2012. Design, synthesis and biological evaluation of 5-hydroxy, 5-substituted pyrimidine-2,4,6-triones as potent inhibitors of gelatinases MMP-2 and MMP-9. European Journal of Medicinal Chemistry, 58, 368-376.
O’Neil, M.J., Smith,A., Heckelman, P.E., Obenchain Jr., J.R., Gallipeau, J.A.R., et al., 2001. The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals. 13th Edition. MERC & CO., INC. 1406.
Pavia, D.L., Lampman, G.M., Kriz, G.S., dan Vyvyan, J.R., 2015. Introduction To Spectroscopy. 5th Edition. Cengage Learning. United States of America.
Pecorino, L., 2012. Molecular Biology of Cancer: Mechanisms, Targets, and Therapeutics. 3rd Edition. Oxford University Press. United Kingdom.
Prajapat, G., Gupta, R., dan Bhojak, N., 2018. Thermal, Spectroscopic and Antimicrobial Properties of Novel Nickel (II) Complexes with Sulfanilamide and Sulfamerazine Drugs. Chemical Science International Journal., 24 (2), 1-13.
Silverstein, R.M., Webster, F.X., dan Kiemle, D.J., 2005. Spectrometric Identification of Organic Compound. 7th Edition. John Wiley & Sons, Inc. USA.
Sun, M., Dai, W., dan Liu, Q.D., 2008. Fragmentation of aromatic sulfonamides in electrospray ionization mass spectrometry: elimination of SO2 via rearrangement. Journal of Mass Spectrometry, 43, 383-393.
Supratman, U., 2010. Elusidasi Struktur Senyawa Organik. Widya Padjadjaran. Indonesia.
Triono, S., 2007. Konsultasi GC-MS. Wawancara oleh Maywan Hariono pada tahun 2007 di Fakultas MIPA Kimia Universitas Gadjah Mada.
Vandenbroucke, R.E., dan Libert, C., 2014. Is there new hope for therapeutic matrix metalloproteinase inhibition. Nature Reviews Drug Discovery, 3.
Vollhardt, P. dan Schore, N., 2014. Organic Chemistry Structure and Function. 7th Edition. W. H. Freeman and Company. USA.
Yousef, E.M., Tahir, M.R., St-Pierre, Y., dan Gaboury, L.A., 2014. MMP-9 expression varies according to molecular subtypes of breast cancer. BMC Cancer, 14 (609), 1–12.
Zhu, T., Cao, S., Su, P.C., Patel, R., Shah, D., Chokshi, H.B., et al., 2013. Hit Identification and Optimization in Virtual Screening: Practical Recommendations Based Upon a Critical Literature Analysis. Journal of Medicinal Chemistry, 56 (17), 7.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
LAMPIRAN
Lampiran 1. Tahap sintesis senyawa turunan a
proses pengadukan selama 30 menit
Lampiran 2. Mekanisme reaksi antara sulfamerazin dengan DAB
membentuk basa Schiff yang berwarna jingga
23
ahap sintesis senyawa turunan arilamida-5 setelah dilakukan
oses pengadukan selama 30 menit
Mekanisme reaksi antara sulfamerazin dengan DAB
asa Schiff yang berwarna jingga
5 setelah dilakukan
Mekanisme reaksi antara sulfamerazin dengan DAB-HCl
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
Lampiran 3. Hasil uji DAB-HCl dengan sulfamerazin (A) dan senyawa turunan
arilamida-5 (B). Pembentukan basa Schiff ditandai dengan warna jingga
Lampiran 4. Perhitungan Bahan Sintesis dan Hasil Rendemen Senyawa Turunan
Arilamida-5
Perhitungan bahan:
1. Sulfamerazin digunakan x 3,59 mmol = 0,00359 mol
Berat molekul = 264,30 g/mol
0,00359 mol x 264,30 g/mol = 0,95 g
2. Piridin digunakan x 7,18 mmol = 0,00718 mol
Berat molekul = 79,1 g/mol
Massa jenis = 0,982 g/mL
0,00718 mol x 79,1 g/mol = 0,57 g atau 0,57 g:0,982 g/mL = 0,58 mL
3. 3-bromopropionil klorida digunakan x 5,39 mmol = 0,00539 mol
Berat molekul = 171,418 g/mol
Massa jenis = 1,701 g/mL
0,00539 mol x 171,418 g/mol = 0,92 g atau 0,92 g:1,701 g/mL = 0,61 mL
Hasil rendemen:
Senyawa turunan arilamida-5 yang seharusnya (teoritis) = 0,00359 mol x 399,225
g/mol = 1,43 g
Senyawa turunan arilamida-5 = ����� ����� ��������
����� �������� x 100%
= �,�� �
�,�� � x 100% = 67,13 %
B A
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
Lampiran 5. Perbesaran pada sinyal 2,85 ppm (integrasi= 2) dan 2,98 ppm
(integrasi= 2) menunjukan sinyal triplet of triplet. Integrasi= 2 menandakan
bahwa terdapat 2 atom H yang terdeteksi yaitu proton HB dari senyawa turunan
arilamida-5
Lampiran 6. Perbesaran pada sinyal 3,72 ppm (integrasi= 2) dan 3,87 ppm
(integrasi= 2) menunjukan sinyal triplet of triplet. Integrasi= 2 menandakan
bahwa terdapat 2 atom H yang terdeteksi yaitu proton HA dari senyawa turunan
arilamida-5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
Lampiran 7. Perbesaran pada sinyal 7,76 ppm (integrasi= 2) dan 7,93 ppm
(integrasi= 2) menunjukan sinyal doublet. Integrasi= 2 menandakan bahwa
terdapat 2 atom H yang terdeteksi yaitu proton HC (7,76 ppm) dan HD (7,93 ppm)
dari senyawa turunan arilamida-5
Lampiran 8. Perbesaran pada sinyal 7,62 ppm (integrasi= 1) dan 8,31 ppm
(integrasi= 1) menunjukan sinyal doublet dan triplet. Integrasi= 1 menandakan
bahwa terdapat 1 atom H yang terdeteksi yaitu proton HE (8,31 ppm) dan HF (7,62
ppm) dari senyawa turunan arilamida-5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Lampiran 9. Mekanisme
pada kromatografi gas
Lampiran 10. Mekanisme
arilamida-5 pada kromatografi gas
27
Mekanisme pola fragmentasi m/z 334 senyawa turunan arilamida
pada kromatografi gas-spektrometri massa
Mekanisme pola fragmentasi base peak m/z 55 senyawa turunan
5 pada kromatografi gas-spektrometri massa
senyawa turunan arilamida-5
senyawa turunan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
Lampiran 11. Rancangan microwell plate untuk uji aktivitas in vitro
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A B100 B100 B100 B45 E5 S50
B45 E5 S50
B45 E5 S50
B43 KP2 E5 S50
B43 KP2 E5 S50
B43 KP2 E5 S50
B
B44 STA1
E5 S50
B44 STA1
E5 S50
B44 STA1
E5 S50
C
D
E
F
G
H
Keterangan:
B100 = Dapar 100 µL
B45 = Dapar 45 µL
B44 = Dapar 44 µL
B43 = Dapar 43 µL
E5 = Enzim 5 µL
S50 = Substrat 50 µL
KP2 = Kontrol Positif (NNGH inhibitor) 2 µL
STA1 = Senyawa Turunan Arilamdia-5 1 µL
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
Lampiran 12. Perhitungan Nilai IC50 Senyawa Turunan Arilamida-5