JUDUL PERCOBAAN : PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BIURET HARI/TANGGAL PERCOBAAN : Selasa, 19 November 2013 SELESAI PERCOBAAN : Selasa, 19 November 2013 TUJUAN PERCOBAAN : Menentukan kadar protein yang ada pada sampel dengan menggunakan metode biuret DASAR TEORI : Protein berasal dari kata Yunani kuno proteos yang artinya “yang utama”. Dari asal kata ini dapat diambil kesimpulan bagaimana pentingnya protein dalam kehidupan. Protein terdapat pada semua sel hidup, kira- kira 50% dari berat keringnya dan berfungsi sebagai pembangun struktur, biokatalis, hormon, sumber energi, penyangga racun, pengatur pH, dan bakan sebagai pembawa sifat turunan dari generasi ke generasi (Girindra, 1993). Protein merupakan polipeptida berbobot molekul tinggi. Protein sederhana hanya mengandung asam-asam amino. Protein kompleks mengandung bahan tambahan bukan asam amino, seperti derivat vitamin, lipid atau karbohidrat. Protein berperan pokok dalam fungsi sel. Analisis terhadap protein dan enzim darah tertentu digunakan secara luas untuk tujuan diagnostik (Harper, 1995).
Uji tentang adanya protein dalam suatu sampel dilihat daro konsentrasinya
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
JUDUL PERCOBAAN : PENENTUAN KADAR PROTEIN
DENGAN METODE BIURET
HARI/TANGGAL PERCOBAAN : Selasa, 19 November 2013
SELESAI PERCOBAAN : Selasa, 19 November 2013
TUJUAN PERCOBAAN : Menentukan kadar protein yang ada pada
sampel dengan menggunakan metode biuret
DASAR TEORI :
Protein berasal dari kata Yunani kuno proteos yang artinya “yang utama”.
Dari asal kata ini dapat diambil kesimpulan bagaimana pentingnya protein dalam
kehidupan. Protein terdapat pada semua sel hidup, kira-kira 50% dari berat
keringnya dan berfungsi sebagai pembangun struktur, biokatalis, hormon, sumber
energi, penyangga racun, pengatur pH, dan bakan sebagai pembawa sifat turunan
dari generasi ke generasi (Girindra, 1993).
Protein merupakan polipeptida berbobot molekul tinggi. Protein sederhana
hanya mengandung asam-asam amino. Protein kompleks mengandung bahan
tambahan bukan asam amino, seperti derivat vitamin, lipid atau karbohidrat.
Protein berperan pokok dalam fungsi sel. Analisis terhadap protein dan enzim
darah tertentu digunakan secara luas untuk tujuan diagnostik (Harper, 1995).
Protein dapat ditetapkan kadarnya dengan metode biuret. Prinsip dari
metode biuret ini adalah ikatan peptida dapat membentuk senyawa kompleks
berwarna ungu dengan penambahan garam kupri dalam suasana basa (Carprette,
2005). Reaksi biuret terdiri dari campuran protein dengan sodium hidroksida
(berupa larutan) dan tembaga sulfat. Warna violet adalah hasil dari reaksi ini.
Reaksi ini positif untuk 2 atau lebih ikatan peptida (Harrow, 1954).
Reaksi :
Biuret adalah reagen yang digunakan untuk menguji kandungan protein suatu
bahan makanan. Pengujian biuret dengan cara meneteskan larutan biuret pada
bahan makanan yang akan diuji. Jika terkandung protein pada bahan makanan
tersebut maka warna biuret yang tadinya warnanya merah kehitaman akan
berubah menjadi ungu atau violet. Kandungan senyawa/zat pada reagen biuret : CuSO4 → memberikan kompleks berwarna
KOH → memberikan suasana basa (mengubah Cu2+ → Cu+)
KNaC4H4O6 (Kalium Natrium Tartrat) → untuk menstabilkan kompleks ion
Cu2+
Larutan ion Cu2+ membentuk kompleks dengan ikatan peptida suatu protein
sehingga menghsilkan warna ungu dengan absorbansi dari panjang gelombang
(λ) maksimal 540 nm
Metode Spektrofotometri
Sifat protein jika dilarutkan dengan asam klorida dan enzim protease
akan menghasilakan asam amino karboksilat. Disisi lain protein dapat mengalami
denaturasi yaitu perubahan struktur protein yang menimbulakn perubahan sifat
fisika, kimia dan biologi bila Protein apabila dipanaskan dapat mengakibatkan
gelombang elektromagnetik tertentu contohnya bisa, kokain kuman-kuman dan
lain-lain.
Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan
pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna
pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma
atau kisi difraksi dengan detektor fototube (Yoky 2009). Spektrofotometer adalah
alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi
panjang gelombang. Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini,
metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri. Spektrofotometer
dapat mengukur serapan di daerah tampak, UV (200-380 nm) maupun IR (> 750
nm) dan menggunakan sumber sinar yang berbeda pada masing-masing daerah
(sinar tampak, UV, IR). Monokromator pada spektrofotometer menggunakan
kisi atau prisma yang daya resolusinya lebih baik sedangkan detektornya
menggunakan tabung penggandaan foton atau fototube.
Komponen utama dari spektrofotometer, yaitu sumber cahaya,
protein dan air. Perbedaan kekentalan putih telur disebabkan oleh perbedaan
kandungan air (Suryono 2006).
Protein sederhana pada putih telur terdiri atas ovalbumin,
ovoconalbumin dan ovoglobulin, sedangkan yang kedua termasuk glycoprotein,
yaitu ovomucoid dan ovomucin. Ovomucin pada putih telur pada putih telur yang
kental lebih besar daripada putih telur yang encer. Ovomucin merupakan fraksi
protein putih telur yang membentuk selaput dan berfungsi menstabilkan struktur
buih. Pemberian asam asetat yang berlebihan akan mengakibatkan penggumpalan
sebagian ovomucin dan memperkecil elastisitas gelembung buih. Kerusakan
gejala-gejala ovomucin mengakibatkan air dari protein putih telur akan keluar dan
putih telur menjadi encer. Semakin encer putih telur, maka semakin tinggi tirisan
buih yang dihasilkan (Suryono 2006).
Albumin
Albumin merupakan protein utama dalam plasma manusia (kurang
lebih 3,4-4,7 g/dl) dan menyusun sekitar 60% dari total protein plasma. Albumin
merupakan jenis protein terbanyak di dalam plasma yang mencapai kadar 60
persen. Protein yang larut dalam air dan mengendap pada pemanasan itu
merupakan salah satu konstituen utama tubuh (Sarikkuntuk 2006).
1 ml larutan standar protein dengan kadar 1mg, 2mg,3mg,
4mg, 5mg per ml protein
Absorbansi
Ditambah 4 ml reagen biuretDikocokDiinkubasi pada suhu 41oC selama 10 menitDibiarkan pada suhu ruang selama 10 menit sampai terbentuk warna ungu yang stabil dan sempurnaDiukur absorbansi pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis
ALAT DAN BAHAN :
1. Alat :
a. Tabung reaksi 9 buah
b. Pipet gondok 1 buah
c. Gelas kimia 7 buah
d. Gelas ukur 1 buah
e. Spatula 1 buah
2. Bahan :
a. Larutan standar protein
b. Larutan sampel protein
c. Reagen biuret
d. Aquades
ALUR KERJA :
1. Pembuatan standar
2. Penetapan absorbansi larutan blanko
1ml aquades
Absorbansi
Ditambah 4 ml reagen biuretDikocokDiinkubasi pada suhu 41oC selama 10 menitDibiarkan pada suhu ruang selama 10 menit Diukur absorbansi pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis
1ml lar. Sampel
Absorbansi
Ditambah 4 ml reagen biuretDikocokDiinkubasi pada suhu 41oC selama 10 menitDibiarkan pada suhu ruang selama 10 menit Diukur absorbansi pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis
3. Penetapan absorbansi larutan sampel
HASIL PENGAMATAN :
No. Prosedur Percobaan Hasil Pengamatan Dugaan/Reaksi Kesimpulan
1. Pembuatan larutan standar Dengan pengenceran
bertahap, volume yang
digunakan adalah :
a. V1 = 10 ml
b. V2 = 13,3 ml
c. V3 = 15 ml
d. V4 = 16 ml
e. V5 = 10 ml
Sebelum :
Standar protein (10
mg/ml) : tidak berwarna
Aquades : tidak berwarna
Larutan standar berbagai
konsentrasi : tidak berwarna
Reagen biuret : larutan biru
jernih
Kandungan senyawa/zat pada
reagen biuret :
CuSO4 → memberikan
kompleks berwarna
KOH → memberikan suasana
basa (mengubah Cu2+ → Cu+)
KNaC4H4O6 (Kalium Natrium
Tartrat) → untuk menstabilkan
kompleks ion Cu2+
Larutan ion Cu2+ membentuk
kompleks dengan ikatan
peptida suatu protein sehingga
menghsilkan warna ungu
dengan absorbansi dari
panjang gelombang (λ)
maksimal 540 nm
Dari sepktrosfotometri
UV-Vis didapatkan
persamaan :
y = 0,0395x + 0,02942
R2 = 0,99618
Dari microsoft excel
didapatkan persamaan
:
y = 0,040x + 0,014
R2 = 0,983
Sesudah :
Larutan standar + r. Biuret :
larutan biru jernih (+)
Larutan standar + r. Biuret
+ diinkubasi : larutan biru
jernih (++)
Kepekatan larutan dari
pekat samapi tidak pekat
5mg> 4mg> 3mg> 2mg>
1mg
C (mg/ml) A
1 0,062
2 0,103
3 0,141
4 0,176
5 0,205
Reaksi :
2. Penetapan absorbansi larutan blanko Sebelum :
Aquades : tidak berwarna
Reagen biuret : biru jernih
Sesudah :
Aquades + reagen biuret :
biru jernih (+)
3. Penetapan absorbansi larutan sampel
Sebelum :
Sampel : tidak berwarna
Reagen biuret : biru jernih
Sesudah :
Sampel + reagen biuret :
biru jernih (+)
Sampel + reagen biuret +
diinkubasi : biru jernih (+
+)
Sampel Absorbansi
Sampel 1 0,053
Sampel 2 0,059
Sampel 3 0,054
ANALISIS DATA :
Pada percobaan “ Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret “ ini bertujuan
untuk menentukan kadar proteinn yang ada pada sampel dengan menggunakan
metode biuret. Pada percobaan ini dilakukan dalam tiga tahap.
Tahap pertama yaitu pembuatan larutan standar yang bertujuan untuk
standarisasi larutan yang dianalisis yang digunakan untuk pembuatan kurva
standar. Hal ini dilakukan dengan memasukkan 1 ml larutan standar protein
dengan kadar 1mg, 2mg, 3mg, 4mg dan 5mg per ml protein melalui pengenceran
bertahap dengan larutan induk standar yang digunakan yaitu 10mg/ml. Volume
yang digunakan dalam pengenceran bertahap ini adalah ebagai berikut :
Mula-mula larutan induk protein 10 mg/ ml di buat menjadi larutan standar
protein 5 mg/ml dengan perhitungan :
M1 x V1 = M2 x V2
10 mg/ml x V1 = 5 mg/ml x 20 ml
V1 = 10 ml
Setelah itu dilakukan pengenceran dari 5 mg/ml menjadi 4 mg/ml dengan
perhitungan :
M1 x V1 = M2 x V2
5 mg/ml x V1 = 4 mg/ml x 20 ml
V1 = 16 ml
Setelah itu dilakukan pengenceran dari 4 mg/ml menjadi 3 mg/ml dengan
perhitungan :
M1 x V1 = M2 x V2
4 mg/ml x V1 = 3 mg/ml x 20 ml
V1 = 15 ml
Setelah itu dilakukan pengenceran dari 3 mg/ml menjadi 2 mg/ml dengan
perhitungan :
M1 x V1 = M2 x V2
3 mg/ml x V1 = 2 mg/ml x 20 ml
V1 = 13,3 ml
Setelah itu dilakukan pengenceran dari 2 mg/ml menjadi 1 mg/ml dengan
perhitungan :
M1 x V1 = M2 x V2
2 mg/ml x V1 = 1 mg/ml x 20 ml
V1 = 10 ml
Setelah itu larutan standar protein tersebut dimasukkan kedalam tabung reaksi.
Lalu ditambahkan 4 ml reagen biuret dan dikocok. Fungsi penambahan biuret
pada larutan untuk menghasilkan warna ungu karena Cu2+ membentuk kompleks
dengan ikatan peptida suatu protein. Setelah itu diinkubasi pada suhu 41oC selama
10 menit dan diinkubasi lagi pada suhu ruang selama 10 menit sampai warna ungu
yang terbentuk stabil dan sempurna. Fungsi dilakukan inkubasi pada percobaan
ini adalah terjadi penyesuaian larutan dan reaksi yang terjadi pada suhu tersebut.
Lalu diukur absorbansi pada panjan gelombang 520 nm dengan alat
spektrofotometer UV – Vis. Dari pengukuran didapatkan :
C (mg/ml) A
1 0,062
2 0,103
3 0,141
4 0,176
5 0,205
Berdasarkan absorbansi dari UV – Vis diperoleh persamaan y = 0,0395 x +
0,02942 dengan nilai regresi R2 = 0,99618. Sedangkan dari excel diperoleh
persamaan y = 0,040 x + 0,014 dengan nilai regresi R² = 0,983.
0 1 2 3 4 5 60
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
f(x) = 0.0401428571428571 x + 0.0141428571428571R² = 0.983498950001121
Kurva Larutan Standar Protein
absorbansiLinear (absorbansi)
Konsentrasi
Abso
rban
si
Tahap kedua adalah penetapan absorbansi larutan blanko. Pada
percobaan ini dilakukan seperti halnya pada pembuatan larutan standar. Tapi
disini digunakan aquades sebagai pengganti larutan standar protein. Setelah itu
ditambah 4 ml reagen biuret dan dikocok. Larutan menjadi biru jernih. Lalu
diinkubasi Setelah itu diinkubasi pada suhu 41oC selama 10 menit dan diinkubasi
lagi pada suhu ruang selama 10 menit. Fungsi dilakukan inkubasi pada percobaan
ini adalah terjadi penyesuaian larutan dan reaksi yang terjadi pada suhu tersebut.
Lalu diukur absorbansi pada panjan gelombang 520 nm dengan alat