8/19/2019 Pembuatan Apusan Darah
1/14
Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia Yogyakarta @2013
pembuatan pengecatan
sedi n pus d r hPEMBUATAN DAN PENGECATAN SEDIAAN APUS DARAH TEPI
(PERIPHERAL B LOOD SMEAR = FILM)
TIK : Mahasiswa mampu melakukan pembuatan dan melakukan pengecatansediaan apusan darah tepi.
Sediaan Apus Darah berguna untuk :- Hitung Jenis Lekosit secara manual- Pemeriksaan Morfologi Darah Tepi- Pemeriksaan malaria- Cek jumlah trombosit
Alat-alat yang diperlukan dalam pembuatan dan pengecatan sediaan apus darah tepiadalah:1. Kaca obyek (slide/object glass) yang bersih, kering dan baru2. Kaca pemulas (spreader/penggeser)3. Pipet darah dan pengaduk
4. Rak pengecatan5. Rak pengeringan6. Timer/pencatat waktu
Reagensia yang diperlukan:1. Cat Romanowsky
- Wright- Leishman- May Grunwald- Giemsa
2. Buffer distilled water pH 7,2 (larutan penyangga) untuk melarutkan cat3. Methanol (90%) untuk fiksasi
Darah yang digunakan :1. Yang terbaik adalah bahan darah langsung/tanpa antikoagulan (kapiler, vena)2. Darah EDTA harus sesegera mungkin dibuat, karena akan mempengaruhi hasil.
8/19/2019 Pembuatan Apusan Darah
2/14
Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia Yogyakarta @2013
CARA PEMBUATAN SEDIAAN APUS :
Alat yang diperlukan: 1. Kaca obyek yang bersih2. Kaca pemulas
Cara membuat kaca pemulas:a. Pilih sebuah kaca obyek dengan tepi
yang rata. b. Buatlah tanda diagonal pada dua sudut
tepi kaca obyek.c. Potonglah kedua sudut tersebut.
- Kaca obyek yang akan digunakan untukpembuatan apusan harus benar-benar bersih,kalau perlu dibersihkan dengan etermenggunakan kain halus.
- Pegang kaca obyek dengan ibu jari dantelunjuk tangan kiri. Letakkan setetes darah (2
atau 3 mm) sekitar 1 cm dari tepi kaca obyek.- Dengan tangan kanan, letakkan tepi dari kacapemulas di depan tetesan darah dengan sudut30 – 45 derajat.
- Geserlah kaca pemulas ke belakang sampaimenyentuh tetesan darah.
8/19/2019 Pembuatan Apusan Darah
3/14
Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia Yogyakarta @2013
- Biarkan darah menyebar sepanjang tepi kacapemulas.
- Doronglah kaca pemulas ke ujung kaca obyekdengan gerakan halus sampai seluruh darahmenyebar menjadi apusan yang cukup tipis
- Darah dari pasien anemia seharusnya diapusdengan lebih cepat.
- Biarkan sediaan kering di udara, lalu tulislah identitas pasien (berupa nomor urut sediaan)pada bagian kepala dari sediaan dengan pensil kaca.
Ciri-ciri sediaan apus yang baik: - Panjang apusan 1/2 - 2/3 panjang kaca - Harus ada bagian yang cukup tipis untuk
diperiksa- Pinggir sediaan rata, tidak berlubang-
lubang dan bergaris-garis
A : memenuhi semua kriteria B : tidak memenuhi semua kriteria
Beberapa hasil pembuatan sediaan apus yang kurang baik
Hasil pembuatan sediaan apus yangideal
8/19/2019 Pembuatan Apusan Darah
4/14
Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia Yogyakarta @2013
Sumber kesalahan pembuatan sediaan apus:
- Film yang terlalu tebal- Film yang terlalu tipis- Gambaran berpasir
- Garis-garis pada bagian ekor apusan
8/19/2019 Pembuatan Apusan Darah
5/14
Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia Yogyakarta @2013
CARA PENGECATAN SEDIAAN APUS
Pengecatan Wright :
1. Letakkan preparat pada rak pengecatan dalam posisi mendatar, dengan lapisan darah di atas2. Teteskan 20 tetes Cat Wright pada tengah sediaan
dan biarkan 5 menit
3. Teteskan larutan penyangga pada sediaan samabanyak dan biarkan 20 menit
4. Cuci dengan air mengalir (sediaan apus dipegangdengan posisi miring dengan menggunakan
penjepit atau dengan sedikit memiringkan rak pengecatan)
5. Letakkan sediaan dengan posisi miring pada rak pengeringan, dan biarkan kering di udara
Cara pemeriksaan sediaan apus darah tepi : Periksalah sediaan apus di bawah mikroskop dengan pembesaran lemah (obyektif 10 x)
- Sel-sel lekosit sebaiknya merata penyebarannya- Taksirlah kesan jumlah lekosit (perbandingan lekosit per jumlah eritrosit ), Apakahsesuai dengan hitung lekosit ? Bila tidak sesuai dengan jumlah lekosit, makapenghitungan harus diulang.
Periksalah sediaan dari daerah kepala sampai ke ekor. Pada umumnya bagian ekor sel-selnya lebih besar, seperti monosit, netrofil
Sel yang lebih kecil seperti limfosit ada di bagian kepala badan. Pada pengamatan sepintas, catatlah bila dijumpai adanya kelainan.
8/19/2019 Pembuatan Apusan Darah
6/14
Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia Yogyakarta @2013
Pilihlah sediaan di bagian yang eritrositnya tidak saling menumpuk (daerah ideal) danteteskan setetes minyak imersi kemudian amati dengan perbesaran kuat (obyektif 100x)
Gambaran mikroskopis sediaan apus pada beberapa tempat :
Ideal Ekor Kepala
Sumber kesalahan dalam pembuatan dan pengecatan sediaan apus :- Gelas obyek tidak bersih, kotor dan berlemak- Kaca penggeser tidak rata- Darah yang diteteskan terlalu sedikit atau terlalu banyak- Waktu pengecatan terlalu lama atau kurang lama- Pencucian terlalu lama
Berikut ini beberapa contoh pembuatan apusan dan pengecatan yang kurang baik :
Metanol tercampur air Satelitosis (karena pengaruh EDTA)
ideal
ekorkepala
8/19/2019 Pembuatan Apusan Darah
7/14
Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia Yogyakarta @2013
Cat kotor
Pelaporan Hasil- Alat : Differential cell counter - Buatlah tabel seperti di bawah ini:
Jumlah sel Nilai Normal (%) Jumlah Sel setiap lapangan pandang
I II III IV V VI VII VIII IX dst Basofil 0 – 1 Eosinofil 1 – 4 Netrofil batang 2 – 6 Netrofil segmen 55 – 65 Limfosit 25 - 33 Monosit 3 – 6 Total 100
Asam:- Buffer terlalu asam - Suasana asam
8/19/2019 Pembuatan Apusan Darah
8/14
Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia Yogyakarta @2013
Prosedur Penghitungan :
1. Pilihlah daerah dimana lekosit tersebar merata dan jelas (daerah ideal) yaitu pada bagianapusan yang tipis dengan lensa obyektif 10X.
2. Setelah menemukan daerah ideal, tetesi dengan minyak emersi dan periksa dengan lensa
obyektif 100X.3. Dengan menggunakan pengatur mikro pada mikroskop, mulailah menghitung dari pinggiransediaan ke arah bawah.
4. Setelah itu, geserlah kekanan kemudian keatas lagi dan seterusnya.
8/19/2019 Pembuatan Apusan Darah
9/14
Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia Yogyakarta @2013
CHEKLIST DAN KRITERIA PENILAIANPEMBUATAN SEDIAAN APUS DAN PENGECATAN WRIGHT
NO ASPEK YANG DINILAI Feedback
1 Menyebutkan dan menunjukkan kelengkapan alat dan bahan (darahEDTA, pengaduk, kaca objek, kaca pemulas, pensil kaca/spidolpermanen, rak pengecatan/rak pengeringan, cat wright, larutanpenyangga, penjepit, label identitas, sarung tangan)
2 Mencuci tangan (simulasi) dan Memakai sarung tangan Melakukan simulasi mencuci tangan tanpa menggunakan air, namuntatacara mencuci tangan tetap dilakukan.
3 Homogenisasi darah EDTAHomogenisasi dengan cara mengaduk darah menggunakan pengadukatau mengggoyang-goyangkan tabung berisi darah
4 Meneteskan 1 tetes (2 atau 3 mm) darah pada gelas objek + 1 cm daritepi
5 Meletakkan kaca pemulas di depan tetesan darah 6 Menggeser kaca pemulas ke belakang sampai menyentuh tetesan
darah 7 Menunggu darah menyebar rata sepanjang kaca pemulas8 Mendorong kaca pemulas ke depan dengan stabil, tidak terlalu
cepat/lambat membentuk sudut ± 30 0 – 45 0 sampai darah habis9 Menilai hasil sediaan (tunjukkan ke evaluator)
a. Panjang apusan 1/2 - 2/3 panjang kaca b. Harus ada bagian yang cukup tipis untuk diperiksac. Pinggir sediaan rata, tidak berlubang-lubang dan bergaris-garis Ketiga kriteria terpenuhi
10 Mengeringkan sediaan di udara (simulasi waktu) 11 Memberi identitas (nomor urut sediaan, nama, nomor RM, tanggal
pembuatan sediaan).Memberi identitas menggunakan pensil kaca pada bagian kepalasediaan sebelum dilakukan pengecatan (atau dengan spidol permanendi samping bagian kepala sediaan yang tidak ada darahnya)
12 Meletakkan sediaan di atas rak pengecatan 13 Menggenangi sediaan dengan cat wright ± 20 tetes pada tengah
sediaan selama 5 menit (simulasi waktu) 14 Menggenangi sediaan dengan larutan penyangga sama banyak
selama 20 menit (simulasi waktu)
14 Mencuci dengan air mengalirSediaan apus dipegang dengan posisi miring dengan menggunakan
penjepit 15 Mengeringkan sediaan di udara, posisi miring (simulasi waktu)
8/19/2019 Pembuatan Apusan Darah
10/14
Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia Yogyakarta @2013
SEDIAAN DARAH UNTUK MALARIA
Alat dan Bahan: Kaca obyek yang bersih dan kering Lancet steril
70% ethanol dan air Kasa steril Sarung tangan bedah Pensil kaca Box penyimpan Catatan pelaporan
A. Pembuatan Sediaan Apus Malaria
Pegang tangan pasien. Desinfeksi jari ketiga dengan kapas
alkohol 70%.
Tusuk jari ketiga dengan lancet secaracepat. Pada bayi bisa pada ibu jarikaki.
Ibu jari tangan tidak dianjurkan, baikpada anak maupun dewasa .
Hapus darah pertama dengan kasakering.
Tetesan berikutnya (2-3 tetes darah)disentuhkan pada kaca objek, pada 1cm dari tepi kaca. Tetesan ini akandigunakan untuk membuat sediaantebal.
Kemudian, teteskan lagi 1 tetes darahdengan jarak 1 cm dari tetesan
sebelumnya. Tetesan ini digunakanuntuk membuat sediaan darah tipis.
Usap ujung jari dengan kasa kering.
Keterangan: u ntuk la t ihan d ig unakan darah vena dengan ant ikoagu lan EDTA
8/19/2019 Pembuatan Apusan Darah
11/14
Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia Yogyakarta @2013
Pembuatan sediaan darah tipis (seperti pada materi sebelumnya)
Pembuatan sediaan darah tebal : Dengan menggunakan ujung
kaca objek, lakukan gerakan
memutar pada tepi tetesan 3-6putaran sehingga diperolehsediaan darah tebal dengandiameter + 1-1,5 cm.
Keringkan.
Pemberian label dilakukan padasediaan darah tipis.
Contoh Hasil Sediaan Apus Darah Tipis dan Tebal:
B. Pengecatan Sediaan
Bahan dan alat yang diperlukan: Sediaan apus darah tipis dan tebal yang sudah kering Larutan Buffer Methanol murni Larutan Giemsa: 1 bagian Larutan Giemsa induk dalam 30-50 larutan pengencer pH 7,2.
8/19/2019 Pembuatan Apusan Darah
12/14
Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia Yogyakarta @2013
Air mengalir
Cara Pengecatan Sediaan Tipis: Setelah sediaan kering, fiksasi sediaan dengan methanol absolut. Keringkan. Genangi dengan larutan Giemsa 30-60 menit. Cuci dengan air mengalir, keringkan. Periksa di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat.
Cara Pengecatan Sediaan Tebal: Setelah sediaan kering, genangi dengan larutan buffer selama 5 menit (sampai
terhemolisis). Keringkan. Genangi dengan larutan Giemsa selama 30-60 menit. Cuci dengan air mengalir, keringkan. Periksa di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat.
8/19/2019 Pembuatan Apusan Darah
13/14
Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia Yogyakarta @2013
PEMBUATAN SEDIAAN DARAH MALARIA DENGAN PENGECATAN GIEMSA(SEDIAAN DARAH TEBAL DAN TIPIS)
NO ASPEK YANG DINILAI Feedback
1 Menyebutkan dan menyiapkan kelengkapan alat dan bahan (darahEDTA, pengaduk, kaca obyek, kaca pemulas, pensil kaca/spidolpermanen, rak pengecatan/rak pengering, cat Giemsa, larutan metanolabsolut, larutan penyangga/Buffer, penjepit, label identitas, sarungtangan)
2 Memakai sarung tangan3 Homogenisasi darah EDTA 4 Meneteskan 2-3 tetes darah pada gelas objek + 1 cm dari tepi 5 Meneteskan 1 tetes darah pada gelas objek + 1 cm dari tetesan pertama Membuat sediaan tipis 6 Meletakkan kaca pemulas di depan tetesan darah 7 Menggeser kaca pemulas ke belakang sampai menyentuh tetesan
darah 8 Menunggu darah menyebar rata sepanjang kaca pemulas9 Mendorong kaca pemulas ke depan dengan stabil, tidak terlalu
cepat/lambat membentuk sudut ± 30 0 – 45 0 sampai darah habis.10 Menilai hasil sediaan (tunjukkan ke evaluator)
a. Panjang apusan 1/2 - 2/3 panjang kaca b. Harus ada bagian yang cukup tipis untuk diperiksac. Pinggir sediaan rata, tidak berlubang-lubang dan bergaris-garis
Ketiga kriteria terpenuhi Membuat sediaan darah tebal 11 Meletakkan salah satu ujung kaca objek lain pada tetesan darah
12 Membuat gerakan memutar (3-6 kali putaran) pada tepi tetesan darahsampai diperoleh sediaan tebal diameter + 1-1,5 cm
13 Mengeringkan sediaan di udara (simulasi waktu) 14 Memberi identitas (nomor urut sediaan)
Pada bagian kepala sediaan tipis sebelum dilakukan pengecatandengan pensil kaca (atau dengan spidol permanen di bagian sediaanyang tidak ada darahnya)
Mengecat sediaan darah malaria tebal dan tipis 15 Meletakkan sediaan di atas rak pengecatan 16 a. Menggenangi sediaan darah tipis dengan larutan methanol absolut
selama 5 menit/sampai sediaan kering (simulasi waktu)
b. Menggenangi sediaan tebal dengan larutan penyangga padatengah sediaan selama 5 menit/sampai seluruh darah terhemolisis(simulasi waktu)
Dilakukan dengan hati hati, metahnol tidak boleh mengenai sediaandarah tebal, begitu juga larutan biffer tidak boleh mengenai sediaandarah tipis.
17 Membuang larutan penyangga ke sisi tepiDilakukan dengan hati hati tanpa mengenai sediaan darah tipis
18 Mengeringkan sediaan (simulasi waktu)
8/19/2019 Pembuatan Apusan Darah
14/14
Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia Yogyakarta @2013
NO ASPEK YANG DINILAI Feedback
19 Menggenangi seluruh sediaan tebal dan tipis dengan larutan Giemsaselama 30-60 menit (simulasi waktu)
20 Mencuci dengan air mengalirSediaan apus dipegang dengan posisi miring menggunakan penjepit,tanpa membuang larutan Giemsa terlebih dahulu
21 Mengeringkan sediaan di udara, posisi miring (simulasi waktu) 22 Memberi identitas (Nama, nomor RM, tanggal pembuatan sediaan)
setelah pengecatan dengan label identitas, pada bagian kepala sediaan