Mestrado em Engenharia Biomédica: Especialização em EBTO Virologia e Terapia Génica 2º ANO (1º Semestre ) Kevin Sales & Sónia Vaz Ano lectivo 2012-2013 Parvovírus: terapia génica
Oct 30, 2014
Mestrado em Engenharia Biomédica: Especialização em EBTOVirologia e Terapia Génica
2º ANO (1º Semestre )
Kevin Sales & Sónia VazAno lectivo 2012-2013
Parvovírus: terapia génica
Parvovírus
Vírus mais pequenos ( = 18-26 nm)
Parvoviridae
Parvovirinae(vertebrados)
Dependovirus
Parvovírus autónomos
Densovirinae(invertebrados)
Dependovirus
Nem todos requerem a ajuda do adenovírus (exemplo:
herpesvírus, alguns retrovírus);
Alguns podem replicar na ausência do vírus ajudante;
Usados como vectores de genes: Produção em massa de determinadas proteínas;
Tratamento de várias doenças genéticas.
Não está associado a qualquer doença;
Parvovirus autónomo
Não necessita de vírus ajudante;
Vírus B19: Foi descoberto no soro de um dador de sangue saudável;
Infecta os precusores dos glóbulos vermelhos;
Infecção assintomática;
Doenças associadas: - artrite aguda;
- anemia aplástica;
- quinta doença.
Fonte:Carter, J. and Sauders, V. (2007). Virology: principles and applications. England: John Wiley & Sons, Ltd
PARVOVÍRUS: Virião
Simetria icosaédrica;
Formada a partir de 60 moléculas proteicas;
Uma espécie de proteína forma a maioria da estrutura da
cápside;
Aproximadamente esférica;
Cada vértice apresenta uma saliência com um poro no centro;
CÁPSIDE
ssDNA linear (4-6 kb);
Existência de pequenas sequências complementares no final da
molécula de DNA (dsDNA -> Base Pairing);
GENOMA
Fonte: Carter, J. and Sauders, V. (2007). Virology: principles and applications. England: John Wiley & Sons, Ltd
PARVOVÍRUS: Replicação
Depende de proteínas da célula hospedeira;
Apenas disponíveis durante a fase S do ciclo celular (síntese de
DNA);
Ocorre apenas durante a fase S (ao contrário de outros vírus de
DNA).
PARVOVÍRUS: Replicação
LIGAÇÃO E ENTRADA:
Fonte:Carter, J. and Sauders, V. (2007). Virology: principles and applications. England: John Wiley & Sons, Ltd
PARVOVÍRUS: Replicação
Conversão ssDNA para dsDNA e Replicação DNA:
Conversão mediada por DNA polimerase celular;
Extremidade 3’-terminal actua como primer (local onde a enzima
polimerase se liga);
Ocorre por replicação rolling-hairpin;
Fonte:Carter, J. and Sauders, V. (2007). Virology: principles and applications. England: John Wiley & Sons, Ltd
PARVOVÍRUS: Replicação
TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO:
Fonte: Carter, J. and Sauders, V. (2007). Virology: principles and applications. England: John Wiley & Sons, Ltd
PARVOVÍRUS: Ciclo de Replicação
Fonte: Carter, J. and Sauders, V. (2007). Virology: principles and applications. England: John Wiley & Sons, Ltd
AAV: Caracterização
Adaptado de: Buning H., Perabo L., Coutelle O., Quadt-Humme S. & Hallek M. (2008). Recent developments in adeno-associated virus vector technology. The journal of gene medicine 10: 717-733.
≈ 5kb Primer da replicação Integração do genoma viral e
sua desintegração
Proteínas funcionais
Proteínas estruturais (VP1,
VP2, VP3)
14 serotipos → pequenas diferenças na sequência das proteínas da cápside
Especificidade para diferentes tecidos
AAV: Infecção
Etapas da infecção
Ligação ao receptor celular
Entrada na célula
Transporte endossomal
Libertação do endossoma
Desencapsulação e entrada no núcleo
1
2
3
4
5
AAV-2
1
2
3
4
Adaptado de: Ortolano S., Spuch C. & Navarro C. (2012). Present and future of adeno associated vírus based gene therapy approaches. Recent patents on endocrine, metabolic & immune drug discovery 6: 47-66.
5
E o que acontece depois de entrar no núcleo?
AAV: Ciclo Lítico vs Latência
Vírus auxiliar
Ciclo lítico
PRESENTE
Replicação do genoma do AAV
Expressão de genes
Produção de viriões
Ciclo latência
AUSENTE
Expressão das proteínas Rep
Ligam-se às ITR e ao AAVS1
Integração do genoma viral
Locus: 19q13.4
AAV: Estratégias de terapia génica
1. Colheita e cultivo in vitro das células do paciente
2. Transdução com AAV com transgene
3. Selecção e expansão das células com transgene
4. Reintrodução dessas células no paciente
Ex vivo
1. Formulação do vector AAV com o transgene
2. Injecção directa do vector no tecido alvo do paciente
In vivo
Adaptado de: Menck C. F. M. & Ventura A. M. (2007). Manipulando genes em busca de cura: o futuro da terapia génica. Revista USP 75: 50-61.
AAV: Produção de vectores
Adaptado de: Buning H., Perabo L., Coutelle O., Quadt-Humme S. & Hallek M. (2008). Recent developments in adeno-associated virus vector technology. The journal of gene medicine 10: 717-733.
Alternativa:Células de insectos (produção 5 vezes superior)
Cápside: poderá ser de diferentes serotipos
Purificação
Centrifugação por gradiente de
densidade
Colunas de cromatografia
AAV: Terapia génica
Características vector ideal
Fácil produção
Não gerar resposta imune
Expressão do transgene
eficiente e a longo prazo
Especificidade para o tecido
alvo
Vector AAV
Não patológico Pouca estimulação do
sistema imune Larga escala de
infecciosidade particulas virais/ml Especificidade para
determinados tecidos
Vantagens Difícil produção e
purificação a larga escala
Espaço limitado para o transgene
Estimulação das células T citotóxicas
Inicio lento da expressão do transgene
Desvantagens
Cápside AAV-2
Aplicação de AAV em terapia génica: Doenças
Doença Tecido alvo Serotipo(s)
Amaurose Congénito de Leber Olho AAV-2
Parkinson CNS AAV-2
Hemofilia B Fígado, músculo esquelético AAV-2
Distrofia muscular de Ducheme Músculo esquelético AAV-1/2
Falha cardíaca severa Coração AAV-1; AAV-6
Artrite reumatóide Junções AAV-2
Fibrose cística Pulmão AAV-2
Cancro → expressão do factor de necrose tumoral para induzir apoptose
Aplicação de AAV em terapia génica: Doenças
HEMOFILIA B: Doença genética associada ao cromossoma X; Consiste numa deficiência no factor de coagulação IX (FIX);
Tratamento actual: Injecções intravenosas do factor de coagulação concentrado (2 a 3 vezes
por semana); Carácter profilático; Extremamente dispendioso.
Alternativa:
TERAPIA GÉNICA
Aplicação de AAV em terapia génica: Doenças
HEMOFILIA B: Terapia Génica
Transferência do gene mediada pelo vector AAV;
Permite a restauração da actividade de coagulação;
AAV-2
- a produção do factor diminui progressivamente;
- torna-se indetectável 14 semanas após o
tratamento.
O hospedeiro desenvolve uma resposta imunitária contra as proteínas da cápside do vector AAV-2.
COMO RESOLVER O PROBLEMA?
Aplicação de AAV em terapia génica: Doenças
HEMOFILIA B: Terapia Génica (cont.)
Modificação da cápside para impedir resposta do SI:- Inserção de ligandos;- Uso da cápside do AAV-8 ou de outros AAV (requerimento: < seroprevalência);
Fonte:Buning H., Perabo L., Coutelle O., Quadt-Humme S. & Hallek M. (2008). Recent developments in adeno-associated virus vector technology. The journal of gene medicine 10: 717-733.
Exemplo de um estudo clínico:Nathwani, A.C. et al.
HEMOFILIA B: Métodos
AAV2/8 Transporta consigo o gene que
codifica o FIX
Administração intravenosa
(diferentes concentrações)
Monitorização overnight
AAV-2 ITRAAV-8 Cápside +
Exemplo de um estudo clínico:Nathwani, A.C. et al.
HEMOFILIA B: Características dos pacientes antes e após transferência do gene
Nathwani A.C. et al. (2011). Adenovirus-Associated Virus Vector–Mediated Gene Transfer in Hemophilia B. The New England Journal of Medicine 365 (25): 2357-2365.
Exemplo de um estudo clínico:Nathwani, A.C. et al.
HEMOFILIA B: Resultados e Discussão
Quanto maior a dose administrada -> maiores os níveis de FIX;
4 (dos 6 pacientes) pararam de receber o tratamento profilático (injecção de
FIX concentrado) -> retomando as actividades que estavam impedidos de
realizar devido à doença;
2 pacientes diminuíram o número de injecções de FIX concentrado
necessárias; (solução possível: aumentar a dose de administração do
transgene -> aumento da expressão de FIX);
Exemplo de um estudo clínico:Nathwani, A.C. et al.
HEMOFILIA B: Resultados e Discussão (cont.)
Nenhum paciente apresenta uma resposta imunológica contra o transgene FIX;
A administração do transgene FIX provoca um aumento dos níveis de
aminotransferase (solução: administração de glucocorticóides, que não
afectam a expressão do FIX);
Esta estratégia permite assim a expressão, a longo prazo, do transgene FIX (a
níveis terapêuticos) -> sem apresentar uma toxicidade aguda e a longo prazo;
MAS . . . Está associada ao risco de disfunção hepática;
Conclusões
É necessário conhecer e compreender melhor o processo
infeccioso de modo a superar as limitações e optimizar a
eficiência e segurança dos vectores virais
Continua por resolver o problema associado à resposta
imunitária…
Bibliografia
Buning H., Perabo L., Coutelle O., Quadt-Humme S. & Hallek M. (2008). Recent developments in adeno-associated virus vector technology. The journal of gene medicine 10: 717-733.
Carter, J. & Sauders, V. (2007). Virology: principles and applications. England: John Wiley & Sons, Ltd.
Giacca M. & Zacchigna S. (2012). Virus-mediated gene delivery for human gene therapy. Journal of controlled release 161: 377-388.
Menck C. F. M. & Ventura A. M. (2007). Manipulando genes em busca de cura: o futuro da terapia génica. Revista USP 75: 50-61.
Nathwani A.C. et al. (2011). Adenovirus-Associated Virus Vector–Mediated Gene Transfer in Hemophilia B. The New England Journal of Medicine 365 (25): 2357-2365.
Ortolano S., Spuch C. & Navarro C. (2012). Present and future of adeno associated vírus based gene therapy approaches. Recent patents on endocrine, metabolic & immune drug discovery 6: 47-66.
Qiu Y., Yang B., Lan X., Li X., Yin X. & Liu J. (2012). Advances in studies on recombinant adeno-associated virus vector. Asian journal of animal and veterinary advances 7: 1255-1260.