Universität Hohenheim Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen Prof. Dr. Andreas Schaller Molekulare Charakterisierung von IDE- defizienten Tomatenpflanzen Ihre Reaktion auf Verwundung und ihre Interaktion mit Manduca sexta Diplomarbeit vorgelegt von Silke Karojet betreut von Dr. Yoann Huet Hohenheim, Mai 2006
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Universität Hohenheim
Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen
Prof. Dr. Andreas Schaller
Molekulare Charakterisierung von IDE-defizienten Tomatenpflanzen
Ihre Reaktion auf Verwundung und ihre Interaktion m it
Manduca sexta
Diplomarbeit
vorgelegt von
Silke Karojet
betreut von Dr. Yoann Huet
Hohenheim, Mai 2006
für Yannic
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung IV
1. Einleitung
1.1 Verteidigung im Pflanzenbereich 1
1.2 Der Oktadekanoidweg und Systemin in Tomatenpflanzen 3
1.3 Das Insulin-degradierende Enzym (IDE) 8
1.4 Die Hypothese 11
1.5 Manduca sexta 12
2. Materialien und Methoden
2.1 Materialien 14
2.1.1 Chemikalien und Lösungen 14
2.1.2 Kits 20
2.1.3 Enzyme und Antikörper 20
2.1.4 Nucleotide und Nucleinsäuren 21
2.1.5 Organismen 21
2.1.5.1 Pflanzliches Material 21
2.1.5.2 Insekten 23
2.1.6 Sonstiges 24
2.2 Methoden 24
2.2.1 Western-Analyse 24
2.2.1.1 Proteinextraktion und SDS-Polyacrylamidgel-
elektrophorese (SDS-PAGE) 24
2.2.1.2 Proteintransfer auf eine Nitrocellulose-Membran 25
2.2.1.3 Immunodedektion mit Hilfe des IDE-Antiserums 25
2.2.2 Southern-Analyse 26
2.2.2.1 CTAB-Extraktion 26
2.2.2.2 Restriktionsverdau der genomischen DNA 27
Inhaltsverzeichnis
II
2.2.2.3 Auftrennung der DNA-Fragmente und Transfer
auf eine Nitrocellulose-Membran 27
2.2.3 Northern Blot Analyse 28
2.2.3.1 RNA-Extraktion 28
2.2.3.2 Auftrennung der RNA und Transfer auf eine
Nitrocellulose-Membran 28
2.2.4 Sonderherstellung und Hybridisierung 29
2.2.5 Strippen von Blots 30
2.2.5 Reverse Transkription 30
2.2.7 PCR (Polymerase Chain Reaction) 30
2.2.8 Verwundung der Tomatenpflanzen 31
2.2.9 Manduca sexta-Zucht 31
2.2.10 Experimente mit Manduca sexta 32
3. Ergebnisse 36
3.1 Identifizierung unabhängiger Linien 36
3.1.1 Identifizireung der IDE-defizienten Linien mittels Western-
Analyse 36
3.1.2 Analyse der IDE-defizienten Linien mittels Southern-
Analyse 38
3.2 Untersuchung der Abwehrreaktion 44
3.2.1 Induktion des Proteinaseinhibtors II nach mechanischer
Verwundung 44
3.2.2 Induktion des Proteinaseinhibtors II nach Frass von
Manduca sexta 46
3.3 Einfluss des DIE-Silencing auf die Entwicklung von
Manduca sexta 47
3.4 Einfluss des DIE-Silencing auf das Ovipositions-Verhalten
von Manduca sexta 49
3.5 Untersuchung der Expression von HPL und AOS 51
4. Diskussion 54
5. Literatur 61
Inhaltsverzeichnis
III
Abkürzungen 71
Eidesstattliche Erklärung 73
Dank 74
IV
Zusammenfassung
Das Insulin-degradierende Enzym (IDE) aus Tieren ist einer Metallo-Endopeptidase,
die in vitro mehrere nicht-miteinender verwandte Peptide spaltet, und in vivo an der
Proteolyse von Insulin beteiligt ist. Obwohl das Hormon Insulin nicht in Pflanzen vor-
kommt, besitzen Pflanzen homologe Sequenzen des IDE-Gens. Aufgrund ihres kon-
servierten H-x-x-E-H-Motives der katalytischen Domäne gehört IDE zur Familie der
Inverzinkin-Metalloproteasen, deren charakteristische Domäne das inverse Motiv
anderer Zink-abhäniger Metalloproteasen darstellt. In vorausgegangene Arbeiten
konnte IDE als Systemin-abbauende Protease identifiziert werden. In Tomaten
aktiviert Systemin, ein aus 18 Aminosäureresten bestehendes Peptid, den Okta-
dekanoidweg und führt so zur Induktion von Genen die an der Abwehr von herbivoren
Insekten beteiligt sind.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde aus bereits transformierten Tomatenpflanzen der T1-
Generation, in denen die Expression von LeIDE mittels der RNAi-Technik unterdrückt
worden war, 2 unabhängig-transformierte Linien mit Hilfe der Southern- und Western-
Analyse bestimmt. Um zu untersuchen, ob IDE auch Systemin in planta spaltet,
wurden verschiedene Verwundungs- und Insekten-Versuche durchgeführt. Als
molekularer Marker der Verwundungs- und Abwehrreaktion gegen herbivore Insekten
wurde der Proteinaseinhibitor II benutzt, und dessen Induktionskinetik auf trans-
lationaler Ebene betrachtet. Weder mechanische Verwundung, noch Fraß von
Manduca sexta, führt zu einer Veränderung der Kinetik der PI-II-Induktion in IDE-
defizienten Pflanzen. Dies deutet darauf hin, dass IDE keinen Einfluss auf die Abwehr-
reaktion von Tomatenpflanzen hat, und dass IDE wahrscheinlich auch nicht Systemin
in planta degradiert.
Die Bioessays mit Manduca sexta, liefern aufgrund der zögerten Verpuppung und des
veränderten Ovipositions-Verhaltens der Insekten, die als Larven auf IDE-defizienten
Pflanzen aufgezogen wurden, einen Hinweis darauf, dass die Unterdrückung der IDE-
Expression zu einer Veränderung im Primär- oder Sekundär-Stoffwechsel führen
könnte.
1 Einleitung
1
1 Einleitung
1.1 Verteidigung im Pflanzenreich
Im Laufe der ebenso langen wie faszinierenden Geschichte der Evolution, ausgehend
von der Zusammenlagerung von Atomen zu Molekülen, über einfachste Ur-Zellen bis
hin zu hoch kompliziert organisierten Organismen, haben fast alle höheren Pflanzen
eine sessile Lebensweise entwickelt. Die Anpassung an die Lebensräume an Land
führte bei den Pflanzen zum Verlust der Mobilität, was zur Folge hat, dass Pflanzen,
bei sich verschlechternden abiotischen oder biotischen Umweltbedingungen, sich nicht
durch Flucht entziehen können.
Um sich bei einem Befall durch Pathogene oder Herbivore zu schützen, haben Pflan-
zen deshalb eine Vielzahl von Verteidigungsstrategien entwickelt. Zum Schutz vor
pflanzenfressenden Insekten oder anderen Tieren wurden neben strukturellen Ab-
wehrmechanismen, wie zum Beispiel Trichomen oder Dornen, die unter anderem die
Fortbewegung der Insekten auf den Pflanzen beeinträchtigen oder andere Tiere vom
Fraß abschrecken, auch biochemische Abwehrmechanismen entwickelt. Die Produk-
tion von Toxinen und Stoffen, die die Nahrungsaufnahme oder Entwicklung beein-
trächtigen gehören zu den biochemischen Resistenzfaktoren gegen Herbivore.
Diese Faktoren sind besonders gut untersucht bei den Solanaceen, einer Pflanzen-
Familie, zu der auch landwirtschaftlich und pharmazeutisch wichtige Arten wie Kar-
Säule zur Sondenaufreinigung Bio-Spin-Column, BioRad, München
„semi-dry“ Blotting-Apperatur Nova Blot, Amersham Biosciences, Freiburg
UV Stratalinker® 1800 Stratagene, La Jolla, CA
Plastikverbrauchsmaterial wie Pipettenspitzen, Reaktionsgefäße und Petrischalen
wurden von der Firma Sarstedt, Nümbrecht bezogen.
2.2 Methoden
2.2.1 Western-Analyse
2.2.1.1 Proteinextraktion und SDS-Polyacrylamidgele lektrophorese
(SDS-PAGE)
Ungefähr 75 mg gefrorenes Blattmaterial wurden in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit
einem Plastik-Pistill homogenisiert. Sofort wurden 300 µl Protein-Extraktions-puffer
zugesetzt, und der Ansatz dann zentrifugiert (15000 x g, 2 min bei 4° C). Die Konzen-
tration des, in ein neues Reaktionsgefäß überführten, Überstandes wurde bestimmt.
Dazu wurde die Bradford-Lösung mit 10 µl des Protein-Extraktes versetzt, 10 min bei
RT inkubiert und die Absorption am Photometer bei einer Wellenlänge von 595 nm ge-
messen. Alle Schritte der Extraktion wurden auf Eis durchgefürt.
5 µg des Extraktes wurden mit ddH2O auf ein Volumen von 22,5 µl verdünnt, mit 7,5 µl
SDS-Probenpuffer versetzt, für 5 min auf 95° C erhitzt und anschließend über Poly-
acrylamid-Gele in SDS-PAGE-Puffer bei 100 V aufgetrennt. Die Sammelgele (Stärke:
3 Ergebnisse
25
1,5 mm) hatten eine Acrylamid-Konzentration von 4,5 % ( 0,375 ml Acrylamid-Stamm-
lösung, 0,85 ml Sammelgel-Puffer, 2,125 ml ddH2O, 10 µl APS 10 %, 6,0 µl TEMED),
und die Trenngele eine Konzentration von 6,5 % (1,45 ml Acrylamid-Stammlösung,
2,25 ml Trenngelpuffer, 5,3 ml ddH2O, 30 µl APS 10%, 6,75 µl TEMED). Als Größen-
standard wurden 3 µl „PageRulerTM Prestained Protein Ladder“ (Fermentas) aufge-
tragen.
2.2.1.2 Proteintransfer auf eine Nitrocellulose-Mem bran
Anschließend wurden die durch die SDS-Page getrennten Proteine auf Nitrocellulose-
Membran übertragen. Hierfür wurde das Blotting-Papier mit den entsprechenden Puf-
fern getränkt (drei Papiere in Anoden-Puffer 1, sechs Papiere in Anoden-Puffer 2,
sechs Papiere in Kathoden-Puffer), die Membran kurz in Wasser, und dann in Anoden-
Puffer 1, inkubiert, und Blotting-Apperatur entsprechend Abb. 2-1 luftblasenfrei aufge-
baut. Der elektrophoretische Transfer erfolgte für 1h30min bei 100 mA / Gel.
Abb. 2-1 Aufbau der Apperatur beim Western Blot
2.2.1.3 Immunodedektion mit Hilfe des IDE-Antiserum s
Zur Absättigung der Membran wurde diese für mindestens eine Stunde mit Blockier-
ungs-Lösung inkubiert. Danach folgte eine 12stündige Inkubation mit dem LeIDE-Anti-
serum. Das Antiserum war 1:3000 mit frischer Blockierungs-Lösung verdünnt. Die
Membran wurde dann drei mal für 5min mit TBS/Tween gewaschen, und für 1h mit
dem Peroxidase-konjugiertem sekundären Antikörper (1:10000 verdünnt in Blockier-
ungs-Lösung) inkubiert. Die Membran wurde wieder drei mal für 5min mit TBS/Tween
gewaschen und mit der ECL-Lösung entwickelt. Dazu wurde die ECL-Lösung durch
mischen der Lösung A und B (3 µl / ml Lösung A) frisch angesetzt, und die Mem-
Kathode
6 Lagen Blotting-Papier, getränkt mit Katoden-Puffer
Polyacrylamidgel
Nitrocellulose-Membran
3 Lagen Blotting-Papier , getränkt mit Anoden-Puffer1
6 Lagen Blotting-Papier , getränkt mit Anoden-Puffer2
Anode
3 Ergebnisse
26
branen damit für 5 min im Dunklem inkubiert. Nach Abtropfen der Membran wurde
diese zwischen zwei Plastikfolien gelegt, und das Signal mit Hilfe eines lichtempfind-
lichen Röntgenfilm dedektiert. Nach einem Waschschritt wurde zum Vergleich der au-
getragenen Proteinmenge eine Ponceau-Färbung durchgeführt.
Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Und die Membranen wurden in
kleinen Plastikboxen unter leichtem Schwenken inkubiert.
2.2.2 Southern-Analyse
2.2.2.1 CTAB-DNA-Extraktion
Es wurden 6 g Blattmaterial von Tomatenpflanzen verwendet, die zuvor für 24 h, zur
Verringerung des Stärkegehaltes, abgedunkelt waren. Das Pflanzengewebe wurde in
flüssigen Stickstoff zu Pulver gemörsert, mit CTAB-Extraktionspuffer (5 ml / g FG) ver-
setzt, und für 30 min bei 65° C inkubiert. Es wurde 1x V ol. Chloroform zugesetzt, und
für 5 min bei 5000 x g zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde abgenommen und mit 1/10 x Vol. CTAB-NaCl-Puffer und 1x Vol. Chloroform versetzt, und erneut für 5 min bei
5000 x g zentrifugiert. Die DNA in der wässrigen Phase wurde dann durch Zugabe von
1x Vol. Präzipitationspuffer und während einer Inkubation von 30 min bei 65° C gefällt.
Der Ansatz wurde 5 min bei 500 x g zentrifugiert, die DNA in high-salt-TE (1 ml / g FG)
aufgenommen und erneut für 30 min bei 65° C inkubier t. Nach Zugabe on 0,6 x Vol.
Isopropanol fiel ein wolkenartig die langkettigen DNA-Moleküle aus. Der Ansatz wurde
weiter über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Mit einer sterilen Glasnadel wurde
die entstandene DNA-„Wolke“ dann in ein neues Gefäß mit 5 ml 80 % Ethanol über-
führt und 10 min bei 10000 x g (4° C) zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenom-
men, das DNA-Pellet getrocknet und anschließend in TE (0,5 µl / g FG) resuspendiert.
Es folgte ein RNase-Verdau, für den 10 µg / ml des Enzyms zugesetzt wurden, und
der Ansatz für 30 min bei 37° C inkubiert wurde. Dana ch wurde die DNA mit ⅓ x Vol.
10 M NH4OAc und 2,5 x Vol. Ethanol für 30 min auf Eis gefällt, und anschließend 15
min bei 7500 x g (4° C) abzentrifugiert. Das Pellet w urde erneut mit 80 % gewaschen,
getrocknet und in 0,5 ml TE aufgenommen. Der Ansatz wurde nochmals kurz zentri-
fugiert, das Extrakt abgenommen und konnte dann bei –20° C gelagert werden.
Die Konzentration der DNA wurde in TAE-Agarosegelen (1 % Agarose, 0,1 µg / ml
(w/v) Ethidiumbromid) geschätzt. Hierfür wurde die extrahierte DNA 1:10 verdünnt,
3 Ergebnisse
27
und davon jeweils 2,5 µl, 5 µl, 10 µl und 2 µl unverdünntes DNA-Extrakt aufgetragen.
Die Proben wurden vor dem Auftragen mit 2 µl Ladepuffer versetzt und mit TE-Puffer
auf ein Endvolumen von 20 µl gebracht. Als Größenstandart wurden 2 µl und 6 µl
DNA-Ladder aufgetragen. Die Elektrophorese wurde in 1 x TAE-Puffer bei 90 V für 1,5
h durchgeführt und die Gele danach unter UV-Licht fotografiert. Auf diese Weise
konnte auch gleichzeitig die Qualität der DNA kontrolliert werden.
2.2.2.2 Restriktionsverdau der genomischen DNA
Zur Fragmentierung der genomischen DNA wurden zwischen 5 und 10 µg DNA mit je
50 U (außer SspI : 125 U) des Restriktionsenzyms und dem entsprechenden Puffer in
einem Endvolumen zwischen 200 und 350 µl über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag
wurden nochmals 20 U des gleichen Enzyms zugesetzt, und für weitere 2 h inkubiert.
Es folgte eine Phenol-Chloroform-Reinigung und eine Ethanol-Fällung. Die verdaute
DNA wurden dann in 20 µl TE-Puffer aufgenommen.
2.2.2.3 Auftrennung der DNA-Fragmente und Transfer auf eine Nitrocellulose-
Membran
Die durch den Restriktionsverdau erhaltenen DNA-Fragmente wurden in einem 0,8
%igen TAE-Agarosegel in Anwesenheit von Ethidiumbromid aufgetrennt. Vor dem Auf-
tragen der Ansätze wurden diese mit Ladepuffer versetzt. Die Gele liefen über Nacht
bei 30 V in TAE-Puffer. Nach dem Lauf wurden die Gele unter UV-Licht fotografiert
und für 20 min in 0,25 N HCl inkubiert. Anschließend folgten weitere Inkubationen für
30 min in Denaturierungs-Lösung und zwei Mal für 15 min in Neutralisierungs-Lösung.
Für den Blot-Aufbau wurde das Blotting-Papier mit 20x SSC angefeuchtet, die Nitro-
cellulose-Membran gewässert und dann kurz in 20x SSC inkubiert. Der Blot wurde
nach Abb. 2-2 luftblasenfrei aufgebaut. Nach erfolgten Transfer über Nacht in 20x
SSC, wurde die Nitrocellulose-Membran kurz in 2x SSC gespült und anschließend
durch UV-Strahlung auf der Membran fixiert (Stratalinker, 120 mJ).
Die Markierung der Sonde und die Hybridisierung der Membran zum Nachweis von
gesuchten DNA-Fragmente ist unter 2.2.4 beschrieben.
3 Ergebnisse
28
Abb. 2-2 Aufbau der Apperatur für Southern und Nort hern Blots
2.2.3 Northern Blot Analyse
2.2.3.1 RNA-Extraktion
Für die RNA-Extraktion wurden ungefähr 100 mg Blattmaterial verwendet, das zuvor in
flüssigem Stickstoff gemörsert wurde. Es wurden 750 µl Extaktionspuffer und 750 µl
PCI-Phenol-Lösung zugegeben und für 10 min bei 10000 x g zentrifugiert. Die wäs-
srige Phase wurde mit 750 µl PCI-Lösung für 5 min unter Schütteln extrahiert und er-
neut für 10 min bei 10000 x g zentrifugiert. Dieser Extraktionsschritt wurde wiederholt,
und es folgte ein nochmals ein Extraktionsschritt mit CI-Lösung. Die wässrige Phase
wurde dann mit ¼ x Vol. 10M LiCl versetzt und über Nacht auf Eis gefällt. Der Ansatz
wurde dann bei 4° C für 20 min bei 10000 x g zentrif ugiert, das Pellet mit 70% Ethanol
gewaschen, und in 100 µl DEPC-Wasser resuspendiert. Es folgte eine weitere Fällung
mit 1/10 x Vol. 3 M NaAc und 2,5 x Vol. Ethanol. Anschließend wurde das Pellet mit 70
% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 50 µl DEPC-Wasser resuspendiert.
Die Konzentrationsbestimmung der RNA erfolgte am Photometer (Eppendorf
bioPhotometer 6131) bei einer Wellenlänge von 260 nm in UV-Küvetten.
2.2.3.2 Aufrennung der RNA und Transfer auf eine Ni trocellulose-Membran
Zur Analyse der Gen-Expression wurden je 5,5 µg der Gesamt-RNA in einem form-
aldehydhaltigen 1,2%igen Agarose-Gel (1,5 g Agarose, 12,5 ml 10x RNA-Gelpuffer,
22,5 ml Formaldehyd, 90 ml H2O) elektrophoretisch aufgetrennt. Die Proben wurden
mit 1 µl 10x RNA-Gelpuffer, 3,5 µl Formaldehyd, 10 µl Formamid und 2µl RNA-Lade-
(6); SalI (7). Für jeden Verdau-Ansatz wurden ca. 2 µg
Plasmid-DNA verwendet, der mit 5 U des jeweiligen En-
zyms versetzt wurde. (1): Ladder, 1kb; (8): pART27, un-
verdaut.
-20 bp 400bp 400bp -20 bp Sonde
I I I I I I
SalI
NotI / Sac
I
NotI / Spe
I / Eco
RV /
SfiI / A
paI
NheI
Bam
HI
SalI
HXXEX
XEXXH
LB
RB
NT
CT
OT
NP
npt II
1 2 3 4 5 6 7 8
3 Ergebnisse
40
Da aufgrund der ähnlichen Bandenmuster die Transformationsergebnisse in den
Linien InsHP2, InsHP3, InsHP6 und InsHP7 nicht als unabhängig identifiziert werden
konnten, wurden außerdem die Linien InsHP4, InsHP9 und InsHP11untersucht (s.
Abb. 3-5). Zusätzlich wurde auch die Wildtyp-DNA mit den gleichen Restriktionsen-
zymen verdaut und mit der nptII-Fragment hybridisiert, um die Spezifität der Sonde zu
überprüfen.
Der WT-Blot zeigte, dass die verwendete Sonde spezifisch das Kanamycin-Resistenz-
gen erkennt. Auch erwies sich die Linie InsHP4 als nicht transformiert. Die Linien
InsHP 9 und 11 zeigten wieder ein ähnliches Bandenmuster, dass sich aber doch von
dem der Linien InsHP2, InsHP3, InsHP6 und InsHP7 unterschied. Diesmal konnte für
den Verdau mit SspI zwei Banden nachgewiesen werden. Auffällig ist auch, dass bei
allen sechs transformierten Linien nach Verdau mit XbaI von der Sonde mehrere Ban-
den erkannt werden.
InsHP2 InsHP3 InsHP6 InsHP7
Abb. 3 -4 Southern Blots der Linien InsHP2, InsHP3, InsHP6 und InsHP7
10 µg (InsHP2 und 3) bzw. 5 µg (InsHP6 und 7)genomischer DNA wurden mit den Enzymen EcoRI,
HindIII, SspI und XbaI geschnitten und mit der radioaktiv markierten Sonde für das nptII-Gen
hybridisiert.
Eco
RI
Hin
dIII
Xb
aI
Ssp
I
Eco
RI
Hin
dIII
Xb
aI
Ssp
I
Eco
RI
Hin
dIII
Ssp
I
Xb
aI
Eco
RI
Hin
dIII
Ssp
I
I I I I I I I I
10,0 kb
6,0 kb
4,0 kb 3,5 kb 3,0 kb 2,5 kb
2,0 kb 1,5 kb
3 Ergebnisse
41
Diese Southern-Analysen zeigten, dass den untersuchten Linien zwei unabhängige
Transformationsergebnisse zugrunde liegen. Zu der einen Gruppe gehören die Linien
InsHP2 und 3, zur anderen die Linien InsHP 9 und 11. Die Linie InsHP6 ähnelt stark
den Linien InsHP2 und 3, lediglich beim Verdau mit XbaI ist ein Unterschied zu be-
merken (Fehlen der Bande bei 3,5 kb).
Da der Vergleich der verschieden Blots untereinander bei diesen ähnlichen Mustern
nicht zu einem wirklich eindeutigem Ergebniss führen konnte, wurde eine weitere
Southern-Analyse durchgeführt bei der diesmal die verschiedenen Linien auf die selbe
Membran geblottet wurden. Bei dem Verdau mit XbaI entstanden immer Muster mit
mehreren Banden, deshalb wurde hier dieses Enzym gewählt, um die genomische
DNA der verschiedenen Linien nochmals zu schneiden. Um die Auflösung zu verbes-
sern liefen beide Gele jetzt ungefähr 16 Stunden (s. Abb. 3-6 A).
Hier erkennt man jetzt bei starkem Kontrast für die Linien InsHP2, InsHP3 und InsHP6
jeweils zwei Banden mit einer ungefähren Größe von 4 kb und 3,5 kb (s. Abb. 3-6 A
und C). Beide Banden sind auch bei den Linien InsHP9 und InsHP11 vorhanden. Hin-
Abb. 3 -5 Southern Blots der Linien InsHP4, InsHP9, InsHP11 und von WT
10 µg genomischer DNA wurden mit den Enzymen EcoRI, HindIII, SspI und XbaI geschnitten und
mit der radioaktiv markierten Sonde für das nptII-Gen hybridisiert.
Eco
RI
Hin
dIII
Ssp
I
Xb
aI
InsHP9
Eco
RI
Hin
dIII
Ssp
I
Xb
aI
Eco
RI
Hin
dIII
Ssp
I
Xb
aI
Eco
RI
Hin
dIII
Ssp
I
Xb
aI
WT InsHP11 InsHP4 I I I I I I I I
10,0 kb
6,0 kb 4,0 kb 3,5 kb 3,0 kb 2,5 kb 2,0 kb 1,5 kb
3 Ergebnisse
42
zu kommen aber bei diesen beiden Linien weitere 4 Banden mit einer Größe zwischen
ungefähr 5 und 7 kb, die bei der Linie InsHP11 deutlich erkennbar sind. Obwohl er-
kennbar ist, das auf das Gel für die Linie InsHP9 etwas mehr DNA aufgetragen wurde
(Abb. 3-6 B), fällt die Bindung der Sonde auf dem Blot schwächer aus. Trotzdem sind
die drei Banden mit einer Größe zwischen ungefähr 3,5 kb und 5 kb und die Bande
kurz ober-halb der 6 kb-Bande noch schwach erkennbar (Abb. 3-6 C).
Um sicher zu gehen, dass bei den Linien InsHP9 und 11 die Vielzahl der Bande nicht
auf einen unvollständigen Restriktionsverdau zurückzuführen ist, wurde dieser letzte
Blot nochmals mit einer Sonde für das IDE-Gen hybridisiert (Abb. 3-7). Für alle Linien
konnten hier zwei Banden mit jeweils der selben Größe detektiert werden. Dies zeigt
zum einen, dass die sechs Banden der Linien InsHP9 und 11 auf eine mehrfache In-
sertion der T-DNA zurückzuführen ist, und weist zum anderen, auf das Vorhanden-
sein eines zweiten IDE-Gens hin.
Aufgrund dieses Southerns mit XbaI konnten die Ergebnisse der vorausgegangenen
Blots bestätigt werden. Die 9 Kanamycin-resistenten Linien bestehen also nur aus 2
Abb. 3 -6 Southe rn Blot der Linien InsHP2, InsHP3, InsHP6, InsHP9 u nd InsHP11 nach Verdau mit XbaI
A 7,5 µg genomischer DNA wurden mit dem Enzym XbaI geschnitten und mit der radioaktiv markierten
Sonde für das nptII-Gen hybridisiert. B Entsprechendes Gel, mit Ethidium-bromid angefärbt. C Der selbe Blot,
stark kontrastiert.
XbaI
InsHP
2 3 9 11 6
I I I I I I I I
10,0 kb
6,0 kb
4,0 kb
3,5 kb
3,0 kb
2,5 kb
2,0 kb
1,5 kb
B C A
3 Ergebnisse
43
Gruppen von unabhängigen Linien. Zu der einen Gruppe gehören die Linien InsHp2, 3
und 6, zu der anderen die Linien InsHP 9 und 11. InsHP7 wird wegen des gleichen
Bandenmuster der Southern-Analysen in Abb. 3-4 der ersten Gruppe zugeordnet.
In Tabelle 3-1 werden die Ergebnisse der Western- und Southern-Analyse nochmals
veranschaulicht.
Alle weiteren Experimente wurden mit der Linie InsHp7 durchgeführt.
1 InsHP 2 9 7 6 3 4 10 11
Tab. 3-1 Ergebnisse der Southern - und Western -Analyse n der verschidenen Kanamycin -
resistenten Linien. Die hell- oder dunkelviolett unterlegten Linien kennzeichnet die
Zugehörigkeit zu einer der beiden unabhängigen Linien. (1) Unter den Nachkommen der Linie
InsHp3 sind auch Individuen, die nicht gesilenced sind. Nicht-gesilencte Linien sind mit grün
unterlegt.
Abb. 3 -7 Southern Blot der Linien InsHP2, InsHP3, InsHP6, I nsHP9
und InsHP11 nach Verdau mit XbaI. 7,5 µg genomischer DNA wurden
mit dem Enzym XbaI geschnitten und mit der radioaktiv markierten Sonde
für das IDE-Gen hybridisiert.
gesilenced
1
nicht gesilenced
InsHP
x x
x
2 9 7 6 3 4 10 11
x
x
x
x x(1)
x
3 Ergebnisse
44
3.2 Untersuchung der Abwehrreaktion
Um die Hypothese zu bestätigen, dass das Fehlen des IDE zu einer verstärkten und
länger anhaltenden Abwehrreaktion führt, wurde als stellvertretendes Gen die Induk-
tion des Proteinaseinhibitors II (PI-II) auf translationaler Ebene bei IDE-defizienten und
bei Wildtyp-Pflanzen untersucht. Von den verwundeten bzw. von Manduca sexta-
Larven angefressenen Blättern wurden, über einen Zeitraum von bis zu vier Tagen,
Sammelproben von sechs oder fünf Pflanzen genommen. Die Transkriptmenge zu den
verschiedenen Zeitpunkten wurde durch Northern-Analyse unter Verwendung der
LePI-II-Sonde untersucht. Zur Kontrolle der aufgetragenen Gesamt-RNA-Menge
wurden die Blotts gestrippt, und erneut mit einer Ubiquitin-Sonde hybridisiert, oder die
mit Ethidiumbromid gefärbten Gele wurden zur Kontrolle unter UV-Licht fotografiert.
3.2.1 Induktion des Proteinaseinhibtors II nach mec hanischer Verwundung
Abbildung 3-7 A zeigt die zeitabhängige Expression des Proteinaseinhibitors II nach
mechanischer Verwundung. Bei Wildtyp-Pflanzen liegt der Höhepunkt der Induktion
zwischen acht und zwölf Stunden, bei IDE-defizienten Pflanzen bei zwölf Stunden.
Auch erscheint die Induktion bei InsHP7 stärker als als bei Wildtyp-Pflanzen. Um die
gleichmäßige Beladung des Gels zu kontrollieren, wurden die Blots zusätzlich mit
einer Ubiquitin-Sonde hybridisiert. Beim Vergleich der Stärke der Signale von PI-II und
UBQ relativiert sich allerdings der obige Eindruck, sowohl hinsichtlich des Maximums
der Induktion, als auch hinsichtlich der Stärke.
Aufgrund des bestehendes Verdachtes einer Infektion mit dem Tomaten-Mosaikvirus
wurde dieser Versuch wiederholt (Abb. 3-7 B), die Samen dafür vor der Aussaat mit
Hypochlorid und TNP sterilisiert, und die extrahierte RNA mit RT-PCR und Primern,
spezifisch für die RNA der Hüllproteine des Virus, untersucht. Dieser Test fiel negativ
aus, die Ergebisse werden hier nicht gezeigt. Der Ausschluß einer Virus-Infektion war
nötig, da bei einer solchen Infektion die Expression der Salicylsäure hoch reguliert,
und unter deren Einfluß die Expression der Jasmonsäure herunter reguliert wird, was
sich negativ auf die produzierte Menge an PI-II auswirken würde.
Da die Transkriptmenge am Tag 3 und 4 nach der Verwundung nicht mehr als rele-
vant erachtet wurde, um eine Aussage bezüglich der Unterschiede in der Induktion
zwischen Wildtyp und ide zu können, wurden diese beiden Zeitpunkte nicht mehr
untersucht. Als zusätzlicher Zeitpunkt wurde aber die Transkriptmenge nach 0,5
Stunden untersucht, um die Induktion nach Verwundung besser mit der nach Insekten-
3 Ergebnisse
45
Fraß vergleichen zu können, gefressen hatten, da hier erwartet wurde, dass die Induk-
tion früher einsetzt.
Hier zeigen dann Wildtyp- und ide-Pflanzen eine maximale Transkriptmenge bei 8
Stunden, und der Unterschied hinsichtlich der Stärke der Transkription ist auch hier
wieder nur sehr geringfügig.
Das Fehlen von IDE scheint also keinen, oder wenn dann nur einen geringfügigen Ein-
fluß auf die Kinetik der Induktion des Proteinaseinhibitors II zu haben.
WT InsHP7
0 2 4 8 12 24 48 72 96 0 2 4 8 12 24 48 72 96
Abb. 3 -7 Zeitlicher Verlauf der PI -II-Induktion nach mechanischer Verwundung bei WT- und ide-
Pflanzen A Blätter von jungen (2 Wochen alt) Tomatenpflanzen wurden verwundet, und die Proben nach
der angegebenen Zeit genommen (5 Pflanzen pro Zeitpunkt). Die Transkriptmenge des Proteinase-
inhibitors II (PI-II) wurde mit einer radioaktiv-markierten Sonde dedektiert. Als Kontrolle der aufgetragenen
RNA-Menge wurde der gestrippte Blot erneut mit einer Sonde für Ubiquitin (UBQ) hybridisiert. B
Wiederholung des Experimentes mit virus-frei getesteten Pflanzen
UBQ
PI-II
A
B
0 0,5 2 4 8 12 24 48 0 0,5 2 4 8 12 24 48
PI-II
WT InsHP7
Zeit [h], nach Verwundung
Zeit [h], nach Verwundung
3 Ergebnisse
46
3.2.2 Induktion des Proteinaseinhibtors II nach Fra ss von Manduca sexta
In Tabakpflanzen können die Gehalte an Jasmonsäure (McCloud und Baldwin, 1997),
wie auch die Transkription von Proteinaseinhibitoren nach Frass von Mandca sexta
deutlich erhöht sein (Roda und andere, 2004; Wu und andere, 2006) gegenüber
mechanischer Verwundung. Deshalb wurde auch bei IDE-defizienten Pflanzen unter-
sucht, ob es zu einer Änderung der Expression des Proteinaseinhibitors II kommt,
bedingt ist durch den Frass von Manduca sexta Larven.
Der Versuch wurde wie unter 2.2.10 (Experiment 4) beschrieben durchgeführt. Auch
hier wurden Proben über einen Zeitraum von 2 Tagen genommen.
Beide Genotypen zeigen das Maximum der Induktion des Proteinaseinhibitors II nach
12 Stunden (s. Abb.3-8), auch hinsichtlich der gebildeten PI-II-mRNA besteht kein
Unterschied. Genauso fällt auch die Transkriptmenge bei beiden Genotypen innerhalb
von zwei Tagen wieder auf das Ausgangsniveau zurück.
Weder mechanische Verwundung, noch Frass von Manduca sexta, führt zu einer Ver-
änderung der Kinetik der PI-II-Induktion in IDE-defizienten Pflanzen. Dies deutet da-
rauf hin, dass IDE keinen Einfluß auf die Abwehrreaktin von Tomatenpflanzen hat, und
dass Systemin wahrscheinlich auch nicht von IDE in planta degradiert wird.
Abb. 3 -8 Zeitlicher Verlauf der PI -II-Induktion bei WT - und ide-Pflanzen nachdem Manduca -
Larven an den Blättern gefressen hatten. An den Blättern von 2 Wochen alten Tomatenpflanzen
hatten Larven von Manduca sexta (frühes 5. Larvenstadium) gefressen. Nach der angegebenen Zeit
wurden dann Proben entnommen (5 Pflan-zen pro Zeitpunkt). Die Transkriptmenge des Proteinase-
inhibitors II (PI-II) wurde mit einer radioaktiv-markierten Sonde dedektiert. Als Kontrolle der aufge-
tragenen RNA-Menge wird das mit Ethidiumbromid angefärbte Gel gezeigt.
0 0,5 2 4 8 12 24 48 0 0,5 2 4 8 12 24 48
WT InsHP7
PI-II
Zeit [h], nach Insektenfraß
3 Ergebnisse
47
3.3 Einfluß des IDE-Silencing auf die Entwicklung von Manduca sexta
Neben dem Nachweis von der veränderten Transkription von bestimmten Genen, stellt
ein Bioassay mit Insekten eine weitere Möglichkeit dar, um eine Vorstellung davon zu
bekommen, welchen Einfluß IDE auf die Abwehrreaktion von Tomatenpflanzen haben
könnte.
Manduca-Experiment 1:
Bei diesem Experiment wurde untersucht, ob es unter Einfluß des gesilenceten IDE-
Gens zu einer Akkumulation von Substanzen kommt, wie zum Beispiel dem Protein-
aseinhibitors-II, die die Nahrungsaufnahme und Wachstum der Manduca-Larven be-
einträchtigen. Substanzen, die mit der Induktion des Jasmonsäureweg assoziert sind
müssten zu einer verringerten Gewichtszunahme der Larven führen, und sich somit
auch auf die von ihnen gefressene Pflanzenmenge auswirken.
Wie Abb 3-9 zeigt, konnte, nachdem die Manduca-Larven 7 Tage auf den verschie-
denen Tomatenpflanzen gefressen hatten, kein signifikanter Unterschied betreffend
des Gewichtes zwischen den beiden Insekten-Gruppen festgestellt werden. Zu
diesem Zeitpunkt hatten alle das 4. Larvenstadium erreicht. Auch hinsichtlich der ge-
fressenen Blattmenge konnte kein deutlicher Unterschied erkannt werden (Abb 3-10),
weshalb dieser Parameter auch weiter nicht genauer untersucht wurde.
Abb. 3 -9 Gewicht der Manduca-Larven
nach 7 Tagen auf WT- und ide-Pflanzen.
Zu Beginn des Versuchs waren die
Pflanzen 4 Wochen alt. Auf jede Pflanze
wurden 4 Larven, kurz nach der Häutung
zum 2. Larvenstadium (L2) aufgesetzt.
Für jeden Genotyp wurde eine Gruppe
von 6 Pflanzen verwendet.
Anzahl der Larven auf WT-Pflanzen: n =
20 und auf ide-Pflanzen: n = 21 G
ewic
ht d
er L
arve
n in
g
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1 WT ide
3 Ergebnisse
48
Manduca-Experiment 2:
Hier wurde der komplette Lebenszyklus von Manduca sexta untersucht. Dafür wurden
frisch geschlüpfte Larven auf die Pflanzen aufgesetzt und verblieben dort bis zum Ver-
lassen der Pflanzen, was während der 2. Hälfte des 5. Larvenstadiums stattfindet. Hin-
sichtlich des Gewichts beim Erreichen des „wandering“-Stadiums konnten bei Larven,
die entweder auf Wildtyp- oder aud ide-Pflanzen aufgezogen wurden, auch hier kein
signifikanter Unterschied festgestellt werden (s. Abb 3-11). Allerdings benötigten die
Larven auf den IDE-defizienten Pflanzen rund 3 Tage länger, bis alle Larven dieser
Gruppe das „wandering“-Stadium erreicht hatten (s. Abb 3-12). Dieser Unterschied
machte sich allerdings nur bemerkbar in Bezug auf Erreichen des „wandering“-
Stadiums und nicht beim Wechsel von einem Larvenstadium zum nächsten (Daten
hier nicht gezeigt).
WT
Abb. 3 -10 Status der WT- und ide-Pflanzen an denen 7 Tage Manduca sexta-Larven gefressen hatten.
ide
Abb. 3 -11 Gewicht der Manduca-Larven
bei Erreichen des „wandering“-Stadiums.
Zu Beginn des Versuchs waren die
Pflanzen 8 Wochen alt. Auf jede Pflanze
wurden 4 frisch geschlüpfte Larven (L1)
aufgesetzt. Für jeden Genotyp wurde eine
Gruppe von 18 Pflanzen verwendet.
Anzahl der Larven auf WT-Pflanzen: n =
24 und auf ide-Pflanzen: n = 25
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
10,00
Gew
icht
der
Lar
ven
in g
WT ide
3 Ergebnisse
49
Zusätzlich wurde nach der Verpuppung bei beiden Manduca-Gruppen das Geschlech-
terverhältniss bestimmt. Bezüglich des Geschlechterverhältnisses sowie der Anzahl
der geschlüpften Imagines konnten keine Unterschiede zwischen den beiden Gruppen
festgestellt werden (Daten hier nicht gezeigt).
Um die Fitness der beiden Manduca-Gruppen beurteilen zu können wurde außerdem
das unter 3.3 aufgeführte Ovipositions-Experiment durchgeführt.
3.4 Einfluß des IDE-Silencing auf das Ovipositions-Verhaltens von Manduca
sexta
Manduca-Experiment 3:
Um die Auswirkungen auf die Fitness von Manduca sexta zu testen, wenn diese im
Larvenstadium IDE-defizienten Tomatenpflanzen als Nahrung konsumierten, wurde
ein Ovipositions-Experiment entworfen. Unter Darwinscher Fitness versteht man den
Erfolg der Fortpflanzung eines Genotyps, der an der Anzahl der Nachkommen gemes-
sen wird, und ist stark von den Umweltbedingungen, und so auch von der Nahrung,
abhängig. Es wurde mit zwei verschiedenen Gruppen von Faltern gearbeitet, die ent-
weder auf Wildtyp- oder auf ide-Pflanzen herangezogen wurden. Für die Oviposition
standen den Faltern Wildtyp- und ide-Pflanzen zur Auswahl. Die Bereitstellung der
beiden Pflanzengenotypen, zwischen denen die weiblichen Falter für die Oviposition
0%
25%
50%
75%
100%
125%%
der
Lar
ven,
die
das
„w
ande
ring“
-Sta
dium
err
eich
t ha
ben
Abb. 3 -12 Prozentualer Anteil (kumulativ) der Manduca-Larven, die das „wandering“-
Stadium erreicht hatten in Abhängigkeit des Larvenalters. Anzahl der Larven auf WT-
Pflanzen: n = 20 und auf ide-Pflanzen: n = 21. WT ide
16 20 23 26 Tage nach Schlüpfen
3 Ergebnisse
50
wählen konnten, sollte auch Aufschluss darüber geben, ob das „Silencing“ des IDE-
Gens zu einer veränderten Zusammensetzung der Sekundärmetabolite, einschließlich
der flüchtigen organischen Verbindungen, oder der Oberflächenbeschaffenheit der
Pflanzen geführt hat.
Zwei weibliche Falter, die als Larven auf WT-Pflanzen herangezogen wurden, haben
zusammen in einem Käfig im Schnitt 383 ± 72 (n = 3, Anzahl der Wiederholungen des
Experiments) Eier gelegt, und zwei Manduca Weibchen, die auf ide-Pflanzen aufge-
zogen wurden, 334 ± 89. Es konnte also kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der
Anzahl der gelegten Eier festgestellt werden. Betrachtet man allerdings das Oviposi-
tions-Verhalten der beiden Gruppen in Bezug auf die ihnen zur Verfügung gestellten
unterschiedlichen Pflanzen-Genotypen, so fällt auf, dass Falter, die über ihre kom-
plette Larvenzeit auf ide-Pflanzen gefressen hatten, ide-Pflanzen für die Oviposition
mieden (Abb.3-13 B). Die Weibchen legten hier nur 120 ± 49 Eier auf IDE-defiziente
Pfanzen, aber 214 ± 42 Eier auf WT-Pflanzen. Wohingegen Falter von Larven, die auf
WT-Pflanzen aufgezogen wurden zwischen den beiden Genotypen bei der Wahl ihrer
Wirtspflanzen für die Oviposition nicht unterschieden (Abb.3-13 A). Diese Falter legten
210 ± 30 Eier auf ide-Pflanzen und 172 ± 73 Eier auf WT-Pflanzen ab.
Abb. 3 -13 Oviposition von Manduca sexta Weibchen, die als Larven auf A WT-Pflanzen oder
B IDE-defizienten Pflanzen aufgezogen wurden. In den Diagrammen zeigen die mit grün
unterlegten Balken die Anzahl der Eier an, die auf Wildtyp-Pflanzen gelegt wurden und die
mit violett unterlegten Balken die Anzahl der Eier auf IDE-defizienten Pflanzen.
0
50
100
150
200
250
300
0
50
100
150
200
250
300
1
A B WT ide WT ide
Anz
ahl d
er g
eleg
ten
Eie
r
Anz
ahl d
er g
eleg
ten
Eie
r
3 Ergebnisse
51
3.5 Untersuchung der Expression von HPL und AOS
Das Ovipositions-Verhalten von Manduca sexta wird auch beeinflusst durch flüchtigen
organischen Verbindungen (VOCs, volatile organic compounds) die von den Pflanzen
produziert werden (Schoonhoven,2005) und als chemische Signale fungieren. Die Er-
gebnisses des Ovipositions-Versuchs, könnten darauf hin deuten, dass das „Silencing“
des IDE-Gens zu einer Veränderung in der Zusammensetzung dieser flüchtigen Subs-
tanzen führt. Mehrere Klassen von chemischen Verbindungen gehören zu den VOCs.
Hierzu zählen auch kurzkettige Aldehyde und die korrespondierenden reduzierten Al-
kohole, sowie Derivate der Jasmonsäure. HPL und AOS sind beides Enzyme, die
erste Schritte der Biosynthese dieser flüchtigen Verbindungen katalysieren (Howe und
andere, 2000).
Das Substrat für beide Enzyme ist 13-hydroperoxy-Oktadecatriensäure (13-HPOT),
das mit Hilfe der LOX aus Linolensäure synthetisiert wird. AOS führt durch die Bildung
von Allenoxid in den Oktadecanoidweg und so letztendlich zur Bildung von Jasmon-
säure. HPL hingegen spaltet 13-HPOT in 3-Hexanal, ein C6-Aldehyde, und 12-oxo-(Z)-
9-Dodecensäure, die weiter zu Traumatin (12-oxo-(E)-10-Dodecensäure) umgesetzt
wird.
3-Hexanal, und das daraus hervorgehnde 2-Hexanal, gehören mit in die Gruppe der
flüchtigen volatilen Verbindungen, die von Tabakpflanzen nachts, nach Befall durch
herbivore Insekten verstärkt abgegeben werden. Die Eiablage von Heliothis virescens
(Tabakeule) ist auf solchen Tabakpflanzen veringert gegenüber nicht-befallenen
Pflanzen (De Moraes und andere, 2001). Eventuell könnte eine veränderte Expression
von HPL in den IDE-defizenten Tomatenpflanzen eine Erklärung für das Ovipositions-
verhalten von Manduca sexta liefern. Da 13-HPOT das Substrat für HPL und AOS ist,
und AOS ein Enzym des Oktadekanoidwegs, und somit zur Synthese von Jasmon-
säure und derern fllüchtigen Derivat Methyl-Jasmonsäure führt, wurde auch die Ex-
pression von AOS untersucht.
Die Induktion der beiden Enzyme wurde hier mit Hilfe der RT-PCR-Technik überprüft.
Es wurde die selbe RNA benutzt, die bereits schon für die Untersuchung der Induktion
des PI-II nach Frass durch Manduca sexta (s. 3.2.1) extrahiert wurde. Diese wurde mit
Hilfe von Reverser Transkriptase in cDNA umgeschrieben, und mit den Gen-spezi-
fischen Primern partiell amplifiziert. Zur Kontrolle der eingesetzten Menge an cDNA
wurde eine PCR mit Actin-Primern durchgeführt, da Actin konstitutiv exprimiert wird.
Die Primer wurden anhand der veröffentlichten Sequenzen (AOS: AJ271093; HPL:
AF230372) des Tomaten Genoms hergestellt. Die partielle cDNA von HPL sollte eine
3 Ergebnisse
52
Länge von 455 bp, die von AOS von 394 bp aufweisen. Um eine Verunreinigung mit
genomischer DNA ausschließen zu können wurden jeweils auch Ansätze ohne
Reverse Transkriptase als Negativ-Kontrolle hergestellt.
hpl
Wie Abbildung 3-14 zeigt, ist bei der Induktion von HPL sowohl für WT wie auch ide
bereits nach einer halben Stunde eine ungefähr doppelt so große Transkriptmenge
nachweisbar, die weiter ansteigt bis 8 Stunden nachdem die Manduca-Larven an den
Pflanzen gefressen hatten, und dann wieder auf das Ausgangsniveau abfällt. Zieht
man Größe der Aktin-Banden mit in Betracht, so kann weder hinsichtlich der Stärke
und des Verlaufs der Induktion, noch der Transkriptmenge zum Zeitpunkt t0 zwischen
Abb. 3 -14 Expression von HPL und AOS nach Frass von Manduc a sexta über einen Zeit-raum von 48 Stunden. Als Kontrolle der verwendeten Transkriptmenge werden auch die Aktin-Fragmente gezeigt, und als Negativ-Kontrolle jeweils die Ansätze ohne Reverse Transkriptase.
I
I 500 bp
250 bp
HPL:
AOS:
Aktin:
I
I
I
I
500 bp 250 bp
500 bp
250 bp
WT L InsHP7
0 0,5 2 4 8 12 24 48 0 0,5 2 4 8 12 24 48
Zeit nach Frass von M.s.:
I
I
I
I
I I
500 bp 250 bp
500 bp 250 bp
500 bp 250 bp
3 Ergebnisse
53
WT und ide ein eindeutiger Unterschied festgestellt werden. Für die Induktion von
AOS verhält es sich ähnlich, außer, dass das Maximum der Induktion bereits nach 4
Stunden erreicht ist.
Auch durch das Bioassey mit Manduca sexta konnte hinsichtlich der Gewichtszu-
nahme keine Veränderung der Abwehrreaktion erkannt werden. Offen bleibt, worauf
die Verzögerung der Verpuppung im 5. Larvenstadium zurückzuführen ist, bei den Lar-
ven, die auf IDE-defizienten Pflanzen aufgezogen wurden, und warum die Imagines
dieser Larven die ide-Pflanzen für die Oviposition meiden.
4 Diskussion
54
4 Diskussion
Das Insulin-degradierende Enzym (IDE) aus Tieren ist einer Metallo-Endopeptidase,
die in vitro mehrere nicht-miteinander verwandte Peptide spaltet, und in vivo an der
Proteolyse von Insulin beteiligt ist. Obwohl das Hormon Insulin nicht in Pflanzen vor-
kommt, besitzen Pflanzen homologe Sequenzen des IDE-Gens. In vitro konnte bereits
auch gezeigt werden, dass das IDE der Tomatenpflanze Systemin degradiert Huet
(ETH-Diss. 15732). Systemin wirkt in Tomatenpflanzen als Signalpeptid, das den
Oktadekanoidweg auslöst und so die Produktion von Abwehrproteine induziert. Ob
IDE auch hiermit in planta im Zusammenhang steht wurde anhand von Verwundungs-
Experimenten und in Bioassays mit Hilfe des herbivoren Insekts Manduca sexta unter-
sucht. Hierfür standen bereits 9 Kanamycin-resistente Linien zur Verfügung, deren
IDE-Defizienz durch RNAi-Technik erzeugt wurde, und bei denen die Effektivität des
Silencings und die Unabhängigkeit der Linien noch durch Western- und Southern-
Analyse überprüft werden musste.
Über den Nachweis des IDE-Protein durch Western-Analyse konnten mehrere IDE-
defiziente Linien identifiziert werden. Auffällig war hier die Linie InsHP3. Diese zeigte
nicht bei allen Proben der Einzelpflanzen ein einheitliches Vorhandensein der IDE-
Banden. Dies könnte zum einem bedeuten, das lediglich ein hairpin-Konstrukt bei der
Agrobakterien-Transformation insertiert wurde und das heterozygot vorliegenden Kon-
strukt bereits segregiert, und ein Teil der Nachkommen der T1-Generation wieder dem
Wildtyp entspricht. Außerdem könnte hier eventuell auch der Fall vorliegen, dass im
Bezug auf die Aus-prägung des „Siliencing“-Effektes, durch zufällige epigenische
Veränderungen der T-DNA eine heterogene Population der Nachkommen entsteht
(Meza et al. ,2001). Bei den Linien InsHP3 und InsHP7 sind auf der Höhe der 120
kDa-Bande noch sehr schwache und unscharfe Banden zu erkennen, was eventuell
damit im Zusammenhang steht, dass bei dem partiellen Silencing der Effekt nicht
vollständig zum tragen kommt. Ebenso kann es sich hier aber um eine Kreuzreaktion
mit einem anderen Protein handeln, die auf die Verwendung des polyklonalen
Antiserums zurückzuführen ist.
In der Zwischenzeit konnte der „Silencing“-Effekt auch auf der Transkript-Ebene, an-
hand des Northern Blots für das „Manduca-Experiment 4“ (s. 3.2.2) durch erneute Hy-
4 Diskussion
55
bridisierung mit einer IDE-Sonde bestätigt werden. Es wurden nur beim Wildtyp das
IDE-Transkript detektiert, nicht aber in der, für Versuche verwendeten Linie InsHP7.
Durch die Southern-Analyse, unter Verwendung der nptII-Sonde, konnten zwei Grup-
pen von unabhängigen Linien gebildet werden. Die eine beinhaltet die Linien InsHP2,
InsHP3, InsHP6 und InsHP7, die andere die beiden Linien InsHP9 und InsHP11.
Beide Linien weisen ein komplexes Bandenmuster auf, was wahrscheinlich auf
mehrere insertierte T-DNA-Konstrukte zurückzuführen ist.
Die nachfolgende Hybridisierung mit einer Sonde für das IDE-Gen könnte auf das Vor-
handensein eines zweiten Gens für IDE in Tomaten hin, wie dies auch bei Arabidop-
sis thaliana der Fall ist. Allerdings enthält das Arabidopsis-Genom auch ein IDE-ähn-
liche Sequenz, die aber mehrere Exons, einschließlich der katalytischen Domäne, am
5´-Terminus nicht aufweist. Würde auch das Tomaten-Genom ein IDE-ähnliches Gen
aufweisen, so könnte die hier verwendete IDE-Sonde, spezifisch für die 3´-terminale
Sequenz, sowohl diese oder auch ein eventuell vorhandenes 2. IDE-Gen nachweisen.
Die Detektion des für die Transformation verwendeten „hairpin“-Konstruktes kann hin-
gegen ausgeschlossen werden, da dieses die 5´-terminale Sequenz für die kata-
lytische Domäne enthält.
Die zur Überprüfung der Arbeitshypothese durchgeführten Verwundungs-Experimente
zeigten die IDE-defizienten Pflanzen keine oder nur sehr geringfügige Unterschiede in
der Expression des Proteinaseinhibitors II im Vergleich zur Wildtyp-Kontrollgruppe.
Die Reaktion der Pflanzen auf Verwundung ist nicht die selbe nach Insektenfraß. So
kann zum Beispiel bei Tabakpflanzen die Gehalte des Proteinaseinhibitors nach Insek-
tenfraß im Vergleich zu mechanischer Verwundung deutlich erhöht sein , (Lou und
Baldwin, 2003) und bei Kartoffelpflanzen wird das Maximum der Proteinaseinhibitor-
Gehalte nach Fraß von Manduca sexta bereits nach 12 Stunden erreicht (Korth und
Dixon,1997), im Gegensatz zum Maximum nach 24 Stunden bei mechanischer Ver-
wundung. Deshalb wurde auch hier ein „Fress“-Versuche mit Manduca sexta durch-
geführt, der ebenso wie die durchgeführten Verwundungseperimente, keine Unter-
schiede zwischen den Reaktion der IDE-defizienten Pflanzen und der des Wildtyp
zeigen konnte.
Durch diese Ergebnisse konnte die Arbeitshypothese, dass IDE durch den Abbau des
Signalpeptide Systemin zu einer Beendigung der Induktion des Oktadakanoidweges
4 Diskussion
56
verantwortlich ist, nicht bestätigt werden. Wäre allerdings IDE nicht die einzigste Prote-
ase, die Systemin degradiert, so könnte der Ausfall nur eines abbauenden Enzyms
durch die anderen beteiligten Proteasen wieder aufgehoben werden, und eine Änder-
ung der Proteinaseinhibitor-Expression wäre unter diesen Bedingungen nicht zu be-
obachten. So zeigt auch die Subtilase SBT3 aus Tomaten, deren Spaltungsmuster von
Systemin mit der Maldi-TOF-Massenspektrometrie untersucht wurde, eine Schnittstel-
len in Systemin (Huttenlocher, unveröffentlicht). SBT3 konnte im Gegensatz zu IDE
auch bereits im Apoplasten nachgewiesen werden.
Da der Nachweis eines in den Apoplast sezernierten IDEs in Pflanzen noch aussteht,
könnte IDE auch intrazellulär Systemin degradieren. Dieser Mechanismus ist von Pep-
tid- und Proteinhormonen bekannt. So wird zum Beispiel Insulin sowohl extrazellulär
direkt am Rezeptor als auch intrazellulär nach Endocytose des Insulinrezeptors, ein-
schließlich des daran gebundenem Insulin abgebaut. Wobei der Abbau durch IDE
hauptsächlich in Endosomen stattfindet (Duckworth und andere, 1998). Eine eben-
solche Funktion, des intrazellulären Systemin-Degradation von Systemin durch IDE,
wäre mit den Ergebnissen der PI-II-Transkript-Analysen nach Verwundung oder Insek-
tenfraß, sowie auch mit den in vitro Degradierungs-Versuchen von IDE und Systemin
vereinbar.
Obwohl die Versuche mit Manduca sexta im Hinblick auf die Induktion des Oktadeka-
noidweges nicht die erwarteten Ergebnisse liefern konnte, ergaben sich doch durch
die Bioessays interessante Hinweise auf mögliche biologische Prozesse, an denen
LeIDE mitbeteiligt sein könnte.
Die auffällige Verzögerung der Verpuppung von Larven die auf IDE-defizienten Pflan-
zen gefressen hatten, kann aufgrund der oben erwähnten Ergebnisse nicht auf einen
erhöhten Proteinaseinhibitor-Gehalt nicht auf zurückgeführt werden.
Bei holometabolen Insekten wird die Verpuppung durch das Zusammenspiel von
Ecdyson, ein Steroidhormon, und dem Juvenilhormon, das eine isoprenoide Struktur
aufweist gesteuert. Während der Ecdyson-Titer während jedem Larvenstadium an-
steigt, findet eine Verpuppung nur dann statt, wenn der Juvenilhormon-Titer, nachdem
die Larven ein kritisches Gewicht erreicht haben, unter eine bestimmte Schwellen-
grenze absinkt (Nijhout und Williams, 1974). Da die äußeren Bedingungen, wie Tem-
peratur oder Länge der Photoperiode, die auch den Hormonhaushalt der Insekten be-
einflussen können, für alle Versuchstiere gleich waren, muss der Effekt der verzöger-
4 Diskussion
57
ten Verpuppung doch durch die Nahrungsqualität der Wirtspflanzen bedingt sein.
Durch das Silencing könnte es zu einer veränderten Nährstoff-Zusammensetzung
gekommen sein, was sich negativ auf die Wachstumsrate auswirken kann (Li P und
andere, 2003), oder zu einer Anhäufung eines Stoffwechselproduktes das sich auf die
Nahrungsverwertung oder auf den Hormonhaushalt der Insekten auswirken kann.
Auf die Wachstumsrate von Manduca sexta-Larven wirkt sich aber auch ein geringer
Wassergehalt ihrer Nahrung negativ aus (Martin und Van´t Hof, 1988; Woods und
Harrison, 2001). Für das Wachstum der Insekten-Larven ist eine positive Bilanz von
ausgeschiedenem und, fast ausschließlich über die Nahrung, aufgenommenem Was-
ser nötig (Hadley, 1994). Die Menge des ausgeschiedenen Wassers, wird im Darm
durch Entzug von Wasser aus den Exkrement-Pelltets reguliert (Reynolds and
Bellward, 1989), und bei Manduca sexta durch das diuretische Hormon (Mas-DH)
gesteuert (Kataoko und andere, 1989; Audsley und andere, 1993) gesteuert. Wäh-
rend der Durchführung der Versuche mit Manduca sexta im Gewächshaus, wurden
Beobachtungen gemachten, dass die von den auf IDE-defizienten Pflanzen fres-
senden Insekten abgebebenen Ekremente teilweise von deutlich trockenerer Beschaf-
fenheit waren, im Vergleich zu denen von Insekten, die sich von Wildtyp-Pflanzen er-
nährten. Dies könnte eventuell ein Hinweis darauf sein, dass IDE mit an der Regula-
tion des Wasserhaushaltes der Pflanzen beteiligt ist.
Um einen Einblick in die biologische Funktion von LeIDE zu erhalten, wurde nicht nur
die Larvenentwicklung überprüft, sondern auch der gesamte Entwicklungszyklus von
Manduca sexta untersucht. Die Überprüfung von eventuellen Auswirkungen auf die er-
folgreiche Verpuppung, die Geschlechterverteilung, und die Anzahl der abgelegten
Eiern auf Wildtypflanzen führte zu signifikanten Unterschieden zwichen den beiden In-
sektengruppen, die auf Wijldtyp- oder IDE-defizienten Pflanzen gehalten wurden.
Überraschenderweise, zeigten aber weibliche Imagines, die während ihrer kompletten
Larvenzeit von IDE-defizienten Pflanzen gefressen hatten in ihrem Ovipositions-
verhalten eine deutliche Präferenz für Wildtyp-Pflanzen.
Welcher Mechanismus hier zugrunde liegen kann ist unklar. Allerdings ist bekannt,
dass die Larven hinsichtlich der Auswahl ihrer Futterpflanzen eine Art „Prägung“ er-
fahren können. Die Larven von Manduca sexta sind oligophag und auf Arten der Gat-
tung Solanaceae spezialisiert. Frisch geschlüpfte Larven, können sich aber auch von
Pflanzen anderer Gattungen ernähren. Haben die Larven aber einmal von Solana-
ceen-Arten gefressen, werden diese Pflanzenarten in Nahrungs-Auswahlversuchen
4 Diskussion
58
bevorzugt (Jermy und andere, 1967; Schoonhoven, 1967). Diese induzierte Präferenz
geht auch nach mehreren Häutungen der Larven nicht verloren (Jeremy und andere,
1967) und ist auf Indiosid D zurückzuführen, ein Glycosid mit steridorialem Grund-
gerüst, das nur in Solanaceen-Arten vorkommt (del Campo und andere, 2001; del
Campo und Miles 2003). Durch Kontakt mit diesem Stoff findet eine Normierung der
Geschmacks-Rezeptoren statt, die daraufhin verstärkt auf Indiosid D reagieren.
Allerdings vermeiden aber die Imagines eben diese Pflanzen zur Oviposition, auf
denen sie als Larven gefressen hatten.
Bei Manduca sexta gliedert sich der Prozess der Auswahl einer Wirtspflanze zur Ovi-
position in zwei Abschnitte. Zunächst wird aus der Ferne über visuelle und olfak-
torische Reize eine mögliche Wirtspflanze für die Oviposition erkannt und angeflogen.
Nach Kontakt mit der Pflanzenoberfläche wird anhand der Oberflächenstruktur und
des Geschmacks entschieden ob die Pflanze zur Eiablage akzeptiert wird (Schoon-
hoven, 2005).
Das IDE-defizienten Pflanzen für die Oviposition vermieden werden könnte also auf
ein flüchtige organische Verbindungen (VOCs) oder auf Substanzen, die auf der Blatt-
oberfläche vorhanden sind zurückzuführen sein. Substanzen der Blattoberfläche kön-
nen Primärmetabolite, wie Zucker oder Aminosäuren sein, oder Sekundärmetabolite,
die auf weiblichen Insekten eine abstoßende oder anziehende Wirkung zeigen
(Schoonhoven, 2005).
HPL und AOS sind beides Enzyme, die mit an der Synthese von verschiedenen
Substanz-Klassen der VOCs beteiligt. AOS ist ein Enzym des Oktadekanoidweges
und führt zur Synthese von Jasmonaten, zu denen auch die flüchtigen Verbindungen
Methyl-Jasmonsäure oder cis-Jasmon gehören. Ausgehend von der selben Vorstufe
wie AOS, leitet HPL in die Synthese der flüchtigen C6-Aldehyde ein. Eine veränderte
Expression der Gene müsste zu einem veränderten von der Pflanze abgegebenen
Duftprofils führen, und könnte so das Ovipositions-Verhalten der Insekten erklären.
Der Vergleich der Transkriptmengen von HPL und AOS in unverwundeten und ver-
wundeten ide- und Wildtyp-Pflanzen lieferte keinen eindeutigen Unterschied zwischen
den beiden Genotypen. Die unveränderte Expression von HPL in den IDE-defizienten
Pflanzen deutet darauf hin, dass über diesen Weg kurzkettige Aldehyde nicht ver-
stärkt synthetisiert und freigesetzt werden, und somit auch nicht das unterschiedliche
Ovipositionsverhalten der weiblichen Imagines beeinflussen. Allerdings wurde mit HPL
4 Diskussion
59
nur ein mögliches Enzym von vielen untersucht, die für die Synthese von flüchtigen or-
ganischen Verbindungen verantwortlich sind.
Die vergleichbaren Transkriptmengen von AOS bei WT- und ide-Pflanzen, einem En-
zym des Oktadekanoidweges, bestätigen die Ergebnisse der Untersuchung der Ex-
pression des Proteinaseinhibitors, dass IDE nicht an spezifischen Degradation von
Systemin beteiligt ist, und so auch nicht die Syntheserate von Jasmonsäure ver-
ändert.
Die genaue Funktion von LeIDE in planta ist also weiterhin unklar. Ein generelles Bild
von der Auswirkung eines Silencings dieses Gens zu bekommen, könnte eine Micro-
array-Analyse hilfreich sein, die Aufschluss darüber geben würde, in wie weit das
„Silencing“ des IDE-Gens die Regulation anderer Gene beeinflusst. Genauso interes-
sant wie Analyse der differentiellen Genexpression zwischen IDE-defizienten Toma-
tenpflanzen und Wildtyp, wäre hier auch der Vergleich mit Pflanzen die von herbivoren
Insekten befallen sind. Aufgrund von Beobachtungen während der Durchführung der
Versuche mit Manduca sexta, dass IDE-defiziente Pflanzen Probleme mit der Regula-
tion ihres Wasserhaushaltes haben könnten, wäre hier auch die Transkriptom-Analyse
von IDE-defizienten Pflanzen, die unter Trockenstress stehen interessant.
Aufgrund der Ovipositions-Versuche mit Manduca sexta sollte eine Analyse der Zu-
sammensetzung der Substanzen der Blattoberfläche und eine Analyse der flüchtigen
organischen Verbindungen mittels Gas-Chromatographie durchgeführt werden, um
aufzuklären welche Veränderung im Profil der Substanzen zu dem veränderten Ovipo-
sitionsverhalten auf IDE-defizienten Tomatenpflanzen führen. Da die Imagines von
Manduca sexta nacht-aktiv sind und von den Pflanzen während der Licht- oder Dun-
kelphase die flüchtigen volatilen Verbindungen in unterschiedlichen Zusammen-
setzungen abgegeben werden, muss darauf geachtet werden, das die Probennahmen
während der Dunkelphase erfolgt.
Da alle Versuche mit Manduca sexta bis jetzt nur mit einer IDE-defizienten Linie durch-
geführt werden konnten, müssen diese mit einer zweiten, unabhängigen Linie wieder-
holt werden.
Für die Beantwortung der Fragestellung welche Aufgabe IDE in der Pflanze erfüllt,
wäre auch die Analyse von Tomatenpflanzen interessant, die LeIDE überexprimieren.
4 Diskussion
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Auch das Vorhandensein des möglichen 2. IDE Gens könnte nochmals durch Verwen-
dung einer 5´-terminalen Sonde überprüft werden, und dieses dann gegebenenfalls
sequenziert werden. Und für den Fall, dass mehrere verschiedene Proteasen an der
Steuerung des Oktadekanoidweges durch die Inaktivierung von Systemin beteiligt
sind, könnte die Herstellung von z..B einer ide/sbt3-Doppelmutante und deren Charak-
terisierung interessant sein.
5 Literatur
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5 Literatur
Affholter JA, Fried VA, Roth RA. (1988) Human insulin-degrading enzyme shares
structural and functional homologies with E. coli protease III. Science 242: 1415-1418.