Universitt Hohenheim
Institut fr Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen
Prof. Dr. Andreas Schaller
________________________________________________________
Phnotypische und molekulare
Charakterisierung einer Subtilase loss of
function Mutante in Arabidopsis thaliana
___________________________________________________________________________________________________
Diplomarbeit vorgelegt von:
Mathias Knappenberger
Studiengang Biologie
Fakultt Naturwissenschaften
Stuttgart-Hohenheim, im August 2004
Gewidmet meinen Eltern
II
Zusammenfassung
Das Genom von Arabidopsis thaliana weist 56 Gene fr Subtilasen
auf, die einen
eigenen Klan innerhalb der Serinproteasen bilden. Die
molekulare
Charakterisierung einiger pflanzlicher Subtilasen zeigt, das sie
durch gezielte
Proteolyse wichtige Aufgaben bei Differenzierungsprozessen
und
Abwehrreaktionen in der Pflanze bernehmen.
In dieser Arbeit erfolgte eine phnotypische und molekulare
Charakterisierung der
Subtilase At4g21630 loss of function Mutante von Arabidopsis
thaliana.
Mit Hilfe von Reportergenfusionen wurde die Promotoraktivitt von
At4g21630,
ausschlielich in der Postfertilisationsphase der
Embryonalentwicklung, in den
Zellen der Integumente, des Embryos und des Suspensors,
nachgewiesen.
Phntoypisch zeigen at4g21630 Embryonen bis zum Globular-Stadium,
sowie
juvenile und adulte at4g21630 Pflanzen keine sichtbaren
morphologischen
Vernderungen, doch reagieren reife at4g21630 Samen der
T2-Generation
whrend der Keimung insensitiv bzw. sensitiv auf die Anwesenheit
von
exogenem ABA und GA im Vergleich zu wt Samen. Eine Reprimierung
oder
Aktivierung der Promotoraktivitt durch die beiden Phytohormone
im reifen
Samen war nicht feststellbar.
Der beobachtete Effekt auf die Samenkeimung scheint daher
auf
Differenzierungsprozesse, die in der Postfertilisationsphase, im
unreifen Samen
ablaufen zurckzufhren zu sein.
Die Ergebnisse der at4g21630 Samen der T2-Generation konnte mit
frisch
geernteten Samen der T3-Generation nicht wiederholt werden, was
darauf
hindeutet, dass die Nachreife der Samen hier zustzlich noch
einen Effekt ausbt.
III
Inhaltsverzeichnis Seite
Zusammenfassung III
Inhaltsverzeichnis IV
Abkrzungsverzeichnis VIII
Abbildungsverzeichnis X
Diagramme XII
1 Einleitung 1 1.1 Einfhrung 1
1.2 Systematische Einteilung der Subtilasen 2
1.3 Biochemische Eigenschaften von Subtilasen 4
1.4 Proteinaufbau 6
1.5 Funktion von Subtilasen 8
1.6 Zielsetzung der Arbeit 9
2 Material und Methoden 11 2.1 Material 11
2.1.1 Verwendete Organismen 11
2.1.1.1 Pflanzen 11
2.1.1.2 Bakterienstmme 11
2.1.2 Vektoren 11
2.1.3 Oligonukleotide 12
2.1.4 Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien 14
2.1.5 Laborgerte 17
2.1.6 Puffer und Lsungen 18
2.1.6.1 Oberflchensterilisation von Samen 18
2.1.6.2 DNA-Miniprp aus Bakterien 18
IV
2.1.6.3 Gelelektrophorese 18
2.1.6.4 Genomische DNA-Isolierung aus Pflanzen 19
2.1.6.5 RNA-Isolierung 20
2.1.6.5.1 RNA-Isolierung aus Samen 20
2.1.6.5.2 RNA-Isolierung aus Bltenmaterial 20
2.1.6.6 Lsungen fr Dnnschnitte 20
2.1.7 Medien und Sonstiges 21
2.2 Methoden 23
2.2.1 Anzucht der Pflanzen, Behandlung, Ernte 23
2.2.1.1 Anzucht der Pflanzen 23
2.2.1.1.1 Anzucht der Pflanzen im Gewchshaus 23
2.2.1.1.2 Anzucht der Pflanzen auf Agar-Platten 23
2.2.1.3 Keimungsassays 24
2.2.1.4 Genetische Analyse der Segregationspopulation 24
2.2.2 Pflanzentransformation von Arabidopsis thaliana 24
2.2.3 Molekularbiologische Methoden 25
2.2.3.1 Agrobakterien und Escherichia coli 25
2.2.3.1.1 Transformation von Bakterien 25
2.2.3.1.2 Gewinnung von Plasmid-DNA 26
2.2.3.2 DNA-Agarosegelelektrophorese 26
2.2.3.3 Verdau der DNA 27
2.2.3.4 Vektorkonstruktion 28
2.2.3.4.1 Ligation der amplifizierten DNA
Fragmente in den pCR-2.1Topo Vektor 28
2.2.3.4.2 Ligation der DNA-Fragmente in den
Transformationsvektor pGreen0029 28
2.2.3.4.3 Analyse der Ligationsprodukte durch
Restriktionsverdau der Plasmid-DNA 30
2.2.3.5 DNA-Sequenzierung 30
2.2.3.6 Isolierung genomischer DNA aus Pflanzen 30
2.2.3.7 RNA-Isolierung 31
2.2.3.7.1 RNA-Isolierung aus Samen 31
V
2.2.3.7.2 RNA-Isolierung aus Bltenmaterial 32
2.2.3.7.3 RNA-Isolierung mit TRIzolReagent 32
2.2.3.8 Polymerase-Ketten-Reaktion 33
2.2.3.9 Reverse-Transkription 34
2.2.3.10 Histochemischer GUS-Test 34
2.2.3.11 Dnnschnitte 34
2.2.3.12 Samen Frbung 35
2.2.3.12.1 Rutheniumrot Frbung 35
2.2.3.12.2 Vanillin Assay 35
2.2.3.12.3 Tetrazolium Assay 35
3 Resultate 36 3.1 Genomischer Aufbau von At4g21630 36
3.2 Segregationsanalyse 37
3.3 T-DNA-Lokalisation 40
3.4 Transkriptanalyse in den homozygoten T-DNA-Insertionslinien
42
3.5 Phnotypische Analyse 44
3.5.1 Keimungsassay mit ABA 44
3.5.2 Keimungsassay mit GA 48
3.6 Charakterisierung der Samenschale 51
3.7 Expressionsanalyse mit Hilfe der RT-PCR 53
3.7.1 RT-PCR mit RNA aus Samen 53
3.7.2 RT-PCR mit RNA von unterschiedlichen Entwicklungs-
stadien und Geweben 54
3.7.3 Expressionsanalyse von At4g21640 und At4g21650 56
3.8 GUS-GFP-Lokalisation 57
3.8.1 Sequenzierungsergebnisse der Vektorkonstruktion 58
3.8.2 GFP-Lokalisation 59
3.8.3 Identifizierung transformierter Samen 60
3.8.4 GUS-Lokalisation 62
3.8.5 Dnnschnitte GUS gefrbter Schoten und Blten 63
3.9 Morphologie von at4g21630 Embryonen 68
VI
VII
4 Diskussion 70
5 Ausblick 80
6 Literatur 82
7 Zitierte Internetseiten 92
8 Anhang 93
Abkrzungsverzeichnis
Abkrzungsverzeichnis
2,4-D 2,4-Dichlorphenoxyessigsure
C Grad Celsius
ABA Abscisinsure
Abb Abbildung
Amp Ampicillin
bp Basenpaare
cDNA complementary DNA
CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid
CIP alkalische Phosphatase aus Klberdarm
Col Columbia
DEPC Diethylpyrocarbonat
DIC Durchlicht-Differentieller Interferenzkontrast
dNTP Desoxy-Nukleotidtriphosphat
DNA Desoxyribonukleinsure
DNase Desoxyribonuklease
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraessigsure
EGTA Ethylenglykol-bis-(2-aminoethylethyl)-tetra-essigsure
EtOH Ethanol
F Forward
g Erdbeschleunigung
g Gramm
GA Gibberellinsure
GABA -Aminobuttersure
Gent Gentamycin
GFP Green fluorescent Protein
HAF Hours after flowering
IPTG Isopropyl--D-1-thiogalactopyranosid
Kan Kanamycin
kb Kilobasenpaare
VIII
Abkrzungsverzeichnis
IX
Konz. Konzentration
LB Left Border
M molar (mol/Liter)
min Minute(n)
mRNA Messenger-RNA
PCR Polymerase Kettenreaktion
PPT Phosphinothricin
R Reverse
RB Right Border
Rif Rifampicin
RNA Ribnukleinsure
RNase Ribonuklease
RT Raumtemperatur
RT-PCR Reverse Transkription-PCR
s Sekunden
SDS Natriumdodecylsulfat
TAE Tris/Acetat/EDTA
TSS Transcription start site
TTC 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid
Tween20 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat
U Enzymeinheiten
N ber Nacht
verd. verdnnt
Vol. Volumen
wt Wildtyp
X-Gal 5-bromo-4-chloro-Indoxyl--D-galactosid
X-Gluc 5-bromo-4-chloro-3-Indolylglucuronid
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Schematische Darstellung der Klassifizierung von
Serinproteasen
im Klan SB nach der Proteindantenbank MEROPS
Abb. 2: Phylogenetischer Stammbaum der Subtilasen in Arabidopsis
auf
Basis abgeleiteter Aminosuresequenz
Abb. 3: Reaktionsmechanismus einer Serinprotease
Abb. 4: Schematischer Aufbau einer pflanzlichen Subtilase
Abb. 5: Vektor pGreen0029 mit dem Fusionsgen GUS-GFP
Abb. 6: Konstruierter Transformationsvektor pGreen0029 mit
dem
Promotor von At4g21630, Nos-Terminator und dem Fusionsgen
GUS-GFP
Abb. 7: Genomischer Aufbau von At4g21630
Abb. 8: PCR-Analyseergebnis einer segregierenden T2-Population
der Salk
127987-Linie
Abb. 9: PCR-Analyseergebnis einer segregierenden T2-Population
der Sail
410_G07-Linie
Abb. 10: T-DNA-Insertion in der Sail 410_G07-Linie
Abb. 11: T-DNA-Insertion in der Salk 127987-Linie
Abb. 12: Anordnung der Primer fr RT-PCR
Abb. 13: Analyse der Expression von At4g21630 in den homozygoten
T-
DNA-Insertionslinien
Abb. 14: Frbung der Samen mit Rutheniumrot
Abb. 15: RT-PCR-Analyse mit RNA aus Samen der T2-Generation der
Sail
410_G07-Linie
Abb. 16: RT-PCR-Analyse der Expression von At4g21630 in
unterschiedlichen Entwicklungsstadien und in
unterschiedlichen
Geweben
Abb. 17: Expressionsanalyse von At4g21640
Abb. 18: Expressionsanalyse von At4g21650
Abb. 19: Sequenz des klonierten Nos-Terminators
X
Abbildungsverzeichnis
XI
Abb. 20: Promotorsequenz von At4g21630
Abb. 21: GFP-Lokalisation in Samen der T0-Generation
Abb. 22: Nachweis der T-DNA mit dem Promotor At4g21630 in
den
transformierten Pflanzen der T1-Generation
Abb. 23: GUS-Lokalisation
Abb. 24: GUS-Lokalisation in der Schote
Abb. 25: GUS-Lokalisation im Embryo
Abb. 26: GUS-Lokalisation im Embryo
Abb. 27: GUS gefrbte Schote
Abb. 28: Dnnschnitt durch die Samenanlagen von loss of
function
Pflanzen der Sail 410_G07 Linie
Abb. 29: Aufbau der Integumente im reifen Embryosack
Diagramme
Diagramme
Diagramm I: Vergleich Keimungsraten zwischen wt Samen und
at4g21630
Samen der T2-Generation der Sail 410_G07-Linie auf MS-Medium
mit 5M ABA.
Diagramm II: Vergleich Keimungsraten zwischen wt Samen und
at4g21630
Samen der T2-Generation der Sail 410_G07-Linie auf MS-Medium
mit verschiedenen Konzentrationen von ABA.
Diagramm III: Vergleich Keimungsraten zwischen wt Samen und
at4g21630
Samen der T2-Generation der Sail 410_G07-Linie auf MS-
Medium ohne Zustze.
Diagramm IV: Vergleich Keimungsraten zwischen wt Samen und
at4g21630
Samen der T2-Generation der Sail 410_G07-Linie auf MS-
Medium mit 1M GA.
Diagramm V: Vergleich Keimungsraten zwischen wt Samen und
at4g21630
Samen der T2-Generation der Sail 410_G07-Linie auf MS-
Medium mit verschiedenen Konzentrationen GA.
Diagramm VI: Vergleich Keimungsraten zwischen wt Samen und
at4g21630
Samen der T3-Generation der Sail 410_G07-Linie auf MS
Medium mit 4M ABA.
Diagramm VI: Vergleich Keimungsraten zwischen wt Samen und
at4g21630
Samen der T3-Generation der Sail 410_G07-Linie auf MS-
Medium mit 1M GA.
XII
1. Einleitung Seite 1
1 Einleitung
1.1 Einfhrung
Die Proteolyse von Proteinen durch Endo- und Exoproteasen ist
ein vielseitiger Mechanismus
der Zelle, der in gezielter Weise zur nderung von Struktur,
Aktivitt, Funktion und
subzellulrer Verteilung von Proteinen eingesetzt wird. Anhand
des Katalysemechanismus
differenziert man Serin-, Cystein-, Threonin-, Metall-, und
Aspartatproteasen.
Regulatorisch bedeutsam ist vor allem die Reifung von Proteinen
und der gezielte
Proteinabbau.
Proteine, die durch Endocytose in die Zelle gelangen, werden im
Lysosom abgebaut. Der
lysosomale Abbauweg ist berwiegend unspezifisch, whrend die
nicht-lysosomalen
Abbauwege den selektiven Abbau von Proteinen erlauben. Der am
besten charakterisierte
nicht-lysosomale Abbauweg ist der Ubiquitin-Proteasom-Weg, in
dem Proteine in einem 26S
Proteasom abgebaut werden, nachdem sie mit mehreren Moleklen
Ubiquitin konjugiert
wurden.
Viele Proteine werden als inaktive Vorstufen gebildet und durch
proteolytische Spaltung in
die aktive Form berfhrt. Beispiele dafr sind die Aktivierung von
Verdauungsenzymen und
von Zymogenen der Blutgerinnungskaskade bei Sugern.
In Pflanzen wird das Polypeptid Systemin wahrscheinlich durch
das 50-kDa SBP50 Protein
gespalten. SBP50 wird durch Antiserum, das gegen
Proproteinkonvertasen (PCs) von
Drosophila gerichtet ist, inhibiert. Diese Daten fhrten zu der
Annahme, dass SBP50, wie die
tierischen Proproteinkonvertasen, eine Subtilisin-hnliche
Serinprotease ist (Schaller et al.,
1994).
Durch diese Entdeckung, dem Vorkommen von insgesamt 628
Proteasen in Arabidopsis
thaliana und die wenigen Kenntisse ber ihre Funktionen, wurde
das Interesse des Institutes
fr Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen an der Universitt
Hohenheim fr die
pflanzlichen Subtilasen und ihre Substrate geweckt.
1. Einleitung Seite 2
1.2 Systematische Einteilung der Subtilasen
Subtilasen sind Serinproteasen, die sowohl in Pro- als auch in
Eukaryonten vorkommen. Der
Prototyp der Subtilasen ist Subtilisin Carlsberg, die erste
Subtilase von der die Struktur und
Sequenz bekannt war, aus Bacillus licheniformis. Gem der
MEROPS-Klassifikation
(http://merops.sanger.ac.uk/) gehren die Subtilasen zum SB-Klan,
der wiederum in Familien
und Subfamilien unterteilt wird (Abb.1).
S8-Familie S53-Familie
S8A-Subfamilie S8C-SubfamilieS8B-Subfamilie
Pflanzliche Subtilasen
S1P, SK-1 und NARC-1
SB-Klan
Kexin und PCs
Abb. 1: Schematische Darstellung der Klassifizierung von von
Serinproteasen im Kla SB nach der Proteindatenbank MEROPS
(http://merops.sanger.ac.uk/)
Im Jahre 1988 konnte die erste eukaryontische Subtilase, die
Kex2p-Protease von
Saccharomyces cerevisiae identifiziert werden (Fuller et al.,
1988). Sie wird zusammen mit
Furin und sechs weiteren Proproteinkonvertasen (PCs) von Sugern
zur S8B-Subfamilie
(Seidah, 2003) zugeordnet. Pflanzliche Subtilasen werden zur
Pyrolysin-Gruppe innerhalb der
S8A-Familie zugeordnet (Siezen and Leunissen, 1996). Mitglieder
der Familie der Pyrolysine
sind im Vergleich zu Kexin und den PCs nher mit dem
prokaryontischen Subtilisin
verwandt. Prokaryontische Subtilasen sind fr die Degradation von
Proteine verantwortlich,
whrend Kexin und PCs als Prohormonkonvertasen fungieren. Die
Entdeckung des
Subtilisin/Kexin-Isozym 1 (SKI-1) (Seidah et al., 1999) und die
Site-1-Protease (S1P)
(Sakai et al., 1998) in Sugern, die ebenfalls zur Gruppe der
Pyrolysine zugeordnet werden,
bewies aber, dass auch Mitglieder der Gruppe der Pyrolysine als
Proproteinkonvertasen
fungieren knnen.
SKI-1 spaltet das Protein pBDNF (pro-brain-derived neurotophic
factor) (Seidah et al., 1999)
und S1P kontrolliert durch die Spaltung der Vorstufe von nSREBP
(nuclear sterol regulatory
element binding protein) vermutlich den Lipidmetabolismus in
tierischen Zellen (Sakai et al.,
http://merops.sanger.ac.uk/
1. Einleitung Seite 3
1998). Im Jahre 1995 konnte durch berexpression der
Proteinvorstufe von KP6, ein
Pilztoxin von Ustilago maydis, in Tabakzellen demonstriert
werden, dass in pflanzlichen
Systemen Kex2p-hnliche Proteine vorkommen und in der Lage sind
wie tierische
Prohormonkonvertasen zu fungieren. Die Vorstufe des KP6-Toxin
wird in U. maydis durch
Kex2p zum reifen Protein prozessiert (Kinal et al., 1995).
Tabakzellen sind ebenso in Lage,
das reife Protein zu bilden und mssen deshalb Kex2p hnliche
Proteine besitzen. Weitere
Forschungen zeigten, dass die Vorstufe von KP6 durch eine Kex2p
verwandte Protease im
Golgi-Apparat von Tabakzellen zum reifen Protein prozessiert
wird (Jiang and Rogers, 1999).
Das Genom von Arabidopsis thaliana weist die Sequenz von 56
Subtilasen auf, die von den
Arbeitsgruppen um Prof. Dr. Schaller und Prof. Dr. Altmann in
sechs Subfamilien eingeteilt
wird
(http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcawp/psdb.html).
Abb. 2: Phylogenetischer Stammbaum der Subtilasen in Arabidopsis
auf Basis abgeleiteter Aminosure-sequenzen (Rautengarten et al.,
eingereicht). In der Tomate konnten bisher 15 Subtilasen
identifizert werden (Jorda et al., 1999; Jorda and
Vera, 1999), die in fnf Subfamilien gegliedert sind (Meichtry et
al., 1999).
http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcawp/psdb.html
1. Einleitung Seite 4
1.3 Biochemische Eigenschaften von Subtilasen
Das charakteristische Merkmal der Serinproteasen ist das
Vorkommen einer katalytischen
Triade aus rumlich benachbarten Seitenketten der Aminosuren
Asparaginsure, Histidin
und Serin.
Die Substratspezifitt wird durch die Eigenschaften spezifischer
Aminosure begrenzt, die
sich auf den Seitenketten befinden, die das aktive Zentrum
umgeben.
Der Reaktionsmechanismus einer Serinprotease (Abb. 3) ist ein
Wechselspiel zwischen der
Hydroxylgruppe des Serylrestes 195 (Chymotrypsin Nummerierung)
mit dem benachbarten
Histidin 57. Dadurch wird die Hydroxylgruppe polarisiert und
wird dadurch befhigt, die
Carbonylgruppe des Subtrates an der Spaltstelle des Peptids
nucleophil anzugreifen. Das
entstehende Oxanion wird durch zwei NH-Gruppen des
Peptidrckgrates stabilisiert. In der
nchsten Teilreaktion zerfllt das tetraedrische Zwischenprodukt
unter Deprotonierung des N3
des Histidins 63 in das Acyl-Enzym-Zwischenprodukt. Der neue
N-Terminus des
Spaltstckes lst sich vom Enzym ab. An seine Stelle tritt Wasser
aus dem Lsungsmittel,
welches in der nchsten Reaktion die Esterbindung zwischen Serin
195 und dem neuen C-
Terminus spaltet (Lffler und Petrides, 2003).
1. Einleitung Seite 5
Abb. 3: Reaktionsmechanismus einer Serinpeptidase von
http://delphi.phys.univ-tours.fr/Prolysis/Images/mecaser.gif
In Subtilasen und im (Chymo)trypsin-Klan der Serinproteasen
findet man unabhngig
voneinander ein aktives Zentrum gleicher Struktur, obwohl die
Faltung der gesamten
Molekle vllig andersartig ist. Die Subtilasen und
(Chymo)trypsine, eine weitere
Serinproteasefamilie, sind damit ein Beispiel fr konvergente
Evolution (Dickerson und
Greis, 1971).
Charakteristisch fr pflanzliche Subtilasen ist ein
Temperaturoptimum von ber 50C
(Yahmagata et al., 1994; Fontanini et al., 2002; Hamilton et
al., 2004), Calcium-Abhngigkeit
(Tornero et al., 1996; Hamilton et al., 2003) und ein ungefhres
Molekulargewicht von 70
kDA (Yamagata et al., 1994; Rudenskaya et al., 1998; Janzik et
al., 1999; Fontanini et al.,
2002; Hamilton et al., 2004). Das pH-Optimum der meisten bisher
charakterisierten
http://delphi.phys.univ-tours.fr/Prolysis/Images/mecaser.gifhttp://delphi.phys.univ-tours.fr/Prolysis/Images/mecaser.gif
1. Einleitung Seite 6
Subtilasen liegt im alkalischen Bereich (Yamagata et al., 1994;
Rudenskaya et al., 1998;
Bogacheva et al., 1999), was auf eine Lokalisation der
Subtilasen im Zellinneren hinweist.
Nur wenige der bisher biochemisch untersuchten Subtilasen weisen
ein Optimum der
proteolytischen Aktivitt bei pH 5,0 oder niedriger auf (Janzik
et al., 2000; Hamilton et al.,
2003). Dieser niedrige pH-Wert ist ein Indiz fr die Lokalisation
der Subtilasen im Apoplast
der Pflanzenzelle, da hier ein niedriger pH-Wert vorliegt.
Kexin und die Pro-Proteinkonvertasen der Subfamilie S8B aus
Sugern spalten Proteine, die
ein Erkennungsmotiv (R/K)-(X)n-(K/R) aufweisen, wobei n fr 0, 2,
4, oder 6 und X fr jede
andere Aminosure auer Cys steht (Nakayama et al., 1997).
Pflanzliche Subtilasen zeigen hingegen kein spezielles
Erkennungsmotiv. So spaltet die
pflanzliche Subtilase Cucumisin (Kaneda et al., 1975), die
Insulin-B-Kette in vitro an acht,
die Subtilase Taraxalisin (Rudenskaya et al., 1998) sogar an
neun verschiedenen Positionen.
Diese Daten deuten darauf hin, dass diese Subtilasen nur
degenerative Fuktionen erfllen. Die
beiden Pyrolysin-Mitglieder S1P und SKI-1 in Sugern zeigen eine
Spezifitt, die sich von
den Mitgliedern der Subfamilie S8B deutlich unterscheidet. Diese
Proteasen spalten C-
terminal von Leu-, Thr- oder Asp-Resten (Seidah et al., 1998;
Tour et al., 2000).
LeSBT1 spaltet Substrate, die entweder Gln oder Leu in der
P1-Positon (Nomenklatur nach
Schechter und Berger, 1967) aufweisen (Janzik et al., 1999).
Ara12, eine Subtilase von A.
thaliana, bevorzugt die hydrophoben Aminosuren Phe und Ala und
die saure Aminosure
Asp an der P1-Position, whrend an der P1-Position keine
spezifische Aminosure erkannt
wird (Hamilton et al., 2003).
Die Substraterkennung von LeSBT1 wird vermutlich nicht allein
durch die Aminosure an P1-
Position definiert, sondern noch von anderen Aminosuren, die die
Spaltstelle umgeben
(Janzik et al., 1999).
1.4 Proteinaufbau
Subtilasen bestehen aus vier funktionellen Domnen, Pr-, Pro,
katalytische- und PA-
Domne.
Abb. 4: Schematischer Aufbau einer pflanzlichen Subtilase.
Signalpetid Prodomne
Katalytische Domne PA-Domme
1. Einleitung Seite 7
Subtilasen werden als Prproproteine synthetisiert und durch
Proteolyse der Pr- und
Prodomne zur aktiven Protease prozessiert (Beers et al., 2004).
Die N-terminale Prdomne
stellt ein Signalpeptid dar, welches fr die Sekretion aus der
Zelle via dem
endoplasmatischen Retikulum ntig ist. Die berwiegende Anzahl der
untersuchten
Subtilasen in Pro- und Eukaryonten sind extrazellulr
lokalisiert, nur wenige Subtilasen
konnten intrazellulr detektiert werden (Siezen and Leunissen,
1996), was bedeutet, dass die
Substrate von Subtilasen ebenso im extrazellulren Raum
lokalisiert sein mssen.
Durch die nachfolgende Prodomne werden die Zymogene im inaktivem
Zustand gehalten
und erst durch die Abspaltung der Prodomne wird die katalytische
Domne aktiviert
(Yamagata et al., 1994). Die Prodomne der Proproteinkonvertasen
von Sugern wird durch
eine intra-molekulare Reaktion gespalten und bleibt als
kompetetiver Inhibitor nicht-kovalent
mit dem Enzym verbunden. Durch eine zweite Spaltung wird die
Prodomne degradiert und
das aktive Enzym freigesetzt (Fugre et al., 2002).
Mglicherweise fungiert die Prodomne darber hinaus als
intramolekulares Chaperon fr die
katalytische Domne, wie es fr Subtilisin E und anderen
prokaryontischen Subtilasen gezeigt
werden konnte (Shinde et al., 1992).
Die PA-Domne, die eine selbststndige Domne innerhalb der
katalytischen Domne
darstellt, findet man bisher nur bei Mitgliedern der
pflanzlichen Subtilasen. Sie besteht aus ca.
120 Aminosuren (Luo et al., 2001). Die Proproteinkonvertasen von
Sugern weisen keine
PA-Domne auf, sondern besitzen nach der katalytischen Domne eine
P-Domne. Deren
Kristallstruktur lsst vermuten, dass sie whrend der
Prozessierung des Proteins mit der
Prodomne interagiert (Brenner et al., 2003).
Als einzige Subtilase von A. thaliana besitzt At5g19660 keine
PA-Domne, sondern enthlt
eine C-Terminale Transmembrandomne. Die Sequenz von At5g19660
zeigt eine nahe
Verwandtschaft zu S1P/SKI-1 von Sugern und nur eine entfernte
bereinstimung mit allen
anderen Subtilasen von A. thaliana (Abb. 2).
Homologe PA-Domnen findet man auch bei funktionell nicht
verwandten Proteinen wie
Metallproteinasen, Transferrinrezeptoren TR1 und TR2 von Sugern
und auch bei
pflanzlichen Transmembranproteinen (Luo et al., 2001). Die
Funktion der PA-Domne ist
noch nicht vollstndig geklrt, sie knnte eine Rolle bei
Protein-Protein-Interaktionen oder
bei der Substratselektion spielen (Mahon et al., 2000, Lawrence
et al., 1999).
1. Einleitung Seite 8
1.5 Funktion von Subtilasen
ber die Funktion, Expression und subzellulre Lokalisation der
PCs in Sugern gibt es
bedeutend mehr Informationen als ber pflanzliche Subtilasen.
Substrate fr PCs sind
verschiedene Prohormone, Rezeptoren, Wachstumsfaktoren und
virale Glykoproteine. Furin,
PC5-B und PC7 konnten im trans-Golgi-Netzwerk lokalisiert
werden, whrend PC1, PC2 und
PC5-A in den skretorischen Granula von Zellen detektierbar sind
(Seidah and Chrtien,
1997).
In den letzten Jahren wurden zahlreiche Subtilasen von Pflanzen
isoliert, u.a. von Avena
sativa (Coffeen et al., 2004), Arabidopsis thaliana (Tanaka et
al., 2001), Hordeum vulgare
(Fontanini et al., 2002), Lycopersicon esculentum (Meichtry et
al., 1998), Taraxacum
officinale (Bogacheva et al., 1999), Lilie (Taylor et al., 1997)
und der Sojabohne (Batchelor et
al., 2000). Die bisherigen Kenntnisse ber die Funktion von
pflanzlichen Subtilasen weisen
daraufhin, dass sie wichtige Aufgaben und Funktionen whrend der
Differenzierung von
Pflanzenzellen und der Pathogenabwehr bernehmen.
In Tomaten werden Mitglieder der Subtilasefamilie P69 durch
Pflanzenpathogene induziert
(Tornero et al., 1996), die mRNA-Expression der Mitglieder P69B
und P69C werden bei
Infektionen mit P. syringae verstrkt (Jord et al., 2000).
Die Expression von pflanzlichen Subtilasen kann zell- und
entwicklungsspezifsch sein. So
konnte SCS1, eine Subtilase aus der Sojabohne, nur in der
Samenschale detektiert werden
(Batchelor et al., 2000). Die Expression fr LIM9, eine
extrazellulre Protease aus Lilium
longiflorum, ist am hchsten, wenn das Tetradenstadium bei der
Mikrosporogenese erreicht
ist (Tylor et al., 1997) und die mRNA von ag12 wird nur in einem
frhen Stadium der
Knllchenbildung bei Alnus glutinosa gebildet (Ribeiro et al.,
1995).
In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana konnte die
zellspezifische Expression einiger
Subtilasen gezeigt und nachgewiesen werden, dass die Expression
der Subtilasen At2g19170,
At4g34980 und At5g67360 gewebe- und entwicklungsspezifisch,
durch Stressfaktoren
induziert wird (Golldack et al., 2002).
Die Morphologie der Stomataverteilung und Stomatadichte der
sdd1-1 (stomatal density and
distribution) Mutante wird durch die Subtilase SDD1 (At1g04110)
verursacht. SDD1 reguliert
die Anzahl der protodermalen Zellen, die Anzahl der
asymmetrischen Teilungen der
Satellitenmeristemoide, die Bildung von Satellitenmeristemoiden
und die Orientierung der
ersten asymmetrischen Teilung der Nebenzellen (Berger and
Altmann, 2000).
1. Einleitung Seite 9
ALE1 (abnormal leaf shape1; At1g6230) eine weitere Subtilase von
A. thaliana wird bentigt
fr die Differenzierung der Epidermis und fr die Ausbildung der
Kutikula im entwickelten
Embryo. Loss of function Pflanzen zeigen eine gestrte
Morphologie der Epidermiszellen.
Eine durchgehende Ausbildung der Kutikula im entwickelten Embryo
und in den Samen fehlt.
Diese morphologischen Strungen fhren zu einem extensiven
Wasserverlust in juvenilen
Pflanzen (Tanaka et al., 2001).
Mit Hilfe eines Promotor-GUS-Konstruktes konnte gezeigt werden,
dass die mRNA der
Subtilase AIR3 (At2g04160) in Zellen exprimiert wird, die an der
Bildung von Seitenwurzeln
beteiligt sind (Neuteboom et al., 1998).
ber die endogenen Substrate, die von pflanzlichen Subtilasen
prozessiert werden, ist sehr
wenig bekannt, obwohl in vitro gezeigt werden konnte, dass
Pflanzen unspezifische
Substanzen, wie Glucagon oder synthetische Peptide hydrolysieren
(Janzik et al., 1999;
Hamilton et al., 2003).
Man vermutet, dass SDD1 und ALE1 von den Zellen in den Apoplast
sekretiert werden und
dort Signalmolekle durch proteolytische Spaltung aktivieren, die
als Signal fr die
Differenzierung der Zellen bentigt werden. Die extrazellulre
aber membran-assoziierte
Lokalisation von SDD1 ist im Einklang mit einer solchen Funktion
(von Groll et al., 2002).
In Vertebraten sind verschiedene Peptide BMB4, BMP2 und BMP7 an
der Epidermisbildung
beteiligt. In Xenopus Embryos wird BMP4 durch proteolytische
Spaltung von
Proproteinconvertasen aktiviert (Tanaka et al., 2001). Bisher
konnte aber in Arabidopsis
thaliana noch kein Substrat fr eine Subtilase identifiziert
werden.
In Avena sativa wird die Proteolyse-Kaskade des Enzyms
Ribulose-1,5-bisphosphat
Carboxylase/Oxygenase durch Serinproteasen katalysiert, die
ebenfalls zur pflanzlichen
Subtilasefamilie gehren (Coffeen et al., 2004).
1.6 Zielsetzung der Arbeit
Die bisherigen Befunde deuten darauf hin, dass Subtilasen
wichtige Funktionen bei
Abwehrreaktionen und Differenzierungsprozessen in Pflanzen
besitzen. Um weitere
Informationen, auch im Rahmen des Arabidopsis thaliana
Functional Genomics Project, ber
Subtilasen zu erhalten, beschftigen sich verschiedene
Arbeitsgruppen intensiv mit der
Funktion und Substratidentifizierung von Subtilasen.
Im Rahmen dieser Arbeit soll die molekulare Charakterisierung
der Subtilase At4g21630
erfolgen.
2. Material und Methoden Seite 10
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Verwendete Organismen
2.1.1.1 Pflanzen
Wildtyp-Samen ktoyp Col. von Arabidopsis thaliana stammen von
Chris
Sommerville (Carnegie Institute, Stanford, USA).
Die Salk-T-DNA-Insertions-Linien, Salk 127987 und Salk 036863,
(Alonso et al.,
2003) wurde ber NASC Arabidopsis Stock Center
(www.nasc.nott.ac.uk/)
bezogen. Die Sail-T-DNA-Insertion-Linie, Sail 410_G07, (Sessions
et al., 2002)
wurde von der Firma Syngenta (www.syngenta.com) bezogen.
2.1.1.2 Escherichia coli und Agrobakterium tumefaciens Stmme
Top10 Escherichia coli-Stamm fr Klonierung
F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZlacX74 recA1 araD139
(ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG (Invitrogen One
Shot)
GV3101 Agrobakterium tumefaciens-Stamm fr
Pflanzentransformation
(Hellens et al., 2000)
2.1.2 Vektoren
pSoup Tet-r; trfA; oriV; RepA;ColE1 ori (www.pgreen.ac.uk)
Vektor fr Pflanzentransformation via Agrobakterien.
Ermglicht
pGreen-Replikation mit Hilfe des Repliaktionsproteins RepA
pMP90 Ti plasmid (Hellens et al., 2000)
pGreen Vektor fr Pflanzentransformation via Agrobakterien
http://nasc.nott.ac.uk/http://www.syngenta.com/
2. Material und Methoden Seite 11
Transformiert wurde mit pGreen0029
pGreenII backbone: ColE1 ori; nptl; pSa-Ori
T-DNA: enthlt nos-kan, multiple cloning site (Hellens et
al.,
2000)
In der mutiple cloning site befindet sich zwischen der KpnI-
und
XhoI- Schnittstelle das 2544bp lange Funsionskonstrukt
GUS-GFP
aus pCambia1303 (http://www.cambia.org/main/r_et_camvec.htm).
BglI 1 StuI
pSA-ori GUS-GFP ColEI ori npt
PvuIBspIRBBspHI
nos-KanLB KpnI 1652 XhoISalI 4237ClaI 4247HindIII 4252EcoRV
4260EcoRI 4264
PstI 4274SmaI 4278Bam HI 4282SpeI 4288XbaI 4294NbtI 4301SacI
4322
T-DNA
BglI 1 StuI
pSA-ori GUS-GFP ColEI ori npt
PvuIBspIRBBspHI
nos-KanLB KpnI 1652 XhoISalI 4237ClaI 4247HindIII 4252EcoRV
4260EcoRI 4264
PstI 4274SmaI 4278Bam HI 4282SpeI 4288XbaI 4294NbtI 4301SacI
4322
T-DNA
Abb. 5: Vektor pGreen0029 mit dem Fusionsgen GUS-GFP. Die
Grenzen der T-DNA sind rot gekennzeichnet. Das Selektionsgen
Kanamycin wurde grn untermalt.
2.1 Topo NPT II; Amp; pUC ori; LacZ fragment; f1 origin; M13
forward (-
20) priming site; multiple cloning site; M13 reverse priming
site;T7 promotor/priming site (Invitrogen)
Vektor fr schnelle und effiziente Ligation von PCR-Produkten
mit
T/A berhang.
2.1.3 Oligonukleotide
Im Folgenden sind die in dieser Arbeit verwendeten Primer
aufgefhrt. Die
Angabe (+) oder (-) gibt an, ob die Strang- oder
Gegenstrangsequenz zur
Herstellung des Primer verwendet wurde.
2. Material und Methoden Seite 12
Primer fr die RT-Expression und DNA-Amplifiaktion von
At4g21630,
At4g21640 und At4g21650. Primer Sequenz in 5 3-Orientierung
Templat Hersteller
33-1362 CTGCAAAAGGTCTACTTCATGAA
ACCAAC
At4g21630(+) Qiagen
33-2587R TACGGTATAGAGTTGTATCGAGC
AAGAAG
At4g21630(-) Qiagen
33-452 AGCTTCTATACCACACAGTCACA
CATGCA
At4g21630(+) Qiagen
33-1424 TATCAACGACGCCGATGATAGCT
TCACTG
At4g21630(-) Qiagen
30-308 TGCTGGAGCCTTAGACAGTGATA
GCAAAG
At4g21650(+) Qiagen
30-1176R GTTGGTGTCATGAAGAAGACCTT
TTACAG
At4g21650(-) Qiagen
31-208 CGACAGAATCACACACACTTCTC
ACTGCA
At4g21640(+) Qiagen
31-1226R ATAGCTTCACTGCCCATGCTGGT
GTTATG
At4g21640(-) Qiagen
Primer fr die berprfung der RT-PCR Primer Sequenz in 5
3-Orientierung Templat Hersteller
EF1 817 CCAGTGGGACGTGTTGAGACTGG
TATGA
Elongationsfaktor
(+)
Qiagen
EF1 1202R GGCTCCTTCTCAATCTCCTTACCA
GAAC
Elongationsfaktor
(-)
Qiagen
Primer fr die Klonierung und Sequenzierung des Promotors von
At4g21630. In
Klammern sind die Schnittstellen angegeben, die fr die
Klonierung mit den
Primern ber die PCR-Reaktion eingebracht worden sind. Die
Sequenz fr die
Schnittstelle wurde unterstrichen. Primer Sequenz in 5
3-Orientierung Verwendungszweck Hersteller
1-33R CCGTCGACTGTCTGAAGTGAGAA
GTGTGTGCATGTGTG
Klonierung (SalI) (-) Qiagen
1390-33 CCGAATTCGATGGTGTTCATGAT
GTTACAATCCCTGT
Klonierung (EcoRI)
(+)
Qiagen
2. Material und Methoden Seite 13
P673F CATAATGTGGCGAATCATGTAAT
G
Sequenzierung (+) Qiagen
P411R CCTTTTGTCTCGATTCGGTTTTAG
TAG
Sequenzierung (-) Qiagen
GUS-GFP
37R
GGTTTCTACAGGACGTAAACT Sequenzierung (-) Qiagen
Primer fr die Klonierung und Sequenzierung des Nos-Terminators.
In Klammern
sind die Schnittstellen angegeben, die fr die Klonierung mit den
Primern ber die
PCR-Reaktion eingebracht worden sind. Die Sequenz fr die
Schnittstelle wurde
unterstrichen. Primer Sequenz in 5 3-Orientierung
Verwendungszweck Hersteller
NOSterm-
637R
CCGGTACCGATATCAGCTTGCATG
CCGGT
Klonierung (KpnI) (-) Qiagen
NOSterm-
355
CCGGTACCAGTCAAGCAGATCGTT
CAAAC
Klonierung (KpnI)
(+)
Qiagen
GUS-
GFP2471F
GACCACATGGTCCTTCTTGA Sequenzierung (+) Qiagen
pCambia
2101
CGTGCAGGAGAGGACCATCT Sequenzierung (+) Qiagen
Primer fr die Sequenzierung und Amplifikation der T-DNA
Insertionsstelle Primer Sequenz in 5 3-Orientierung
Verwendungszweck Hersteller
Sail-LB3 TAGCATCTGAATTTCATAACCAAT
CTCGATACAC
Sequenzierung Qiagen
Sail-LB1 GCCTTTTCAGAAATGGATAAATAG
CCTTGCTTCC
Amplifikation Qiagen
SALK-LBa1 TTCACGTAGTGGGCACATCGCCCT
GATAGA
Sequenzierung Qiagen
SALK-LBb1 AAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGC
AACTC
Amplifikation Qiagen
2. Material und Methoden Seite 14
2.1.4 Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien
()Abscisinsure; Sigma, Deisenhofen
1,4 Dithiothreit; Roth, Karlsruhe
2,4-D; Duchefa, Haarlem
2-Mercaptoethanol; Serva, Heidelberg
2Propanol; Roth, Karlsruhe
Advantage 2 Polymerase Mix; Clontech, Palo Alto
Agarose; Life Technologies, Eggenstein
alkalische Phosphatase aus Klberdarm; MBI-Fermentas,
St.Leon-Rot
Ampicillin Natriumsalz; Duchefa, Haarlem
Bacto-Trypton; Difco Laboratories, Detroit
Bromphenolblau; Serva, Heidelberg
Chloroform; Roth, Karlsruhe
CTAB; Roth, Karlsruhe
D(-)-Fructose; Fluka AG, St. Louis
D(-)-Mannit; Roth, Karlsruhe
D(+)-Glucose; Fluka AG, St. Louis
D(+)-Saccharose; Roth, Karlsruhe
Diethylpyrocarbonat; Roth, Karlsruhe
di-Natriumhydrogenphosphat; Merck, Darmstadt
DNase, RNase frei; Stratagene, Cedar Creek
dNTP-Mix; Bioline, London
EDTA; Fluka AG, St. Louis
EGTA; Roth, Karlsruhe
Ethanol; Roth, Karlsruhe
Ethidiumbromid; Roth, Karlsruhe
GA A3; Duchefa, Haarlem GeneRuler1kb DNA Ladder; MBI-Fermentas,
St.Leon-Rot
Gentamycin Sulfat; Duchefa, Haarlem
Glufosinatammonium PESTANAL ; Sigma, Deisenhofen
Glycerin; Roth, Karlsruhe
2. Material und Methoden Seite 15
Glycin; Roth, Karlsruhe
IPTG; Duchefa, Haarlem
Iso-Amylalkohol; Merck, Darmstadt
Kaliumacetat; Roth, Karlsruhe
Kaliumchlorid; Roth, Karlsruhe
Kaliumhexacyanoferrat(II)-Trihydrat; Merck, Darmstadt
Kaliumhexacyanoferrat(III); Serva, Heidelberg
Kanamycin A monosulfat; Duchefa, Haarlem
LB Broth Low Salt; Duchefa, Haarlem
Lithiumchlorid; Merck, Darmstadt
Magnesiumchlorid; Fluka AG, St. Louis
Magnesiumsulfat; Merck, Darmstadt
Methyljasmonsure; Serva, Heidelberg
Murashige & Skoog Medium Basal Salt Mixture; Duchefa,
Haarlem
Murashige & Skoog Medium including Vitamins; Duchefa,
Haarlem
N,N-Dimethylformamid; Roth, Karlsruhe
Natrimhydroxid;
Natriumacetat; Merck, Darmstadt
Natriumchlorid; Merck, Darmstadt
Natriumdihydrogenphosphat; Merck, Darmstadt
Natriumhypochlorid; Roth, Karlsruhe
Natriumlarylsulfat; Roth, Karlsruhe
Pfu Turbo DNA Polymerase; Stratagene, Cedar Creek
Phenol; Roth, Karlsruhe
Plant Agar; Duchefa, Haarlem
Polyoxyethylensorbitanmonolaurat; Roth, Karlsruhe
PPT; Duchefa, Haarlem
Proteinase K; Roth, Karlsruhe
QIAquick Gel Extraction Kit; Qiagen, Hilden
Restriktionsenzyme und Buffer; MBI-Fermentas, St.Leon-Rot
RevertAIDTM M-MuLV Reverse Transcriptase; MBI-Fermentas,
St.Leon-Rot
Ribonuclease A; Roth, Karlsruhe
2. Material und Methoden Seite 16
Rutheniumrot; Waldeck GmbH, Mnster
Sarcosine; ICN, Aurorar
Silwet L-77; Lehle Seeds, Round Rock
T4-DNA Ligase; MBI-Fermentas, St.Leon-Rot
T4-DNA Polymerase; MBI-Fermentas, St.Leon-Rot
Technovit 3040; Heraeus Kulzer GmbH, Wehrheim
Technovit 7100; Heraeus Kulzer GmbH, Wehrheim
Thermostabile Taq-DNA-Polymerase; PEQLAB, Erlangen
TopoXL PCR-Cloning Kit; Life Technologies, Eggenstein
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan; Fluka AG, St. Louis
TRIzolReagent; Life Technologies, Eggenstein
TTC; Fluka AG, St. Louis
Vanillin; Merck, Darmstadt
X-Gal; Duchefa, Haarlem
X-Gluc; Duchefa,Haarlem
Xylene Cyanol; Serva, Heidelberg
Yeast Extract; Difco Laboratories, Detroit
Plastikverbrauchsmaterial wie Pipettenspitzen, Reaktionsgefe und
Petrischalen
wurden von der Firma Sarstedt bezogen.
2.1.5 Laborgerte
Binokulare Zeiss SV11
Hund SM33
Computerprogramme SPOT RT Software v3.5
Digitalkamera Nikon, Coolpix995
Digitalkamera fr Mikroskop und Sport RT, Visitron Systems
Binokular
Elektorporator EQUIBIO, Easyjec T
Mikroskop Zeiss Axioskop 2 plus
Mikrotom Lang
2. Material und Methoden Seite 17
Mikrotommesser Heraeus
UV-Vis Photometer Cary100, Varian
PCR-Maschine MyCyclerTM, BioRad
Rotoren Sorvall HB-4
Sorvall HS-4
Zentrifugen Eppendorf 5402
Sorvall MC 12V
Sorvall RC 5B Plus
2.1.6 Puffer und Lsungen
2.1.6.1 Oberflchensterilisation von Samen
Bleech 2-4 Tropfen Tween20 in 50ml
6% wssriger Natriumhypochlorid-Lsung
2.1.6.2 DNA-Miniprp aus Bakterien
Lsung I 25mM Tris/HCl, pH 7,5
50mM Glucose
10mM EDTA
20min autoklaviert
Lsung II 0,2N NaOH
1% SDS
frisch angesetzt aus 0,4N NaOH und 2% SDS
Lsung III 3M Kaliumacetat
Lagerung bei 4C
Lsung IV 3M Natriumacetat pH 5,2
mit Essigsure auf pH 5,2 eingestellt
TE-Puffer 10mM Tris/HCl
1mM EDTA, pH 8,0
20min autoklaviert
2. Material und Methoden Seite 18
RNase, pankreatisch 10mg/ml in TE
10min 85C zur Inaktivierung von DNasen
Proteinkase K 10mg/ml in Wasser
2.1.6.3 Gelelektrophorese
1 x TAE-Puffer 4,84g Tris HCl
1,14ml Essigsure
2ml 0,5M EDTA pH 8,0
mit H2O auf 1l aufgefllt
20min autoklaviert, danach Zugabe von EtBr 14g/l
10 x DNA-Ladepuffer 50% Glycerin
1mM EDTA
1 Spatelspitze Bromphenolblau
20min autoklaviert
10 x RNA-Ladepuffer 50% Glycerin
1mM EDTA
0,25% Bromphenolblau
0,25% Xylen Cyanol
40min autoklaviert
2.1.6.4 Isolierung genomischer DNA aus Pflanzen
DEX 0,14M Sorbitol
0,22M Tris/HCl, pH 8,0
0,222M EDTA
0,8M NaCl
0,8% CTAB
1% Sarcosine
-Mercaptoethanol wird frisch hinzugegeben, je
20l pro ml DEX
2. Material und Methoden Seite 19
2.1.6.5 RNA-Isolierung
2.1.6.5.1 RNA-Isolierung aus Samen
Extraktionspuffer 8M LiCl
2% -Mercaptoethanol
Lsungspuffer 0,5% SDS
100mM NaCl
25mM EDTA
10mM Tris pH 7,6
40min autoklaviert, danach Zugabe von
2% -Mercaptoethanol
2.1.6.5.2 RNA-Isolierung aus Bltenmaterial
Extraktionspuffer 0,2M Na-tetra-Borat
30mM EGTA
danach pH 9,0 mit HCl einstellen
1% SDS
40min autoklaviert, nach dem Abkhlen 5mM
filtersterilisiertes DTT dazugegeben
Fllung 4M LiCl
10mM EDTA
40min autoklaviert
Waschpuffer 2M LiCl
5mM EDTA
40min autoklaviert
2.1.6.6 Lsungen fr Dnnschnitte
Fixierungslsung FAA 50% vergllter EtOH
5% Eisessig
2. Material und Methoden Seite 20
3,7% Formaldehyd
Infiltrationslsung 100ml Basislsung Technovit + 1g Hrter 1
Polymerisationslsung 15ml (Basislsung Technovit + Hrter 1)
+1ml
Hrter II
2.1.7 Medien und Sonstiges
MS-Medium 2,2g/l MS-Medium
pH 5,7
1% Saccharose
0,8% Agar
nach dem Autoklavieren (20min) und Abkhlen
je nach Bedarf Zugabe von Antibiotika, Herbiziden
oder Phytohormonen
35mg/l PPT
100mg/l Kan
LB-Medium 20g/l LB Broth
pH 7,0
(1,2% Agar fr Platten)
20min autoklaviert
nach Bedarf Antibiotika:
50mg/l Kan
100mg/l Amp
TYNG 10g/l Bacto-Trypton
5g/l Yeast-Extrakt
5g/l Natriumchlorid
0,2g/l Magnesiumsulfat
(1,2% Agar fr Platten)
pH 7,5
nach dem Autoklavieren (20min) und Abkhlen
je nach Bedarf Zugabe von Antibiotika
50mg/l Kan
2. Material und Methoden Seite 21
50mg/l Gent
SOC-Medium 20g/l Fleischextrakt (Bacto-Tryptone)
5g/l Hefeextrakt
10mM NaCl
2,5mM KCl
pH 7,0 eingestellt mit 5N NaOH
20min autoklaviert
10mM MgCl2
20mM Glucose
Kurz vor der Verwendung wurde dem Medium der
Zucker und MgCl2 aus sterilfiltrierten 1M
Stammlsungen zugesetzt.
Infiltrationsmedium MS Salt
5% Saccharose
0,005% Silwet L-77
X-Gluc-Stammlsung 100mM X-Gluc in Dimethylformamid, Lagerung
bei
-20C
X-Gluc-Frbelsung 1mM X-Gluc in 50mM Phosphatpuffer
NaH2PO4/Na2HPO4 pH 7,0
2 mM Kaliumhexacyanoferrat(II)
2 mM Kaliumhexacyanoferrat(II)-Trihydrat
frisch ansetzen
ABA-Stammlsung 4,5mg/ml Methanol, nicht sterilfiltriert,
Lagerung
bei 4C - -20C
GA-Stammlsung 20mg/ml 70% Ethanol, sterilfiltriert, Lagerung
bei
4C - -20C
Kan-Stammlsung 100mg/ml Wasser, sterilfiltriert, Lagerung bei
-20C
Amp-Stammlsung 50mg/ml Wasser, sterilfiltriert, Lagerung bei
-20C
X-Gal-Stammlsung 20mg/ml in Dimethylformamid, Lagerung im
Dunkeln bei -20C
IPTG-Stammlsung 200mg/ml in Wasser, filtersterilisiert, Lagerung
bei
-20C
2. Material und Methoden Seite 22
2.2 Methoden
2.2.1 Anzucht der Pflanzen, Behandlung, Ernte und
genetische Analyse des verwendeten
Pflanzenmaterials
2.2.1.1 Anzucht der Pflanzen
2.2.1.1.1 Anzucht der Pflanzen im Gewchshaus
Samen der jeweiligen Linie wurden in einem Eppendorf-Gef in 0,1%
Agar
suspendiert und fr 48h bei 4C stratifiziert. Danach wurden sie
auf frische Erde
ausgelegt und kamen ins Gewchshaus unter einer Plastikabdeckung,
bis die
Keimlinge vier Bltter hatten. Anschlieend wurde die Abdeckung
entfernt.
2.2.1.1.2 Anzucht der Pflanzen auf Agar-Platten
Samen die auf 0,8% Agar-Platten kamen, wurden zuerst
oberflchensterilisiert.
Zur Sterilisierung von Pflanzensamen wurden je 100-500 Samen mit
200l 70%
EtOH fr 5min behandelt und kurz mit 13.000g zentrifugiert.
Danach gab man
500l 6% Natriumhypochlorid mit wenigen Tropfen Tween20 hinzu und
lie dies
15min lang einwirken. Im Anschluss folgten fnf Waschschritte mit
je 500l
sterilem Wasser. Jeder Waschschritt wurde durch einen kurzen
Zentrifugationsschritt (13.000g) unterbrochen und das Wasser mit
der Pumpe
unter der Sterilbank abgesaugt. Zum Schluss wurden die Samen in
100-300l
steriler 0,1% Agar-Lsung resuspendiert.
Samen auf Agar-Platten kamen in den Kulturraum mit
Wachstumsbedingungen
von 22C und einer Lichtperiode von 16h.
2. Material und Methoden Seite 23
2.2.1.2 Ernte von Pflanzenmaterial fr RNA- bzw.
DNA-Isolierung
Die bentigten Gewebe und Organe wurden von Pflanzen aus dem
Gewchshaus
oder von Pflanzen, die auf Agar-Platten wuchsen, abgeschnitten
in flssigem
Stickstoff eingefroren und bei -80C gelagert.
2.2.1.3 Keimungsassays
Hierfr wurden ca. 100 stratifizierte Samen der T2-Generation der
Sail 410_G07-
Linie, der Salk 127987-Linie und der T3-Generation der Sail
410_G07-Linie auf
MS-Platten ausgelegt, die unterschiedliche Konzentrationen von
ABA bzw. GA
enthielten, und in den Kulturraum gebracht. Die Messung der
Keimungsrate
erfolgte bei ABA jeden Tag, bei GA alle 1-2 Stunden. Samen bei
denen die
Radikula zu sehen war, wurden als gekeimt gezhlt. Fr den
Keimungstest
wurden Samen von jeweils fnf verschiedenen wt Pflanzen vom kotyp
Col. und
Samen von fnf verschiedenen homozygoten At4g21630 Pflanzen der
T2- und T3-
Segregationspopulation der Sail 410_G07-Linie verwendet.
2.2.1.4 Genetische Analyse der Segregationspopulation
Die Samen der T2- und T3-Segregationspopulation wurden auf
Kan-Medium fr
die Salk 127987-Linie oder auf PPT-Medium fr Sail 410_G07-Linie
ausgelegt,
um zu testen ob eine oder mehrere T-DNA-Insertionen im Genom
vorliegen.
Mit Hilfe von Gen- und T-DNA spezifischen Primern wurde
zustzlich berprft,
ob das DNA-Bandenmuster mit dem Keimungstest auf Kan-Medium oder
PPT-
Medium co-segregiert.
2.2.2 Pflanzentransformation von Arabidopsis thaliana
Die Transformation von Arabidopsis thaliana (kotyp Col.) mit
Agrobakterien
erfolgte nach der Methode von Bent et al. (1998).
Pflanzentransformationen
2. Material und Methoden Seite 24
wurden mit Hilfe des Agrobakterium-vermittelten Gentransfers
unter Verwendung
des Agrobakterien-Stammes GV3101 mit dem Helferplasmid pSoup
durchgefhrt.
Fr die Transformation wurden die Agrobakterien in 5ml
TYNG-Medium +
Antibiotika (Kan und Gent) fr zwei Tage bei 28C inkubiert. Von
dieser
Vorkultur wurden 2,5ml entnommen und in 150ml TYNG-Medium +
Antibiotika
(Kan und Gent) N bei 28C bis zu einer OD von eins angezogen.
Die
gewachsenen Agrobakterien wurden abzentrifugiert (450g, 30min)
und in 20ml
Infiltrationsmedium gelst.
Zur Transformation wurden geschlossene sekundre Bltenknospen
verwendet.
Der primre Bltenstand wurde eine Woche vorher abgeschnitten, so
dass sich
sekundre Bltenstnde entwickeln konnten.
Diese wurden in die Agrobakterien-Suspension gegeben,
untergetaucht und fr ca.
20-30s inkubiert. Nach der Transformation wurden die Pflanzen fr
zwei Tage mit
einer Plastikschale bedeckt, um eine hohe Luftfeuchtigkeit zu
erzeugen. Die hohe
Luftfeuchtigkeit erhht die Transformationsrate. Diese Behandlung
wurde nach
sechs Tagen mit den gleichen Pflanzen wiederholt.
2.2.3 Molekularbiologische Methoden
2.2.3.1 Agrobakterien und Escherichia coli
2.2.3.1.1 Transformation von Bakterien
Die bertragung von Plasmid-DNA erfolgte mittels Elektroporation.
Hierzu
wurde ein 40l Aliquot der elektrokompetenten Bakterien auf Eis
aufgetaut und
1l des zu transformierenden Plasmides zugegeben. Diese
Suspension wurde in
eine gekhlte 2mm Elektroporationskvette gegeben und danach wurde
sofort die
Elektorporation mit 15F, 2500V durchgefhrt. Nach der
Elektroporation wurde
1ml SOC-Medium in die Kvette hinzugegeben und die Suspension in
ein 1,5ml
Reaktionsgef berfhrt und fr 60min bei 37C inkubiert. Danach
wurden die
Bakterienzellen auf das jeweilige Selektionsmedium berfhrt.
2. Material und Methoden Seite 25
2.2.3.1.2 Gewinnung von Plasmid-DNA (Mini-Prep)
Die Bakterien wurden in 3ml LB + Antibiotika, N bei 37C
angezogen. 1,5ml
der N Kultur wurden in 1,5ml Reaktionsgefe berfhrt und
abzentrifugiert
(2min, 13.000g). Das Medium wurde verworfen und die Bakterien
mit 100l
Lsung I resuspendiert. Danach wurde 150l Lsung II zugegeben,
vorsichtig
gemischt und fr 5min auf Eis inkubiert. Dann erfolgte die Zugabe
von 150l
Lsung III und es wurden weitere 5min auf Eis inkubiert.
Anschlieend wurde
fr 5min bei 15.800g zentrifugiert und der berstand in ein neues
Reaktionsgef
berfhrt und durch Zugabe von 400l EtOH gefllt. Das Pellet wurde
nach
Zentrifugation (4C, 15min, 15.800g) in 200l TE gelst, 1l
RNase
hinzugegeben und fr 30min bei 37C inkubiert. Danach wurden 4l
10% SDS-
Lsung und 2l Proteinase K zugegeben und ebenfalls fr 30min bei
37C
inkubiert. Danach wurde die Plasmid-DNA mittels Phenol-,
Chloroform (1:1)-
Extraktionen gereinigt und mit 1/10 Vol. Lsung IV und dem
2,5fachem Volumen
an 99% EtOH fr 30min, bei -20C przipitiert. Nach Zentrifugation
(bei 4C,
15min, 15.800g) wurde das Pellet mit 200l eiskaltem, 70% EtOH
gewaschen und
nochmals zentrifugiert (4C, 10min, 15.800g). Der berstand
dekantiert und das
Pellet im Vakuum getrocknet und anschlieend in 30l TE gelst und
bei -20C
aufbewahrt.
2.2.3.2 DNA-Agarosegelelektrophorese
Die Auftrennung von DNA erfolgte auf 0,8%-1,0% TAEAgarosegelen,
die mit
0,05M Ethidiumbromid Gelvolumen versetzt wurden. Als
Gren-standard
wurden 2g GeneRuler1kb DNA Ladder (MBI-Fermentas) aufgetragen.
Nach
der Auftrennung wurde die DNA unter dem UV-Licht betrachtet und
die Lage im
Gel durch Fotos dokumentiert.
2. Material und Methoden Seite 26
2.2.3.3 Verdau der DNA
Fr den Kontroll-Verdau von Plasmid-DNA wurde etwa 1g DNA
eingesetzt und
in 20l bei 37C fr 1h restringiert. Fr Restrikionsfragmente, die
fr die Ligation
dienten, wurden ca. 5g DNA eingesetzt und mit je 25U der
bentigten
Restriktionsenzyme und 10l des entsprechenden Puffers in einem
Endvolumen
von 100l fr mindestens 3h bei 37C verdaut. Verdaute Plasmid-DNA
wurde
ber 0,8% Agarose-Gele aufgetrennt. Das zu isolierende
DNA-Fragment wurde
unter UV-Licht mit einer Skalpellklinge aus dem Gel
ausgeschnitten und mit
Hilfe des QIAqickGel Extraktion Kit gem Vorschrift von Qiagen
isoliert. Der
berstand, der die DNA enthlt, wurde N mit 1/10 Vol. Lsung IV und
dem
2,5fachem Volumen an 99% EtOH gefllt. Nach Zentrifugation (bei
4C, 15min,
15.800g) wurde das Pellet mit 200l eiskaltem, 70% EtOH gewaschen
und
nochmals zentrifugiert (4C, 10min, 15.800g). Nach dem Trocknen
des Pellets
wurde dies in 10l dest. Wasser resuspendiert und zur
Mengenabschtzung wurde
1l auf ein 0,8% Agarosegel aufgetragen.
2.2.3.4 Vektorkonstruktion
2.2.3.4.1 Ligation der amplizierten DNA-Fragmente in den
pCR2.1-
Topo Vektor
Zur Ligation der beiden DNA-Fragmente, den Promotor von
At4g21630 und den
Nos-Terminator, in den pCR2.1-Topo Vektor, wurden diese zuerst
mit Hilfe der
PCR amplifiziert. Als Donormaterial fr den Promotor diente
wt-DNA vom
kotyp Col.. Der Donor fr den Nos-Terminator stammte aus dem
Vektor pGreen
0029.
PCR-Ansatz fr den Nos-Termiantor: 80l ddWasser; 10l 10xCloned
Pfu DNA
polymerase reaction buffer; 5U Pfu Turbo DNA Polymerase; 0,4mM
Primer
NOSterm-637R; 0,4mM Primer NOSterm-355; 0,4mM dNTPs, 60ng
Plasmid-
DNA
2. Material und Methoden Seite 27
PCR-Ansatz fr den Promotor von At4g21630: 80l ddWasser; 10l
10xCloned
Pfu DNA polymerase reaction buffer; 5U Pfu Turbo DNA Polymerase;
0,4mM
Primer 1390-33; 0,4mM Primer1-33R; 0,4mM dNTPs; 6,8g Arabidopsis
DNA.
PCR-Programm fr die Amplifikation des Terminators: 1 Zyklus: 95C
120s
25 Zyklen: 50C 40s
95C 20s
72C 40s
PCR-Programm fr die Amplifikation des Promotors: 1 Zyklus: 95C
120s
30 Zyklen: 59C 30s
95C 20s
72C 120s
Durch die PCR-Reaktion wurde am 3`- und am 5`Ende des
Nos-Terminators
jeweils eine Erkennungssequenz fr das Restriktionsenzym KpnI
eingebaut. Der
Promotor von At4g21630 wurde am 3`Ende mit der Erkennungssequenz
fr das
Restriktionsenzym SalI und am 5`Ende mit der Erkennungssequenz
fr das
Restriktionsenzym Eco RI flankiert.
Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden anschlieend auf ein
0,8%
Agarosegel aufgetragen, aufgetrennt und eluiert. Das isolierte
Promotor- und Nos-
Fragment wurde nun in den pCR2.1-Topo Vektor gem der Vorschrift
von
Invitrogen eingebaut und in E.coliZellen transformiert.
Es folgte eine blau-wei-Selektion der E.coli Kolonien auf LBKan
-Platten mit
Hilfe von 40l IPTG und 40l X-Gal, um die rekombinanten Kolonien
zu
identifzieren. Rekombinante Kolonien erscheinen auf der
Agarplatte wei.
2.2.3.4.2 Ligation der DNA-Fragmente in den
Transformationsvektor
pGreen0029
Aus den identifizierten rekombinanten Kolonien wurde die
Plasmid-DNA isoliert
und das inserierte DNA-Fragment (Nos-Termiantor oder Promotor)
mit dem
passenden Restriktionsenzym restringiert. Der Nos-Terminator
enthlt am 5`Ende
2. Material und Methoden Seite 28
fnf zustzliche Schnittstellen, die aus der Multiple Cloning site
des pCR2.1-
Topo Vektors stammen (SacI, BamHI, SpeI, BstXI und Eco RI). Das
Einfgen
der Schnittstellen war nicht beabsichtigt, anscheinend wurde die
KpnI-
Schnittstelle des Topo-Vektors bevorzugt gespalten.
In den Transformationsvektor pGreen0029, mit dem Fusionsgen
GUS-GFP,
wurde deshalb zuerst das Promotorfragment kloniert, um die
Entstehung von zwei
Schnittstellen fr Eco RI zu vermeiden, weil dadurch die Ligation
des
Promotorfragments nicht mglich wre.
Fr die Ligation des Promotors von At4g21630 wurde der Vektor an
der Multiple
Cloning site mit SalI und Eco RI aufgeschnitten und nach der
Gel-Elution mit
10U CIP, bei 37C, 60min lang, dephosphoryliert. Nun folgte die
Zugabe von
EDTA, sodass eine 5mM EDTA-Konz. entstand. Danach wurde die
dephosphorylierte DNA mittels Phenol-, Chloroform
(1:1)-Extraktionen und
anschliessender Ethanol-Przipitation gereinigt, um die
alkalische Phosphatase
vollstndig zu inaktivieren
Zur Abschtzung des Konzentrationsverhltnisses von Vektor zu
Insert wurden
Aliquots ber ein 0,8% Agarose-Gel aufgetrennt und die DNA-Menge
zustzlich
photometrisch bestimmt. Fr die Ligation wurde ein
Konzentrationsverhltnis
Vektor zu Insert von 3:1 bevorzugt. Die Ligation wurde mit 5U
T4-DNA Ligase,
1l 10xLigase-Puffer und der jeweiligen Konzentration von
Promotor und Vektor
in einem gesamt Volumen von 10l fr 3h bei RT durchgefhrt.
Anschlieend
folgte bei 65C, fr 10min ein Hitzeschritt um die T4-DNA Ligase
zu
inaktivieren.
Dieser Vorgang wurde nach der Klonierung des Promotors mit dem
Nos-
Terminator wiederholt. Hierzu wurde der Vektor pGreen0029, mit
dem
Fusionsgen GUS-GFP und dem Promotor, an der Multiple Cloning
site mit KpnI
aufgeschnitten. Die Ligation wurde mit 5U T4-DNA Ligase, 1l
10xLigase-
Puffer und der jeweiligen Konzentration von Nos-Terminator und
Vektor in
einem gesamt Volumen von 10l fr 3h bei RT durchgefhrt.
2. Material und Methoden Seite 29
2.2.3.4.3 Analyse der Ligationsprodukte durch Restriktionsverdau
der
Plasmid-DNA
Um zu berprfen, ob der Vektor das gewnschte DNA-Insert enthielt,
wurden
ca. 400ng der isolierten Vektor-DNA in einem 20l Ansatz mit 5U
des jeweiligen
Restriktionsenzyms 1h bei 37C restringiert. Die
Restriktionsprodukte wurden
mittels eines 0,8% Agarosegels aufgetrennt und analysiert.
Um die richtige Orientierung des Nos-Terminators festzustellen
wurde zustzlich
eine PCR-Reaktion mit den Primern GUS-GFP 2101 und NOSterm
637R
durchgefhrt.
BspHI
pSA-ori GUS-GFP ColEI ori npt
BspIRBnos-Kan
LB
BglIIBglII
StuI
KpnISacIBamHISpeIBstXIEcoRI
XhoI
SalI
PstISmaIBam HI SpeIXbaINbtISacI
KpnIEcoRI
T-DNA
BspHI
pSA-ori GUS-GFP ColEI ori npt
BspIRBnos-Kan
LB
BglIIBglII
StuI
KpnISacIBamHISpeIBstXIEcoRI
XhoI
SalI
PstISmaIBam HI SpeIXbaINbtISacI
KpnIEcoRI
T-DNA
nos-term
Promotor At4g21630
nos-term
Promotor At4g21630
PvuI
Abb. 6: Konstruierter Transformationsvektor pGreen0029 mit
Promotor von At4g21630 (blau unterlegt), Nos-Terminator (schwarz
unterlegt) und dem Fusionsgen GUS-GFP. Die Grenzen der T-DNA sind
rot gekennzeichnet. Das Selektionsgen Kanamycin wurde grn
untermalt.
2.2.3.5 DNA-Sequenzierung
Die DNA-Sequenzierung wurde von der Firma MWG Biotech AG
(Ebersberg)
durchgefhrt.
2.2.3.6 Isolierung genomischer DNA aus Pflanzen
Zur Isolierung von genomischer DNA wurde eine kurze, schnelle
Methode
benutzt, um DNA von transgenen Pflanzen fr die PCR-Analyse zu
erhalten.
10mg Blattmaterial wurde mit flssigem Stickstoff und mit der
Hilfe eines
gekhlten Pistills zu einem feinem Pulver zerstossen. Hierzu
wurden 100l DEX-
2. Material und Methoden Seite 30
Puffer gegeben und kurz gevortextet. Nach Zugabe von 200l
Chloroform wurde
die Probe 30min lang bei 65C inkubiert und anschlieend
zentrifugiert (RT, 5min
13.000g). Der berstand wurde in ein neues Reaktionsgef berfhrt,
mit 100l
Isopropanol fr 15min bei RT gefllt und danach zentrifugiert (4C,
15min,
15.800g).
Das Przipitat wurde mit 70% Ethanol gewaschen und nach einem
weiteren
Zentrifugationsschritt (4C, 5min, 15.800g) in 30l TE gelst.
Fr die PCR wurde 1,5l template DNA verwendet, der Rest wurde bei
-20C
eingefroren.
2.2.3.7 RNA-Isolierung
Um RNase freie Lsungen und Gefe zu erhalten, wurde 0,01%
DEPC
hinzupipettiert, N geschttelt und anschlieend fr 45min
autoklaviert.
Reaktionsgefe wurden aus neuen Beuteln mit Handschuhen entnommen
und
einmal fr 45min autoklaviert. Es wurden nur gestopfte Spitzen
verwendet.
2.2.3.7.1 RNA-Isolierung aus Samen
Die RNA-Isolierung aus Samen erfolgte nach der Methode von
Vicient und
Delseny (1998). Es wurden ca. 100mg Samenmaterial mit flssigem
Stickstoff
zerstoen und anschlieend 2ml Extraktionspuffer hinzugegeben und
bei 4C N
inkubiert. Nach Zentrifgation fr 4s wurde der berstand in ein
2ml
Eppendorfgef berfhrt und fr weitere 30min bei 15.800g
zentrifugiert. Das
Pellet wurde mit kalten 70% EtOH gewaschen, kurz an der Luft
getrocknet und
danach mit Hilfe von 1ml Lsungspuffer gelst. Die Extraktion
erfolgte durch die
zweimalige Zugabe von einem Volumen Phenol, eine einmalige
Zugabe von
einem Volumen Phenol/Chloroform (25:25) und zweimal durch die
Zugabe von
einem Volumen Chloroform. Zwischen jedem Schritt wurde
zentrifugiert (4C,
15min, 15.800g) und die wssrige Phase in ein neues 2ml
Reaktionsgefe
berfhrt. Die Przipitation erfolgte mit Hilfe von 0,1 Volumen 3M
NaAc pH 5,2
und dem 2,5fachem Volumen an 99% EtOH. Nach Zentrifugation (4C,
30min,
2. Material und Methoden Seite 31
15.800g) wurde der berstand verworfen und 0,5ml 3M NaAc pH
5,2
hinzugegeben und nochmals zentrifugiert (4C, 10min, 15.800g).
Danach folgte
mit kaltem 70% Ethanol ein Waschschritt bevor das Pellet
getrocknet und in
100l DEPC-Wasser gelst wurde.
2.2.3.7.2 RNA-Isolierung von Blten und Schoten
Hierzu wurde bis zu 10g Blattmaterial mit flssigem Stickstoff
zerstoen. Zu je
einem g Pflanzenmaterial wurde 2,5ml Extraktionspuffer (auf 50C
vorgewrmt)
zugegeben. Dies wurde fr 25min zentrifugiert (4C, 12.000rpm).
Der berstand
wurde mit steriler, gestopfter Plastikpipette abgenommen und
2mal mit einem
Volumen Phenol/Chloroform extrahiert und zentrifugiert (4C,
4.000g). Der
Abschluss der Extraktion erfolgte durch die Zugabe von einem
Volumen
Chloroform. Nach der Zentrifugation (4C, 10min, 4.000g) wurde
die wssrige
Phase mit einem Volumen 4M LiCl, 10mM EDTA, pH 8,0 N bei 4C
gefllt
und anschlieend zentrifugiert (4C, 30min, 4.400g). Das
RNA-Pellet mit 6-8ml
2M LiCl, 5mM EDTA, pH 8,0 gewaschen und in 400l DEPC-Wasser
gelst. Es
folgte eine weitere Fllung mit sterilem 1/50 Volumen 5M NaCl und
dem
2,5fachem Volumen an 99% EtOH. Danach wurde das Pellet fr 10min
an der
Luft getrocknet und anschlieend in DEPC-Wasser gelst und bei
-80C
aufbewahrt.
2.2.3.7.3 RNAIsolierung mit TRIzolReagent
Alternativ wurde die RNA-Isolierung mit TRIzolReagent
(Invitrogen), fr die
Isolierung kleiner Mengen (bis zu 100mg) RNA, nach dem Protokoll
des
Herstellers durchgefhrt.
2. Material und Methoden Seite 32
2.2.3.8 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Die Standard-PCR wurde in einem Volumen von 25l in Gegenwart von
5l
5xPCR-Puffer, 0,5l dNTPs (10mM), jeweils 5U
Taq-DNA-Polymerase
(PEQLAB) und je 0,5l 10M Forward- und Reverse Primer verwendet.
Fr die
Amplifikation der Klonierungsprodukte wurden 5U der Pfu Turbo
DNA
Polymerase benutzt.
Die Menge an Template-DNA variierte je nach Ausgangsmaterial
(Plasmid-DNA,
genomische DNA, cDNA).
PCR-Programme:
Fr die Segregationsanalyse:
1 Zyklus: 95C 2min
30 Zyklen: 95C 20s
58C 40s
72C 90s
Fr die Amplifikation des Elongationsfaktor 1:
1 Zyklus: 95C 2min
28 Zyklen: 95C 20s
55C 30s
72C 40s
Fr die Amplifikation der cDNA von Atg421630, Atg421640 und
Atg421650:
1 Zyklus: 95C 2min
35 Zyklen: 95C 20s
61C 40s
72C 90s
2. Material und Methoden Seite 33
2.2.3.9 Reverse-Transkription
Die reverse Transkriptionsreaktion wurde mit der RevertAIDTM
M-MuLV
Reverse Transkriptase (MBI-Fermentas) an der gesamten RNA
durchgefhrt. Fr
die reverse Transkriptionsreaktion wurde 2g-5g gesamt RNA
eingesetzt und
mit DEPC Wasser auf 9,5l aufgefllt. Zu diesem Volumen wurde 5U
DNase
(RNase frei) zugegeben und fr 45min bei 37C inkubiert. Zur
Inaktiverung der
DNase wurde ein Hitzeschritt 15min, bei 70C durchgefhrt. Fr die
reverse
Transkription wurde 0,5g oligo(dT) hinzugegeben und fr 5min, 70C
inkubiert,
danach sofort auf Eis. Nun wurde mit 4l 5xReaktion-Puffer, 2l
dNTP-Mix
(10mM) und mit 2l DEPCWasser auf 19l aufgefllt und fr 5min,
37C
inkubiert, und wieder auf Eis gestellt. Zum Schluss gab man 200U
der Reversen
Transkriptase hinzu und inkubierte bei 42C, 60min. Die Reaktion
wurde durch
einen Hitzeschritt 15min, 70C gestoppt. Fr die anschlieende PCR
wurde je
1,5l cDNA verwendet, der Rest wurde bei -20C eingefroren.
2.2.3.10 Histochemischer GUS-Test
Das zu untersuchende Blten- und Schotenmaterial wurde, nach dem
Abtrennen
sofort in 1-2ml X-Gluc-Frbelsung berfhrt und 3mal im Vakuum fr
je 1min
infiltriert. Nach diesem Schritt, wurde das Material N bei 37C
inkubiert und
anschliessend mit 70% EtOH entfrbt.
2.2.3.11 Dnnschnitte
Das Pflanzenmaterial wurde in FAA-Lsung fr 1h-2h fixiert und
danach mit
ansteigenden Konzentrationen EtOH (50%, 70% und 85%) fr je 1h,
in 100%
EtOH N entwssert. Nach dem Ende der Entwsserung folgte die
Prinfiltration
mit ansteigenden Konzentrationen Technovit-Lsung 7100 (25%
Technovit, 50%
Technovit, 75% Technovit) fr je 2h, in 100% Technovit fr einen
Tag. Hierbei
wird das EtOH durch ansteigende Konzentrationen der
Technovit-Lsung 7100
ersetzt. Nun folgte die N Infiltration mit Technovit 7100 und
Hrter I. Die
2. Material und Methoden Seite 34
Polymerisation mit Hrter II geschah ebenfalls N im Deckel eines
1,5ml
Reaktionsgefes. Mit Techovit 3040 wurde das
Polymerisationsprodukt am
Histobloc befestigt.
2.2.3.12 Samen Frbung
2.2.3.12.1 Rutheniumrot Frbung
Gequollene Samen der T2- und T3-Generation der Sail
410_G07-Linie und wt
Samen von kotyp Col. wurden mit wssriger 0,2% (w/v)
Rutheniumrot-
Frbelsung bedeckt (Penfield et al., 2001), fr 10min bei RT
geschttelt und
danach mit dem Zeiss Axioskop 2 plus untersucht. Pektine werden
durch
Rutheniumrot gefrbt (Usadel et al., 20004).
2.2.3.12.2 Vanillin Assay
Samen der T2- und T3-Generation der Sail 410_G07-Linie und wt
Samen von
kotyp Col. wurden mit einer 1% Vanillin (w/v) 6N HCl Lsung fr 1h
bei RT
inkubiert. Vanillin wird durch die Bindung an Proanthocyanidine
rot (Debeaujon
et al., 2000).
2.2.3.12.3 Tetrazolium Assay
Samen der T2- und T3-Generation der Sail 410_G07-Linie und wt
Samen von
kotyp Col.wurden mit einer wssrigen 1% (w/v) TTC-Lsung fr zwei
Tage bei
30C im Dunkeln inkubiert (Debeaujon et al., 2000). TTC dient zur
berprfung
der Keimfhigkeit des Samens. TTC wird durch eine
NADH-abhngige
Reduktase zu rotem, wasserunlslichen Formazan reduziert (He,
1975)
3. Resultate Seite 35
3 Resultate
Das Institut fr Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen an
der Universitt
Hohenheim, beteiligt sich mit anderen Arbeitsgruppen an der
Identifizierung der
Funktion von Subtilasen.
Das Ziel dieser Arbeit ist die molekulare Charakterisierung der
Subtilase
At4g21630.
In Vorarbeiten, wurden Arabidopsis Linien, in denen verschiedene
Subtilasegene,
die durch T-DNA-Insertion mutiert worden waren,
unterschiedlichen
Stressfaktoren ausgesetzt und die Reaktion mit wt Pflanzen des
kotyps Col.
verglichen. Hierzu gehrten Messungen der Wurzellnge auf cadmium-
und
arsenhaltigen Medien (Howden and Cobbett, 1991; Schwger et al.,
2000),
Keimungsassays auf hohen Salzkonzentrationen (Saleki et al.,
1993), Resistenz
gegenber Aluminium und Kupfer (Larsen et al., 1996; van Vleit et
al., 1995) und
Assays auf MS-Medien mit verschiedenen Pflanzenhormonen (Hayashi
et al.,
1998; Bleecker et al., 1988; Beemster and Baskin, 2000, Weigel
and Glazebrook,
2002).
In diesen Versuchen zeigte die Mutante fr At4g21630 bei
Keimungsassays eine
Unempfindlickeit gegenber ABA im Vergleich zu wt Samen (Kapitel
3.5) und
wurde aus diesem Grund fr weitere Untersuchungen im Rahmen
der
vorliegenden Arbeit ausgewhlt.
3.1 Genomischer Aufbau von At4g21630
Abb. 7: Genomischer Aufbau von At4g21630 Das Gen besteht aus
zehn Exons (als Rechtecke dargestelt), die durch neun Introns
voneinander getrennt sind (als Linien dargestellt). Das Gen (ohne
Promotor) besteht aus 3253bp. Die Pfeilspitze markiert das
3`Ende.
Die cDNA von At4g21630 besteht aus 2319bp. Die Translation der
RNA-
Sequenz in Aminosuren ergibt ein 82,66kDa und aus 772
Aminosuren
3. Resultate Seite 36
bestehendes Protein (hhtp://www.arabdiopsis.org). At4g21630 wird
der AtSBT3
Subgruppe innerhalb der Subtilasefamilie zugeordnet (Abb. 2).
Phylogenetisch
sind At4g21640 und At4g216350 am nchsten mit At4g21630 verwandt
(Abb. 2).
Alle drei Gene sind auf dem Chromosom vier nacheinander
angeordnet, was
mglicherweise ein Indiz fr funktionelle Redundanz ist und auf
eine Enstehung
durch Genduplikation hindeutet.
3.2 Segregationsanalyse
Durch Segregationsanalysen von Pflanzen der T1-Generation der
Sail 410_G07-
und Salk 127987-Linie sollte ermittelt werden, ob nur eine oder
mehrere T-DNA-
Insertionen im Genom vorliegen.
Die Vorarbeiten von Dr. Stintzi und Ursula Glck-Behrens belegen,
dass die
Pflanzen Sail 410_G07- und Salk 127987-Linie jeweils nur eine
T-DNA-Insertion
im Genom enthalten.
Es sollte brprft werden, ob in einer Population von T2-Pflanzen
die T-DNA-
Insertion heterozygot oder homozygot vorliegt.
Dazu wurde von den T2-Pflanzen genomische DNA isoliert (s.
Material und
Methoden) und mit Hilfe von Gen- und T-DNA spezifischen Primern
auf das
Vorhandensein der T-DNA-Insertion untersucht.
Heterozygote Pflanzen enthalten ein Allel mit der
T-DNA-Insertion. Somit sind
zwei Banden auf dem Agarosegel erkennbar, eine Bande fr das
wt-Allel und eine
weitere Bande fr das Allel mit der T-DNA. Homozygote T-DNA-
Insertionspflanzen und wt Pflanzen zeigen jeweils nur eine
DNA-Bande, die
durch ihre Gre von einander zu unterscheiden sind.
Die PCR-Analyse wurde von Ursula Glck-Behrens durchgefhrt.
Es wurden drei unabhngige T-DNA-Insertionslinien, Salk 127987,
Salk 036863
und Sail 410_G07, untersucht, um sicher zu stellen, dass ein
mglicherweise
beobachteter Phnotyp mit dem Funktionsverlust der Subtilase
At4g21630
korreliert. Fr jede dieser Linien wurden 23 bzw. 43 Pflanzen der
T2-Generation
untersucht.
3. Resultate Seite 37
A B A B A B A B A B A B A B
Nr. 2 3 4 5 6 7 8Nr. 2 M 5 6 M 7 8
Nr. 11 12 13 M 14 15 16 17 M 18
A B A B A B A B A B A B A B A B
Nr. 20 21 22 M 23 18
A B A B A B A B A B
wt-DNA 972bp
T-DNA 828bp
wt-DNA 972bp
T-DNA 828bp
A B A B A B A B A B A B A B
Nr. 2 3 4 5 6 7 8Nr. 2 M 5 6 M 7 8
Nr. 11 12 13 M 14 15 16 17 M 18
A B A B A B A B A B A B A B A B
Nr. 2 3 4 5 6 7 8Nr. 2 M 5 6 M 7 8Nr. 2 3 4 5 6 7 8Nr. 2 M 5 6 M
7 8
Nr. 11 12 13 M 14 15 16 17 M 18Nr. 11 12 13 M 14 15 16 17 M
18
A B A B A B A B A B A B A B A B
Nr. 20 21 22 M 23 18
A B A B A B A B A B
Nr. 20 21 22 M 23 18
A B A B A B A B A B
wt-DNA 972bp
T-DNA 828bp
wt-DNA 972bp
T-DNA 828bp
wt-DNA 972bp T-DNA 828bp
Abb. 8: PCR-Analyseergebnis einer segregierenden T2-Population
der Salk 127987-Linie. Fr jede der zu untersuchenden T2-Pflanzen
deren Nummer unter dem jeweiligen Gelausschnitt angegeben ist,
wurden zwei Primerkombinationen (A und B) eingesetzt. Die Gre der
fr das Wildtyp- und mutierte Allel zu erwartende PCR-Produkt ist
angegeben. A = Gen spez. Primer 33-452 und Gen spez. Primer 1424R
fr die Detektion der wt-Bande. B = T-DNA spez. Primer Salk Left
Border und der Gen spez. Primer 33-1424R fr die Detektion der
T-DNA-Insertion. M = Grenmarker
Fr die Linie Salk 127987 konnten 16 wt Pflanzen (Nr. 2, 3, 5, 6,
7, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 20, 21, 22, 23) und drei homozygote Pflanzen
(Nr. 4, 8, 18)
identifziert werden (Abb. 8).
Nr 1 2 3 4 5 M 6 7 8 10 11 12 13 14 M 15 16 17 18
A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B AB A B A B A
B
Nr. 19 20 21 22 M 23 24 25 26 28 M 29 30 31 32
A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B
Nr. 33 34 35 36 37 M 38 39 40 41 M 42 43
A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B
wt-DNA 1221bp
T-DNA 640bp
wt-DNA 1221bp
T-DNA 640bp
wt-DNA 1221bp
T-DNA 640bp
Nr 1 2 3 4 5 M 6 7 8 10 11 12 13 14 M 15 16 17 18
A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B AB A B A B A
B
Nr 1 2 3 4 5 M 6 7 8 10 11 12 13 14 M 15 16 17 18
A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B AB A B A B A
B
Nr. 19 20 21 22 M 23 24 25 26 28 M 29 30 31 32
A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B
Nr. 19 20 21 22 M 23 24 25 26 28 M 29 30 31 32
A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B
Nr. 33 34 35 36 37 M 38 39 40 41 M 42 43
A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B
Nr. 33 34 35 36 37 M 38 39 40 41 M 42 43
A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B
wt-DNA 1221bp
T-DNA 640bp
wt-DNA 1221bp
T-DNA 640bp
wt-DNA 1221bp
T-DNA 640bp
Abb. 9: PCR-Analyseergebnis einer segregierenden T2-Population
der Sail 410_G07-Linie. Fr jede der zu untersuchenden T2-Pflanzen
deren Nummer unter dem jeweiligen Gelausschnitt angegeben ist,
wurden zwei Primerkombinationen (A und B) eingesetzt. Die Gre der
fr das Wildtyp- und mutierte Allel zu erwartende PCR-Produkt ist
angegeben. A = Gen spez. Primer 33-1362 und Primer 2587R fr die
Detektion der wt-Bande B = T-DNA spez. Primer Garlic Left Border
und der Gen spez. Primer 33-2687R fr die Detektion der
T-DNA-Insertion. M = Grenmarker
3. Resultate Seite 38
Fr die Linie Sail 410_G07 wurden 16 wt Pflanzen ( Nr. 1, 2, 11,
12, 13, 14, 15,
19, 20, 24, 25, 33, 36, 39, 40, 42), 23 homozygote Pflanzen (
Nr. 3, 4, 5, 6, 7, 8,
10, 16, 17, 18, 21, 22, 23, 26, 28, 29, 30, 34, 35, 37, 38, 41,
43) und zwei
heterozygote Pflanzen (Nr. 31, 32) identifiziert (Abb. 9).
Die PCR-Analyse der Salk 036863-Linie identifizierte nur eine
homozygote
Pflanze, die im Gewchshaus verendete (Daten nicht gezeigt).
Das Ergebnis der PCR wurde berprft, indem zwischen 70-100
T2-Samen auf
Selektionsmedium (PPT fr Linie Sail 410_G07, Kan fr Linie Salk
127987)
ausgest und nach ca. zehn Tagen die ergrnten und die
nekrotischen Pflanzen
gezhlt wurden. In homozygoten Mutanten findet in der nchsten
Generation
keine Segregation statt, so dass alle Nachkommen auf Kanamycin
bzw. PPT
wachsen knnen.
Ist die T-DNA-Insertion nur heterozygot vorhanden, wrde eine
Segregation von
3:1 (resistent:sensitiv) stattfinden. Sensitive Pflanzen zeigen
einen verkmmerten
Wuchs, bilden keine echte Bltter und besitzen farblose
Kotyledonen. Bei wt
Pflanzen erhlt man 100 % sensitive Pflanzen.
Die Analyse besttigte das PCR-Ergebnis weitgehend, lediglich die
beiden
heterozygoten Sail 410_G07-Linien 31 und 32 (Abb. 9) wurden
anhand dieser
Analyse als wt Pflanzen identifiziert. Eine weitere PCR auf
genomische DNA von
Linie 31 und 32 besttigte diesen Befund (Daten nicht gezeigt).
Die T-DNA
Bande auf dem Gel (Abb. 9), muss demnach durch eine
Kontamination mit DNA
von T-DNA-Insertionspflanzen entstanden sein.
Obwohl es sich bei den Elternpflanzen der T1-Generation um eine
heterozygote
Pflanze gehandelt haben muss treten sowohl fr die Sail
410_G07-Linie als auch
fr die Salk 127987-Linie keine heterozygoten Pflanzen in der
T2-Generation auf
(Abb. 8 und 9). Anscheinend gehen die heterozygoten Pflanzen
whrend der
Segregation verloren.
Die Ursache fr den selektiven Verlust heterozygoter Pflanzen ist
unklar.
Eine Beeinflussung der gametophytischen Entwicklung durch die
T-DNA-
Insertion kann ausgeschlossen werden (Howden et al., 1998), da
gengend
homozygote Pflanzen vorhanden sind und das Phnomen der
3. Resultate Seite 39
Segregationsverzerrung bei unterschiedlichen
T-DNA-Insertionslinien auftritt.
Mglicherweise spielen exogene Faktoren, die bisher nicht bekannt
sind, bei der
Segregationsverzerrung eine Rolle (Feldmann et al., 1997). Eine
andere mgliche
Erklrung fr dieses Phnom ist, dass die Eizelle das
unterschiedliche Allel in den
Pollen erkennt und eine Bildung der Zygote nur mglich ist, wenn
die Allele der
Einzelle und des Pollens identisch sind.
Die phnotypische Analyse wurde mit T2-Samen aus der
Segregationspopulation
der Sail 410_G07- und Salk 127987-Linie durchgefhrt.
3.3 T-DNA-Lokalisation
Zur genauen Lokalisation der T-DNA innerhalb des At4g21630 Gens,
wurden die
Insertionsstellen mittels PCR amplifiziert und anschliessend
sequenziert. Fr die
Amplifikation der Sail 410_G07-Linie wurde der Gen spez. Primer
33-1362 und
der T-DNA spez. Primer Sail LB1, fr die Salk 127989 Linie der
Gen spez.
Primer 33-1424R und der T-DNA spez. Primer Salk LBa1 verwendet.
Fr die
Sequenzierung der PCR-Produkte wurde im Falle der Sail-Linie der
T-DNA spez.
Primer Sail LB3 und im Falle der Salk-Linie der T-DNA spez.
Primer Salk LBb1
benutzt.
CGGTTTCTATGTACAAATATAAGTCCTATATAAC
Abb. 10: T-DNA-Insertion in der Sail 410_G07-Linie Exons werden
als Rechtecke dargestellt, Introns als Strich, Pfeilspitze markiert
das 3` Ende. Die T-DNA-Insertion befindet sich im Exon sechs. Blau
markierte Basen sind genomischen Urspungs, schwarz markierte Basen
stammten aus der LB-Region der T-DNA. Die 12 rot markierten Basen
konnten mit Hilfe eines Megablast nicht identifizert werden.
3. Resultate Seite 40
TGCGTCAATTTGGCGAGCTGTCGGTCGGGGAGTGGTGATTTGTCAATTTGTCAA
TTCACAGCTTC
Abb. 11: T-DNA-Insertion der Salk 127987-Linie- Exons werden als
Rechtecke dargestellt, Introns als Strich, Pfeilspitze markiert das
3`Ende. Die T-DNA-Insertion befindet sich im Exon zwei. Blau
markierte Basen sind genomischen Urspungs, schwarz markierte Basen
stammen aus der LB-Region der T-DNA und rot markierte Basen konnten
mit Hilfe eines Megablast nicht identifizert werden. Die 15 grn
markierte Basen ergaben eine 100%ige bereinstimmung mit einem 15bp
langen DNA-Fragment des Locus At5g24540 und At5g24550. Beide Gene
codieren fr eine 6-Phospho-beta-galactosidase aus Arabidopsis
thaliana.
Fr die Sail 410_G07-Linie und die Salk 127987-Linie wurde eine
Insertion der
T-DNA im Exon sechs bzw. im Exon zwei festgestellt. Die T-DNA
kann also
nicht durch den Spleivorgang verloren gehen und fhrt aller
Wahrscheinlichkeit
in beiden Fllen zu einem los