Modelling crescita microbica. La crescita microbica Cosa è la crescita microbica? Valutiamo –Cellule totali (microscopio) –Corpuscoli (Coulter counter,

Modelling crescita microbica

La crescita microbica

• Cosa è la crescita microbica?

• Valutiamo– Cellule totali (microscopio)– “Corpuscoli” (Coulter counter, OD)– Cellule vive (FACS, microscopio)– Biomassa (peso secco)– Cellule proliferanti (UFC)– Attività metabolica (NADH, ATP,…)

Biomassa

Può esistere crescita disgiunta dalla duplicazione?

Modelli cinetici

• Utilità del modelling: una descrizione quantitativa dei processi cellulari permette l’ottimizzazione dei processi fermentativi.

• Resa e produttività sono due parametri misurabili, ma è molto più difficile predire come un cambio delle condizioni operative li possa modificare.

• La predizione è permessa da un modello matematico, ossia da una serie di relazioni tra le variabili del sistema.– Relazioni: equazioni matematiche, espressioni logiche– Variabili: agitazione, feed-rate, pH, temperatura, [S], [P],

biomassa

Disegno del modello

• Dipende dall’uso: decidere il numero di reazioni da considerare e la loro stechiometria

• Kinetic expressions: le velocità delle reazioni considerate dal modello dipendono dalle variabili.

• Mass balance equations: descrivono come la materia entra, viene trasformata ed esce dal volume considerato (bioreattore); descrivono come cambiano nel tempo le concentrazioni.

• Simulazione del processo (assegnare parametri)• Comparazione dati sperimentali• Fitting dei parametri sperimentali (minimizzare la somma

dei quadrati degli errori)

Complessità modello

• Complessità descrizione metabolismo e comportamento asincrono

• Modelli non strutturati– biomassa

• Modelli strutturati– Volume cellulare, età

– Compartimentazione reazioni; dettaglio reazioni enzimatiche

Non strutturatiNon segregati

Non strutturatiSegregati

StrutturatiSegregati

StrutturatiNon segregati

Descrizione cellule

Des

criz

ione

pop

olaz

ione

“As simple as possible but not simpler”

Modello più semplice di crescita

Fissione batterica binaria in mezzo omogeneo– Generazione– Tempo di generazione

• Crescita asincrona, media dei tempi

• Modalità batch, fbatch e continua

Crescita in batch

• 4 fasi classiche• Terminata la latenza, aumento della velocità di

crescita fino alla vmax

• Descrizione: numero di cellule o biomassa

Valutazione biomassa

• La massa aumenta con un processo autocatalitico.

dX/dt=X

= velocità di crescita specifica

Volendo determinare , integriamo: Xt=X0e t

Passando ai logaritmi naturali: LnXt=LnX0 +t

Calcolo • Un grafico del

logaritmo naturale della biomassa contro il tempo in fase esponenziale dà una linea retta con come coefficiente angolare.

• Se uso i log10, il coefficiente angolare è uguale a /2,303

0

5

10

15

20

25

30

0 2 4 6 8 10

ore

bio

mas

sa

0,1

1

10

100

0 2 4 6 8 10

ore

bio

mas

sa

td = LN(2)/

• Ad ogni divisione, il numero di cellule raddoppia partendo da un inziale N0

• Nt=N02n

• n=(LN(Nt)-LN(N0))/LN(2)• td = t/n = t LN(2)/(LN(Nt)-LN(N0))• In crescita exp bilanciata dimensioni medie costanti,

relazione tra numero di cellule e biomassa.• Considerando che in un td la biomassa passa da x0 a 2x0

• 2x0=x0etd ; LN(2x0)=LN(x0) + td ; td = LN (2)

Numero di cellule

Velocità e rese

• Le velocità volumetriche di formazione prodotti e scomparsa substrati sono determinabili sperimentalmente

• Velocità specifiche (ri)sono ottenute normalizzando le volumetriche per la biomassa presente.

• Rese: quantità di substrato che viene recuperata in biomassa o prodotti. Definita come rapporto delle velocità specifiche.

• YSX=/rs

• YSP=rp/rs

• Indicatore ultimo della distribuzione dei flussi metabolici• Attenzione al senso (sX). YXS è la quantità di substrato

convertito per unità di biomassa formata.• RQ è la resa della CO2 sull’O2: rCO2/rO2

BLACK BOX

• Una singola reazione riassume tutte le reazioni della cellula.

• Tutte le rese sono quindi costanti• La velocità di consumo del substrato è allora rs=YXS• Anche la formazione del prodotto, il consumo di

ossigeno, etc, sono proporzionali alla • Come otteniamo l’entrata in stazionaria? • Una singola cellula di E. coli che si duplica ogni 20’ in 43 ore occupa

il volume della Terra, e in 45 ore ne eguaglia il peso

in relazione a S

• Per un substrato limitante, la velocità dipende dalla concentrazione solo entro certi limiti.

• Un modo popolare per descrivere questo comportamento è il modello di Monod:

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 20 40 60 80 100 120 140

concentrazione s

ve

loc

ità

sp

ec

ific

a

= max S/ (Ks + S)

Maintenance

• La resa non è costante al variare delle condizioni di crescita.

• “Metabolismo endogeno”• Pirt: maintenance (ms), la resa può non essere costante• rs= Ytrue

XS+ms

• YSX=/(YtrueXS+ms)

• A bassi valori di la resa in biomassa decresce perché una quota crescente di substrato è utilizzato per le necessità del mantenimento; se è alta m è trascurabile e si torna alla formula originaria.

• rATP=YXATP+mATP

Mass Balances

Combinare il modello cinetico con un modello del bioreattore.

Accumulo= velocità di formazione + ingresso – uscita

d(cs,iV)/dt = -rs,ixV + Fcf

s,i-Foutcs,i

Vci

x

Fcf

i

Fout

ci

x

Mass Balances

• d(cs,iV)/dt=-rs,ixV + Fcfs,i-Foutcs,i

• Dividendo per V:

d(cs,i)/dt=-rs,ix + Fcfs,i/V-Fout cs,i /V

• D = F/V dilution rate

• Fed batch: Fout =0

• Batch e continuo F=Fout

d(cs,i)/dt=-rs,ix + D(cfs,i- cs,i)

Batch

• dx/dt=x ; x(t=0)=x0

• dcs/dt=-rsx ; cs (t=0) = cs,0

• Equazione diff primo ordine, si può calcolare la biomassa nel tempo. La biomassa si accrescerà nel tempo, consumando il substrato, in accordo con Monod, e l’andamento del substrato sarà in accordo con

• cs=cs,0 – YXS (x-x0)

Poiché alla fine il substrato è 0:

• YSX=(xfinale-x0)/cs,0

Per definizione

Simulazione batch

0

2

4

6

8

10

12

0 10 20 30

S

X

Chemostato

(Ж) d(cs,i)/dt=-rs,ix + D(cfs,i- cs,i)

• dx/dt=x-Dx; dx/dt = (-D)x

=D

• x = YSX(cfs-cs): è possibile misurare precisamente

la resa (la derivata (Ж)=0, YSX=/rs)

• cs=DKs/(max-D): la concentrazione del substrato limitante aumenta con D

• Calcolo maintenance: x = D (cfs,i- cs,i)/(Ytrue

XSD +ms), regressione lineare.

Fed batch

d(cs,iV)/dt=-rs,ixV + Fcfs,i-Foutcs,i

• D = dV/Vdt: se voglio mantenerlo costante feeding esponenziale:

• Fout = 0• quando t=0 d(xV)/dt = 0xV ; xV=x0V0e

t

• F(t)= YXS0x0V0et/(cf

s-cs)

0: la specifica velocità che voglio mantenere

Esempio pratico: produzione di interleukina in Z. bailii

Batch reactor Fed-batch reactor

Variable Kinetic model Phases kinetic model

Biomass G = max G/(G+ksG) 0 = t <t* Fed A A = costant 0≤ t ≤ tA

E = maxE E/(E+ksE) t>t* Fed B B1 = A exp [(tA-t)/X] tA <t ≤ t1

B2 = A exp [(tA-t1)/X] t >t1

Glucose qG = G/YX/G 0 ≤ t <t* Fed A (qG)A = A/(YXG)A 0 ≤ t ≤ tA

Fed B (qG)B1= B1/(YXG)B tA <t≤ t1

(qG)B2= B2/(YXG)B t >t1

(YX/G)B = (YX/G)Aexp(-(t/G))

EtOH (product) (qE)p = GYE/X 0 ≤ t < t* — —EtOH (substrate) (qE)S = E/YX/E t≥ t* — —

IL-1 (qIL)G = GYIL/X 0 ≤ t < t* Fed A (qIL)A = A(YIL/X)A 0 ≤ t ≤ tA

(qIL)E = EYIL/X t ≥ t* Fed B (qIL)B1=B1 (YIL/X)B tA <t ≤ t1

(qIL)B2=B2 (YIL/X)B t >t1

(YIL/X)B = (YIL/X)A exp (-t/IL)

Esempio pratico: produzione di interleukina in Z. bailii

Parameters used for simulations.

Parameters Values Determination

Batch maxG 0.28 h-1 experimental and ref. [15]maxE 0.02 h-1 by fittingYX/G 0.18 (g g-1) experimentalYX/E 0.10 (g g-1) experimentalYIL/X 4.5 x106 (g g-1) experimentalYE/X 1.11 (g g-1) experimentalkSG 15 (g l1) by fittingkSE 30 (g l1) by fitting

Fed-batch (A)(YX/G)A 0.37 (g g-1) experimental(YIL/X)A 1 x 105 (g g -1) experimental

Fed-batch (B) X 8.7 h by fittingG 102 h by fittingIL 37.2 h by fitting

Fase batch

Fase fed batch

Dove sta il problema?

Fase fed batch