Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction.

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IntroductionIntroductionIntroductionIntroduction

• "Chercher une aiguille dans une meule de foin" ?

• Chercher à repérer un gène particulier dans un génome entier, qui en contient jusqu'à des centaines de milliers, c'est un peu comme chercher une aiguille dans une meule de foin...

•La réponse a ce problème :

Les techniques de la biologie moléculaire

L’électrophorèseL’électrophorèseL’électrophorèseL’électrophorèse

L’électrophorèse des acides nucléiques

• Déplacements de fragments d’acides nucléiques chargés selon leur taille sur un gel soumis a un champ électrique

Le gel utilisé

L’agarose pourles fragments d’ADN

de taille (0,5-20kb)

L’acrylamide pour lesfragments de moins

de 1000 pairesde base

L’électrophorèse en champs alternées

Principe• On change périodiquement

l’orientation du champ par a port au gel ,lors du changement de l’orientation du champ électrique l’acide nucléique change le sens de son orientation .

Visualisation par autoradiographie

But

Séparer, analyser ou purifier des acides nucléiques

Remarque

• Les fragments d’acides nucléiques peuvent être séparer selon leur structure ;par exemple les différents formes d’un plasmide (ouvert ,linéaire ,surenroulé)

Remarque

• Elle permet aussi d’étudier des interactions des acides nucléiques avec des protéines

La centrifugationLa centrifugationLa centrifugationLa centrifugation

Centrifugation en gradient de saccharose

• Principe:

• Séparer les macromolécules selon leur poids moléculaire et/ou leur

forme

Utilisations majeurs• Purification des phages• Sélection des fragments d’ADN

voulus• Isolement des polysomes• Fractionner les ARN (ARNm, ARNt,

…)

Un exemple d'utilisation de la

centrifugation zonale : le fractionnement de

molécules d'ARN

Centrifugation en gradient de chlorure de

césium1. /Centrifugation isopycnique

(gradient continu)Utilisation d’une:

Solution de chlorure de césium(CsCl)

Utilisations majeurs• Préparation de plasmides et de

phages

Exemple: La purification des plasmides

2/ .Centrifugation sur coussin (gradient

discontinu) 

Utilisation majeure

• préparation rapide et à grande échelle des phages ou des virus de densité connue.

• Un exemple d'utilisation de la centrifugation sur coussin : la

purification des phages

La PCRLa PCRLa PCRLa PCR

Historique• En 1960 dans les sources de

Yellowstone aux U.S.A. « Thermus aquaticus » est découverte vivant à 70°C, trente ans plus tard son ADNpoly <Taq > est utilisée dans la PCR

• (La revue Sciences décernait sa 1ere distinction de molécule de l’année à la Taq polymérase)

Définition

• PCR « polymérase chain reaction ») technique d’amplification in vitro mis au point par le chimiste Kary MULLIS en 1985 ( Prix Nobel 1993)

Principe

Faire progresser nos capacité d’analyse des gènes

Composés utilisés• L’ADN matrice• Amorces d’oligonucléotides • Une ADN polymérase• Des désoxyribonucléotides

triphosphate (dNTP)

Déroulement des cycles

d’amplification

• La dénaturation• L’appariement des primers• Elongation

Schéma de la PCR 

ApplicationsLa PCR a apportée d’importantes

contributions dans beaucoup de domaines:

• Les maladies héréditaires• La recherche contre le cancer• Les sciences médico-légales • Les biotechnologies

L’hybridationL’hybridationL’hybridationL’hybridation

Généralités

Les techniques de l’hybridation reposent sur :

Complémentarité des

bases successives de

l’ADN

La réversibilité du processus de séparations deux brins d’ADN

Les cas possibles pour une hybridation

1. Hybridation stable (100%) 2. Pas d’hybridation3. Hybridation partielle (50%)

But

Repérer une molécule d’ADN ou d’ARN spécifique dans une

population hétérogène

Les différentes techniques

d’hybridation• Hybridation ADN/ADN :

Southern blotting • Hybridation ARN/ADN :

Northern blotting• Hybridation Dot-blotting et

slot-blotting

Southern

• Sonde ADN

• Cible ADN (nucléaire,

phagique plasmidique ou autres,…)

Northern

• Sonde ADN

• Cible ARN

Dot-blotting & Slot-blotting

• Sonde ADN

• Cible ARN ou ADN Monocaténaire

Conclusion

• Grace aux techniques de la biologie moléculaire les chercheurs ont pu établir une partie de la carte des gènes humains, et espèrent obtenir le séquençage de tous le génome humain a des fins thérapeutique, médicales, a titre de prévention

Référence• *Cours de l’institut national de recherche pédagogique • *Biologie moléculaire PCEM 1 2006-2007 Université de Paris –VI

Faculté de Médecine Pierre et Marie Curie • *Comprendre la biologie moléculaire V. Laudenbach’, (2), J. Mantz(1),

J.M. Desmontsl(1) (1) ‘Département d’anesthésie-réanimation chirurgicale, hôpitaux Bichat-Claude Bernard-Robert Paris ;

• (2)Laboratoire de neurologie du développement Paris • * Thèse de Licence d’informatique Année 2001-2002 Option :

Introduction à la biologie moléculaire • *Principes des techniques de biologie moléculaire 2° édition Par D.

Tagu, C.Moussard, éds (I.N.R.A. de Paris)• *Article du magazine La recherche édition spéciale < Les frontières

du vivant > N°317 Février 1999• * Participation à l’établissement d’une phylogénie moléculaire de

requins d’eau profonde de l’ordre des Squaliformes de L’Université de Nantes Département Sciences et Techniques Alimentaires Marines

• *L’essentiel en génétique Edition : BERTI • *Biochimie génétique biologie moléculaire de Jacqueline Etienne &

Eric Clauser Edition Masson• *Principe de génie génétique 6° édition ; édition De Boeck