I. PENDAHULUAN1.1 Latar Belakang
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan
berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk
kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria,
dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk
linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan
DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak
berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan
kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat
yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola
pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya,
struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk
sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki
protein histon. Isolasi DNA adalah suatu tekhnik yang digunakan
untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu
sel dalam jaringan. isolasi DNA dapat dilakukan melalui
tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA
dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat
dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau
bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini
dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam
konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA Pada proses
isolasi DNA ini, sel eukariotik harus dihancurkan terlebih dahulu
melalui cara mekanik dan enzimatis.1.2 Tujuan
Mengetahui Definisi Isolasi DNA
Mengetahui metode dan tahapan dalan isolasi DNA
Mengetahui manfaat isolasi DNA
1.3 Manfaat
Mahasiswa dapat mengetahui dan melakukan proses-proses yang
berkaitan langsung untuk melakukan isolasi DNA.
II. TINJAUAN PUSTAKA2.1 Definisi Isolasi DNA
Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA.salah satu prinsip
isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi.sentrifugasi merupakan teknik
untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul
komponennya.molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada
di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian
atas tabung
(Mader, 1993).Isolasi DNA merupakan kegiatan yang dapat
dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak
sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun
isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada
setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang
berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan
polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat
pemurnian DNA
(Jamilah, 2005).DNA isolation is the most important step in
molecular biology analysis. Several DNA isolation techniques which
are developed were expensive.
Arti: Isolasi DNA merupakan tahap terpenting dalam analisis
biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA yang telah
dikembangkan sangat mahal dan memerplukan waktu yang lama.
(Listanto,1996)2.2 Macam-macam Metode Isolasi DNA1.Teknik Random
Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Teknik pengujian polimorfisme DNA
berdasarkan pada amplifikasi dari segmen-segmen DNA acak yang
menggunakan primer tunggal yang sekuen nukleotidanya ditentukan
secara acak.Primer tunggal ini biasanya berukuran 10 basa.PCR
dilakukan pada suhu anealing yang rendah yang memungkinkan primer
menempel pada beberapa lokus pada DNA. Aturan sederhana untuk
primer adalah terdiri atas 18- 28 susunan basa dengan persentase
G+C 50-60%
(Istanti,1999)2. Metode CTAB
Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) merupakan metode yang
umum digunakan dalam ekstraksi DNA genom tanaman yang banyak
mengandung polisakarida dansenyawa polifenol
(Ardiana,2009)Menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan
dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan
karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping
deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA
dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA.
Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Prasetyo,
2008).3. Phenol:chloroform
Mengunakan senyawa Phenol-choloroform-isoamyl alcohol, Metode
standard untuk ekstraksi DNA,Akhir-akhir ini ditinggalkan, karena
sifat toksik phenol.
(Barnum 2005)4. SaltingOut
Menggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6 M), untuk
medenaturisasi protein menggunakan Proteinase K untuk denaturasi
protein. (Barnum 2005).5. Guanidine isothiocyanate
Metode ini lebih cepat dibanding dua metode sebelumnya,
Thiocyanate bersifat toksik, untuk lisis dinding sel , Memerlukan
chloroform untuk denaturasi protein.
(Barnum 2005).6. Silica Gel
Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer
tertentu (NaI), Cepat, tetapi recovery DNA kurang (Barnum
2005).
7. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA
secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah
primer oligonukleotida.Primer yang digunakan sebagai pembatas
daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya
komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan
proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi
konservatif
(Giri, 2004)2.3 Tahapan Isolasi DNA
Pada prinsipnya isolasi DNA sel harus dipecah terlebih dahulu
dengan beberapa agensia, baik secara fisik kimia atau dengan
mempergunakan enzim tertentu. Pemecahan dengan cara fisik misalnya
dengan menggunakan alat sonikator, yaitu merupakan alatb yang
menghasilkan suara ultra tinggi. Pemecahan dengan alat ini biasanya
cukup fektif untuk memecah sel bacteri, tetapi kurang efektif untuk
memecah sek eukaryote.
Pemecahan sel juga dapat dilakukan dengan menggunakan enzim
lisozim yang dapat memecah dinding sel. Seringkali penggunaan enzim
ini dikombinasikan dengan perlakuan fisik, misalnya dengan pemansan
sehingga sel lebih mudah pecah. Senyawa lain yang sering digunakan
untuk memecah sel untuk isolasi DNA adalah CTAB (Cetyl Trimetyl
Ammonium Bromide).
Setelah sel pecah selanjunya dilakukan isolasi dan pemurnian
DNA. Untuk mengisolasi suatu fragmen DNA tertentu, DNA genom
kemudian dipotong dengan menggunakan enzin endonuclease restriksi,
enzim ini enzim yang dapat memotong molekul DNA di bagian tertentu.
Hasil potongan dengan enzim tertentu akan menghasilkan ujung-ujung
DNA yang sama sesuai dengan titik potong oleh enzim.
Selain dengan menggunkan enzin endonuclease restriksi, DNA genom
juga dapat dipotong-potong secara mekanis, misalnya menggunakan
alat sonikator.Hasil potongan dengan alat mekanis adalah molekul
DNA yang ujungnya tidak beraturan.
(Yuwono,2006)2.4 Manfaat Isolasi DNA
Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.
Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik
melaluiteknik Hibridisasi Southern Isolasi DNA genomik dalam rangka
pembuatan pustaka genomik. Isolasi plasmid atau DNA fage dalam
prosedur rutin peminakan DNA. Isolasi DNA yang diperlukan sebagai
cetakan (template) dalam prosedurperbanyakan DNA secara in vitro
melalui teknik PCR. (Arumingtyas, 2012)III. METODOLOGI3.1 Alat dan
Bahan Fungsi
3.1.1 Alat yang digunakan :
Mortar:menghaluskan bahan
Pistil:alat untuk menghaluskan bahan
Tips: Ujung dari mikropipet, mendetialkan pengambilan dan
pengeluaran sampel
Gelas ukur: mengukur bahan cairan buffer yang akan digunakan
Tubes 1,5 ml: wadah/tabung unutk pengamatan
Tissue: pembersih alat dan pengelap
Gunting : menggunting bahan (penisah bahan dari tulang daun)
Spatula : memindahkan bahan dari mortar
Mikro pipet: untuk mengambil bahan cair
Erlenmeyer: wadah dari bahan cair
Microwave: memanaskan bahan
Mesin PCR: untuk replikasi
Oven: memanaskan bahan dan mengeringkannya
Vortex: untuk menghomogenkan campuran
Timbangan analitik : mengukur berat bahan
Stirrer: mengaduk bahan dengan cairan
pH meter: mengukur ph
Mesin elektroforesis: untuk mengelektroforesis bahan Centrifuge:
untuk menghomogenkan larutan
Autoclafe: untuk menyeterilkan bahan
Lemari es: untuk menginkubasi bahan pengamatan Pipet :mengambil
bahan cair3.1.2Bahan yang digunakan
Daun - Belimbing : Bahan yang diamati
bayam : Bahan yang diamati
sawi hijau : Bahan yang diamati CTAB: melisis membran sel
HCl: untuk mencuci DNA
EDTA: sebagai penyangga
Merkaptho etanol: sebagai penyangga
Nitrogen cair: membantu proses penggerusan
PVP (polivinipirolidone) : memisahkan fase organic &
fenol
CHISAM (chloroform isoamil alcohol) : untuk mengurangi
kontaminasi protein
Buffer pencuci: untuk mencuci DNA
Betha-Mertacaptoethanol : menghilangkan kontaminan
polisakarida
Ethidium bromide: mengurangi kontaminan RNA
PROMEGA
: sebagai penyangga
SRR
: sebagai penyangga
Isopropanol dingin: untuk presipitasi
3.2 Langkah Kerja + dokumentasiTimbang 0.1 gr sampel daun
Masukan dalam mortar dan tambahkan sedikit PVPdan tambahkan
nitrogen cair.Gerus cepat sampai halus (jangan sampai
mencair).Campur buffer ekstraksi dengan karbon (0.5 % w/v) dan
mercaptoe ethanol 4 l (kocok sebelum digunakan)
Masukan 1 ml kedalam tube ukuran
1.5 ml dan tutup kembali tube
Beri label
Tube berisi buffer reaksi
Segera vortex sampai homogen
Inkubasi 65o C 30 menit (balik tube tiap 15 menit)
Kaluarkan tube dan dinginkan
Sentrifuge 10000 rpm (10 menit)
Ambil supernatan
Pindahkan ke tube baru
Tambah 500 l CHISAM
Vortex sampai homogeny
Centrifuge 10000 rpm (10 menit)
Pindahkan supernatan ke tube baru 1.5 ml
Tambah 500 l CHISAM
Centrifuge 10000 rpm (10 menit)
Pindahkan supernatan ke tube baru 1.5 ml
Tambah 300 l isopropanol dingin secara perlahan
Bolak-balik tube perlahan
Inkubasi dalam freezer (30 menit)
Keluarkan tube ( biarkan hingga tidak terlalu dingin )
Sentrifuse (8000 rpm) selama 10 menit
Buang supernatan dan tambahkan buffer pencuci 500 l pada pellet
dalam tube kemudian vortex
Sentrifuse pada 9000 rpm (10 menit)
Buang supernatan
Kering anginkan pellet 20 menitTambahkan buffer TE 50-100 l dan
larutka pellet DNA dengan mengetukan tube perlahanTambah 1 l RNAse
, inkubasi dalam oven (37oC selama 30 menit)ISOLAT DNA
Simpan dalam Freezer
Dokumentasikan
analisis
3.3 Analisis Perlakuan
Timbang 0.1 gr sampel daun kamudian daun dimasukan dalam mortar
dan tambahkan sedikit PVPdan tambahkan nitrogen cair., hati-hati
alam proses pengambilan nitrogen cair. Kkemuudian setelah nitrogen
cair di letakan dalam mortar, kakukan penggerusan secara cepat
sampai halus (jangan sampai mencair).
Lalu campur buffer ekstraksi dengan karbon (0.5 % w/v) dan
mercaptoe ethanol 4 l (kocok sebelum digunakan). Setelahnya masukan
1 ml kedalam tube ukuran 1.5 ml dan tutup kembali tube dan jangan
lupa beri laleb pada tiap tube, (Tube berisi buffer reaksi), pada
tube yang telah berisi buffer reaksi, masukan gerusan bahan daun
yang telah halus dengan menggunakan spatula, masukan secara
perlahan dan usahakan jangan sampai ad abahan yang jatuh, kemudian
setelah bahan masuk dan bercampur dengan buffer reaksi segera
vortex bahan sampai homogen.
Inkubasi 65o C 30 menit (balik tube tiap 15 menit). Setelah itu
keluarkan tube dan dinginkan, lalau sentrifuge dengan kecepatan
10000 rpm (10 menit). Setelah disentrifuge ambil supernatan dari
bagian yang ada pada tube yang telah mengalami beberapa pemisahan
bagian. Lalu pindahkan ke tube baru dengan ukuran 1.5 ml dan Tambah
500 l CHISAM kemudian Vortex lagi sampai homogeny. Centrifuge lagi
dengan kecepatan 10000 rpm (10 menit).
Lalu pindahkan supernatan ke tube baru 1.5 ml dan tambah 500 l
CHISAM lagi-lagi bahan di Centrifuge 10000 rpm (10 menit).
Dan lagi-lagi dipindahkan supernatan ke tube baru 1.5 ml dan
tambah 300 l isopropanol dingin secara perlahan-lahan. Bolak-balik
tube secara perlahan kmudian Inkubasi dalam freezer (30 menit),
setelahnya keluarkan tube ( biarkan hingga tidak terlalu dingin ),
lalu Sentrifuse (8000 rpm) selama 10 menit. Dan buang supernatan
dan tambahkan buffer pencuci 500 l pada pellet dalam tube kemudian
vortex.
Sentrifuse pada 9000 rpm (10 menit) kemudian buang supernatan.
Kering anginkan pellet 20 menit Dan terakhir tambahkan buffer TE
50-100 l dan larutka pellet DNA dengan mengetukan tube perlahan
Tambah 1 l RNAse , inkubasi dalam oven (37oC selama 30 menit).
ISOLAT DNA pun di dapatkan jangan lupa Simpan dalam Freezer,
Dokumentasikan dan laporan pun siap menunggu untuk dikerjakan dan
dikumpulkanIV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil (Dokumentasi dan Keterangan)
NoGambarKeterangan
1Sampel yang digunakan adalah daun bayam
Hasilnya :
DNA tidak terlihat
2Sampel yang digunakan adalah daun belimbing
Hasilnya :
DNA terlihat
3Sampel yang digunakan adalah daun sawi hijau
Hasilnya :
DNA tidak terlihat
4.2 Pembahasan di banding dengan literature
Dari hasil praktikum dapat disimpulkan bahwa dari ketiga hasil
yang didapat dapat dilihat bahwa benang-benang yang terlihat jelas
hanya di sampel no dua (daun belimbing), hal ini dikarenakan untuk
sampel daun belimbing baru saja dipetik dan masih muda. Sehingga
memungkinkan untuk lebih terlihat DNA nya Sedangkan pada kedua
sampel lainya , DNA tidak terlihat, hal ini dikarenakan kedua
sampel lainya merupakan sampel dari kelompok sebelumnya yang
diambil lebih dahulu dibanding sampel daun belimbing. Selain itu
kegagalan isolat lainnya pada kedua sampel ialah pada saat
diletakkan pada freezer dan adanya human error. Human error pun
dapat disebabkan oleh adanya kesalahan saat pengambilan supernatant
atau saat pemberian larutan lainnya.Hal ini sesuai literatur yang
didapat, menurut Zubaidah (2004) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat
dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis
maupun bagian tanaman dapat menimbulkan masalah berbeda, antara
lain karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam
konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA dan juga
mempengaruhi enzim-enzim seperti polimerase, ligase, endonuklease
restriksi, atau enzim untuk kegiatan molekuler lain yang dapat
menyebabkan DNA tidak dapat digunakan untuk aplikasi
penelitian.Selain itu disebabkan adanya faktor internal dan
eksternal.V. PENUTUP5.1 Kesimpulan
Dari hasil praktikum dapat di simpulkan bahwa pada pengamatan
bahwa DNA terlihat pada sampel daun belimbing. Hal ini dikarenakan
untuk pengambilan sampel daun belimbing dipetiknya baru mendekati
saat pratikum dibandingkan pengambilan sampel lainnya
5.2Saran
Untuk praktikum
Alat yang digunakan perlunya pembaharuan mengenai jenis alat
yang digunakan.
Waktu untuk pratikum lebih diperhatikan lagi, agar pratikan bisa
mengikuti sampai tahapan terakhirUntuk assiten :
Sudah baik, lebih ditingkatkan lagi penjelasannya mbak , biar
kita tidak bingungDAFTAR PUSTAKAArdiana, Dwi Wahyuni.2009.Teknik
Isolasi DNA Genom Tanaman Pepaya dan Jeruk dengan Menggunakan
Modifikasi Bufer CTAB. Teknisi Litkayasa Nonkelas pada Balai
Penelitian Tanaman Buah Tropika, Sumatera Barat.B uletin Teknik
Pertanian Vol. 14 No. 1, 2009: 12-16.5halArumingtyas, EL. 2011.
Isolasi DNA dan RAPD. Disampaikan pada Pelatihan
Giri, Rahman EA . 2004. Regulasi Ekspresi Gen Pada Organisme
Bakteri. Bandung : KPP Bioteknologi Bandung.Istanti, Annie. 1999.
Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UMJamilah. 2005.
Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak
Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai
Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi
tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri MalangListanto, E;
pardal,s.j; Wang, k. 1996. Jurnal Bioteknologi Pertanian,
Indonesian Journal of Agricultural Biotechnologi. Metode sederhana
isolasi DNA dari tanaman jagung transgenic untuk polymerase chain
reaction. Balai penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan.
BogorMader,S.S.1993.Biology.Wm.C Brown Publishers: LowaPrasetyo, A.
2008. Karakterisasi virus pada tanaman jarak pagar (Jatropha curcas
L.). Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada. Skripsi.(Tidak
Dipublikasikan)Barnum, 05 Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an
Introduction, 2nd edition. USA : Thomson Brooks/Cole.Utami,
Annisa.dkk .2012. Variasi metode isolasi DNA daun temulawak
(cucurma xanthorrhiza). Prosiding seminar nasional kimia Unesa.
Surabaya Yuwono, Triwibowo.2006. Bioteknolgi Pertanian. Gadjag Mada
University Press. YogyakartaZubaidah, 2004.Isolasi dan
karakterisasi Gen Perbaikan DNA Baru pada Bakteri Radioresisten
Deinococcus radiodurans.Prosiding Seminar Nasional Sains dan Teknik
Nuklir, Bandung, Juni 2004.