BAB I PENDAHULUAN A. Dasar Teori Isolasi DNA Sebelum membahas mengenai isolasi DNA, ada baiknya kita sekilas membahas DNA itu sendiri. Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen dan intergen (Campbell dkk. 2004: 221). DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk. Organisme prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular, sedangkan organisme eukariotik mempunyai DNA berbentuk linier. DNA eukariot terletak dalam inti sel, sedangkan DNA prokariot terletak dalam sitoplasma. Struktur DNA pertama kali dijelaskan oleh James Watson dan Francis Crick. Mereka memperoleh model DNA dari hasil foto difraksi sinar X yang dibuat oleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins. Watson dan Crick menyimpulkan bahwa struktur DNA merupakan rantai ganda (double helix). Untai ganda tersusun dari dua rantai polinukelotida yang terpilin. Kedua rantai memiliki susunan antiparalel, yaitu satu rantai berorientasi dari ujung 5’ ke 3’sedangkan yang lain
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
BAB I
PENDAHULUAN
A. Dasar Teori
Isolasi DNA
Sebelum membahas mengenai isolasi DNA, ada baiknya kita sekilas membahas
DNA itu sendiri. Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling
penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi
genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA
dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional
maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen dan intergen
(Campbell dkk. 2004: 221).
DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk. Organisme
prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular, sedangkan organisme eukariotik mempunyai
DNA berbentuk linier. DNA eukariot terletak dalam inti sel, sedangkan DNA prokariot
terletak dalam sitoplasma.
Struktur DNA pertama kali dijelaskan oleh James Watson dan Francis Crick.
Mereka memperoleh model DNA dari hasil foto difraksi sinar X yang dibuat oleh
Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins. Watson dan Crick menyimpulkan bahwa struktur
DNA merupakan rantai ganda (double helix). Untai ganda tersusun dari dua rantai
polinukelotida yang terpilin. Kedua rantai memiliki susunan antiparalel, yaitu satu rantai
berorientasi dari ujung 5’ ke 3’sedangkan yang lain berorientasi ujung 3’ ke 5’. Ujung 5’
merupakan ujung yang berakhir dengan gugus 5-fosfat dan ujung 3’ berakhir dengan
gugus OH. Kedua rantai dihubungkan dengan ikatan hidrogen yang memghubungkan
kedua basa nitrogen.
Komponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat, dan basa nitrogen. Komponen gula
pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu gula ribose yang kehilangan satu atom
oksigen. Basa yang ada pada DNA ada dua macam, yaitu purin dan pirimidin. Purin
terbagi lagi menjadi dua macam, yaitu adenin dan guanin. Pirimidin terdiri dari dua jenis,
yaitu timin dan sitosin.
DNA mempunyai fungsi-fungsi yang sangat penting bagi tubuh kita. Hal tersebut
dikarenakan DNA merupakan molekul kehidupan utama di dalam sel makhluk hidup.
Fungsi-fungsi tersebut adalah:
Tempat menyimpan dan menyalurkan informasi genetik suatu makhluk hidup,
Fungsi heterokatalis, yaitu fungsi untuk melaksanakan pengaturan pembuatan
molekul-molekul lain yang penting dalam tubuh dan fungsi autokatalis, yaitu fungsi
DNA untuk mereplikasi dirinya sendiri.
DNA eukariot tidak hanya dijumpai pada nukleus, tetapi dapat ditemukan pada
mitokondria dan kloroplas. DNA yang diisolasi dari kloroplas menunjukkan sifat
berbentuk sirkular, terdiri dari untai ganda, replikasi semikonservatif, dan bebas dari
protein histon. DNA kloroplas penting dalam proses fotosintesis. DNA juga dijumpai
pada organisme prokariotik. DNA prokariot mempunyai DNA ekstranuklear yang
dinamakan plasmid. Plasmid merupakan DNA yang tidak terlalu esensial bagi fungsi
kehidupan bakteri, tetapi penting dalam pengaturan siklus hidup dan perumbuhan dalam
lokasi hidupnya.
Kebanyakan plasmid adalah sirkular dan tersusun dari beberapa ribu pasangan basa.
Plasmid mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga mampu mereplikasi diri
tanpa pengaturan dari DNA kromosom. Replikasi dimulai dari titik ori hingga semua
plasmid tereplikasi.
Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya
ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk
memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang
mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan
akan berada pada bagian atas tabung.
Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu
supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2002: 115).
Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen
dari campuran.
Terdapat sejumlah tujuan dari isolasi DNA, antara lain:
Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.
Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui
teknik Hibridisasi Southern
Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik.
Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA,
Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur
perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR.
Setiap maksud penggunaan DNA yang beragam membutuhkan persyarakan kualitas
DNA yang berbeda. Kualitas DNA tersebut ditentukan oleh hal-hal berikut:
Kemurnian
Panjang DNA
Kemampuan untuk dipotong oleh sembarang enzim
Tidak mengalami modifikasi kimiawi selama proses isolasi berlangsung
Oleh sebab itu, terdapat sejumlah teknik isolasi DNA, yang disesuaikan untuk
berbagai maksud penggunaan dan kualitas minimum yang ingin dicapai.
Isolasi DNA pada Tanaman
Metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA dari berbagai jenis tanaman, organ
tanaman, maupun jaringannya dapat dilakukan dengan berbagai cara. Namun pada intinya
terdapat tiga faktor utama yang sangat penting untuk dalam melakukan purifikasi dan
ekstraksi DNA secara maksimal. Pertama adalah cara dalam menghomogenkan jaringan
tanaman khususnya adalah dinding selnya. Kedua adalah komposisi dari larutan buffer
yang ditambahkan dalam penggerusan jaringan tanaman dan yang ketiga adalah
penghilangan enzim penghambat-polisakarida.
Sebagai contoh dari isolasi DNA tanaman adalah isolasi DNA tanaman pisang.
Tahapan yang dilakukan untuk mendapatkan DNA tanaman pisang adalah penggerusan
atau homogenasi daun pisang dengan penambahan nitrogen cair. Fungsinya adalah untuk
mempermudah penggerusan dan menjaga agar DNA tidak mengalami kerusakan. Hal ini
dilakukan sampai didapatkan daun tanaman pisang yang telah hancur. Selanjutnya
dilakukan penambahan buffer ekstrak yang berfungsi untuk melisiskan membran sel dan
membran fosfolipid bilayer, atau dalam praktikum kali ini hanya menggunakan nitrogen
cair karena memiliki fungsi yang sama dengan bufer ekstrak.
Kemudian dilakukan inkubasi sampel dalam water bath bersuhu 60 derajat C selama
60 menit. Hal ini dilakukan untuk optimalisasi kerja buffer ekstrak. Selanjutnya dilakukan
sentrifugasi sampel dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit dalam suhu 4 derajat
C. hal ini dilakukan untuk memisahkan debris dan komponen sel lain yang menjadi
pengotor dengan DNA. Hasilnya didapatkan bahwa supernatan berwarna hijau sedangkan
pelet berwarna putih kehijauan.
Supernatan yang telah diperoleh selanjutnya diambil dan ditambahkan dengan
larutan Phenol:Chloroform:Isolamyl Alkohol (PCI). Hal ini dilakukan untuk
mengekstraksi DNA dari kontaminan. Fenol merupakan pelarut organik yang dapat
melarutkan protein, lipid dan molekul lain sepergi polisakarida sehingga diharapkan akan
didapatkan supernatan yang berisi DNA bebas kontaminan. Setelah pencampuran,
homogenat tersebut divorteks untuk optimalisasi homogenasi.
Selanjutnya dilakukan sentrofugasi homogenat dengan PCI tersebut dengan
kecepatan 10000 rpm selama 10 menit dalam suhu 4 derajat C. hasil yang didapatkan
adalah supernatan dan pelet yang berada pada tiga lapisan lapisan atas berwarna hijau
jernih, lapisan tengah berwarna hijau keruh dan pelet yang berwarna hijau tua. Kemudian
diambil supernatan pada lapisan paling atas dan ditambahkan larutan Chloroform:Isoamyl
Alkohol untuk presipitasi lanjutan. Kemudian kembali dilakukan vorteks dan sentrifugasi.
Untuk memperoleh DNA dari daun tanaman pisang, diperlukan bahan seperti
nitrogen cair atau buffer ekstrak (2%CTAB, 100 mM Tris-HCl (pH:8), 20 mM EDTA, 14