KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIFBAB IPENDAHULUANA. Latar
BelakangPada zaman sekarang ini orang kembali lagi menggeluti bahan
alam sebagai bahan penting dalam membuat obat. Para ahli sekarang
ini telah memulai meneliti kembali tanaman obat untuk mengetahui
khasiat yang lebih mendalam dari tanaman tersebut.Didaerah-daerah
pedalaman, banyak masyarakat yang masih menggunakan tumbuh-tumbuhan
yang mereka anggap mempunyai khasiat untuk pengobatan untuk
beberapa penyakit tertentu, tanpa pengetahuan dasar. Ada beberapa
kasus, dimana masyarakat menggunakan suatu obat, yang ternyata
setelah diketahui zat aktifnya melalui ekstraksi dan identifikasi
komponen kimia, ternyata memberikan efek yang berlawanan, hal ini
tentunya membahayakan bagi jiwa manusia.Dari alasan tersebut di
atas, maka dianggap perlu pengetahuan yang cukup untuk mengenal
berbagai macam tumbuhan yang berkhasiat obat, mulai dari morfologi,
kegunaan, prinsip-prinsip ekstraksi, isolasi dan identifikasi
komponen kimia yang terdapat dalam suatu simplisia, khususnya bagi
seorang farmasis.Pisang ambon (Musa acuminata Colla) merupakan
contoh dari tanaman yang digunakan oleh masyarakat untuk
melancarkan pencernaan, dapat mengurangi rasa nyeri pada
persendian, mencegah terjadinya osteoporosis, dan menjaga kesehatan
kulit. hal inilah yang melatar belakangi Pisang ambon (Musa
acuminata Colla) diambilnya sebagai salah satu sampel karena
memiliki kandungan senyawa antioksidan sehingga kita mau
mengisolasinya.Dalam uji fitokimia ini, kita akan melakukan isolasi
sampel dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis
preparatif, dimana fraksi-fraksi yang didapat dari kromatografi
kolom konvensional ditotolkan pada lempeng, dengan fase diamnya
adalah silica gel kasar dan fase geraknya adalah eluen klorofrom :
methanol yang akan dilihat nilai Rf dan nodanya pada sinar UV 254
dan sinar UV 366.B. Rumusan MasalahAdapun rumusan masalahnya yaitu
bagaimana cara mengisolasi ekstrak pisang ambon (Musa acuminata
Colla) dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis
preparatifC. Maksud dan Tujuan Praktikum1. Maksud PraktikumAdapun
maksud dilakukannya praktikum ini adalah untuk mengisolasi senyawa
aktif antioksidan daro ekstrak kulit pisang ambon (Musa acuminata
Colla) dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis
preparatif.2. Tujuan PraktikumAdapun tujuan percobaan ini yaitu
untuk mendapatkan isolate yang aktif sebagai antioksidan dari
ekstrak kulit pisang ambon (Musa acuminata Colla) menggunakan
kromatografi kolom preparatif berdasarkan warna dan tingkat
kepolaran.3. Manfaat PraktikumAdapun mamfaat dari praktikum ini
adalah praktikan dapat memisahkan komponen kimia dari fraksi
klorofrom Pisang ambon (Musa paradisiaca) dengan menggunakan metode
kromatografi lapis tipis preparatif.
BAB IITINJAUAN PUSTAKAA. Uraian Tanaman1. Klasifikasi tanaman
(Integrated Taxonomic Information System, 2014).Regnum:
PlantaeSubregnum: ViridaeplantaeInfraregnum: StreptophytaDevisi :
TracheophytaSub devisi : Spermatophytina Class : Magnoliopsida
Superorder: Lilianae Order : Zingiberales Family: Musaceae Genus :
Musa LSpecies : Musa acuminata Colla.1. Morfologi pisang
ambonSeperti tanaman yang lainnya, tanaman pisang mempunyai
bagian-bagian tanaman seperti akar, batang, daun, bunga, buah dan
biji. Menurut (Tjahjadi, 1991) akar pohon pisang merupakan akar
serabut yang berpangkal dari umbi batang yang sebagian letaknya
berada di bawah tanah. Rata-rata panjangnya adalah 4-5 meter untuk
yang menjalar kesamping dan hanya 75-150 cm untuk yang tumbuh ke
dalam tanah. Batang pisang menurut (Nakasone, 1998) merupakan
batang semu yang terbentuk dari pelepah daun yang membesar di
pangkalnya dan mengumpul membentuk struktur berselangseling yang
terlihat kompak sehingga tampak sebagai batang (pseudo stem).
Secara fisiologi daun pisang menurut (Nur et al., 2006) berwarna
hijau tua untuk daun yang dewasa dan hijau muda untuk daun yang
masih muda kecuali untuk beberapa spesies, terdapat bercak merah
pada lembaran daunnya atau pada ibu tulangnya. Daun pisang memiliki
pelepah daun yang yang membesar dan mengumpul berselang seling
membentuk suatu struktur seperti batang yang disebut psudo stem.
Bunga terdiri dari kumpulan dua baris bunga pertama dan disusul
bunga jantan. Braktea membuka secara sekuen sekitar satu per hari.
Tangkai bunga terus memanjang sampai 1,5 m. Buah kemungkinan
berkembang dari ovari interior dan eksokarp disusan pada lapisan
epidermis dan paerenkim, dengan daging menjadi mesokarp. Endokarp
terdiri atas lapisan hampir rongga ovar.ian. Masing-masing node
memiliki dua baris pada bunga yang membentuk tandan pada buah dan
secara umum disebut sisir dengan buah individual yang disebut
finger (Nakasone, 1998).1. Kandungan kimia Menurut Atun et al.,
2007 menyebutkan bahwa kulit buah pisang ambon (Musa acuminata
Colla) kaya akan senyawa flavonoid, maupun senyawa fenolik yang
lainnya, disamping banyak mengandung karbohidrat, mineral seperti
kalium dan natrium, serta selulosa. Hasil penapisan fitokimia
ekstrak menunjukkan hasil positif untuk senyawa tannin, kuinon,
flavonoid dan polifenolat (Fitrianingsih et al., 2012). Menurut
Kanazawa dan Sakakibara (2000) jenis flavonoid yang teridentifikasi
adalah narigenin dan rutin, serta menurut Someya (2002), terdapat
katekin, galokatekin dan epikatekin.1. Manfaat tanamanPisang ambon
merupakan buah yang banyak dikonsumsi oleh masyarakat karena
mengandung senyawa yang disebut asam lemak rantai pendek, yang
memelihara lapisan sel jaringan dari usus kecil dan meningkatkan
kemampuan tubuh untuk menyerap nutrisi. Menurut penelitian yang
telah dilakukan buah pisang ambon matang sangat efektif dalam
mengurangi keparahan klinis dari penyakit diare dan banyak
mengandung vitamin, mineral, protein dan karbohidrat yang baik
untuk dikonsumsi tubuh (Amrullah dan Elly, 1985).B. Metode
Kromatografi Lapis Tipis PreparatifIstilah kromatografi mula-mula
ditemukan oleh Michael Tswett (1908), seorang ahli botani Rusia.
Nama kromatografi diambil dari bahasa Yunani (chromato= penulisan
dangrafe= warna). Kromatografi berarti penulisan dengan warna.
Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas
perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantara dua
fase, yaitu fase diam (stationary) dan fasa bergerak (mobile). Fasa
diam dapat berupa zat padat atau zat cair, sedangkan fasa bergerak
dapat berupa zat cair atau gas (Yazid, 2005). Kromatografi adalah
proses melewatkan sampel melalui suatu kolom, perbedaan kemampuan
adsorpsi terhadap zat-zat yang sangat mirip mempengaruhi resolusi
zat terlarut dan menghasilkan apa yang disebut kromatogram
(Khopkar, 2008).Pada kromatografi lapis tipis preparatif, cuplikan
yang akan dipisahkan ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi
pelat lapisan besar dan dikembangkan secara tegak lurus pada garis
cuplikan sehingga campuran akan terpisah menjadi beberapa pita.
Pita ditampakkan dengan cara yang tidak merusak jika senyawa itu
tanwarna, dan penyerap yang mengandung senyawa pita dikerok dari
pelat kaca. Kemudian cuplikan dielusi dari penyerap dengan pelarut
polar. Cara ini berguna untuk memisahkan campuran reaksi sehingga
diperoleh senyawa murni untuk telaah pendahuluan, untuk menyiapkan
cuplikan analisis, untuk meneliti bahan alam yang lazimnya
berjumlah kecil dan campurannya rumit dan untuk memperoleh cuplikan
yang murni untuk mengkalibrasi kromatografi lapis tipis kuantitatif
(Gritter, 1991).Pengembangan plat KLTP biasanya dilakukan dalam
bejana kaca yang dapat menampung beberapa plat. Keefisienan
pemisahan dapat ditingkatkan dengan cara pengembangan berulang.
Harus diperhatikan bahwa semakin lama senyawa berkontak dengan
penyerap maka semakin besar kemungkinan penguraian (Hostettman,
1995). Pendeteksian bercak hasil pemisahan dapat dilakukan dengan
beberapa cara. Untuk senyawa tak berwarna cara yang paling
sederhana adalah dilakukan pengamatan dengan sinar ultraviolet.
Beberapa senyawa organik bersinar atau berfluorosensi jika disinari
dengan sinar ultraviolet gelombang pendek (254 nm) atau gelombang
panjang (366 nm). Jika dengan cara itu senyawa tidak dapat
dideteksi maka harus dicoba disemprot dengan pereaksi yang membuat
bercak tersebut tampak yaitu pertama tanpa pemanasan, kemudian bila
perlu dengan pemanasan (Gritter,1991).Pada kromatografi lapis
tipis, fase diam berupa lapisan tipis yang terdiri atas bahan padat
yang dilapiskan pada permukaan penyangga datar yang biasanya
terbuat dari kaca, dapat pula terbuat dari plat polimer atau logam.
Lapisan melekat pada permukaan dengan bantuan bahan pengikat,
biasanya kalsium sulfat atau amilum (pati). Penjerap yang umum
dipakai untuk kromatografi lapis tipis adalah silika gel, alumina,
kieselgur, dan selulosa (Gritter, 1991). Dua sifat yang penting
dari fase diam adalah ukuran partikel dan homogenitasnya, karena
adhesi terhadap penyokong sangat tergantung pada kedua sifat
tersebut. Ukuran partikel yang biasa digunakan adalah 1-25 mikron.
Partikel yang butirannya sangat kasar tidak akan memberikan hasil
yang memuaskan dan salah satu cara untuk memperbaiki hasil
pemisahan adalah dengan menggunakan fase diam yang butirannya lebih
halus. Butiran yang halus memberikan aliran pelarut yang lebih
lambat dan resolusi yang lebih baik (Sastrohamidjojo, 1985).Fase
gerak ialah medium angkut yang terdiri atas satu atau beberapa
pelarut. Jika diperlukan sistem pelarut multi komponen, harus
berupa suatu campuran sesederhana mungkin yang terdiri atas
maksimum tiga komponen (Stahl, 1985). Dalam pemisahan senyawa
organik selalu menggunakan pelarut campur. Tujuan menggunakan
pelarut campur adalah untuk memperoleh pemisahan senyawa yang baik.
Kombinasi pelarut adalah berdasarkan atas polaritas masing-masing
pelarut, sehingga dengan demikian akan diperoleh sistem pengembang
yang cocok. Pelarut pengembang yang digunakan dalam kromatografi
lapis tipis antara lain: n-heksana, karbontetraklorida, benzena,
kloroform, eter, etilasetat, piridian, aseton, etanol, metanol dan
air (Gritter, 1991).Dalam mengidentifikasi noda-noda dalam
kromatografi sangat lazim menggunakan harga Rf (Retordation Factor)
yang didefinisikan sebagai: Rf = Harga Rf beragam mulai dari 0
sampai 1. Faktor-faktor yang mempengaruhi harga Rf
(Sastrohamidjojo, 1985): a. Struktur kimia dari senyawa yang sedang
dipisahkan b. Sifat Penjerap c. Tebal dan kerataan dari lapisan
Penjerap d. Pelarut dan derajat kemurniannya e. Derajat kejenuhan
uap pengembang dalam bejana f. Teknik percobaang. Jumlah cuplikan
yang digunakan h. Suhu i. Kesetimbangan
BAB IIIMETODE PRAKTIKUMA. Alat dan Bahan1. AlatAdapun alat yang
digunakan pada praktikum ini adalah batang pengaduk, botol coklat,
cawan porselin, gelas kimia, kolom kaca, pipa kapiler, pipet
volume, sendok tanduk besi, statif, timbangan analitik dan vial.2.
BahanAdapun bahan yang digunakan yaitu aluminium foil, aquadest,
etil asetat, ekstrak kulit pisang ambon, kapas, kertas saring,
kloroform, methanol, silika gel kasar, dan tissue.B. Cara Kerja0.
Penyiapan Sampel1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan 1.
Diambil fraksi dari hasil Kromatografi kolom dengan perbandingan
eluen methanol : kloroform (7 : 3)1. Ditotolkan pada lempeng kaca
ukuran 20x 20 cm secara berhimpitan0. Penyiapan Eluen1. Dibuat
perbandingan eluen methanol : kloroform (7 : 3) dan dihomogenkan1.
Dimasukkan dalam chamber dan dijenuhkan terlebih dahulu0. Penyiapan
fase diam1. Disiapkan lempeng dengan ukuran 20 x 20 cm 1. Digaris
lempeng dengan batas atas 0,5 cm dan batas bawah 1 cm dengan
menggunakan pensil0. Cara kerja1. Disiapkan alat dan bahan yang
akan digunakan1. Dimasukkan lempeng yang telah ditotol dalam
chamber yang berisi eluen1. Diamati noda yang terelusi yang naik
sampai tanda batas1. Diamati pada lampu UV 254 nm dan 366 nm0.
Pengelompokan Fraksi1. Ditandai noda yang terbentuk berwarna terang
pada lempeng preparatif dengan menggunakan pensil1. Disemprot
dengan pereaksi DPPH agar melihat aktivitas antioksidannya.1.
Dikeruk noda yang dihasilkan pada lempeng1. Pita-pita yang telah
dikeruk dimasukkan dalam vial lalu diberi label
BAB IVHASIL & PEMBAHASANA. Hasil
PraktikumNoPitaRfKeterangan
1.2.Pita 1Pita 2
Aktif sebagai antioksidan
Aktif sebagai antioksidan
Keterangan :Tumbuhan sampel : Kulit pisang ambonFase diam :
Silika gelFase gerak : Eluen klorofrom : methanol (7:3)Ukuran
lempeng : 20 x 20 cm
B. PembahasanKromatografi adalah proses melewatkan sampel
melalui suatu kolom, perbedaan kemampuan adsorpsi terhadap zat-zat
yang sangat mirip mempengaruhi resolusi zat terlarut dan
menghasilkan apa yang disebut kromatogram.Pada kromatografi lapis
tipis preparatif, cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan berupa
garis pada salah satu sisi pelat lapisan besar dan dikembangkan
secara tegak lurus pada garis cuplikan sehingga campuran akan
terpisah menjadi beberapa pita. Pita ditampakkan dengan cara yang
tidak merusak jika senyawa itu tanwarna, dan penyerap yang
mengandung senyawa pita dikerok dari pelat kaca. Kemudian cuplikan
dielusi dari penyerap dengan pelarut polar. Cara ini berguna untuk
memisahkan campuran reaksi sehingga diperoleh senyawa murni untuk
telaah pendahuluan, untuk menyiapkan cuplikan analisis, untuk
meneliti bahan alam yang lazimnya berjumlah kecil dan campurannya
rumit dan untuk memperoleh cuplikan yang murni untuk mengkalibrasi
kromatografi lapis tipis kuantitatif.Sampel yang digunakan dalam
praktikum ini adalah ekstrak kulit pisang ambon Kulit pisang ambon
(Musa acuminata Colla) Menurut Atun et al., 2007 menyebutkan bahwa
kulit buah pisang ambon (Musa acuminata Colla) kaya akan senyawa
flavonoid, maupun senyawa fenolik yang lainnya, disamping banyak
mengandung karbohidrat, mineral seperti kalium dan natrium, serta
selulosa. Hasil penapisan fitokimia ekstrak menunjukkan hasil
positif untuk senyawa tannin, kuinon, flavonoid dan polifenolat
(Fitrianingsih et al., 2012). Menurut Kanazawa dan Sakakibara
(2000) jenis flavonoid yang teridentifikasi adalah narigenin dan
rutin, serta menurut Someya (2002), terdapat katekin, galokatekin
dan epikatekin. Dimana Pisang ambon merupakan buah yang banyak
dikonsumsi oleh masyarakat karena mengandung senyawa yang disebut
asam lemak rantai pendek, yang memelihara lapisan sel jaringan dari
usus kecil dan meningkatkan kemampuan tubuh untuk menyerap nutrisi.
Menurut penelitian yang telah dilakukan buah pisang ambon matang
sangat efektif dalam mengurangi keparahan klinis dari penyakit
diare dan banyak mengandung vitamin, mineral, protein dan
karbohidrat yang baik untuk dikonsumsi tubuh (Amrullah dan Elly,
1985).Dalam fitokimia dilakukan suatu proses isolasi dari suatu
komponen kimia dari tumbuhan yang banyak digunakan dalam pengobatan
tradisional yang berkembang menjadi obat modern. Menggunakan cara
yang bervariasi tergantung dari sifat fisika dan kimia komponen
tersebut. Kemudian dilanjutkan dengan proses pemurnian dengan
kristalisasi dengan tujuan mendapatkan senyawa kimia yang
penampakannya bagus dan kelihatan lebih banyak. Metode fitokimia
sangat penting artinya dalam bidang farmasi sebagai salah satu cara
meneliti senyawa aktif yang terdapat dalam tumbuhan.Prinsip dari
kromatografi Lapis Tipis Preparatif yaitu adsorpsi dan partisi,
adsorpsi yaitu penyerapan pada permukaan oleh adanya fase diam
(silica) sedangkan partisi yaitu pemisahan oleh adanya fase gerak
(eluen).Tujuan dilakukannya praktikum ini yaitu untuk mendapatkan
isolat aktif dari sampel pisang ambon (Musa acuminata Colla) dengan
metode kromatografi lapis tipis preparatif.Dalam praktikum ini,
yang dilakukan yaitu kromatografi lapis tipis preparatif. Dimana
faksi terbaik dari percobaan KKK dan KCV diambil kemudian dibuat
eluen sesuai dengan fraksi yang dipilih. Lalu fraksi ditotol pada
lempeng KLT dengan penotolan yang berkesinambungan. setelah itu
lempeng di elusi di dalam chamber dengan menggunakan eluen
kloroforom : metanol (7:3), setelah nodanya naik dilihat pada UV
254 dan 366 kemudian tandai noda yang tampak seperti pita,
didapatkan dua pita yang masing-masing memiliki nilai Rf, yaitu
pada pita pertama didapat nilai Rf 0,81 cm dan pada pita kedua
didapatkan nilai Rf 0,77 cm. Kemudian, noda yang nampak dikeruk dan
dimasukkan ke dalam botol sentrifug kemudian disentrifugasi selama
15 menit dengan kecepatan 800 rpm. Setelah terbentuk endapan
haslilnya disaring dan dimasukkan ke dalam vial.
BAB VPENUTUPA. KesimpulanDari hasil percobaan menggunakan metode
kromatografi lapis tipis preparative diperoleh dua pita yang aktif
sebagai antioksidan dengan nilai Rf 1 = 0,81 cm dan Rf 2 = 0,77
cm.B. SaranSebaiknya praktikum dapat dilakukan dengan metode
berbeda agar lebih banyak lagi di tahu cara mengekstraksi dengan
metode-motode lain.
DAFTAR PUSTAKAAnonim. 2015. Penuntun dan Buku Kerja Fitokimia
II. Universitas Muslim Indonesia; Makassar.Bamidele,O, Akinnuga,
AM, Anyakudo, MMC, Ojo, OA, Olorunfemi, JO &Dalimartha.,
Setiawan. 2009. Atlas Tumbuhan Obat Indonesia Jilid 6. Jakarta:
Pustaka Bunda.Gritter J.R, dkk., 1991., Pengantar Kromatografi.,
Penerbit ITB, Bandung.Halawane, J. E., N. Hanif.,dan J. Kinho.
2011.Masa Depan.Buku.Balai Penelitian Kehutanan Manado
:Manado.Hendayana, Sumar, dkk. 1994. KIMIA ANALITIK INSTRUMENTASI
IKIP Semarang Press: Semarang.
Integrated Taxonomic Information System, 2015 (online). Diakses
tanggal 3 Mei 2015
(http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=36481)J.
B. Harbone. 1987. Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern
Menganalisis Tumbuhan. Penerbit ITB. Bandung.Kamboj, A &Saluja,
AK 2011, Isolation of Stigmasterol and -sitosterol from Petroleum
Ether Extract of Aerial Parts of Ageratum conyzoides (Asteraceae),
Int J Pharm Pharm Sci, vol.3, no. 1,p.94. Kartesz, JT
2012,Khopkar., S.M., 2008, Dasar-dasar Kimia Analitik, Jakarta,
Erlangga.Ndip, RN, Ajonglefac, AN, Wirna, T, Luma, HN, Wirmum, C
& Efange,SMN2009, In-Vitro Antimicrobial Activity of Ageratum
conyzoides (Linn) on Clinical Isolates of Helicobacter pylori, Afr
J Pharm Pharmacol, vol. 3, no. 11, pp. 586, 590. Prasad, KB 2011,
Evaluation of Wound Healing Activity of Leaves of Ageratum
Conyzoides, Int J of Pharm Pract Drug Res, vol. 1, no. 1 , pp.8, 9,
12.Rohman, Abdul. 2009. Kromatografi untuk Analisis Obat. Graha
Ilmu : Jakarta.Sachin, J, Neetesh, J, Tiwari, A, Balekar, N &
Jain, DK2009,Sample Evaluation of Wound Healing Activity of
Polyherbal Formulation of Roots of Ageratum conyzoides Linn, Asian
J Res Chem, vol. 2,no. 2, p. 137.Sastrohamidjojo., 1985,
Kromatografi, Penerbit Liberty, Yogyakarta.Stahl, Egon. 1991.
Analisis Obat secara Kromatografi dan Mikroskopi. Penerbit ITB:
Bandung.
Lampiran 1. Skema kerja isolasi senyawa aktif antioksidan dari
ekstrak kulit pisang ambon dengan metode kromatografi lapis tipis
preparatif
Alat dan bahan
Pilih fraksi pada KKK dan KCV
Ditotolkan pada lempeng KLT ( ukuran 20x20 cm)
Dielusi dengan eluen yang sesuai
Dan akan terbentuk pita
Diamati di lampu UV
Lempeng hasil KLT disemprot dengan pereaksi tertentu
Fraksi aktif dikeruk
Disimpan dalam vial
Dilanjutkan uji kemurnian
Lampiran 2. Gambar hasil praktikum Pita 1 dan Pita 2 (a)
(b)
( c )Keterangan :Tumbuhan sampel : Kulit pisang ambonFase diam :
Silika gelFase gerak : Eluen klorofrom : methanol (7:3)3. UV 2543.
UV 3663. Semprotan DPPHPutri Atthohiriyah B M Syawaliah Purnama
S.farm 150 2012 0247