LAPORAN LENGKAP KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
BAB IPENDAHULUAN
Kromatografi digunakan sebagai untuk memisahkan substansi
campuran menjadi komponen-komponennya, misalnya senyawa Flavonoida
yang terdapat pada tahu, tempe, bubuk isoflavon memiliki banyak
manfaat. Beberapa kelabihan senyawa isoflavon yang potensial bagi
kesehatan manusia, diantaranya adalah sebagai antioksidan,
antitumor / antikanker, antikolestrol, antivirus, antialergi, dan
dapat mencegah osteoporosis. Dan semua kromatografi bekerja
berdasarkan metode kromatografi.Kromatografi telah didefinisikan
terutama sebagai suatu proses pemisahan yang digunakan untuk
pemisahan campuran yang pada hakekatnya molekuler. Kromatografi
bergantung pada pembagian-ulang molekul-molekul campuran antara dua
fase atau lebih. Tipe-tipe kromatografi mencakup kromatografi
adsorbs, kromatografi partisi cairan, dan pertukaran ion. Sistem
utama yang digunakan dalam kromatografi partisi adalah: partisi
gas, partisi cairan yang menggunakan alas tak bergerak (misalnya
kromatografi kolom), kromatografi kertas dan lapis tipis. Dalam
tiap kasus terjadi distribusi antara fase cair yang terserap secara
stasioner dan zat-alir bergerak yang kontak secara karib dengan
fase cair itu. Dalam kromatografi partisi cairan, fase cair yang
bergerak mengalir melewati fase cair stasioner yang diserapkan pada
suatu pendukung; dalam kromatografi kertas pendukung itu adalah
kertas atau kertas terolah, sedangkan dalam kromatografi lapisan
tipis adsorbennya disalutkan pada lempeng kaca atau lembaran
plastic. Hanya akan dibahas aspek-aspek yang dipilih dari
kromatografi partisi pada selulosa dengan rujukan khusus ke
analisis anorganik.Maksud percobaan adalah untuk mengetahui metode
penentuan kima secara kromatografi lapis tipis.Tujuan percobaan
adalah untuk memisahkan campuran senyawa fase dengan metode
kromatografi lapis tipis dan untuk mengetahui nila RfPrinsip
percobaan adalah adsorbs dan partisi dimana adsorbs adalah
penyerapan pada pemulaan, sedangkan partisi adalah penyebaran atau
kemampuan suatu saat yang ada dalam larutan untuk berpisah kedalam
pelarut yang digunakan.
BAB IIPEMBAHASAN
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan
perbedaan kecepatan peramabatan komponen dalam medium tertentu.
Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua
buah fase yaitu fase diam dan fase gerak.Pemisahan KLT dikembangkan
oleh Ismailoff dan Schraiber pada tahun (1938). Tekniknya
menggunakan penyokong fase diam berupa lapisan tipis sepreti
lempeng kaca, aluminium atau plat inert.Derajat retensi pada
kromatografi lempeng biasanya dinyatakan sebagai factor resensi,
Rf:Pada fase diam, jika dilihat mekanisme pemisahan, fase diam
dikelompokkan:a. Kromatogarfi serapan (Silika gel, alumina,
keiselguhr)b. Kromatografi partisi (Selulosa, keiselguhr, silika
gel)c. Kromatografi penukar ion (Penukar ion selulosa, resina
penukat ion)d. Kromatografi gel (Sephadex, Biogel)Pada fase gerak,
pada proses serapan, yang terjadi jika menggunakan silika gel,
alumina dan fase diam lainnya, pemilihan pelarut mengikuti aturan
kromatografi kolom serapan. System tak berair paling banyak
digunakan dan contoh pelarut organik dalam seri pelarut mikroskop
diberikan dalam Tabel 25, yang meliputi (sifat hidrofob menaik)
methanol, asam asetat, etanol, aseton, etil asetat, eter, kloroform
(perlu diperhatikan pada kloroform yang distabilkan dengan etanol)
benzene, sikloheksana, dan eter petroleum.KLT mempunyai beberapa
kelebihan, yaitu:1. Waktu pemisahan lebih cepat2. Sensitive,
artinya meskipun jumlah cuplikan sedikit masih dapat dideteksi.3.
Daya resolusinya tinggi, sehingga pemisahan lebih sempurna.Aspirin,
phenacetin dan kofein (APC) sering digunakan dalam kombinasi
sebagai sediaan antipiretik analgetik. Penentuan dan
identifikasinya sangat penting yang dapat dilakukan secara
kromatografi lapis tipis.Prosedur di sini mengikuti Ganshirt dan
Malzachur dan penyiapan lempeng sederahan menurut metode Less dan
De Muria. Noda ditampakkan dengan semprotan permanganat dalam
suasana asam, yang akan mengoksidasi senyawa sampel hingga
menghilangkan warna permanganate.
BAB IIIMETODE KERJAA. Alat-alat yang digunakan1. Batang
pengaduk2. Bejana KLT (chamber) + tutup3. Botol semprot4.
Erlenmeyer5. Gelas kimia6. Gelas objek / plat KLT7. Isolasi8. Pipa
kapilerB. Bahan-bahan yang digunakan1. Asam asetat glacial2. Asam
kromat3. Asam sulfat4. Benzene5. Dietileter6. Kalium permanganate7.
Kloroform8. Methanol absolute9. Sampel10. Silika gel11. Zat
pembandingC. Cara kerja1. Penyiapan lempeng1.1 Disiapkan alat dan
bahan yang digunakan1.2 Dibersihkan 8 glas objek (25mm x 75mm)
dengan larutan asam kromat. Kemudian asam sulfat, dibilas dengan
air dan dikeringkan1.3 Dibuat bubur, dari 3gram silika gel G dan 6
ml air diaduk dengan mortis.1.4 Bubur yang sudah jadi dilapiskan
pada plat (glas objek) dengan menggunakan batang pengaduk dengan
ketebalan sekitar 0,1mm sampai 0,3mm.1.5 Dikeringkan, setelah
kering dipindahkan glas objek ke oven dan diaktifkan pada suhu
1000C Selma 1 jam.1.6 Plat atau lempeng yang sudah diaktifkan
disimpan dalam desikator.2. Penyiapan pengembang kromatografi2.1
Disiapkan alat dan bahan yang digunakan2.2 Dipipet 1ml methanol
absolute, 18,090 ml asetat glacial, 60,301ml, dietileter, dan
120,60ml benzene2.3 Dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan
dihomogenkan2.4 Dimasukkan ke dalam chamber secukupnya2.5
Dijenuhkan chamber dengan menutup sambil digoyang kemudian
didiamkan.3. Penotolan sampel3.1 Disiapkan alat dan bahan3.2 Sampel
dilarutkan dalam kloroform 5-10mg/ml, kemudian ditotolkan pada
ujung lempeng (kurang lebih 1,5cm dari ujung) menggunakan pipet
halus (pipa kapiler untuk penentuan titik leleh). Diameter totolan
boleh lebih dari 3cm.3.3 Dianginkan sampai kering.4. Eluen dengan
larutan pengembang4.1 Disiapkan alat dan bahan4.2 Lempeng yang
sudah ditotol dengan sampel dimasukkan ke dalam chamber, kemudian
ditutup dengan segera.4.3 Setelah permukaan pelarut naik kurang
lebih 5cm atau kira-kira 1cm dari ujung atas, diangkat lempeng dari
chamber.4.4 Diberi tanda posisi pelarut lalu dikeringkan di
ujung4.5 Dimasukkan ke dalam oven beberapa menit untuk
menghilangkan pelarut organik.
URAIAN BAHAN1. Asam asetat (FI edisi III, hal 42)Nama resmi :
ACIDUM ACETICUM GLACIALENama lain : Asam asetat glacialRumus
molekul : C2H2O2Berat molekul : 60,05Pemerian : Cairan jernih,
tidak berwarna, bau khas, tajam, jika diencerkan dengan air, rasa
asamKelarutan : Dapat campur dengan air, dengan etanol (95%) P dan
dengan gliserol PPenyimpanan : Dalam wadah tertutup rapatKegunaan :
Zat tambahan2. Asam kromat (FI edisi III, hal 650)Larutkan 84gram
kromtrioksida P dalam 700ml air, tambahan 400ml asam sulfat P
perlahan-lahan sambil diaduk.3. Asam sulfat (FI edisi III, hal
58)Nama resmi : ACIDUM SULFURICUMNama lain : Asam sulfatRumus
molekul : H2SO4Berat molekul : 98,07Pemerian : cairan kental
seperti minyak, korosit, tidak berwarna, jika ditambahkan ke dalam
air menimbulkan panas.Penyimpanan : Dalam wadah tertutup
rapat.Kegunaan : Zat tambahan4. Benzen (FI edisi III, hal
658)Benzen P C6H6, cairan tidak berwarna, transparan mudah terbakar
pemerian cairan transparan: tidak berwarna, mudah menyala.5.
Coffeinum (FI edisi III, hal 175)Nama resmi : COFFEINUMNama lain :
kofeinRumus molekul : C8H10N4O2Berat molekul : 194,19Pemerian :
serbuk hablur berbentuk jarum, meningkat biasanya menggumpal putih,
tidak berbau, rasa pahit.Kelarutan : agak sukar larut dalam air dan
etanol 95% P, mudah larut dalam kloroform P.Penyimpanan : Dalam
wadah tertutup baik.Kegunaan : Stimulan saraf pusat kardiafik.6.
Dietil eter (FI edisi III, hal 650)Nama resmi : DIETIL ETERNama
lain : Dieti, eterRumus molekul : C2H5ORJ : 0,714 gram 0,78
gramJarak didih : Tersuling sempurna pada suhu antara 340C dan
360C.7. Methanol (FI edisi III, hal 706)Nama resmi : METANOLUMNama
lain : methanolRumus molekul : CH2OHBerat jenis : 0,796
0,798Pemerian : Cairan jernih tidak berwarna, bau khasKelarutan :
Dapat bercampur dengan air membentuk cairan jernih tidak
berwarna.
PembahasanKromatografi lapis tipis (KLT) merupakan metode
pemisahan fitokimia dengan adsorbs pada lapisan tipis adsorben
dikenal dengan nama Thin Lager Chormatografi ( TLC). Prinsip kerja
KLT adalah partisi dan adsorbs dimana aleum sebagai fase gerak dan
lempeng KLT sebagai fase diam.KLT sebagai salah satu metode
instrumental yang sering digunakan, karena mempunayi keuntungan
antara lain sebagai berikut :1. Peralatan yang diperlukan sedikit2.
Waktu analisis yang cepat3. Hasil pemisahan lebih baik4. Daya
pemisahan tinggi5. Pengerjaannya sederhana dan mudah6. Harganya
terjangkauDalam praktikum yang telah digunakan fase gerak yaitu
eluen dan terdiri dari methanol absolute, asam asetat glacial,
dietil eter, dan benzene dengan perbandingan 1 : 18 : 60 : 120, dan
fase diam digunakan lempeng KLT yang mana telah dilapisi dengan
silika gel yang berfungsi sebagai penyerap atau penyangga atau
sampel dan eluen. Sebelum lempeng yang dielusi dengan sampel
dimasukkan kertas saring. Chamber yang berisi eluen yang akan
merambat keluar melalui kertas saring. Alasan mengapa eluen harus
dijenuhkan yaitu agar tekanan dalam chamber sama agar noda yang
dihasilkan sesuai dengan diinginkan.
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan
perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada
kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah
fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan
komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen
campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan
tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak
akan bergerak lebih cepat. ( Imam Haqiqi, Sohibul,2008 )
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran
senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang
menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang
memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya.
KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa senyawa yang sifatnya
hidrofobik seperti lipida lipida dan hidrokarbon yang sukar
dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk
mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang
diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara
kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil. ( Anggraeni,
Megawati,2009 )
Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa tekhnik
kromatografi. Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar
bergantung pada sifat kelarutan senyawa yang akan dipisahkan. Semua
kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau
kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas).
Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen
yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda
bergerak pada laju yang berbeda. ( Anggraeni, Megawati,2009 )
Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis
tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas
atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau alumina)
merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis
seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour
dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut atau
campuran pelarut yang sesuai.Pelaksanaan ini biasanya dalam
pemisahan warna yang merupakan gabungan dari beberapa zat pewarna
atau pemisahan dan isolasi pigment tanaman yang berwarna hijau dan
kuning.
a. KromatogramPelaksanaan kromatografi biasanya digunakan dalam
pemisahan warna yang mdrupakan sebuah campuran dari beberapa zat
pewarna.Contoh pelaksanaan kromatografi lapis tipis :Sebuah garis
menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan
setetes pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu.
Diberikan penandaan pada garis di lempengan untuk menunjukkan
posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan menggunakan tinta,
pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk /
tinta ikut naik ke atas.
Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan
pada sebuah gelas kimia bertutup berisa pelarut dalam jumlah yang
tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada
dibawah garis dimana posisi bercak berada. Alasan untuk menutup
gelas kimia adalah untuk meyakinkan bahwa kondisi dalam gelas kimia
terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini,
dalam gelas kimia biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang
terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap
mencegah penguapan pelarut.Karena pelarut bergerak lambat pada
lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna
akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak dari
perbedaan bercak warna.
b. Perhitungan nilai RfJumlah perbedaan warna yang telah
terbentuk dari campuran, pengukuran diperoleh dari lempengan untuk
memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini
berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang
tempuh oleh bercak warna masing-masing.Ketika pelarut mendekati
bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas kimia dan
posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami
proses penguapan.Pengukuran berlangsung sebagai berikut :Nilai Rf
untuk setiap warna yang telah terbentuk dari campuran, pengukuran
diperoleh dari lempengan untuk memudahkan identifikasi
senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini didasarkan pada jarak
yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang ditempuh oleh bercak
warna masing-masing.Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan,
lempengan dipindahkan dari gelas kimia dan posisi pelarut ditandai
dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan.Nilai Rf
untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut :Rf =
jarak yang ditempuh oleh komponen / jarak yang ditempuh oleh
pelarutc. Mengidentifikasi senyawa-senyawaDimisalkan campuran asam
amino yang ingin diketahui senyawanya.Caranya: Setetes campuran
ditempatkan pada garis dasar lempengan lapis tipis dan
bercak-bercak kecil yang serupa dari asam amino yang telah
diketahui juga ditempatkan pada disamping tetesan yang akan
diidentifikasi. Lempengan lalu ditempatkan pada posisi berdiri
dalam pelarut yang sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya. Dalam
gambar, campuran adalah M dan asam amino yang telah diketahui
ditandai 1-5.
Metode PraktikumAlat dan Bahan :1. Alata. Alumunium foilb.
Beaker glassc. Kertas saring whatmand. Lidie. Klipf. Blower2.
Bahana. Safraninb. Pewarna Makananc. Methylene Blued. Minyak
Cara kerja :1. Potong kertas whatman sesuai kebutuhan2. Garis
dengan pensil dengan jarak 2 cm dari sisi bawah kertas3. beri tanda
titik tempat sampel akan diletakkan dengan jarak 1,5-2 cm jarak
tiap sampel4. Letakkan sampel pada tiap titik sebanyak 10 ul
menggunakan pipet kapiler5. Masukkan pelarut dengan ketinggian
1-1.5 cm ke dalam bejana6. Masukkan kertas whatman yang telah
ditetesi sampel 7. Lakukan pengembangan selama 5-10 menit atau
sampai eluen atau pelarut hampir mencapai batas ketinggian 2 cm
dari batas atas, atau dengan ketinggian secukupnya sesuai
keperluan, jika pelarut sampai tengah kertas saring telah
menunjukkan pemisahan sudah biasa ditentukan.8. Sampel dibiarkan
dengan angin-angin / dengan blower9. Berilah tanda batas pelarut
bagian atas10. Lakukan pengamatan, tulis hasil dan pembahasan
terhadap senyawa dan komponen pada kromatogram
Hasil dan PembahasanKromatografi lapis tipis adalah pemisahan
zat berdasarkan kepolarannya, prinsipnya ada dua yakni partisi dan
absorbsi. Bila fase diam berupa zat padat yang aktif, maka dikenal
istilah kromatografi penyerapan (adsorption chromatography). Bila
fase diam berupa zat cair, maka teknik ini disebut kromatografi
pembagian (partition chromatography). Metodenya ada dua fase gerak
( pelarutnya ) dan fase diam ( sampelnya ). Semua kromatografi
memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi
cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak
mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang
terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak
pada laju yang berbeda. Pelarut atau fase gerak :Methil asetat :
heksan : methanol = 1 : 1 : 1Methil asetat sifatnya semi
polarHeksan sifatnya non polarMethanol sifatnya polarSampel yang
digunakan adalah safranin, pewarna makanan, methylen blue, dan
minyak. Setelah pelarut mendekati atas kertas, kertas kemudian
diambil dan dikeringkan dengan blower. Kemudian dilihat dengan
sinar UV yang berfungsi membedakan zat yang berfluorescent dan
tidak / sampel mana yang bercahaya. Bila arna semakin ke atas
semakin non polar, semakin ke bawah polar bila benda di
tengah-tengah semi polar.Setelah menjadi kristal kemudian dicari Rf
( Retardation Factor ). Rf dari masing-masing sampel adalah
safranin ( merah ) = 0,97, pewarna makanan ( orange ) = 0,27,
methylen blue ( biru )= 0,73, dan minyak ( bening ) = 0,85.
Safranin paling menyala merupakan zat yang paling berfluorescent
atau bercahaya.
Kromatografi lapis tipis juga bisa dilakukan pada sudstansi yang
tidak berwarna :a. Menggunakan pendarflourfase diam pada sebuah
lempengan lapis tipis memiliki substansi yang ditambahkan
kedalamnya, supaya menghasilkan pendarflour ketika diberikan sinar
ultraviolet ( UV ). Itu berarti jika menyinarkannya dengan sinar UV
akan berpendar. Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak
pada kromatogram berada, meskipun bercak-bercak ini tidak tampak
berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa penyinaran
sinar UV pada lempengan akan timbul pendaran dari posisi yang
berbeda dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak seperti bidang
kecil yang gelap.Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan, dan
tandai posisi-posisi dari bercak-bercak dengan menggunakan pinsil
dan melingkari daerah bercak-bercak itu. Seketika anda mematikan
sinar UV, bercak-bercak tersebut tidak tampak kembali. b.
Menggunakan bercak secara kimiaUntuk membuat bercak-bercak menjadi
tampak dengan jalan mereaksikannya dengan zat kimia sehingga
menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah
kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino. Kromatogram
dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin.
Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa - senyawa
berwarna, umumnya coklat atau ungu.Dalam metode lain, kromatogram
dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan pada wadah bertutup
(seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan
kristal iodium. Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak
pada kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak
daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai
bercak-bercak kecoklatan. (Anggraeni, 2009)
Kesimpulan dan Saran1. KesimpulanBerdasarkan praktikum yang
telah dilakukan dapat diketahui bahwa :a. kromatografi lapis tipis
adalah pemisahan zat berdasarkan kepolarannyab. Prinsip dari
kromatografi adalah partis ( pemisahan zat) dan absorbsi (
penyerapan zat )c. Metode kromatografi adalah fase gerak /
pelarutnya dan fase diam / sampelnyad. Rf dari masing-masing sampel
adalah safranin ( merah ) = 0,97, pewarna makanan ( orange ) =
0,27, methylen blue ( biru )= 0,73, dan minyak ( bening ) = 0,85.
Safranin paling menyala merupakan zat yang paling berfluorescent
atau bercahaya.2. Sarana. Sebaiknya dilakukan praktikum pada semua
jenis kromatografib. Tidak boleh menggunakan pena untuk memberi
tanda titik pada kertas karena akan terbawa keatas tandanya
Daftar PustakaAnggraeni, Megawati. 2009. Kromatografi Lapis
Tipis.
http://greenhati.blogspot.com/2009/01/kromatografi-lapis-tipis.html.
diakses tanggal 03 juni 2011 pukul 14:00 wibHafni, Aswita. 2010.
Kromatografi Kertas. http://mimin-mien.blogspot.com/2010
/03/kromatografi-kertas.html. diakses tanggal 03 juni 2011 pukul
14:10Haqiqi, Sohibul Himam. 2008. Kromatografi Lapis Tipis.
nadjeeb.files.wordpress .com /2009/10/kromatografi.pdf
Laporan KLTNB: Please use it properly
Disusun oleh: Dewi Meita Sari
BAB I
PENDAHULUAN
1. Tujuan PercobaanMempelajari dan memahami metode pemisahan
dengan metode kromatografi lapis tipis.Memisahkan beberapa logam (
Ni, Mn, Co, dan Zn ) atau asam amino dalam larutan sampel dengan
metode kromatografi lapis tipis.Menentukan nilai Rf pada
masing-masing sampel yang dipisahkan.2. Prinsip PercobaanPemisahan
dengan tehnik kromatografi lapis tipis didasarkan pada adsorpsi
larutan (fase gerak atau eluennya) terhadap adsorbens yang di
gunakan, dimana Adsorbens dilapiskan pada lempeng kaca yang
bertindak sebagai penunjang fase diamnya.
3. Teori DasarDalam analisis kimia suatu bahan, maka akan sering
dihadapkan pada pekerjaan-pekerjaan seperti menghilangkan
konstituen pengganggu atau mengisolasikannya maupun memekatkan
konstituen yang dikehendaki sebelum dilakukuan identifikasi maupun
pengukuran jumlahnya. Untuk melakukan analisis kimia tersebut maka
kita harus menggunakan suatu metode agar dapat menentukan hasil
yang tepat, kromatografi salah satunya, dan dapat pula digunakan
sebagai analisa secara kuantitatif.
Kromatografi adalah suatu metoda untuk separasi yang menyangkut
komponen suatu contoh di mana komponen dibagi-bagikan antara dua
tahap, salah satu yang mana adalah keperluan selagi gerak yang
lain. Di dalam gas kromatografi adalah gas mengangsur suatu cairan
atau tahap keperluan padat. Di dalam cairan kromatografi adalah
campuran cairan pindah gerakkan melalui cairan yang lain, suatu
padat, atau suatu gel agar. Mekanisme separasi komponen mungkin
adalah adsorpsi, daya larut diferensial, ion-exchange,
penyebaran/perembesan, atau mekanisme lain (David. 2001).
Teknik kromatografi merupakan teknik pemisahan yang sangat
sensitif, yang dapat memisahkan campuran kompleks, seperti minyak
bumi yang merupakan campuran dari ratusan senyawa yang terkandung
di dalamnya, dan masih banyak lagi keunggulan lainnya.
Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah suatu tehnik yang
sederhana dan banyak digunakan. Metode ini menggunakan lempeng kaca
atau lembaran plastik yang ditutupi penyerap untuk lapisan tipis
dan kering bentuk silika gel, alomina, selulosa dan polianida.
Untuk menotolkan larutan cuplikan pada lempeng kaca, pada dasarnya
dgunakan mikro pipet/ pipa kapiler. Setelah itu, bagian bawah dari
lempeng dicelup dalam larutan pengulsi di dalam wadah yang tertutup
(Chamber) (Rudi, 2010)
Kromatografi lapis tipis digunakan untuk memisahkan
komponen-komponen atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi oleh
pase diam dibawah gerakan pelarut pengembang. Pada dasarnya KLT
sangat mirip dengan kromatografi kertas , terutama pada cara
pelaksanaannya. Perbedaan nyatanya terlihat pada fase diamnya atau
media pemisahnya, yakni digunakan lapisan tipis adsorben sebagai
pengganti kertas. Bahan adsorben sebagai fasa diam dapat digunakan
silika gel, alumina dan serbuk selulosa. Partikel selika gel
mengandung gugus hidroksil pada permukaannya yang akan membentuk
ikatan hidrogen dengan molekul polar air. Fase diam untuk
kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang
mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak
merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.
Gambar kromatografi lapis
Pada identifikasi noda atau penampakan noda, jika noda sudah
bewarna dapat langsung diperiksa dan ditentukan harga Rf. Rf
merupakan nilai dari Jarak relative pada pelarut. Harga Rf dihitung
sebagai jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak
tempuh oleh eluen ( fase gerak ) untuk setiap senyawa berlaku rumus
sebagai berikut:
Rf juga menyatakan drajat retensi suatu komponen dalam fase
diam. Karenan itu Rf juga disebut factor referensi.
Pemisahan campuran dengan cara kromatografi didasarkan pada
perbedaan kecepatan merambat antara partikel-partikel zat yang
bercampur pada medium tertentu. Dalam kehidupan sehari-hari
pemisahan secara kromatografi dapat kita temui pada rembesan air
pada dinding yang menghasilkan garis-garis dengan jarak
ternentu.
Ada dua cara untuk menyelesaikan analisis sampel yang tidak
berwarna:
1. Menggunakan pendarflourMungkin anda masih ingat apa yang
telah saya sebutkan bahwa fase diam pada sebuah lempengan lapis
tipis seringkali memiliki substansi yang ditambahkan kedalamnya,
supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar
ultraviolet (UV). Itu berarti jika anda menyinarkannya dengan sinar
UV, akan berpendar.
Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram
berada, meskipun bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika
dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa jika anda menyinarkan sinar
UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda
dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil
yang gelap.
Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan, anda harus
menandai posisi-posisi dari bercak-bercak dengan menggunakan pinsil
dan melingkari daerah bercak-bercak itu. Seketika anda mematikan
sinar UV, bercak-bercak tersebut tidak tampak kembali.
2. Penunjukkan bercak secara kimiaDalam beberapa kasus,
dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak dengan
jalan mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk
yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang
dihasilkan dari campuran asam amino.
Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan
ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan
senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat atau ungu.
Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian
ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan
gelas arloji) bersama dengan kristal iodium. Uap iodium dalam wadah
dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat
dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi
yang dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan.
Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian
ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan
gelas arloji) bersama dengan kristal iodium. Uap iodium dalam wadah
dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat
dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi
yang dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan.
Penggunaan kromatografi lapis tipis untuk mengidentifikasi
senyawa-senyawa
Anggaplah anda mempunyai campuran asam amino dan ingin menemukan
asam amino-asam amino tertentu yang terkandung didalam campuran
tersebut. Untuk sederhananya, mari kira berasumsi bahwa anda
mengetahui bahwa campuran hanya mungkin mengandung lima asam
amino.
Setetes campuran ditempatkan pada garis dasar lempengan lapis
tipis dan bercak-bercak kecil yang serupa dari asam amino yang
telah diketahui juga ditempatkan pada disamping tetesan yang akan
diidentifikasi. Lempengan lalu ditempatkan pada posisi berdiri
dalam pelarut yang sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya. Dalam
gambar, campuran adalah M dan asam amino yang telah diketahui
ditandai 1-5.
Bagian kiri gambar menunjukkan lempengan setelah pelarut hampir
mencapai bagian atas dari lempengan. Bercak-bercak masih belum
tampak. Gambar kedua menunjukkan apa yang terjadi setelah lempengan
disemprotkan ninhidrin.
Tidak diperlukan menghitung nilai Rf karena anda dengan mudah
dapat membandingkan bercak-bercak pada campuran dengan bercak dari
asam amino yang telah diketahui melalui posisi dan warnanya. Dalam
contoh ini, campuran mengandung asam amino 1, 4 dan 5.
Fase diam-jel silika
Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom
silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang
besar. Namun, pada permukaan jel silika, atom silikon berlekatan
pada gugus -OH.
Permukaan jel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat
membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai
disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van der Waals dan atraksi
dipol-dipol.
Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium
oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa
yang kita sebutkan tentang jel silika kemudian digunakan serupa
untuk alumina.
Penentuan jumlah komponen senyawa dapat dideteksi dengan
kromatografi lapis tipis (KLT) dengan menggunakan plat KLT yang
sudah siap pakai. Terjadinya pemisahan komponen-komponen pada KLT
dengan Rf tertentu dapat dijadikan sebagai panduan untuk memisahkan
komponen kimia tersebut dengan menggunakan kolom kromatografi dan
sebagai fasa diam dapat digunakan silika gel dan eluen yang
digunakan berdasarkan basil yang diperoleh dari KLT dan akan lebih
baik kalau kepolaraan eluen pada kolom kromatografi sedikit dibawah
kepolaran eluen pada KLT (Lenny, 2006)
Pada hakekatnya KLT merupakan metoda kromatografi cair yang
melibatkan dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Fasa geraknya
berupa campuran pelarut pengembang dan fasa diamnya dapat berupa
serbuk halus yang berfungsi sebagai permukaan penyerap
(kromatografi cair-padat) atau berfungsi sebagai penyangga untuk
lapisan zat cair (kromatografi cair-cair). Fasa diam pada KLT
sering disebut penyerap walaupun berfungsi sebagai penyangga untuk
zat cair di dalam sistem kromatografi cair-cair. Hampir segala
macam serbuk dapat dipakai sebagai penyerap pada KLT, contohnya
silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oksida), kiselgur
(tanah diatomae) dan selulosa. Silika gel merupakan penyerap paling
banyak dipakai dalam KLT (Iskandar, 2007)
BAB II
ALAT DAN BAHAN
a) Alat
Beaker glass dan penutupSprayOvenPlat silika gelKertas saring (
pengganti kertas whatman no 1 )Botol semprotPipa kapilerBatang
pengadukLabu takarb) Bahan
NiSO4.6H2OMnSO4.4H2OZnSO4.6H2OCoCl2.6H2OHClNatrium
nitroprusidaAmmonia pa.Asam rubeanatAquadestc) Bahan alternatif
Profil-alkoholButil alkohol-asam asetat-air ( 80:20:20 v/v )Asam
amino standarLarutan nin-hidrin 0.3% (dalam butil alkohol dengan 3%
asam asetat glasial)BAB III
PROSEDUR PERCOBAAN
Preparasi sampel1. Larutan Ion Ni, Mn, Co, dan ZnDisiapkan dari
senyawa di atas dengan tepat dalam asam klorida 2 M untuk
menghasilkan larutan yang masing-masing berisi 10 dari Ni2+, Mn2+,
Co2+, dan Zn2+ dalam larutan 0.01 cm3.
2. Pelarut aseton-HClSebanyak 43.5 mL aseton dicampurkan ke
dalam larutan HCl pekat (bj 1.18) sebanyak 4 mL dan air sebanyak
2.5 mL
3. Reagensia semprot PACF/R ( trinatrium
pentasianoaminaferrat/asam rubeanat )Sebanyak 0.7 gram trinatrium
pentasianoaminaferrat dilarutkan dalam 20 mL air dan dituang
larutan-larutan yang dihasilkan ke dalam larutan 0.25 gram asam
rubeanat dalam 10 mL etanol. Kemudian larutan tersebut dikocok
selama 15 menit dan disaring. Larutan siap digunakan dan hendaknya
disiapkan pada hari reagensia itu gunakan.
4. Penyediaan PACF ( trinatrium pentasianoaminaferrat )Sebanyak
10 gram natrium prussida yang dibubuk halus ditimbang ke dalam
erlenmeyer kecil, dan ditambahkan sebanyak 24 mL larutan amonnia
pekat (bj.0.88). Kemudian campuran natrium prussida dan amonnia
pekat dikocok baik-baik dan penyumbat dilonggarkan agar gas dapat
lolos, ketika senua zat padat telah terlarut dan pembebasan gas
telah dimulai, erlenmeyer disimpan dalam lemari es pada suhu -7oC
selama 48 jam. Kemudian dihangatkan ke temperatur ruangan, lalu
ditambahkan larutan amonnia pekat (bj.0.88) sedikit lagi, kemudian
disaring dengan pengisapan pompa, lalu zat cair dibuang sebanyak
mungkin kemudian endapan dicuci dengan sedikit methanol. Methanol
dibuang secapat mungkin dengan pengisapan, lalu produk dipindahkan
ke pinggan dalam desikator yang berisi kalsium klorida dan disimpan
dalam gelap. Rendemen adalah 5.4 gram.
5. Asam asetat 0.2 MSebanyak 11 mL asam asetat diencarkan ke
dalam air sebanyak 1 Liter.
Prosedur kerja:v Larutan standar disuntikan kira-kira 1 dan
sampel pada kertas atau pelat kromatogram kira-kira 2 cm dari dasar
pelat bagian bawah dan 1 cm dari dasar pelat bagian atas secara
horizontal. Lalu ditandai pada setiap sampel.
v Pelat atau kertas tersebut dicelupkan pada larutan pengembang
sedikimian rupa sehingga noda-noda sampel dan standar tidak
terendam dalam larutan. Kemudian ditutup rapat-rapat dan dibiarkan
berlansung beberapa lama sampai elusi larutan pengembang mencapai
bagian 0.5-1 cm dibawah tepi atas pelat.
v Setelah kira-kira 15-20 menit pelat tersebut diangkat dan
dikeringkan untuk menjamin penguapan telah sempurna.
v Setelah kering, pelat yang telah dikeringkan disemprot dengan
larutan pewarna (ninhidrin/PACF/R) dan dikeringkan atau dipanaskan
selama beberapa menit sampai noda-noda komponen jelas terlihat.
v Jarak yang ditempuh setiap noda dan jarak yang ditempuh oleh
pelarut diukur.
v Nilai Rf ditentukan atau jenis sampel ditentukan.
BAB IV
DATA PENGAMATAN DAN HASIL PERHITUNGAN
Data PengamatanTabel jarak tempuh senyawa dari titik awal pada
masing-masing pelat:
Sampel
Pelat 1
Pelat 2
Ni
3 cm
3.1 cm
Co
3.2 cm
3.3 cm
Mn
3.1 cm
3.7 cm
Zn
3.8 cm
3.5 cm
Perhitunganv Membuat larutan sampel
Sampel Ni 100 ppm dari NiSO4.6H2OSampel Co 100 ppm dari
CoCl2.6H2OSampel Mn 100 ppm dari MnSO4.6H2OSampel Zn 100 ppm dari
ZnSO4.6H2OTabel Perhitungan menbuat larutan sampel yang dilarutkan
dalam 100 mL HCl
Sampel
Massa
NiSO4.6H2O
0.045 gram
CoCl2.6H2O
0.041 gram
MnSO4.6H2O
0.05 gram
ZnSO4.6H2O
0.041 gram
v Jarak tempuh masing-masing sampel pada gerak 7 cm
Sampel Ni pada pelat 1Sampel Ni pada pelat 2Sampel Co pada pelat
1Sampel Co pada pelat 2Sampel Mn pada pelat 1Sampel Co pada pelat
2Sampel Zn pada pelat 1Sampel Co pada pelat 2BAB V
PEMBAHASAN
Analisis kuantitatif dengan KLT ada dua macam. Yang pertama noda
cuplikan setelah dikembangkan diukur langsung luasnya atau
kerapatannya (density). Secara manual atau menggunakan alatalat
yang disebut densitometer. Tehnik ini disebut evaluasi in one. Luas
atau kerapatan noda dibandingkan dengan kerapatan noda senyawa
standar yang telah diketahui konsentrasinya. Cara yang kedua, noda
diambil dengan cara dikerok atau diisap dengan suatu alat kemudian
dilarutkan dalam suatu pelarut dan larutan terakhir diamati dengan
spectrometer UV vis atau ditimbang (gravimetric) setelah pelarut
diuapkan. Cara gravimetric hanya dapat dilakukan apabila jumlah
cuplikan cukup besar. Cara ini tidak membutuhkan standar
pembanding
Pada percobaan ini, tehnik kromatografi lapis tipis yang
digunakan adalah suatu plat tipis (aluminium) yang berfungsinya
untuk tempat berjalannya adsorbens sehingga proses migrasi analit
oleh solventnya bisa berjalan. Hal inilah yang membedakan antara
kromatografi kertas dengan kromatografi lapis tipis. Yang dimana
pada KLT menggunakan plat tipis sedangkan pada KK menggunakan
kertas (lapisan selulosa) sehingga proses elusinya lebih lama
(kirakira 1020 menit lebih lama dari KLT). Perbedaan lainnya dari
kedua kromatografi tersebut adalah pembentukan noda pada
adsorbensnya dimana pada KLT noda yang dihasilkan lebih tajam
dibandingkan noda yang nampak dalam KK. Hal ini disebabkan pada KK
penyusun dari adsorbens berupa selulosa yang dapat mengikat air,
sehingga ketika dielusi dengan suatu pelarut atau fase gerak maka
noda yang dihasilkan mengalami penyebaran akibat terdapatnya gugus
OH dalam adsorbens yang masih tertingal dalam fase diamnya sehingga
penampakan nodanya terlihat lebih pudar dan bentuk nodanya tidak
bulat. Sedangkan dalam KLT adsorbens yang digunakan berupa slika
gel (SiO2) yang tidak mengikat molekul air, sehingga noda yang
tercipta lebih terfokus dan tajam.
Pada percobaan ini, adsorbens yang digunakan adalah aseton-HCl.
Hal inilah yang menjadi salah satu penyebab sampai tidak munculnya
warna noda pada KLT dalam percobaan ini. Sedangkan faktor penyebab
lainnya disebut dengan faktor yang mempengaruhi nilai Rf pada KLT
seperti kualitas adsorben, ketebalan lapisan, kejenuhan ruang
kromatografi, tehnik pengembangan (elusi), suhu, dan kualitas
pelarut. Fase gerak adalah campuran 2 pelarut organik karena daya
elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa
sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Pada percobaan
kali ini digunakan campuran aseton-HCl. Digunakan HCl karena HCl
dapat mengikat zat sampel dan membawanya menuju garis akhir plat
dengan bantuan aseton yang merupakan zat organic yang mudah
menguap.
Penentuan nilai Rf suatu standar analit pada KLT pada dasarnya
sama dengan penentuan nilai Rf dalam KK, dimana nilai Rf ditentukan
dengan membandingkan jarak noda yang dihasilkan dari migrasi
solvent/ pelarutnya dengan jarak sample/ standar. Nilai Rf
menyatakan ukuran daya pisah suatu zat dengan kromatografi planar
(KK mapun KLT), dimana jika nilai Rf-nya besar berarti daya pisah
zat yang dilakukan solvent (eluenya) maksimum sedangkan jika nilai
Rf-nya kecil berarti daya pisah zat yang dilakukan solvent
(eluenya) minimum. Tidak munculnya noda dalam percobaan kali ini
dapat disebabkan oleh faktorfaktor yang mempengaruhi nilai Rf
seperti diatas, akan tetapi ada juga kemungkinan lain misalnya noda
yang tidak nampak, sehingga untuk menampakkan noda tersebut harus
direaksikan dengan reagen penampak warna berupa ion logam transisi
untuk membentuk kompleks, karena salah satu ciri senyawa kompleks
adalah berwarna akibat adanya bilangan koordinasi dari atom
pusatnya. Adapun untuk identifikasi dan deteksi zat setelah
terbentuknya noda dilakukan dengan beberapa cara misalnya;
planimetri, densitometri, spektrofotometri, dan fluorensis, dimana
masing masing alat tersebut memeliki kelebihan dan kekurangan yang
jika dijabarkan akan lebih panjang dan rumit karena dihubungkan
dengan proses penggunaanya.
Pada percobaan ini, didapatkan nilai Rf yang berbeda-beda dari
tiap analit. Pada penentuan nilai Rf pada ion logam, secara
berturut-turut nilai Rf dari Ni2+, Mn2+, Co2+, dan Zn2+ adalah 0,43
, 0,46 , 0,46 , dan 0,52.
BAB VI
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil pengamatan dari percobaan diatas, maka dapat
disimpulkan sebagai berikut:
Tehnik pemisahan dengan kromatografi lapis tipis merupakan
tehnik pemisahan kromatografi planar dimana zat zat dipisahkan
berdasarkan perbedaan migrasi solute/ zat terlarut antara dua fase
(fase gerak dan fase diamnya). Dimana fase diamnya/ adsorbensnya
dilapisi dengan plat tipis (aluminium) sebagai penunjang
adsorbennya.nilai Rf yang didapatkan adalah nilai Rf dari Ni2+,
Mn2+, Co2+, dan Zn2+ adalah 0,43 , 0,46 , 0,46 , dan 0,52.DAFTAR
PUSTAKA
Basset. J etc. 1994. Buku Ajar Vogel, Kimia Analisis Kuantitatif
Anorganik. Jakarta: Kedokteran EGC.
Iskandar, Yusuf. 2007. Karakteristik Zat Metabolit Sekunder
Dalam Ekstrak Bunga Krisan (Chrysanthemum cinerariaefolium) Sebagai
Bahan Pembuatan Biopestisida. FMIPA. Semarang.
Khopkar, S,M. 2009. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta:
Universitas Indonesia.
Rudi, L. 2010. Penuntun Dasar-Dasar Pemisahan Analitik. Kendari:
Universitas Haluoleo.
Shevla, G. 1985. Analisis Anorganik Kualitatif Makro dan
Semimakro. Jakarta: PT. Kalman Media Pustaka.
Sofia, Lenny. 2006. Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia
Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp. Sumatera Utara:
USU Repository.
Sudjadi. 1988. Metode pemisahan. Yogyakarta : Kanisius
Underwood, AL dan JR. Day R.A. 1986. Analisa Kimia Kuantitatif
edisi keenam. Jakarta: Erlangga.
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
I. TUJUAN PRAKTIKUMMemisahkan dan menentukan pigmen dalam
berbagai sampel dengan kromatografi lapis tipis.
II. TINJAUAN PUSTAKAKromatografi adalah teknik pemisahan
campuran yang berdasarkan kecepatan perambatan komponen dalam
medium tertentu. Uraian mengenai kromatografi pertama kali
dijelaskan oleh Michael Tswett, seorang ahli biotani Rusia yang
bekerja di Universitas Warsawa Pada saat itu, Michael Tswett
melakukan pemisahan klorofil dari pigmen- pigmen lain dari ekstrak
tanaman menggunakan kromatografi kolom yang berisi dengan kalsium
karbonat. Pada kromatografi, komponen- komponen yang akan
dipisahkan berada diantara dua fase yaitu fase diam ( stationary )
dan fase bergerak ( mobile ). Fase diam adalah fase yang akan
menahan komponen campuran sedangkan fase gerak adalah fase yang
akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan
pada fase diam akan tertinggal atau tidak bergerak sedangkan
komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih
cepat ( Sudarmadji, 2007 ).
Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan
Schraiber pada tahun 1938. KLT merupakan bentuk kromatografi
planar, selain kromatografi kertas dan elektroforesis. Berbeda
debgan kromatografi kolom yang mana fase diamnya diisikan atau
dikemas di dalamnya, pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya
berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar
yang didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium atau pelat
plastik. Meskipun demikian, kromatografi planar ini dapat dikatakan
sebagai bentuk terbuka dari kromatografi kolom (Rohman, 2007).
Kromatografi digunakan sebagai untuk memisahkan substansi
campuran menjadi komponen-komponennya, misalnya senyawa Flavonoida
dan isoflavonoida yang terdapat pada tahu, tempe, bubuk kedelai dan
tauco serta Scoparia dulcis, Lindernia anagalis, dan Torenia
violacea. Yang pada senyawa isoflavon memiliki banyak manfaat.
Beberapa kelebihan senyawa isoflavon yang potensial bagi kesehatan
manusia, di antaranya adalah sebagai antioksidan, antitumor /
antikanker, antikolesterol, antivirus, antialergi, dan dapat
mencegah osteoporosis. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut
pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh
kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending) atau karena
pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending).
Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebih
murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikian juga
peralatan yang digunakan. Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan
yang digunakan lebih sederhana dan dapat dikatakan hampir semua
laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat (Rohman,
2007).
Beberapa keuntungan dari kromatografi planar ini :
Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan
analisis.Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan
pereaksi warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar
ultraviolet.Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending),
menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi.Ketepatan
penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan
ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.(James, 1991).
III. ALAT DAN BAHANA. AlatAlat-alat yang digunakan pada
praktikum kali ini adalah
Gelas pialaGelas ukurKertas Whatman No.42Lampu UVNeraca
analitikPenggarisPensilPipa kapilerRuang pengembangB.
BahanBahan-bahan yang digunakan pada praktikum kali ini adalah
Aseton n-heksanEtil asetatMethanolSampel daun (mangga dan
kesturi)
IV. PROSEDUR KERJAMenyiapkan sampel daun mangga dan kesturi,
daunnya dikeringkan dan dibuat serbuk.Menimbang sampel sebanyak 1
gram, dimasukkan ke dalam toples.Menambahkan 25 ml methanol dan
etil asetat pada masing-masing toples untuk dimaserasi selama 24
jam.Setelah dimaserasi, sampel tersebut disaring menggunakan kertas
saring kemudian diambil filtratnya.Menotolkan filtrate tersebut
dengan pipa kapiler pada kertas whatman.Meletakkannya pada bejana
yang sudah dijenuhkan dengan aseton.Menunggu hingga noda yang
ditotolkan naik mencapai tanda batas atas.Setelah itu
mengeringkannya, kemudiannya melihatnya dibawah sinar UV.Mengamati
berapa jumlah komponen yang dapat dilihat.
V. HASIL DAN PEMBAHASANA. Hasil PengamatanSampel
Jarak
Rf
Daun mangga dengan pelarut Etil Asetat
A1= 1,5 cm
A2= 4 cm
A3= 5 cm
A4= 6 cm
0,25
0,67
0,83
1
Daun mangga dengan pelarut methanol
B1= 5 cm
B2= 5,5 cm
B3= 5,7 cm
B4= 6 cm
0,83
0,917
0,95
1
Daun mangga dengan pelarut kloroform
C1= 2 cm
C2= 2,5 cm
C3= 2,8 cm
C4= 5 cm
0,33
0,417
0,467
0,83
Daun mangga dengan pelarut n-heksan
-
-
Perhitungan Rf
v Daun mangga dengan pelarut etil asetat
Rf1 =
Rf2 =
Rf3 =
Rf4 =
v Daun mangga dengan pelarut methanol
Rf1 =
Rf2 =
Rf3 =
Rf4 =
v Daun mangga dengan pelarut kloroform
Rf1 =
Rf2 =
Rf3 =
Rf4 =Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Laporan Praktikum Biokimia
I. Tujuana. Dapat mengetahui dan memahami tehnik pemisahan
dengan metode kromatografi lapis tipis.b. Dapat menentukan Rf
komponen komponen yang dipisahkan dan mengidentifikasi zat yang
dipisahkanII. Dasar Teori Kromatografi adalah suatu cara pemisahan
dimana komponen-komponen yang dipisahkan didistribusikan antara 2
fase,salah satunya yang merupakan fase diam (Stationer Phase),dan
yang lainnya ialah fase gerak (Mobile Phase). Berdasarkan
terikatnya suatu komponen pada fase gerak,komponen-komponen suatu
campuran dapat dipisahkan.komponen yang kurang larut dalam fase
gerak atau yang lebih kuat terserap atau terabsorbsi pada fase diam
akan tertinggal,sedangkan komponen yang lebih larut atau kurang
terserap akan bergerak lebih cepat.
Pada percobaan kali ini yang akan kita bahas adalah Kromatografi
Lapis tipis (KLT).Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah suatu
tehnik pemisahan yang sederhana dan banyak digunakan. Metode ini
menggunakan lempeng kaca atau lembaran plastik yang ditutupi
penyerap untuk lapisan tipis dan kering bentuk silika gel, alomina,
selulosa dan polianida. Untuk menotolkan larutan cuplikan pada
lempeng kaca, pada dasarnya dgunakan mikro pipet/ pipa kapiler.
Setelah itu, bagian bawah dari lempeng dicelup dalam larutan
pengulsi di dalam wadah yang tertutup. (Chamber)Kromatografi Lapis
Tipis (KLT) ini mirip dengan kromatograafi kertas, hanya bedanya
kertas digantikan dengan lembaran kaca tau plastik yang dilapisi
dengan lapisan tipis adsorben seperti alumina, silike gel, selulosa
atau materi lainnya.Lapisan tipis adsorben pada proses pemisahan
berlaku sebagai fasa diam. Kromatografi lapis tipis lebih bersifat
reproduksibel ( bersifat boleh diulang) dari pada kromatografi
kertas.Sebagai fasa diam dalam KLT berupa serbuk halus dengan
ukuran 5 50 mikrometer. Serbuk halus ini dapat berupa adsorben
penukar ion. Bahan adsorben sebagai fasa diam dapat digunakan gel,
alumina, dan serbuk selulosa. Partikel silica gel mengandung gugus
hidrosil dipermukaannya yang akan membentuk ikatan hydrogen dengan
molekul molekul pokar.Untuk membuat lapisan tipis pada KLT perlu
dibuat bubur (slurry) ber air dari serbuk halus tadi. Zat pengikat
dapat menggunakan gips, barium sulfat, polivenil alcohol atau kanji
perlu ditambahkan, untuk membantu peletakan lapisan tipis pada
penyangga. Bubuk halus ini kemudian ditebarkan pada papan penyangga
(kaca, plastik atau aluminium), secara merata sehingga diperoleh
ketebalan lapisan 0,1 0,3 mm. lapisan tipis adsorben diaktifkan
dengan pengeringan didalam oven pada suhu 100 oC selama beberapa
jam.(http://robbaniryo.com/ilmu-kimia/kromatografi-lapis-tipis-klt/)
Pemisahan campuran dengan cara kromatografi didasarkan pada
perbedaan kecepatan merambat antara partikel-partikel zat yang
bercampur pada medium tertentu. Dalam kehidupan sehari-hari
pemisahan secara kromatografi dapat kita temui pada rembesan air
pada dinding yang menghasilkan garis-garis dengan jarak
ternentu.
B. PembahasanPraktikum kali ini yaitu tentang kromatografi lapis
tipis, yang bertujuan untuk memisahkan dan menentukan pigmen dalam
berbagai sampel daun, sampel daun yang digunakan kali ini yaitu
daun mangga.
Sampel yang sudah halus tersebut terlebih dahulu dimaserasi
selama 24 jam. Maserasi bertujuan untuk memisahkan senyawa-senyawa
kimia yang terkandung dalam sampel tersebut. Pada praktikum kali
ini maserasi dilakukan dengan beberapa pelarut yaitu methanol, etil
asetat, kloroform dan n-heksan. Setelah itu menotolkan sampel
tersebut pada KLT dengan pipa kapiler, kemudian dimasukkan dalam
bejana / ruang pengembang yang berisikan n-heksan dibiarkan sampai
tanda batas setelah itu dilihat dibawah sinar UV. Hasil yang
didapat tersebut kemudian dihitung untuk menentukan nilai Rf, Rf
atau Retardation factor yaitu berapa jauh zat yang terpisah dari
titik awalnya.
Hasil yang didapat pada KLT daun mangga yang pelarutnya etil
asetat yaitu 1,5 cm dengan nilai Rf 0,25 cm, titik kedua yaitu 4 cm
dengan nilai Rf 0,67, titik ketiga 5 cm dengan nilai Rf 0,83, titik
keempat 6 cm dengan nilai Rf 1. Daun mangga yang dimaserasi dengan
pelarut methanol yaitu 5 cm dengan nilai Rf 0,83, titik kedua 5,5
cm dengan nilai Rf 0,917, titik ketiga 5,7 cm dengan nilai Rf 0,95,
titik keempat 6 cm dengan nilai Rf 1. Daun mangga yang dimaserasi
dengan pelarut kloroform yaitu 2 cm dengan nilai Rf 0,33, titik
kedua 2,5 cm dengan nilai Rf 0,417, titik ketiga 2,8 cm dengan
nilai Rf 0,467, titi keempat 5 cm dengan nilai Rf 0,83. Daun mangga
yang dimaserasi dengan pelarut n-heksan tidak dapat dilihat dibawah
sinar UV sehingga tidak diperoleh satupun spot atau titik zat yang
terpisah, mungkin karena human eror, atau salah dalam tahapan
kerja.
Dari hasil Rf yang didapat tersebut dan disbanding dengan nilai
Rf pada table yang ada dibuku pedoman praktikum dapat disimpulkan
bahwa daun mangga tersebut mengandung klorofil a, -karoten, lutein
violaksantin.
VI. KESIMPULANKesimpulan yang diperoleh dari praktikum kali ini
yaitu sebagai berikut:
Kromatografi lapis tipis salah satu pemisahan berdasarkan
adsorpsi.Dari nilai Rf yang didapatkan dan dibandingkan dengan
table yang ada daun mangga tersebut kemungkinan mengandung klorofil
a, -karoten, lutein violaksantin.Pada pelarut n-heksan tidak
terdapat spot mungkin karena kesalahan praktikan yang tidak teliti
dalam pengerjaan.
PembahasanKromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara
pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya. Kromatografi
juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit,
baik penyerap maupun cuplikannya. KLT dapat digunakan untuk
memisahkan senyawa-senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti
lipida-lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan
kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen
untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari
kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan
isolasi senyawa murni skala kecil.Pelaksaanan kromatografi lapis
tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang
seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam. Gel silika (atau
alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis
tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat
berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan
pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Pada praktikum kali ini
kami melakukan pengujian parameter pola kromatogram dari ekstrak
dan minyak atsiri tanaman sereh (Cymbopogon nardus) dengan
menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT). Di mana fase diam yang
kami gunakan adalah silika gel GF254 yang bersifat polar dan fase
gerak berupa campuran n-heksana dan etil asetat dengan perbandingan
4:1, di mana n-heksana bersifat non polar sedangkan etil asetat
bersifat semi polar. Untuk melarutkan ekstrak kami gunakan metanol
yang bersifat polar. Penggunaan pelarut-pelarut ini bertujuan untuk
memisahkan senyawa-senyawa berdasarkan tingkat kepolarannya. Jadi,
semakin atas senyawa yang berelusi maka semakin non polar senyawa
tersebut, dan sebaliknya semakin ke bawah senyawa tersebut maka
semakin polar. Dan di tengah-tengah kemungkinan adalah senyawa yang
semi polar. Pertama-tama adalah penyiapan plat KLT yaitu dengan
memotongnya sesuai dengan panjang 10 cm dan lebar 2 cm. Kemudian
dibuat batas bawah dan atasnya agar mudah untuk menghitung Rf-nya.
Batas bawah dan atas yang dibuat masing-masing adalah 1 cm.
Diberikan penandaan pada garis di plat untuk menunjukkan posisi
awal dari totolan zat yang akan di uji.Sebagai penanda batas atas
dan batas bawah fase diam (yang akan dilalui eluen) digunakan
pensil, karena pensil mengandung senyawa karbon yang tidak larut
dalam eluen. Jika ini dilakukan menggunakan tinta, pewarna dari
tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk, oleh karena
itu digunakan pensil sebagai penandanya. Batas bawah diberi garis 1
cm dan bagian atas 1 cm. Di mana eluen yang digunakan tidak boleh
lebih dari 1 cm, hal ini dikarenakan sesuai dengan prinsip
kapilaritas, yaitu untuk menaikkan spot (ascending). Kapilaritas
adalah naiknya cairan eluen melalui pori-pori kapiler lempeng/plat.
Kemudian dilakukan penotolan ekstrak sereh yang sebelumnya telah
dilarutkan dengan metanol dan pada plat yang sama ditotolkan minyak
atsiri dari sereh. Penotolan ini dilakukan dengan menggunakan pipa
kapiler kaca. Lalu pelarut dibiarkan menguap atau dihilangkan
dengan bantuan aliran udara kering. Selanjutnya plat dimasukkan ke
bejana pengembang yang telah berisi eluen n-heksan dan etil asetat
dengan perbandingan 4 : 1 yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan
kertas saring.Karena pelarut bergerak lambat pada plat,
komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak
pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan
bercak warna. Pelarut dapat mencapai bagian atas dari plat. Ini
akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang
berwarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam.Pada
praktikum kali ini, deteksi bercak dilakukan dengan 2 cara yaitu
yaitu fisika dan kimia. Untuk cara fisika, digunakan sinar UV.
Sejumlah senyawa alam akan berflouresensi yaitu memancarkan cahaya
tampak saat dikenai sinar UV atau mengabsorpsi sinar UV. Senyawa
yang mengabsorpsi sinar UV akan tampak sebagai daerah gelap di
bawah UV. Oleh karena itu, digunakan sinar UV dengan tujuannya
untuk mendeteksi senyawa yang dapat berfluoresensi, di mana senyawa
tersebut memiliki gugus khromofor. Gugus khromofor merupakan gugus
yang dapat memberi atau menghasilkan warna. UV yang digunakan yaitu
dengan panjang gelombang 366 nm yang bertujuan untuk menampakkan
bercak yang berfluoresensi sehingga pada pengamatan terlihat bercak
berpendar (memancarkan cahaya).Keuntungan menggunakan UV ialah
karena sinar UV tidak merusak senyawa yang dideteksi, sehingga
hasil kromatografi dapat kembali digunakan.Sedangkan untuk cara
kimia, yaitu dengan mereaksikan bercak menggunakan vanilin-asam
sulfat kemudian dipanaskan untuk mendeteksi senyawa atsiri
(terpenoid, fenol dan turunannya serta fenilpropan) dengan
mekanisme abstraksi H+ sehingga terbentuk senyawa ikatan rangkap
terkonjugasi, peristiwa ini tidak terjadi sekaligus tetapi satu
persatu secara berurutan yang menyebabkan warnanya semakin lama
semakin tidak stabil, dapat juga untuk mendeteksi senyawa saponin
yang ditunjukkan dengan adanya bercak berwarna biru, violet biru
atau terkadang berwarna kekuningn bila diamati pada sinar
biasa.Setelah itu didapatkan pola kromatogram dilihat dari sinar UV
terdapat 5 pola kromatogram, masing-masing menandakan bahwa ekstrak
sereh mengandung banyak senyawa kimia, dan 4 pola kromatogram pada
minyak atsiri sereh. Nilai Rf yang kami dapat pada pola kromatogram
dari ekstrak sereh yaitu Rf1 = 0.0375 cm, Rf2 = 0.0625 cm, Rf3 =
0.1375 cm, Rf4 = 0.225 cm, dan Rf5 = 0.4625. Selanjutnya nilai Rf
pada minyak atsirinya yaitu Rf1 = 0.4 cm, Rf2 = 0.6 cm, Rf3 = 0.625
cm, dan Rf4 = 0.75 cm. Sedangkan dari hasil yang disemprotkan
pereaksi vanillin asam sulfat kemudian dipanaskan hasilnya tidak
jauh berbeda hanya memperjelas pemisahan pola kromatogramnya. Dapat
diperkirakan bahwa tanaman sereh ini mengandung senyawa saponin,
triterpenoid, tanin, kuinon, steroid, sedikit alkaloid, dan minyak
atsiri. Namun untuk pengidentifikasian masing-masing senyawa
berdasarkan Rf yang didapat, kami tidak menemukan literaturnya.