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TEMA I
MATERIALES DE LABORATORIO
El laboratorio es el servicio centralizado de un hospital que
generalmente se divide en varios departamentoscomo son: hematologa,
bioqumica, inmunologa...
El laboratorio ha ido adquiriendo con el paso del tiempo un gran
protagonismo debido a que se puede obteneruna gran informacin sobre
multitud de enfermedades. Ha habido un gran avance en los ltimos
tiemposutilizndose aparatos cada vez ms complicados en sus
determinaciones, pero sencillo en su uso.
Actualmente la exploracin clnica proporciona datos que son
completados o confirmados por el laboratorio.Por ejemplo: un
paciente que presente sntomas como fatiga, palidez, etc. se puede
pensar que padece unproceso anmico, lo cual ser confirmado o no
mediante un anlisis de sangre. Por tanto para sacar unaconclusin
adecuada debe existir una relacin entre los datos obtenidos en
clnica y los obtenidos en ellaboratorio.
Las tcnicas analticas cumplen bsicamente 3 objetivos:
1 Aportan informacin, para que un mdico diagnostique
adecuadamente
2 Pueden ser utilizadas como medidas preventivas para conocer el
estado de salud de un individuo ydetectar precozmente alguna
alteracin.
3 Permiten seguir la evolucin de una enfermedad durante el
tratamiento.
SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
Par el buen funcionamiento de un laboratorio es necesario seguir
unas normas; esto es doblemente importantesi se tiene en cuenta que
en l hay varias personas trabajando.
1 Es necesario antes de empezar cualquier prueba saber que es lo
que vamos a hacer para tener preparado elmaterial y reactivos que
se necesitan.
2 Es esencial la limpieza tanto durante el trabajo como al
finalizarlo.
3 En el laboratorio existen riesgos potenciales, como por
ejemplo: quemaduras por calor o agentesqumicos, cortes,
pinchazos,... que requieren una atencin especial. Es importante
evitar los accidentes que engran manera se deben al descuido y
excesiva rapidez en el trabajo, ms que a la ignorancia.
Las causas ms frecuentes de accidentes son:
1 Las prisas por llevar a trmino el trabajo.
2 La falta de cuidado y la fatiga.
3 La falta de concentracin en el trabajo.
NORMAS GENERALES EN EL LABORATORIO
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1 Debe utilizarse bata mientras se permanece en el
laboratorio
2 No se debe comer no beber dentro del laboratorio, ni utilizar
recipientes para guardar o conservarelementos.
3 No fumar
4 Antes de utilizar los reactivos leer los rtulos.
5 No dejar destapados los envases no las placas de cultivos.
6 Guardar las medidas de asepsia (lavarse las mano, utilizar
guantes,...)
7 Mantener limpias las mesas y lavar el material utilizado al
finalizar el trabajo
8 No pipetear por boca lquidos custicos o txicos o lquidos
potencialmente contaminantes, sino utilizarperas de goma.
9 El material de vidrio roto se debe proteger antes de tirarlo
para evitar cortes.
Si a pesar de las precauciones el accidente se produce el tcnico
debe conocer algunas nociones de primerosauxilios. Por ejemplo: si
hay cortes lo primero es saber si ha quedado algn trozo de un
cuerpo extrao dentro;despus se dejar fluir la sangre libremente y
se har un lavado con agua oxigenada y luego un antisptico.
NOTA: En el caso de quemaduras producidas generalmente por calor
se pondr sobre la zona una gasaempapada en alcohol. En las
quemaduras abiertas se aplicar una pomada antigente y se le pondr
una gasaestril.
MATERIALES DE USO MS FRECUENTE
En los laboratorios clnicos para la caracterizacin y
cuantificacin de sustancias, microorganismos, clulas ycristales
presentes en los fluidos biolgicos se utiliza una gran variedad de
materiales y dispositivos.
Este equipamiento vara segn sus caractersticas, necesidades,
etc., pero en general se disponen de unasmesas en las que se
desarrolla en trabajo y sobre las que estn colocados los aparatos.
En ellas hay conexionespara: gas, luz, etc. Las mesas sern cmodas y
de material impermeable y fcilmente lavable.
Adems habr taburetes, para evitar la fatiga en unos casos y
siendo necesario en otros, como en el caso de lasobservaciones al
microscopio. Tambin habr armarios en los que se guardarn reactivos
y materiales.
No se puede dar una norma general en cuanto al material que se
va a encontrar en el laboratorio, ya que estodepende de sus
necesidades as como de las posibilidades econmicas.
De forma general el material no instrumenta se puede clasificar
en material de vidrio, de plstico, deporcelana, etc.
Material de vidrio: el vidrio se caracteriza por una gran
resistencia qumica frente al agua, cidos, bases, etc.mayor a la de
la mayora de los plsticos, as como por su gran estabilidad
resistencia al calor y transparencia.
Sin embargo no todo tipo de vidrio es adecuado para su uso en el
laboratorio, por el contrario es necesarioemplear vidrios que se
caracterizan por su resistencia qumica, mecnica y trmica.
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Actualmente existen diferentes tipos de vidrios para
laboratorios; la mayora estn fabricados en vidrio deboro silicato
que se caracteriza por su gran resistencia al calor; por ejemplo:
el vidrio pirex... Al trabajar con elvidrio son necesarias unas
precauciones como:
1 No someterlo a cambios bruscos de temperatura porque se pueden
producir tensiones en l que dan lugar arupturas, por ejemplo:
colocar el material de vidrio en la estufa de secado o
esterilizacin en fro, calentar ydejarlo enfriar antes de
sacarlo.
2 No aplicar fuerza sobre llaves o tapones
3 No someterlo a variaciones bruscas de presin
4 No conservar soluciones concentradas de lcalis bases en estos
vidrios ya que son cucasis.
El vidrio se esteriliza en autoclave generalmente envuelto en
papel de filtro.
Probetas: son vasos altos graduados de diferentes tamaos. Todos
ellos llevan la correspondiente divisinfraccionada de su capacidad
total. Sirven para medir volmenes sin demasiada precisin. Los
volmenes msusados son: 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000 y 5000
ml
Matraces aforados: son recipientes en forma cnica en la parte
inferior y un cuello fino en la parte superior.En el lleva una
marca que corresponde al aforo que indica hasta donde hay que
llenar el matraz para que ellquido contenido equivalga a la
capacidad del mismo. Se utiliza para medir con precisin el volumen
queindica el matraz. Son utilizados normalmente para preparar
disoluciones de concentracin conocida. Losvolmenes ms frecuentes
son: 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 y 2000 ml
NOTA: En la utilizacin de material volumtrico, el lquido
contenido se debe enrasar en el menisco(curvatura que se encuentra
en la superficie de un lquido contenido en un tubo estrecho de modo
que el fondode este menisco se emplea como lnea de enrase. Hay que
tener en cuenta en el enrase el llamado error deparalelaje, de modo
que si el menisco se observa por encima de la lnea de enrase el
volumen que nos indicaes menor del real.
Buretas: son tubos cilndricos estrechos con la parte inferior
acabada en punta y la superior como un embudo(exagerado. Son
precisos. En la parte inferior tiene una llave de paso. Estn
graduadas y permiten medirvolmenes pequeos. El cero de la escala se
encuentra en la parte superior. Las buretas se mantienen enposicin
vertical, mediante un soporte. Su tamao es variable en 50 a 100
cm3. Antes de utilizarlas se debenpurgar y para ello se llenan con
un poco ms de lquido de lo que est medido y se deja caer hasta
enrasar encero, as se elimina el aire. Para manejarla se sujeta la
bureta con la mano izquierda y se abre o cierra la llavecon el
pulgar o ndice. El lquido caer sobre un Erlenmeyer que se sujeta
con la derecha.
Pipetas: son tubos cilndricos estrechos cuya parte inferior
acaba en punta, tambin sirven par medirvolmenes con precisiones
generalmente volmenes pequeos (inferiores a 20ml) Son tubos
estrechos depoco dimetro abiertos a ambos lados, terminando en
punta el inferior, la salida del lquido se regula con eldedo ndice
que tapa el orificio de la parte superior. Existen 2 tipos de
pipetas las graduadas que midenfracciones de lquidos y las aforadas
que miden un volumen fijo de lquido y tambin las hay de doble.
Pipetas pasteur: no sirven para medir volmenes sino echar
gotas.
Vasos de precipitados: son vasos de vidrio de forma cilndrica.
Miden volmenes aproximados y los haygraduados y no graduados. Los
volmenes ms corrientes son: 50, 100, 500, 1000, 2000 y 5000ml
Suelenestar construidos con vidrios que soportan temperaturas
elevadas por lo que pueden ponerse en contacto conllamas de mechero
o placas de calefaccin para calentar sus contenidos.
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Embudos: se utilizan para realizar operaciones de filtro con
ayuda de un papel de fil
Tubos de ensayo: son tubos cilndricos de aproximadamente 2 cm3
de dimetro y con fondo cnico. Susaplicaciones son mltiples. Por
ejemplo: se utilizan para realizar pruebas bioqumicas
cualitativas.
Tubos de centrfuga: son tubos cilndricos en los que se colocan
el material que va a ser centrifugado; puedenacabar en forma cnica
o cilndrica y pueden estar graduados o sin graduar.
Erlenmeyer: es un recipiente de forma cnica utilizada para
contener reactivos y soluciones, puede estargraduado o no y en todo
caso miden volmenes con poca exactitud. Es adecuado para evitar
prdidas demateriales efervescencia o en calentamiento prolongado
porque la parte alta del matraz acta comocondensador de vapores,
por lo tanto, da lugar a que haya menos evaporacin.
Portaobjetos: es una pequea lmina de vidrio rectangular donde se
coloca la muestra para ser examinada almicroscopio. Existen
portaobjetos con cavidades semiesfricas de distintos dimetros de
profundidadutilizados para la observacin in vivo de
microorganismos.
Cubreobjetos: es una fina lmina de vidrio con los que se cubren
las muestras a examinar a microscopio.
Otros: varillas de vidrio, vidrio de reloj, embudos de
decantacin, kitasato, placas de petri (son recipientesusados para
el cultivo de microorganismos).
LIMPIEZA Y CONSERVACIN DEL MATERIAL DE VIDRIO
Hay que insistir en la importancia de la limpieza del material.
Puede significar una fuente de error o tcnicasque debern ser
repetidas. La limpieza se debe hacer al final de cada tcnica sin
dejar secar el materialutilizado. Normalmente el material de vidrio
se limpia con agua y jabn con el uso de escobillas adecuadas.En
ocasiones pueden quedar restos siendo entonces necesario un lavado
en mayor profundidad mediante lamezcla crmica formada por
dicromtico potsico 60 gr, agua (primero el agua siempre) 200ml y
cidosulfrico, suficiente para 1 litro.
Con esto se deja unos das u horas. Una vez limpio se debe
aclarar varias veces con agua del grifo acabandocon un ltimo
enjuague con agua destilada.
Material de plstico: En la actualidad asistimos en los
laboratorios clnicos a una invasin de material puedeser de mltiple
uso probetas, vasos de precipitados, etc. o de un solo uso puntas
de pipetas de pistn, pipetaspasteur, placas de petri, etc. La
mayora de los plsticos son atacables por disolventes orgnicos y
algunos deellos por lo cidos fuertes. Adems tampoco soportan
temperaturas elevadas sin deformarse o descomponerse.
Las ventajas frente al vidrio, son que son resistentes a la
rotura, tienen poco peso, poco coste por lo que seutiliza como
material desechable.
Pipetas de pistn o automticas: existe en el mercado una gran
variedad de pipetas de pistn con puntas deplstico desechables.
Estas pipetas han surgido al hacerse cada da ms evidente el peligro
del pipeteo porsuccin de los fluidos biolgicos (suero, sangre,
orina,...) con riesgo de contagio de enfermedades.
Por otro lado diversos disolventes orgnicos producen vapores
txicos. Las pipetas de pistn pueden ser devolmenes fijos o
regulables.
El mbolo tiene 3 posiciones: normal de reposo, intermedio y de
presin a fondo.
Las pipetas se cargan apretando el mbolo hasta la posicin
intermedia y soltndola para llenar la punta y se
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descargan una vez en la posicin normal apretando el mbolo hasta
el fondo.
Dispensadores: son sistemas que proporcionan repetidamente un
volumen seleccionado. Se utilizannormalmente para la adicin de
reactivos a lotes de muestras reaccionantes. Hay una amplia gama
dedispensadores con varios volmenes de utilizacin.
Cubetas: son recipientes usados como contenedores de muestras
generalmente en disolucin en las tcnicas deespectrometras. Deben
ser transparentes para la longitud de onda en la que se realiza la
determinacin. Lasms usadas son de forma prismtica y son de cuarzo o
slice fundido para el ultravioleta y visible; y de clorurosdico
(NaCl) o de fluoruro clcico (F2Ca) para el infrarrojo.
Otros materiales
Estufas: es una caja rectangular provista de una serie de calor
regulado por un mando situado en el exterior. Seutiliza a diario en
el laboratorio de microbiologa para incubar cultivos de
grmenes.
Mechero: el ms utilizado es de tipo Bunsen que consta de un pie
sobre el que descansa un tubo por dondesale el gas. En la parte
inferior llevan un orificio para la entrada de aire. Sirve para
calentar reactivos, flamearasas de siembra,...
Gradillas: son soportes para tubos de ensayo, probetas,...
TEMA II
DISOLUCIONES
En numerosas ocasiones los reactivos son adquiridos por el
laboratorio en forma de polvo que ha de serdisuelto en la proporcin
adecuada para su uso, de ah la importancia de conocer la forma de
expresar laconcentracin variada.
Conceptos bsicos: la materia est compuesta por unas unidades
fundamentales llamadas tomos que secombinan entre s para formar
molculas. Las masas de esos tomos son tan pequeos que su
utilizacinresulta muy engorrosa para los clculos por eso se cre una
escala relativa en la que se escoge un elementocomo tipo y los
valores de los dems elementos se refieren a l por combinarse con
casi todos los elementosse escogi el O2 al que se asign de forma
arbitraria un peso atmico de 16.
tomos: el tomo es la parte ms pequea e indivisible de la
materia. Actualmente podemos definir al tomocomo la partcula de un
cuerpo simple que es qumicamente indivisible y que forma la menor
cantidad de unelemento que puede entrar en combinacin.
Molculas: al unirse 2 o ms tomos se forman las molculas. La
molcula es el lmite de la divisin fsica, esdecir, la parte ms
pequea de una sustancia que conserva sus propiedades qumicas
Se denomina peso molecular de un componente a la suma de los
pesos atmicos de los elementos quecomponen la molcula por cada uno
de ellos por un coeficiente igual al nmero de tomos del mismo
queentra a formar parte de ella.
Se denomina peso atmico gramo tomo gramo de un elemento a la
cantidad del mismo equivalente a supeso atmico expresado en
gramos.
Se denomina mol peso molecular molcula gramo de un compuesto a
la cantidad del mismo que tiene engramos equivalentes a su peso
molecular.
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Concepto de disolucin: se denomina disolucin a las mezclas
ntimas de 2 ms cuerpos diferentes que nosofrecen a simple vista un
aspecto homogneo.
El trmino de disolucin normalmente se suele utilizar para
describir mezclas homogneas de 2 mslquidos de un lquido y 1 varios
slidos.
En toda disolucin hay que distinguir el cuerpo disperso soluto
que es el que se haya en menor proporcin yel cuerpo dispersante o
disolvente que es el componente que interviene en mayor cantidad.
Tanto el solutocomo el disolvente pueden ser slidos, lquido o gas:
soluto (ClNa, azcar, alcohol) disolvente (agua, leche,agua)
La disolucin adopta el estado fsico del disolvente. En el
laboratorio las disoluciones que se manejan conbastante frecuencia
son las de slido en lquido y lquido en lquido generalmente.
Especialmente se utilizanlas disoluciones acuosas.
Una disolucin se dice que est saturada cuando no admite ms
sustancia en disolucin de tal modo que si seaade ms soluto queda en
el fondo sin disolver.
Las disoluciones que se hallan lejos de la saturacin se llaman
disoluciones diluidas y las que estn cerca deella se denominan
disoluciones saturadas. La proporcin que hay entre soluto y
disolvente se conoce comoconcentracin.
Hay varias maneras de expresarla.
MODOS DE EXPRESAR LA CONCENTRACIN
La concentracin de una disolucin nos indica la composicin de la
misa en funcin de las cantidades que hayde soluto y disolvente.
Unidades fsicas: partes por milln, tanto por % en: peso, volumen y
p/v. Unidadesqumicas: molaridad, normalidad y molalidad.
Partes por milln: indica el nmero de gramos por soluto por cada
milln de gramos de disolucin (el nmerode miligramos de soluto por
cada 1000 gramos de disolucin). En disoluciones acuosas es
equivalente asmismo a mg de soluto por litros de disolucin ya que
al tratarse de disolucin extremadamente diluida sudensidad est muy
cerca de la del disolvente, es decir, a la unidad.
5 ppm Fe en agua 5.000 mg de Fe en 1000 ml de agua.
% Peso: expresa los gramos de soluto contenidos en 100gr de
disolucin
% Volumen: expresa los ml de soluto contenidos en 100ml de
disolucin
% P/V: expresa los gramos contenidos en 100ml de disolucin
Molaridad: la M de una disolucin acuosa como nmeros de moles de
soluto por litros de disolucin. Serepresenta por M
Normalidad: la N se define como el nmero de equivalentes gramos
de soluto contenidos en 1 litro dedisolucin. Se representa por N.
Si es valencia 1 la N = M.
Por equivalente de un elemento o compuestos entiende el peso de
una sustancia que reacciona con 1 gramo dehidrgeno o con un peso
que le equivalga. En las prcticas se hallan de la siguiente manera;
en los cidos ybases se dividen su peso molecular por el nmero de
iones H o hidroxilo respectivamente que produce sus
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molculas al disociarse..
Peso equivalente: Sosa NaOH
Peso equivalente: hidrxido potsico KOH
Peso equivalente: Hidrxido clcico Ca (OH)2
Peso equivalente: Hidrxido de aluminio Al (OH)3
Peso equivalente: cido clorhdrico HCl
Peso equivalente: cido ntrico HNO3
Peso equivalente: SO4H2
Peso equivalente: PO4H3
Para calcular el nmero de equivalentegramo en un determinado
peso de un cido o base basta aplicar lasiguiente ecuacin. N = M
Valencia
Molalidad: expresa el nmero el nmero de moles de soluto
disueltos por 1 Kgr de disolvente. Una disolucin2 m de azcar en
agua quiere decir que existe 2 moles de azcar por cada 1000 gr de
disolvente.
PREPARACIN DE DISOLUCIONES
Los disolventes utilizados en la preparacin de disoluciones son
muy variados aunque el agua es el msutilizado de todos ellos. A la
hora de elegir el disolvente se ha de tener en cuenta que tenga
propiedadesqumicas parecidas al soluto. En el laboratorio los
productos que se manejan frecuentemente son cidos ysales utilizando
como disolvente el agua. La operacin previa ser calcular que
cantidades son las que vamosa necesitar dependiendo de las
concentraciones que queramos obtener y la cantidad que vayamos a
preparar.
Tcnica: se pesa la sustancia en un vidrio de reloj o en un vaso
de precipitados (o en un papel de filtro). En elprimer caso una vez
que se tiene pasada la cantidad deseada se transfiere a un vaso de
precipitados lavandocon un disolvente el vidrio de reloj y echando
estos lquidos de lavado en el vaso. Se disuelve entonces elsoluto
con pequeas cantidades de disolvente y se va vertiendo sobre el
matraz aforado en el que habremoscolocado un embudo. Se realiza
varias veces para evitar que queden restos, en el vaso, se va
aadiendodisolvente al matraz hasta llegar a la seal del aforo, el
enrase es correcto cuando el fondo del menisco estangente a la lnea
de aforo.
La cantidad de soluto contenido en un volumen dado de solucin es
igual al producto del volumen por laconcentracin. Si diluimos una
solucin, el volumen de la misma va aumentando a la par que
suconcentracin va disminuyendo mientras que la cantidad de soluto
presente permanecer constante, por ello 2soluciones con diferentes
concentraciones, pero que contienen las mismas cantidades de soluto
estrelacionadas de las siguientes formas (V1 C1 = C2 V2)
CONCEPTOS GENERALES
Cuando nos piden preparar un determinado volumen de una solucin
de concentracin determinada siempre laprimera cuestin que se nos
plantea es saber que cantidad de sustancia pura deber contener el
volumensolicitado de la misma.
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Primer supuesto: soluto total/puro 100%. Si el soluto es una
sustancia totalmente pura una vez calculada lacantidad necesaria
del mismo no tendramos ms que pensar correctamente, disolver en una
proporcin dedisolvente y enrasar hasta el volumen deseado.
Segundo supuesto: si la sustancia de partida es un lquido
totalmente puro una vez calculada la cantidad enpeso necesaria del
mismo, dado que en el caso de lquido es ms fcil medirlo en volumen
que en pesotransformaremos el peso en volumen a travs de la
densidad que es un dato conocido y luego enrasaremos conagua el
volumen solicitado.
Tercer supuesto: si la sustancia de partida (soluto) no es
totalmente puro (que esta va a ser la situacin real)entonces
tendramos que tomar una cantidad mayor de sustancias que si fuera
puro.
Riqueza: es una expresin que nos indica el grado de pureza de
una sustancia.
DILUCIONES SERIADAS
En diferentes reas de laboratorio de anlisis clnicos se deben
diluir las muestras, la sangre pura, lquidosorgnicos, etc. para
preparar la concentracin medible, por ejemplo: diluciones de
recuento de hematies,leucocitos, plaquetas, dilucin es de suero
para determinar las titulaciones de anticuerpos (ANA), etc.
La dilucin puede ser definida como una expresin de concentracin.
La dilucin expresa la cantidad ya seaen volumen o en peso de una
sustancia en un volumen final especfico.
Una dilucin 1:5 o 1/5 contiene un volumen de una sustancia en 5
volumen del total. Por ejemplo: sangre 1/10(1 parte de sangre y 9
de agua). Siempre la misma cantidad de agua y de suero (en la
proporcin).
CONCEPTOS DE pH
Al preparar una dilucin esta va a presentar carcter bsico, cido
o neutro. Un cido es la sustancia capaz deceder protones (H+) y una
base es la sustanica capaz de ceder iones hidroxilo (OH) o captar
protones. Eltrmino que nos refleja ese carcter cido o base es el
pH.
El pH se puede definir como el logaritmo del inverso de la
concentracin de protones pH
Para los valores entre los que pueden oscilar hay que recurrir a
la autoionizacin del agua. El agua se disociasegn la ecuacin: H2O
[OH] [H+] La relacin que existe entre la parte disociada y la
molecular viene dadapor la siguiente frmula
Experimentalmente se ha comprobado que Kw [H2O] = [OH] [H+] =
10
Sustituyendo ese valor en la expresion anterior resulta Al
disociarse la molcula de agua nos da igualcantidad de [OH] que de
[H]
Si predomina la [H+]en una sustancia, esa disolucin va a tener
carcter cido
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
La determinacin del pH puede hacerse de forma cuantitativa
mediante los aparatos peachmetros o de formacualitativa utilizando
los papeles indicadores, estos son de muy fcil manejo. Se impregna
el papel con elindicador durante unos segundos y se compara el
color con una escala de colores. Ejemplo: si se introduce elpapel
indicador en una disolucin y el color e rojo nos indica que el pH
es cido (bajo)
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TEMA III
EL MICROSCOPIO
La palabra microscopio deriva de 2 vocablos griegos `micros'
pequeo y `Scopein' ver.
En trminos generales un microscopio es todo instrumento que
permite amplificar la imagen de un objeto o deun ser pequeo. El
estudio de los microorganismos, clulas sanguneas, cristales en un
sedimento orinario,...precisan de instrumentos que amplen el tamao
de los microorganismos, hasta hacerlos visibles.
Segn el principio que se funda cada microscopio para ampliar las
imgenes se pueden clasificar en 2 tipos:microscopio de luz u pticos
y electrnicos.
Entre los primeros se distinguen varios tipos pero todos tienen
en comn que utilizan lentes pticas. Tipos:microscopio de campo
claro, oscuro, de fluorescencia y de cambio de fase.
Los segundos no incluyen lentes pticas si no que para ampliar
las imgenes utilizan un haz de electrones.
Podemos hacer otra clasificacin:
Microscopio simple: son aquellos que utilizan una sola lente
(lupas)
Microscopio compuesto: son aquellos que estn formados por 2
sistemas de lentes una situada cerca del ojo(ocular) y otra cercana
al objeto (objetivo).
LUPA: es el sistema ptico ms sencillo. Permite la observacin de
un objeto cuando se encuentra a la mnimadistancia de visin
distinta, esto es, la distancia mnima por la cual el ojo puede
percibir un objeto. Cuando seacerca un observador a un objeto crece
el ngulo visual y este parece ser mayor. Sin embargo por debajo
deuna determinada distancia (unos 25 cm) entre el ojo y el objeto,
este no se ve con claridad. Este lmite se debea que se supera la
capacidad mxima de deformacin del cristalino. Si se sita entre el
ojo y el objeto unsistema ptico capaz de aumentar el ngulo visual
se podr ver el objeto con mayor amplitud y claridad.
El aumento habitual de la lupa oscila entre 4 y 60 aumentos (la
relacin existente entre el tamao del objetopercibido a simple vista
y el apreciado). Por el microscopio, es decir, es el nmero de veces
que se ve eltamao de un objeto por encima de su valor real.
En el microscopio compuesto el aumento se calcula multiplicando
el aumento individual del objetivo o delocular. Se resea por un
nmero seguido del signo por (x).
Existen muchos modelos de lupas pero se utilizan normalmente
para la diseccin de animales y observacinde colonias.
El PODER DE RESOLUCIN: el lmite de un microscopio es la
capacidad de este para mostrar distintos yseparados puntos muy
cercanos. El concepto es fcilmente comprensible si imaginamos un
coche que vienepor la noche desde muy lejos hacia nosotros. En la
lejana slo se visualiza un haz luminoso pero conforme seva
acercando hay un instante a partir del cual se distingue la
presencia de 2 faros prximos pero separados. Eneste momento
nuestros ojos tienen un mximo de agudeza visual sobre el
objetivo.
El lmite poder de resolucin se puede definir tambin como la
distancia mnima entre 2 puntos que puedendistinguirse entre el
microscopio. Si queremos que la resolucin de un microscopio sea
alta el lmite o poderde resolucin deber ser lo ms pequeo
posible.
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El lmite de resolucin se calcula mediante la siguiente
ecuacin:
AN = apertura numrica
IR = ndice de refraccin del medio que hay entre la muestra y la
lente
D = lmite de resolucin
= longitud de onda de la luz.
De esta ecuacin se deduce que la resolucin es mayor cuando menor
es .
La resolucin es mayor (d es menor) cuanto ms grande es la
apertura numrica de la lente utilizada (delobjetivo).
APERTURA NUMRICA: es la capacidad de la lente para juntar los
grados de luz que se proyectan hacia ella.Depende del ndice de
refraccin del medio que hay entre la lente y la muestra y del sen ,
siendo la mitaddel ngulo del cono de luz que penetra en la lente.
Si se rellena el espacio existente entre la muestra y elobjetivo
con una sustancia de mayor ndice de refraccin que el aire (por
ejemplo: aceite de cedro `inmersin')se consigue que la mayor parte
de los rayos partidos por los fenmenos pticos ocasionados en el
condensadory el porta se refracta y penetra en el objetivo con lo
que se incrementa la resolucin del microscopio.
LA PROFUNDIDAD DE FOCO: es el espesor del objetivo que se
aprecia enfocado. El contraste es ladiferencia en la absorcin de
luz entre el objeto estudiado y el medio que le rodea. Se puede
aumentar elcontraste mediante tincin de la muestra.
PARTES DEL MICROSCOPIO PTICO COMPUESTO:
Se distingue 2 partes: mecnica y electrnica.
PARTE MECNICA: dentro de ella tenemos un sistema de soporte y
uno de ajuste
Sistema de soporte: consta de:
Pie: sirve como base al microscopio y tiene el suficiente peso
como para sostener el aparato. Antiguamentetena forma de herradura
y ahora rectangular.
Brazo: une el pie con el tubo en caso de transporte se debe
coger al microscopio por esa pieza.
Tubo: es la parte del microscopio que sujeta el objetivo y los
oculares; mantenindolos en la distancia correctade trabajo.
Platina: es una placa horizontal que sostiene las preparaciones
para realizar la observacin. El porta debequedar sobre la
perforacin que hay en el centro de la platina que deja pasar la luz
que viene del condensador.Hay una pinza que sujeta el porta.
Sistema de ajuste:
Manilla de ajuste de los oculares.
Tornillo: que permite al aflojarlo girar la pieza del tubo donde
estn los oculares y observar fcilmente lapreparacin desde otra
posicin.
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Tornillos reguladores de la platina: sirve para desplazar el
porta a lo largo y ancho de la platina. Sumovimiento queda
reajustado en dos escalas mviles lo que permite establecer la
posicin exacta de cualquierpunto de la preparacin.
1 Se observa el valor ms bajo de la escala en mm; est ms cercano
al 0 que la escala en dm (34)
2 Observar el valor de la escala en dm que coincide con uno de
los valores de la escala en ml (34'9)
Tornillo de elevacin del condensador: se utiliza para elevar el
condensador y disminuir la iluminacin oviceversa.
Tornillo de centrado del condensador: se utiliza para centrar el
condensador respecto al objetivo.
Palanca de cierre del diafragma
Tornillo de enfoque: muevan la platina hacia arriba y hacia
abajo y son 2 el macromtico o de avance rpido yotro es el micromtro
o de avance lento. Llevan incorporados un mando del bloqueo que
fija la platina a unadeterminada altura.
Regulador de la intensidad de la lmpara.
PARTE PTICA: dentro de ella tenemos un sistema de iluminacin y
lentes.
Sistema de iluminacin:
Fuente de luz: lmpara halgena de intensidad variable. Situada al
pie del microscopio. En su superficieexterna hay un anillo para
colocar filtros que facilitan la visualizacin de algunas
preparaciones.
Condensador: concentran la luz generada en la lmpara hacia la
preparacin. Est entre la fuente luminosa y laplatina.
Diafragma o iris: sirve para ajustar la apertura numrica. Cuanto
ms se cierra, ms empeora la resolucin ymejora el contraste. Est
situada en el interior del condensador.
Lentes:
Objetivos: genera una imagen real invertida y aumentada del
objeto. Estn colocados en la parte inferior deltubo a nivel de una
pieza mecnica que permite cambiarlos fcilmente y que recibe el
nombre de revlver.Los de mayor aumento poseen un sistema de
amortiguacin que dificulta su ruptura al chocar con lapreparacin.
Tiene dibujado un anillo coloreado que indica su nmero de aumentos:
4X (anillo rojo), 10X(anillo amarillo), 40X (anillo azul), 100X
(anillo blanco, inmersin negro). El objetivo de 100 es el
deinmersin porque precisa del uso de aceite de cedro sobre la
preparacin.
Oculares: capta la imagen formada por el objetivo y la amplia.
Los actuales microscopios son binoculares yestn unidos mediante un
mecanismo que permite ajustar la distancia interpupilar. Los ms
usados son de 10Xaumentos.
MANEJO DEL MICROSCOPIO
1 Accionando el revlver seleccionar el objetivo adecuado.
Generalmente se empieza por un objetivo depoco aumento y luego se
pasa a otro de mayor aumento. Si se hace esto basta con mover el
tornillomicromtrico; para enfocar la muestra con este ltimo
objetivo.
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2 Colocar la preparacin sobre la platina.
3 Encender la fuente de luz y regularla a una intensidad media
para evitar que se funda rpidamente lalmpara.
4 Situar el condensador: bajo si se utiliza un objetivo de bajo
poder de bajo aumento (10X).En la mitad desu recorrido si se
utiliza un objetivo de gran poder de ampliacin (40X) y alto si se
usa un objetivo deinmersin (100X). Tambin conviene ascender el
condensador si se observa una muestra teida y descenderlosi se
estudia una muestra en fresco.
5 Mirando por fuera de los oculares hacen ascender la platina
con el tornillo macromtico hasta que elobjetivo est muy cerca de la
preparacin.
Cuando se utiliza un objetivo de poco poder de ampliacin el
microscopio tiene un tope que impide unacercamiento excesivo. Sin
embargo si se emplea un objetivo de inmersin previamente hay que
depositar unapequea gota de aceite sobre la preparacin y
posteriormente hacer ascender la platina hasta que aquel(objetivo
de inmersin) toque el aceite pero no la preparacin.
6 Ajustar la distancia interpupilar.
7 Moviendo el tornillo macromtrico hacer descender lentamente la
platina hasta que se vea mirando porlos oculares la imagen de la
muestra. Con el objetivo de inmersin nunca debe separarse tanto de
lapreparacin como para perder el contacto con el aceite.
8 Afinar el enfoque con el tornillo micromtrico.
9 Desplazando horizontalmente la platina con movimientos en
zigzag recorrer con el objetivo toda lapreparacin para realizar una
correcta observacin de la misma.
10 Durante la observacin mover continuamente el tornillo
micromtrico para enfocar los planos de lamuestra.
11 Una vez finalizada la observacin hacer descender totalmente
la platina y se retira la preparacin. Si seha utilizado aceite de
inmersin se debe limpiar con una pequea cantidad de xilol
impregnado en una telasuave. Los objetivos secos pueden limpiarse
con agua destilada el exterior del aparato con un pao hmedo.
AJUSTE DE LOS OCULARES
Se realiza una vez enfocada la muestra y se lleva a cabo de la
siguiente forma:
1 Cerrar el ojo izquierdo y ajustar el enfoque del ojo derecho
con el tornillo cm
2 Cerrar el ojo derecho y ajustar el enfoque del ojo izquierdo
con el anillo de ajuste del ocular.
TIPOS DE MICROSCOPIOS
En el microscopio compuesto el campo est intensamente iluminado
y los objetos se ven ms oscuros que l.Este microscopio permite el
estudio de las estructuras externas de las muestras para la cual
esta debe dispuestaen una fina capa que puede ser atravesado por la
luz.
El microscopio de campo oscuro: es un microscopio ptico
ordinario con un condensador especialmentefabricado para dirigir la
luz nicamente desde los lados. Con esto se logra que la luz
difragtada en un objeto se
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dirige y penetra en el objetivo. Si en el campo examinado no hay
ninguna partcula de distinto ndice derefraccin se ve todo oscuro.
Su mxima aplicacin es la de observar la de microorganismos vivos
enpreparaciones en fresco o en gota pendiente. En ellas se observa
el objeto que diafragta la luz brillante y elfondo oscuro. Tambin
se ha utilizado mucho para la visualizacin directa del Treponema
Pallioum (sifilis)
El microscopio de contraste de fases: consta de un dispositivo
situado dentro o debajo del condensador queproduce una diferencia
de un cuarto de en unos rayos luminosos respectos a otros. Esto
origina unasvariaciones de luminosidad en los elementos estudiados
que permiten diferenciarlos del resto de la muestra yobservar con
mayor detalle su estructura interna. Es muy til para observar
objetos transparentes y nocoloreados y as como para preparaciones
bacterialgicas.
El microscopio de fluorescencia: es un microscopio en el cual la
fuente luminosa es luz ultravioleta de modoque la estructura solo
se har visible si es fluorescente. Podemos encontrarnos con
sustancias que sonfluorescentes por s mismas o sustancias o
estructuras que captan colorantes fluorescentes. As sucede
porejemplo cuando se utiliza auramina para demostrar la presencia
de vacilos de Koch. En esputos o cuando seemplea naranja de
acridina se une a la Earduerella Vaginalles en exudados
vaginales.
Este microscopio se utiliza en inmunofluorescencia de modo que
la fijacin del colorante fluorescencia al quese le llama tambin
fluorocromo que pueden ser fluoresterina, rodaminas y la
ficoeritrina. La fijacin decolorante fluorescente a elemento
investigado se realiza con un anticuerpo marcado. Por lo tanto el
objetofluorescente se ve como un cuerpo brillante que resalta sobre
un fondo oscuro.
El microscopio electrnico: est formado por un tubo en cuyo
interior se ha hecho el vaco y a travs del culse propagan los
electrones que inciden sobre el objeto. Despus estos electrones son
refractados y se recogensobre una pantalla en la cul se dibuja la
imagen del objeto.
TEMA IV
SANGRE: FISIOLOGA, COMPOSICIN Y CARACTERSTICAS FSICOQUMICAS
La sangre es un tejido constituido por clulas (leucocitos,
hematies y plaquetas) y plasma (solucin proteicaen la que se hayan
disueltos), iones y otros principios inmediatos
Los leucocitos, hematies y plaquetas reciben el nombre de
elementos formes y gracias a que se hallansuspendidos en el plasma
confieren a la sangre su fluidez caracterstica.
Los hematies tienen a su cargo la oxigenacin de los tejidos. Los
leucocitos la defensa frente a agentesextraos y las plaquetas la
hemostasia.
El plasma desarrolla diferentes funciones entre las que destaca
la inmunitaria (completo, inmunoglobulinas),la hemosttica (factores
de coagulacin), transporte (transferrina), nutritiva (vitamina A y
principiosinmediatos), el equilibrio inico (oligoelementos) y la
eliminacin de sustancias de deshecho (CO2 yproductos del
metabolismo intermediario).
HEMATOPOYESIS
Se denomina hematopoyesis al proceso por el que se forma las
distintas clulas de la sangre que tiene lugar ensu mayor parte en
la mdula sea. Slo las clulas maduras pasan a sangre perifrica y
estas se mantienen enunos lmites de normalidad gracias a un
equilibrio entre construccin y destruccin.
La hematopoyesis comienza en las primeras semanas de vida
embrionaria en el saco vitelino. Al tercer mes elprincipal rgano
hematopoytico es el hgado. Hacia la mitad de la vida fetal el bazo
y en menor extensin los
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ganglios linfticos, el timo y la mdula sea que presentan cierta
actividad hematopoytica.
En el momento de nacer toda la mdula sea tiene capacidad
hematopoytica siendo mxima su actividadhematopoytica.
En el individuo adulto la capacidad formadora de las clulas
sanguneas se limita a la mdula sea de loshuesos planos (costillas,
esternn, pelvis, crneo,...) a los huesos cortos (vrtebras) y
epfisis de los huesoslargos.
TEJIDO HEMATOPOYTICO
El sistema hematopoytico engloba a los tejidos y rganos que
intervienen en la produccin, maduracin ydestruccin de las clulas
sanguneas. Este sistema comprende: el sistema mononuclear
fagoctico, bazo,hgado, timo, mdula sea y glnglios linfticos.
Sistema Mononuclear Fagoctico: este sistema es un conjunto de
monocitos, histocitos y macrfagos;distribuidos en los diferentes
espacios intravasculares y extravasculares cuyas principales
funciones sonfagocticas e inmunolgicas.
Bazo: es un rgano muy vascularizado que se localiza bajo el
diafragma a la izquierda del estmago. En elbazo se produce una
eliminacin de los hematies viejos o defectuosos as como de
cualquier tipo de clulascon malformaciones morfolgicas o
funcionales. El bazo acta tambin como reserva de plaquetas. En el
fetotambin participa en la hematopoyesis
Hgado: es un rgano que se localiza bajo el diafragma en la parte
superior derecha del abdomen. En el feto, elhgado es el lugar
principal de la hematopoyesis desde el tercer mes de gestacin hasta
poco antes delnacimiento. Aunque menos eficaz y selectivo que el
bazo, tambin interviene en la retirada de la circulacinde hematies
lesionados o defectuosos.
Timo: es un rgano linfticopoytico situado en la zona superior
del mediastino (entre los dos pulmones) yase ha desarrollado en el
momento del nacimiento y continua creciendo hasta la pubertad.
Posteriormentecomienza a atrofiarse hasta que en la de servir como
un compartimento para la maduracin de los linfocitos T.
Ganglios Linfticos: se disponen en grupos a lo largo de los
capilares linfticos ms grandes. Contienen unazona interior llamada
mdula y una exterior llamada corteza. En la corteza se encuentra
linfocitos T,macrfagos y linfocitos B.
Mdula sea: es el rgano mayor del cuerpo humano. Es el lugar ms
importante de la formacin de lasclulas sanguneas. Se divide en dos
partes: mdula sea roja (donde tiene lugar la hematopoyesis activa)
y lamdula sea amarilla (grasa; formada por clulas adiposas).
En los primeros aos de vida casi toda la mdula sea es roja.
Despus se va sustituyendo paulatinamente pormdula sea amarilla. En
los adultos la hematopoyesis est limitada a la mdula de los huesos
planos, a lasvrtebras y a la epfisis de los huesos largos.
La celularidad de la mdula sea puede verse alterado por ciertos
estados patolgicos. Por lo que esimportante conocer las
proporciones celulares de las presentes series; as como la
morfologa de un individuosano.
La mdula roja normal es capaz de responder a diferentes
estmulos, por un lado puede hacerse hipercelular(incrementando su
actividad de proliferacin) o por el contrario hipocelular (inactiva
como consecuencia defactores ambientales, radiaciones o
frmacos).
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Las clulas hematopoyticas una vez maduras pasan a la circulacin
entre los factores que constituyen lamaduracin. Salen de una forma
ordenada de las clulas de la mdula sea a la sangre perifrica; en la
que seencuentran una serie de factores humorales y el crecimiento
del parenquima.
ORIGEN Y DIFERENCIACIN DE LAS CLULAS HEMATOPOYTICAS
Todas las clulas sanguneas provienen de una misma clula
primitiva denominada clula madre pluripotente(Stem cell o CFULM).
Capaz de autoperpetuarse y de diferenciarse hacia cualquier lnea
madurativa. Apartir de la CMP aparecen las clulas madres
comprometidas que van a diferenciarse hacia la lnea linfoideque se
conoce como CFUL o hacia la lnea mialoide CFUM y cuyo proceso de
diferenciacin ymaduracin finalizar con la aparicin de la clula
terminal presente en sangre perifrica (hematies, leucocitosy
plaquetas).
El esquema de cmo van a surgir es el siguiente:
1 Precursor linfoide CFUL
1.1 PreT
A Linfocito T
1.2 PreB
B Linfocito B
B.1 Clula plasmtica
2 Precursor mialoide CFUGEMM CFUM
2.1 GFUGM
A Mialoblasto Neutrfilo
B Monoblasto Monocito Macrfago
2.2 CFUBas Promielocito basfilo Basfilo
2.3 CFUEO Promielocito eosinfilo Eosinfilos
2.4 BFUE Promielocito proeritroblasto Hematie
2.5 BFUMeg Megacarioblasto Plaquetas
La poblacin celular hematopoytica se clasifica en 3 grupos:
Clula Madre Stem Cell: se puede definir como la clula que posee
una capacidad de automantenimientoque se prolonga durante una gran
parte de la vida de un individuo. Todas las clulas sanguneas
(hematies,plaquetas, granulocitos, monocitos, linfocitos, etc.)
proceden. Slo un 10% de las clulas Stem se encuentraen fase de
sntesis de ADN; pero el 90% restante que se encuentra en fase
situacin de reposos posee lacapacidad de entrar en fase de sntesis
en situacin de demanda.
El reconocimiento de las clulas madre hematopoyticas se basa
fundamentalmente en los cultivos in vitro de
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mdula sea.
Se ha comprobado que las clulas maduras de la sangre se
desarrollan cultivando mdula sea en diversascondiciones y con la
adicin de diversas sustancias formando colonias (CFC) o tambin
unidad formadora decolonias (UFC)
Clulas progenitoras comprometidas: (no se observan al
microscopio) las clulas que constituyen estecompartimento se
caracterizan por tener un gran potencial proliferativo y estar
predestinadas a diferenciarseen una lnea celular concreta. Se han
caracterizado factores de crecimiento, proliferacin y diferenciacin
deestas clulas a los que se han llamado factores estimulantes de
colonias (CSFS). Estas clulas progenitorasno pueden identificar
morfolgicamente al microscopio.
Clula de morfologa reconocible: son las clulas con
caractersticas morfolgicas y funcionales especficas yuna vida
limitada.
ERITROPOYESIS
Eritropoyesis es la produccin de los hematies o eritrocitos. El
hematie es el vehculo para el transporte de lahemoglobina. En
situaciones anormales se pueden perder o destruir ms hematies de
los habituales, esentonces, cuando la mdula sea puede aumentar la
produccin temporalmente para volver a restablecer elequilibrio.
Etapas de la eritropoyesis:
Proeritroblastos (normoblasto): mide entre 2025 micras. Es la
clula ms inmadura reconociblemorfolgicamente de la serie roja. Es
grande tiene un ncleo redondo con varios nucleolos y
escasocitoplasma azul.
Eritroblasto basfilo (normoblastos iniciales): tiene un tamao
entre 1620 micras. Procede delproeritroblasto. Es ms pequeo. El
ncleo ha perdido nucleolos que no se observan. Son de color
azul.
Eritroblasto policromatfilo: es de menos tamao que el anterior.
El ncleo se va haciendo ms pequeo. Elcitoplasma es policromtico (ms
rosado). Es el ltimo estadio de la serie con capacidad mittica.
Mide entre8 y 12 micras.
Eritroblasto ortocromtico: miden entre 7 y 10 micras. Tiene un
ncleo pequeo, redondo y muy condensado.El citoplasma es acidfilo
(rosado) por su alto contenido en hemoglobina. Una vez finalizado
su maduracinel ncleo es expulsado de la clula y fagocitado por las
clulas del sistema de la mdula sea (mononuclearfagoctico). No tiene
capacidad mittica. Con la prdida del ncleo el eritroblasto
ortocromtico se transformaen reticulocito.
Reticulocito: es una clula anucleada con capacidad de sntesis de
hemoglobina, protenas y ARN. Con latincin vital de azul cresilo
brillante puede observarse la sustancia ribosmica reticulada. El
reticulocitopermanece 48 horas en mdula sea antes de pasar a la
sangre perifrica donde continua como tal 24 horashasta convertirse
en hematies maduros. El nmero de reticulocito en nios y adultos
entre 0'2 y 2% dehematies. Es de gran valor para conocer la
eficacia de la eritropoyesis.
Hematies: es el elemento forma ms maduro y ms pequeo de la serie
roja (68 micras). Los hematiespresentan una vida media de 120 das y
su principal misin es la captacin de O2 por medio de lahemoglobina
y su transporte a los tejidos. Finalmente las funciones del hematie
se deterioran y el bazoprincipalmente hace de filtro retirndolos de
la sangre perifrica.
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La transformacin de proeritrocitos a hematies dura entre 6 y 9
das.
REGULACIN DE LA ERITROPOYESIS
Depende del grado de oxigenacin de los tejidos. Una hormona
sintetizada en el rin y conocida comoeritroproyetina estimula la
eritropoyesis de la mdula sea. La mdula sea puede aumentar la
eritropoyesishasta 10 veces como respuesta a la eritroproyetina si
se dispone de hierro suficiente.
Las acciones ms importantes de la eritroproyetina son:
~ Estimular la formacin y diferenciacin celular.
~ Reducir el tiempo de maduracin celular
~ Aumentar la concentracin de hemoglobina
~ Facilitar la liberacin de reticulocitos a la circulacin y se
va a producir una hipercelularidad eritroblsticaen mdula sea.
Tambin los andrgenos estimulan la eritropoyesis, las hormonas
hipofisarias, tiroideas y suprarrenales.
GRANULOPOYESIS
Los granulocitos se forman en la mdula sea a partir de la Stem
Cell y la primera clula identificable es elMialoblasto. Las clulas
de la granulopoyesis constituyen el 6065% de las clulas de la mdula
sea.
El CFUGM es el precursor biopotencial que puede desarrollar CFUM
para producir monocitos.
Las clulas de la serie granuloctica que se desarrollan a partir
de CFUG; son la siguiente. La primera quepuede identificarse es el
Mialoblasto.
Mialoblastos: son clulas grandes entre 15 y 20 micras. Ncleo
redondo, grande y con nucleolo. El citoplasmaes escaso y
normalmente sin granulaciones y color azul.
Promielocito: generalmente algo mayor que el mialoblasto.
Presenta grnulos azurfilos. La cromatinanuclear empieza a
condensarse y los nucleolos resultan menos evidentes. La relacin
nucleocitoplasma esmenor (citoplasma es mayor).
Mielocito: ncleo redondeado y sin nucleolos. El citoplasma a
perdido la basoflea (color rosado) y contienegran nmero de
granulaciones especficas (neutrfilos, basfilos o eosinfilos)
(tintes diferentes). Es la ltimaclula de capacidad mittica.
Metamielocito: ligeramente inferior al mielocito. Se caracteriza
por un ncleo arrionado (forma rin) conuna cromatina ms
condensador.
Cayado banda: tamao ligeramente inferior al anterior. El ncleo
en forma de banda. En la base deformacin del cayado se produce la
constriccin parcial del ncleo.
Hasta que se forma un fino filamento entre los lbulos y se forma
el leucocito maduro o sementado.
Segn el tipo de granulacin especfica se habla de neutrfilos,
eosinfilos basfilos cada una presenta unasfunciones especficas.
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CFULM (Stemcell) CFUGM
1 CFUG Mieloblasto Promielocito Mielocito Metamielocito Cayado
Leucocito maduro (neutrfilo,eosinfilo y/o basfilo)
2 CFUM Monocitos.
Tras un periodo de 7 horas el neutrfilo emigra por diapedesis
(por pseudpodos) a los tejidos dondepermanece hasta su destruccin y
muerte celular. Seguida de su fagocitosis por los macrfagos
existente entodos los tejidos. La granulopoyesis dura entre 10 y 13
das. Los factores estimulantes del crecimiento regulanel desarrollo
de los granulocitos y monocitos.
Tambin se han identificado sustancias inhibidoras de la
granulopoyesis tales como la lactoferrina que esproducida por los
grnulos secundarios de los neutrfilos.
LINFOPOYESIS
Los linfocitos se desarrollan principalmente en los tejidos
linfoides del cuerpo como: los ganglios linfticos,los folculos
linfoides del bazo, el tracto gastrointestinal (apndice), las
amgdalas y otros sitios.
A partir del precursor linfoide (CFUL) aparece la primera clula
primitiva que es el linfoblasto.
Linfoblasto: posee un citoplasma no granulado que se tie de azul
oscuro en la periferia y ms claro en elcentro. El ncleo es grande.
La cromatina est dispuesta en forma reticular y tiende a ser
punteada. Por logeneral solo contiene 1 2 nucleolos.
Prolifocito: esta clula es ms pequea que su precursora y por lo
general presenta una banda ancha decitoplasma azul. La cromatina
nuclear tiende a aglomerarse y no se detecta un nucleolo
definido.
Linfocito grande: su citoplasma es bastante abundante y adquiere
un color azul celeste. Adems pueden existirunos pocos grnulos
citoplasmticos azurfilos pequeos y muy bien definidos. El ncleo es
redondo o unpoco dentado y la cromatina tiende a estar
aglomerada.
Linfocito pequeo: de menor tamao y el citoplasma es escaso. El
resto es idntico al linfocito grande.
Desde el ao 1962 se sabe que existen 2 tipos de linfocitos
fundamentales linfocitos T y linfocitos B. Que a suvez constan de
diversas subpoblaciones que se diferencian por una serie de
caractersticas inmunolgicas yfuncionales.
Los linfocitos T constituyen entre 6075% de los linfocitos de
sangre perifrica y los B entre u n1020%. Loslinfocitos B pueden
transformarse en clulas plasmticas y estas ltimas son secretoras de
inmunoglobulinas(anticuerpos). Los linfocitos entran y salen varias
veces de la circulacin sangunea. Algunos viven entre1020 das y
otros por espacio de varios aos.
Algunos linfocitos se transforman por un estmulo antignico,
otros se pierden a travs del tracto digestivo yrespiratorio y la
mayor parte son fagocitados por macrfagos en los ganglios.
CFUL
1 CFUL Linfoblatos Prolinfocito Linfocito grande pequeo
2 CFUM (plaquetas, hematies, neutrfilos,...)
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TROMBOPOYESIS
Es la produccin de plaquetas a partir de la Stemcell que se
encuentra en la mdula sea. Las plaquetas secaracterizan por la
endomitosis (divisin nuclear sin citoplasma). La clula mdula ms
primitiva es elmegacarioblasto.
Megacarioblasto: es la clula ms pequea de la serie. Su ncleo es
grande. Tiene nucleolos y el citoplasmaes basfilos y sin
granulaciones.
Promegacariocitos: es mayor que el anterior y se identifica
claramente en la mdula sea. El ncleo esmultiglobulado sin nucleolos
y cromatina densa.
Megacariocito: es mayor que los anteriores. Es la clula ms
grande de la mdula sea. El citoplasma esvoluminoso. Cubierto de
granulacin azurfila. El ncleo es multilobulado. Suele ser pequeo
encomparacin al citoplasma. La ruptura y desprendimiento del
citoplasma dan origen a las plaquetas otrombocitos.
Un megacariocito es capaz de producir 16.000 plaquetas.
Plaquetas: carecen de ncleo son pequeos fragmentos de citoplasma
que se han desprendido de la periferiadel megacariocito. Su tamao
suele estar entre 24micras. Permanecen en sangre entre 812 das.
Despus lasclulas del sistema fagoctico las destruyen en el bazo. Es
muy probable que la maduracin y proliferacinestn reguladas por dos
factores humorales.
1: El factor estimulante de las colonias megacariocticas que
inducen la proliferacin de las clulasprogenitoras
diferenciadas.
2: Es la trombopoyetina: tambin existen constituyentes que
inhiben la trombopoyesis algunos de ellosproducidos por las propias
plaquetas.
CFULM
1 CFUL
2 CFUM BFUMg Megacarioblasto Promegacarioblasto Megacariocito
plaqueta.
MADURACIN DE LA SERIE MONOCTICA Y MACRFAGOS
Este tipo celular se forma principalmente en el bazo y los
tejidos linfoides y en menor medida en la mdulasea. La primera
clula madura reconocible al microscopio es el monoblasto.
Monoblasto: es muy similar al mieloblasto y por lo general
pueden verse nucleolos, excepto que su citoplasmasuele ser ms
claro.
Promonocito: algo mayor que el monoblasto. La relacin
ncleocitoplasma es moderada. El ncleo esgrande y por lo general
contorneado y el citoplasma es basfilo.
Monocito: (1520micras) presente tanto en la sangre como en la
mdula sea. Con un citoplasma que secolorea de azul grisceo. A veces
pueden reconocerse uno finos grnulos azurfilos y vacuolas. El
ncleosuele ser redondo, reniforme o incluso puede ser tambin
globulado. La cromatina est dispuesta en grietas amodo de
madeja.
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RESUMEN
CFULM
1 CFUL (precursor linfoide) linfoblasto prolinfocito linfocito
(grande o pequeo).
2 CFUGM (precursor mieloide)
2.1 BFUE Promieloblasto Eritroblasto basfilo Er. policromatfilo
Er. ortocromtico reticulocito hematies
2.2 CFUG
A) CFUG Mieloblasto Promielocito Mielocito Metamielocito Cayado
polimorfonucleares
B)CFUM Monoblasto Promonocito Monocito
2.3 BFMMeg Megacarioblasto Promegacariocito Megacariocito
Plaquetas.
CONCEPTOS
La sangre circulante: la sangre es un lquido de color rojo que,
circula a travs de los vasos del cuerpo aexcepcin de los vasos
linfticos. Es fcilmente coagulable cuando se detiene. Est
constituida por elementosslidos y un elemento lquido que es el
plasma. La sangre es un lquido viscoso y denso que se
desplazalentamente. Si el agua tiene una viscosidad de 1, la sangre
tiene una viscosidad media de 5. Ello indica quefluir a una
velocidad 5 veces ms lenta que el agua, as mismo, es ms pesada que
es agua. Tiene unatemperatura de 37C, un pH entre 7'357'45 y una
concentracin de cloruro sdico de 3'5% similar al agua demar, dndole
un sabor salado. Supone el 8% del peso corporal. Con un volumen de
5 a 6 litros en un hombrede tamao medio.
Elementos que constituyen la sangre: la sangre est constituida
por 2 porciones uno es el plasma que es dondese encuentra disuelto
las sustancias y otros son los elementos formes (son clulas y
corpsculos que estnsuspendidos en el plasma y son las siguientes: 1
Hematies, glbulos rojos: son clulas anucleadas quetransportan el O2
desde los pulmones a los tejidos.
2 Leucocitos o glbulos blancos:
Granulares (polinucleares PMN): Neutrfilos, eosinfilos, basfilos
Agranulados (mononucleares): linfocitos, monocitos
3 Plaquetas
Plasma: es un lquido de color amarillento que queda en la parte
superior de un tubo de ensayo despus decentrifugar el mismo con una
determinada cantidad de sangre y un anticoagulante apropiado.
Se obtiene por centrifugacin de sangre mezclada con
anticoagulante, variando el aspecto microscpico delmismo segn las
condiciones y patologas del individuo. Siendo en condiciones
normales un lquidoamarillento. La composicin es la siguiente:
Agua: constituye alrededor del 91% del plasma. Sus funciones son
como medio absorbente de calor, actuarcomo solvente y ser el medio
de suspensin de los elementos formes.
Protenas: constituyen el 8% de los solutos del plasma.
Bsicamente existen las siguientes:
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~ Albminas: suponen ms de la mitad de las protenas plasmticas.
Es producida por el hgado; dan origen ala viscosidad de la sangre;
ayuda a conservar el balance hdrico entre los tejidos pues regula
el volumen entrela sangre.
~ Globulinas: de estas el grupo ms importante son las:
Gammaglobulinas: que intervendrn en la defensa immunitaria
Fibringeno: es una protena de fase aguda; representa una pequea
porcin de un papel especial en lacoagulacin sangunea.
Nitrgeno no proteico: son sustancias que contienen N2 y no son
protenas. Son productos de desecho delmetabolismo proteico que se
elimina por el rin, Son el cido rico, urea, creatinina y las sales
de amonio.
Sustancias alimenticias: una vez en el tubo digestivo se
descomponen los productos. Estos pasan a la sangre.Para ser
distribuidos a todas las clulas del organismo. Estos productos son
los aminocidos, la glucosa y loslpidos.
Sustancias reguladoras: son las enzimas y las hormonas. Los
enzimas son producidos por las clulas delcuerpo y catalizan
reacciones qumicas. Las hormonas son producidas por las glndulas
endocrinas y regulanla defensa de funciones orgnicas.
Gases respiratorios: CO2 y O2. Estn ms relacionadas con los
hematies que con el plasma.
Electrolitos: son iones que constituyen las sales inorgnicas del
plasma. Los cationes son: Na, K, Ca+2,MG+2. Los aniones son: P,
SO4, bicarbonatos, Cl. Estas salen tienen la funcin del
mantenimiento de unapresin osmtica adecuada. La regulacin del pH y
el mantenimiento de un balance fisiolgico adecuado entrela sangre y
los tejidos.
Suero: el suero es simplemente el plasma menos las protenas de
la coagulacin (fibringeno). La sangreextrada del organismo,
introducida en un tubo de ensayo y centrifugada si se deja pasar un
tiempo se observaen el plasma la formacin de una masa gelatinosa
blanca que no es ni ms ni menos un cogulo formado porla accin del
fibringeno. Si se retira este cogulo tendremos el plasma
desprovisto de fibringeno y algunosfactores de coagulacin que es a
lo que denominamos suero. El suero se obtiene al centrifugar una
muestra desangre total recogida en un tubo de ensayo sin
anticoagulante o bien obtenida en reposo tras la retraccin
delcoagulo sanguneo.
Es de color amarillo limpio y transparente. Cuando se extrae
suero despus de una comida copiosa puedetener un aspecto lechoso
blanquecino por la presencia de innumerables gotitas de grasa
(presencia decolesterol o triacilglicridos elevada).
El color del suero puede variar en ciertos estados
patolgicos:
AMARILLO FUERTE: aumento de bilirrubina.
COLOR MUY PLIDO: en las anemias, en las hemodiluciones.
PARDO ROJIZO: hemlisis intensas (ruptura de hematies).
ROJIZO: aparece en caso de hemlisis. Tambin en caso de mala
manipulacin de extraccin sangunea o delproceso de separacin de la
muestra sangunea durante la centrifugacin de la misma.
21
-
Anticoagulantes: los 3 anticoagulantes habitualmente utilizados
en hematologa son: citrato trisdico, EDTA(las sales tripotsica
idiosdicas de cidos etilendiaminotetractico) (los dos primeros
previenen lacoagulacin por extraccin del calcio de la sangre
mediante precipitacin o unin en forma no ionizada.),HEPARINA (acta
formando un complejo con la antitrombina III del plasma que inhibe
la trombosis y otrasetapas de la activacin de los factores de la
coagulacin).
Citrato sdico: se utiliza para las pruebas del estudio de
hemostasia (coagulacin) la proporcin es 1 parte decitrato en
solucin acuosa y 9 partes de sangre total. En la actualidad se usa
el citrato tamponado porqueayuda a estabilizar el pH del plasma.
Para el estudio de VSG 1 de citrato y 4 de sangre.
EDTA: se utiliza en una concentracin de 1 a 2 mg/ml de sangre y
es el anticoagulante preferido para losrecuentos celulares y los
estudios morfolgicos.
Heparina: de 0'1 a 0'2 mg/ml de sangre no afecta al tamao
celular o al hematocrito. Es el mejoranticoagulante para la
prevencin de la hemlisis. No es satisfactorio para recuentos
leucocitarios oplaquetarios debido a que produce agregacin
celular.
CAUSAS DE ERROR
Las extensiones se deben preparar inmediatamente. Si no se
pueden realizar en el trmino de 2 o 3 horas lasangre debe
refrigerarse a 4. Si se mantiene a temperatura ambiente, el
hinchazn de los hematies aumentaentre las 6 y las 24 horas. Los
hematies aumenta el hematocrito y el volumen corpuscular medio y
disminuyela concentracin corpuscular media de hemoglobina y la
velocidad de sedimentacin.
Antes de tomar una muestra de un tubo con sangre venosa para una
determinacin hematolgica es importantemezclar la sangre
completamente. Si el tubo ha estado de pie debe invertirse al menos
60 veces o colocarlodurante 2 minutos en un rotador mecnico pues de
lo contrario la precisin se vera afectada.
TEMA V
RECUENTOS DE CLULAS HEMTICAS
Los recuentos de eritrocitos, leucocitos y plaquetas se expresan
como concentraciones que seran nmero declulas X unidad de volumen
de sangre. Hasta hace poco se expresaban en V de mm3. Actualmente
se expresaen litros.
RECUENTOS MANUALES
Para ellos se utiliza las cmaras de recuento o hemocitmetros;
aunque este mtodo se utiliza raramente en elrecuento sistemtico,
sin embargo, se requiere que el tcnico est capacitado para
aplicarlo en:
~ La comprobacin de la validez de los mtodos electrnicos con
objeto de intentar su calibracin.
~ Como mtodo de comprobacin de la validez de recuentos
electrnicos en caso de leucopenia profunda opor el contrario
leucemia.
~ Como mtodo de apoyo:
Cualquier mtodo de recuentos de clulas incluye 3 fases:
1 Dilucin de la sangre.
22
-
2 Muestreo de la sangre diluida en un volumen determinado.
3 Recuento de las clulas en ese volumen.
RECUENTOS ERITROCITARIOS
Para la realizacin del recuento manual necesitamos un lquido de
dilucin, una cmara de recuento ohemocitmetros, una pipeta diluidora
y un microscopio.
Lquido de dilucin: el ms empleado es el lquido de Hayem. Est
compuesto de 5g de ClNa, 2'5g deSO4Na2, 2'5g de Cl2Mg y agua
destilada cantidad suficiente para 1000ml
En general vale cualquier solucin isotnica con un conservante
que no hemolice, aglutine o deforme a loshematies al menos durante
un tiempo (isotnica misma concentracin que el suero sanguneo al
menos en estecaso).
Adems lleva un fijador que conserva la forma del eritrocito
Las diluciones de la sangre para recuentos celulares y
determinaciones de hemoglobina se pueden realizartanto por mtodos
manuales como por mtodos semiautomticos (ms rpidos y fiables)
Los mtodos semiautomticos son instrumentos que aspiran la
muestra y la mezcla con el diluyente.
Los mtodos manuales utilizan pipetas de dilucin o pipetas
microcapilares o un sistema denominadoUnopette que son tubos
microcapilares con un vial de plstico que contiene el
diluyente.
Pipetas de dilucin: son pipetas de cristal que constan de un
tubo capilar graduado dividido en 10 partes ymarcado con 0'5 en la
5 seal y con 1 en la 10 seguido de un ensanchamiento o ampolla que
lleva una perlitaen su interior para facilitar la mezcla. Por
encima de la ampolla lleva un capilar corto por donde se
introduceel tubo aspirador y con una seal 101 en la pipeta de
hematies y una seal 11 grabado en la pipeta de dilucinde los
leucocitos.
La pipeta de recuento de los hematies es roja y la de blancos es
blanca. La pipeta de rojos tiene una capacidadde 100 veces el
volumen del capilar y la de los leucocitos 10 veces el volumen del
capilar. En la pipeta deeritrocitos cuando la sangre es aspirada,
hasta la seal de 0'5 y el lquido de aspiracin hasta la seal 101.
Ladilucin resultante es de 1/200 de lquido de dilucin. Una vez que
se llena la ampolla el capilar no contieneclulas ya que han sido
arrastradas por el lquido de dilucin. Para observarlo en la cmara
de recuento habrque vaciar su contenido antes.
En la pipeta para recuentos de leucocitos las marcas sobre el
tubo capilar son las mismas que la de la pipeta deeritrocitos pero
la ampolla es ms pequea con una seal de 11 grabada por encima de
ella.
Cuando la sangre es aspirada hasta 0'5 y diluida hasta 11 la
dilucin resultante es de 1/20
Cmaras de recuentos: el hemocitmetro o cmara de recuento es un
grueso portaobjetos de cristal en cuyotercio medio estn fijadas 3
plataformas paralelas que se extiende a lo ancho de su superficie.
La plataformacentral est subdividida por una ranura transversal en
2 mitades cada una ms ancha que las 2 laterales yseparadas de ellas
y entre s por fosos. Las plataformas centrales o piezas de fondo
estn exactamente 0'1mlms bajas que las plataformas laterales y
tienen una regla de Neubaver mejorada de 3X3 ml y est subdivididaen
9 cuadrados secundarios de 1X1 mm (1mm2). Los 4 cuadrados de las
esquinas denominados A, B, C y Dse utilizan para el recuento de
leucocitos y estos estn a su vez subdivididos en 16 partes llamados
terciarios.El cuadrado central est dividido en 25 cuadrados
terciarios, cada uno de los cuales mide 0'2 X 0'2 mm
23
-
(0'04mm2) y cada uno de estos se dividen en 16 cuadrados ms
pequeos.
Un grueso cubreobjetos que forma un plano perfecto acompaa a la
cmara de reactivos. Cuando el cubre estsituado sobre la plataforma
de la cmara de recuento hay un espacio de 0'1 mm de altura entre
este y laplataforma rayada. Por tanto cada mm2 forma la base que
tiene un espacio que mide 0'1 m3.
Limpieza de las cmaras, cubres y pipetas: las cmaras y cubres
deben lavarse, inmediatamente despus desu utilizacin, con agua
destilada y se dejan secar al aire. Estas superficies no se deben
tocar con gasas(trapos,...), puesto que se pueden rayar y confundir
con una cuadrcula.
La cmara y el cubre no se deben tocar puesto que las huellas son
difciles de sacar. Antes de su utilizacin lassuperficies deben
estar limpias, secas y sin hilos y marcas de agua. No se deben
tocar excepto por los bordes.
Las pipetas recin usadas se dejarn con la punta hacia abajo en
un recipiente con agua y con una gasa en elfondo. De esta forma
evitaremos que se resequen y deterioren las puntas. Para su
limpieza definitiva se usaruna bomba de succin o un chorro de agua
con una jeringuilla y se pasar 1 con agua del grifo, luego conagua
destilada, despus etanol (alcohol) y finalmente ter. Por ltimo se
hace pasar por el interior de laspipetas una corriente de aire
hasta que estn secas, lo que se comprueba por la bolita que se
mueve librementesin adherirse a las paredes. Si no se necesitan
hasta el da siguiente se coloca con la punta hacia abajo en
unrecipiente de boca ancha con una gasa en el fondo y se eleva la
estufa a 37C.
TCNICA
Los hematies son clulas anucleadas que se observan como discos
bicncavos de 6 a 8 micras de dimetro y 2micras de espesor.
Se puede utilizar sangre capilar o venosa. Si se emplea sangre
venosa debe ser recogida sobre EDTA (tapavioleta) debe mezclarse
bien con el anticoagulante invirtiendo el tubo varias veces antes
de cargar la pipeta.
Echaremos una pequea cantidad de sangre en un vidrio de reloj y
procederemos a cargar la pipeta hasta lamarca 0'5 con cuidado de
que no aparezcan burbujas. Se va llenando la pipeta en posicin
horizontal. Si nospasamos de la marca eliminamos el exceso de
sangre golpeando suavemente la punta de la pipeta sobre untrapo
limpio o papel... Es necesaria mucha exactitud en esta parte ya que
un pequeo error lo multiplicaramospor 200.
Limpiamos la punta de la pipeta con un trapo y la introducimos
en la disolucin de Hayem aspirando amedida que rotamos la pipeta
para que se mezcle bien la sangre. Llenamos hasta la marca 0'1 no
siendonecesario que este enrase sea tan exacto porque en este caso
el error es mnimo. A continuacin colocamos elcubre. La adhesin de
este a la cmara debe ser perfecta para ello aplicamos una suave
presin con lospulgares deslizando este (cubre) hacia arriba y abajo
sobre las plataformas laterales hasta que confirmemos suadhesin.
Esta adhesin se comprueba por la aparicin de los anillos
multicolores de Newton que debenpersistir cuando dejemos de ejercer
la presin (esta maniobra se favorece si previamente se
humedeceligeramente la plataforma).
A continuacin procedemos a cargar la cmara expulsando las 3 4
primeras gotas que ocupan el tubo capilarque no contiene clulas.
Colocamos la pipeta en el borde del cubre controlando que forme
unos 30 con lacmara. El lquido se desliza bajo el cubre atrado por
capilaridad y debemos controlar esta entrada haciendopresin con la
punta de la lengua sobre la boquilla o con el dedo sobre el extremo
de la pipeta. Debemos tenercuidado de que el lquido penetre en el
espacio debajo del cubre sin que rebose o forme burbujas, ya que
elexceso de lquido tiende a elevar el cubre y obtendramos recuentos
errneamente elevados.
Se dejar que las clulas sedimente unos minutos en la cmara y se
llevar al microscopio. Si no vamos a
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-
contar enseguida las clulas se debe proteger el lquido contra la
evaporacin colocando la cmara en unaplaca de petri con un papel de
filtro humedecido en su interior.
Observamos con un objetivo de 10X para comprobar que las clulas
estn distribuidas uniformemente sino esas se repetir el
proceso.
Se cierra parcialmente el diafragma condensador del microscopio
para hacer que los hematies resalten connitidez al utilizar las
lentes de poco aumento. Se cuenta los eritrocitos que hay en 80
cuadrados pequeos conel objetivo de 40X. Para ello se coge un
cuadrado mediado central y los cuatro de las esquinas.
De aquellos hematies que cabalgan en las lneas de los cuadrados
contaremos los que toquen 2 lneas ydespreciaremos los que toquen
los otros 2. As podemos contar los que toquen los otros 2. As
podemos contarlas que toquen la lnea de arriba y la de la derecha y
despreciaremos los de abajo y los de la derecha.
LAS CARACTERSTICAS DE UNA CMARA DE RECUENTOS BIEN CARGADA
SON:
El lquido debe llenar completo o casi completo donde se
encuentra el retculo..
No debe existir lquido en el foso.
No debe existir burbujas.
RECUENTOS DE LEUCOCITOS
Para el recuento de leucos se cuentan los 4 cuadrados de las
esquinas. Hacemos lo mismo que para loshematies pero empleando la
pipeta de blancos, de modo que la solucin que obtenemos es de 1/20.
Se utilizael lquidos de Turck. El lquido de Turck es hipotnico de
modo que se destruyen los hematies y as noentorpecen en el
recuento. El lquido de Turck consta de cido actico glaciar 2ml,
violeta de gencianadisolucin de 1% 1ml y agua destilada en cantidad
suficiente para 1000ml. Deber filtrarse a menudo paraevitar
levaduras y hongos.
Clculos
En un principio es un poco difcil distinguir los leucocitos de
los restos de membranas de los hematieshemolizados. Se debe tener
en cuenta que los leucocitos son ms refringentes (ms brillantes) al
moverlo conel microscopio que los restos de hematies. Se debe
observar la presencia de la membrana citoplasmtica y dela membrana
nuclear (a veces ms) como lneas finas y brillantes. Esto se observa
fcilmente moviendo elmicroscopio hacia delante y hacia atrs.
RECUENTOS DE PLAQUETAS
Debe evitarse la aglomeracin de plaquetas mediante una correcta
y rpida puncin venosa. El recuento puedehacerse con la pipeta de
rojo o la de blancos cogiendo sangre hasta 0'5 y diluyendo hasta la
marca 11 de 101con un lquido de disolucin llamado PlaquetCrom. Est
compuesta por oxalato amnico al 1%. Este lquidoprovoca la hemlisis
de los hematies y adems contiene un antiagregante plaquetario. Una
vez cargada lapipeta la agitamos y esperamos unos minutos para que
se hemolicen bien los hematies. Cargamos la cmara yla colocamos en
una placa de petri con un papel humedecido para evitar la
evaporacin del lquido. Ladejamos reposar 15 minutos para despus
hacer el recuento. Este se hace de la misma manera que loshematies
de modo que si usamos la pipeta de rojos multiplicaremos el nmero
contado por 10.000 y si ha sidola de blancos por 1.000
MTODO DE FONIO PARA RECUENTOS DE PLAQUETAS
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Se coloca sobre el pulpejo del dedo previamente desinfectado una
gota de disolucin de sulfato de magnesio(MgSO4) al 14% estril y a
travs de ella hacemos una puncin dactilar a fin de obtener una
rpida dilucinde la sangre y evitar la autoaglutinacin de las
plaquetas. Se procede a hacer una extensin y se tie como unafrmula
normal pero manteniendo el colorante GIEMSA durante ms tiempo. Se
lleva al microscopio y seobserva con el objetivo de inmersin.
Se cuenta el nmero de plaquetas que hay por cada 1000 hematies.
Para ello contamos el nmero de hematiesque hay en un campo en el
cual deben estar distribuidos homogneamente. Calculamos el nmero de
camposque tenemos que ver para que 1000 hematies. Contamos en ese
nmero de campos las plaquetas que sepresentarn como pequeos
corpsculos de 2 a 4 micras teidas de color azul y algunas
granulacionesprpuras. Despus sabiendo el nmero de hematies por mm3
podremos calcular fcilmente el nmero deplaquetas por mm3
(1000/Xhematies = al nmero de campos que tenga que mirar)
RECUENTOS DE RETICULOCITOS
Los reticulocitos o eritrocitos inmaduros existen en la sangre
del individuo en proporcin de 510 % por cada1000 hematies en
condiciones normales. Debido a que aunque permanecen etc. la mdula
de 2 a 3 dasterminan su maduracin en la sangre perifrica en 24horas
aproximadamente (por eso deben observarse dentrode las 6 primeras
horas despus de la extraccin porque maduran un vitro) Su tamao es
el de los demshematies pero se caracterizan por contener una pequea
cantidad d ARN formando un retculogranulofilamentoso observable al
ser teido. La cantidad de ARN es tanto menor cuanto ms madura es
laclula.
EL MATERIAL
Tubo de hemlisis, porta, porta esmerilado, pipetas pasteur,
microscopio, aceite de cedro, solucin colorantede azul cresil
brillante (frmula: 1gr de cloruro de sodio al 0'85% cantidad
suficiente para 100ml), sangreentera anticoagulada o capilar.
TCNICA
En un tubo de hemlisis se mezclan 3 gotas de sangre bien
homogeneizada con 3 gotas de colorante, Mezclarsuavemente, dejar
reposar 15 minutos de modo que el colorante tia los reticulocitos.
Pasados los 15 minutosse homogeneiza y con la pipeta Pasteur se
pone una gota en el porta y se realiza una extensin con el
portaesmerilado.
NOTA: EXTENSIN: se pone una gota a 1cm del borde derecho del
porta. En el extremo opuesto se sujetacon el ndice y pulgar de la
mano izquierda. Con la derecha se toma el esmerilado sujetndolo
desde arribacon el ndice y pulgar. Se apoya por delante de la gota
a 45 de inclinacin. Se hace retroceder de modo que elborde coincida
con la gota que se extiende por capilaridad por este. Antes de que
llegue a los extremos sedesliza hacia delante con movimiento firme
y rpido por el de la mesa. El movimiento de desplazamientotermina
elevando el de la derecha antes de llegar al final. Se debe secar
rpidamente por agitacin al aire demodo que no se distorsionen las
clulas.
Miramos con objetivo de 100X se busca una zona en la extensin en
el que el nmero de eritrocito por camposea de aproximadamente de
100 y se cuentan los reticulocitos que hay cada 1000 hematies. Para
mayorexactitud se harn 2 extensiones. Los eritrocitos y
reticulocitos aparecern con un color verdoso y el retculode ARN de
azul oscuro se expresa en % %o de eritrocitos. Los valores son:
~ En recin nacidos (sangre del cordn): 26%
~ En adultos y nios: 0'22%
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RECUENTO ELECTRNICO DE CLULAS
La mayora de los mtodos utilizados actualmente para el recuento
de clula sanguneas, estn basadas en unode los principios
siguientes:
1 Un rayo de luz atraviesa una corriente de clulas y estas
ocasionan reflexionan en el rayo que se conviertenen impulsos
elctricos mediante un tubo que se llama fotomultiplicados.
2 Las clulas que pasan a travs de una abertura provocan cambios
en una resistencia elctrica que quedanregistrados como impulsos
elctricos.
RECUENTOS CON LUZ DISPERSA: un haz de luz de tipo monofocal es
condensado por donde fluye lasangre diluida. Si no hay ninguna
partcula la luz va a parar a una pantalla redonda o disco (D) que
la retiene.
Si este haz condensado encuentra una partcula entonces se
refleja la luz que ir a parar a un tipofotomultiplicador
fotodetector que lo convierte en impulso elctrico.
Cuando para la sangre diluida los glbulos entran de uno en uno e
irn dando seales al tubo fotomultiplicadorque sern posteriormente
contadas (las seales). El tubo por el que atraviesan las clulas son
de cristal.
En el caso de recuento de hematies el diluyente ser una dilucin
isotpica para evitar la lisis de estos. En elcaso de los leucocitos
el diluyente llevar un agente hemoltico como por ejemplo la
saponina.
RECUENTOS BASADOS EN LA RESISTENCIA ELCTRICA: se funda en que
las clulas van atravesaruna abertura o orificio por la cual est
pasando una corriente elctrica de modo que provocan cambios en
laresistencia elctrica de modo que provocan cambios en la
resistencia elctrica que se registra como impulsoselctricos. La
sangre se diluye en una disolucin isotnica conductora de la
electricidad. El cilindro de cristallleva un lquido conductor.
Tambin tiene un electrodo en su interior que es el E2 y en su pared
un orificio detamao adecuado para permitir la entrada de las
clulas. En el recipiente que contiene la dilucin celular(sangre
diluida) hay otro electrodo que es el E1.
El cilindro est conectado a un tubo en forma de U parcialmente
lleno de mercurio y que tiene 2 contactoselctricos.
El cilindro est sumergido en la suspensin de clulas que van a
ser contadas y se lleva con la disolucinconductora (una bomba de
vaco hace llegar el mercurio hasta la parte superior del tubo). Y
la suspensin declulas fluye a travs del orificio hacia el interior
del cilindro es menor que en le exterior.
Se cuentan los impulsos elctricos que son proporcionales al
volumen de las clulas. Se empieza el recuentocuando el mercurio
establece contacto con CE1 y se detiene cuando toca CE2 contndose
un volumen desuspensin de clula igual al volumen que hay entre CE1
y CE2.
NORMAS GENERALES DEL MANEJO DEL APARATO DE REACCIN AUTOMTICO
Lo general es seguida los consejos del fabricante. Sin embargo
hay una serie de acciones que son comunes ala mayor parte de los
aparatos.
1 Al comenzar a hacer los recuentos conectar el aparato a la red
y esperar el tiempo necesario para que secaliente.
2 Se limpian los circuitos por donde va a fluir la sangre y
lquidos fluyentes con detergentes que nos va aproporcionar el
fabricante.
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3 Una vez limpio lo circuito se debe calibrar el aparato con las
suspensiones patrn
4 Comenzar el recuento
5 Una vez concluido el recuento el aparato debe quedar en
conclusiones ptimas de reposo hasta el dasiguiente; por lo tanto se
debern lavar los circuitos con el detergente y dejar el aparato
segn las normasrecomendables por el fabricante.
LOS SISTEMAS DE RECUENTO SDR
No diferencian entre eritroblasto, hematies anucleados y
leucocitos por lo que si mediante la observacin delfrotis se
observa una presencia de eritroblastos mayor al 10% se debe hacer
una correccin en el recuento deleucocitos.
Leucocitos reales =
CAUSAS DE ERROR EN LOS RECUENTOS ELCTRICOS
Al igual en el recuento con la cmara cuentaglbulos el empleo de
mtodos electrnicos puede versesometido a varios errores, sobre todo
si se olvida el control peridico y el calibrado diario de los
elementos. Elerror debido al propio mtodo suele ser menor al 1%
pero puede verse notablemente incrementado por lassiguientes
causas:
1 Uso del diluyente incorrecto
2 Presencia de partculas extraas en el lquido diluyentes
3 Lisis incompleta de hemlisis en el recuento leucocitario
4 Obstruccin de capilares u orificio de recuento
5 Contaminacin de arrastre de una muestra a la siguiente
6 Dilucin incorrecta
7 Averas en los componentes elctricos de los aparatos
8 Mala agitacin de la muestra
Hoy en da hay aparatos electrnicos que hacen la diferenciacin de
5 poblaciones celulares de modo quedistinguen linfocito de
monocitos y dentro de los basfilos, neutrfilos y eosinfilos. Estos
aparatos se fundanen la utilizacin de tinciones citoqumicas. Adems
dan alarma cuando hay clulas anormales, inmaduras.
VALORES NORMALES DE LAS CLULAS SANGUNEAS
Los hematies tienen los siguiente parmetros:
En nios de 1 ao estn entre 4'5 + 1'5 106 hem/mm3
En nios de 2 aos estn entre 4'5 + 2 106 hem/mm3
En los hombres estn entre 5'4 + 1'5 106 hem/mm3 (4'55)
28
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En las mujeres estn entre 4'8 + 1'2 106 hem/mm3 (44'5)
En el recin nacido las cifras son ms altas prximas a los 6.106
para descender a los pocos das a los valoresnormales.
Estas cifras son constantes no ofreciendo variaciones por causas
de ejercicio fsico, la noche, etc. Sin embargopuede haber ms
espesamiento de la sangre, o grandes sudaciones o prdidas de lquido
(deshidrataciones)
Los hematies aumentan en personas que viven en lugares
altos.
Durante el embarazo disminuye por hemodilucin (dilucin de la
sangre).
Los leucocitos tienen los siguientes parmetros:
En nios de 1 ao estn entre 10 + 2'5 103 hem/mm3
En nios de 2 aos estn entre 8 + 1'5 103 hem/mm3
En hombres estn entre 7'4 + 3'5 103 hem/mm3
En mujeres estn entre 7'2 + 3'5 103 hem/mm3
Las cantidades normales son entre 5 103 y 10 103. Estas
cantidades son de amplia variacin y las cifrashalladas en un mismo
individuo con pocas horas de diferencia puede variar en estados
normales en hasta en2.000/mm3; por la maana existen unos pocos
menos que por la noche.
Existen ciertos leucocitosis (ms de 10.000/mm3) fisiolgicas
creadas por el ejercicio muscular, la digestinla influencia del
calor o del fro, las emociones extensas, embarazo, e incluso por
cambios posturales.
Al nacer el nmero de leucocitos es muy elevado y al as 24 horas
alcanza incluso las 20.000/mm3. En laprimera semana desciende hasta
8.000 a 10.000 permaneciendo en estas cifras y descendiendo
paulatinamentehasta la pubertad donde alcanzan las cifras normales;
adems la cifra de leucocitos en la primera infancia sonmuy
variables individualmente pudiendo encontrarse cifras de hasta
16.000 /mm3 que no se consideranpatolgicas.
Los lmites correctos de las plaquetas son entre 100.000 400.000
plaq/ mm3.
Las cifras normales dependen en gran medida de los mtodos
empleados en su recuento. Adems en elsupuesto sano ya existen
normalmente variaciones individuales y espontneas.
VARIACIONES EN EL RECUENTO DE LAS CLULAS SANGUNEAS.
Terminologa:
ANEMIA: es la disminucin de la cantidad de hemoglobina acompaada
la mayora de las veces dedisminucin de la cantidad de hematies.
Puede obedecer a una prdida por hemorragia, a hemlisis o a unafalta
de su formacin en la mdula sea (insuficiencia medular).
POLICITEMIA: aumento del nmero de hematies. Puede ser relativa o
permanente (policitemia severa).
LEUCOCITOSIS: es el aumento del nmero de leucocitos por encima
de 10.000/mm3. Se presenta en muchasenfermedades infecciosas en
procesos inflamatorios, agudos y crnicas y alcanza los valores
mximos en las
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leucemias en las que se pueden sobrepasar los 100.000mm3 (cuando
se utilizan sistemas automticos derecuentos las muestras de sangre
con gran nmero de leucocitos pueden contaminar la siguiente
produciendocifras falsamente elevados).
LEUCOPENIA: disminucin de la cantidad de leucocitos por debajo
de los 5.000/mm3. Se presentan algntipo de infecciones. Por
ejemplo: fiebres tifoideas, sarampin, brucelosis y algunas
enfermedades hemticas.
TROMBOPENIA: disminuye la cantidad de plaquetas por debajo de
las 100.000/mm3. Se presentan porejemplo: por las prpuras T
(manchas rojas de la piel).
TROMBOCITOSIS: aumento de las plaquetas por encima de
400.000.
TEMA VI
HEMATCRITO
La sangre est formada por una parte corpuscular (clulas
sanguneas) y una parte lquida (plasma). De laparte corpuscular
aproximadamente el 90% corresponde a glbulos rojos.
Si la sangre se hace in coagulable (por EDTA en proporcin 19) y
se centrfuga; se obtiene la separacin dela parte corpuscular y la
plasmtica. La primera en la que se observa hemates, leucocitos y
plaquetas es la quetiene mayor densidad por lo que quedar en el
fondo del tubo, en cambio el plasma corresponder a la
parteflotante
El hematocrito de una muestra de sangre es la relacin del
volumen de eritrocitos con el de sangre total. Seexpresa como un
porcentaje P/V o preferiblemente en una fraccin decimal en las que
las unidades L/L (sonlongitudes) estn implcitas.
La heparina seca, el oxalato equilibrado o el EDTA resultan
satisfactorios como anticoagulantes.
El hematocrito venoso coincide estrechamente con el obtenido con
la puncin cutnea (yema del dedo).Ambos son mayores que es
hematocrito corporal total.
El hematocrito se puede medir directamente (por centrifugacin
con macromtodos o micromtodos) o deforma indirecta (como el
producto de CVM volumen corpuscular medio por el recuento de
hemates enaparatos automticos). Analizando la sombra que produce la
poblacin eritrocitaria al reflejarse en un campooscuro.
MACROMTODO DE WINTROBE
Consiste en un tubo de cristal graduado al que se centrfuga para
separar las dos fases
COMO SE HACE LA LECTURA
La lectura se realiza midiendo la columna de eritrocito por ml
(L1) y la altura de la muestra total de sangre(L2).
Valor hematocrito = L1/L2.
Por encima de la capa de glbulos rojos aparece una capa blanco
griscea que corresponde a leucocitos yplaquetas y que no se debe
incluir en L1.
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En esta tcnica el tiempo de centrifugacin es alto. Requiere una
cantidad relativamente elevada de sangre (5ml) y adems los tubos
que se utilizan no son desechables por lo que se ha abandonado a
favor delmicromatocrito y sobre todo de los mtodos automticos.
MTODO MICROMATOCRITO
Tiene 2 ventajas: la primera es que se utiliza poca cantidad de
sangre y la segunda es que se pueden hacer ungran nmero de pruebas
a la vez y en poco tiempo.
EQUIPO
Se usa un tubo de hematocrito capilar de 7cm de longitud con un
orificio uniforme de alrededor de 1mm.Estos tubos pueden estar:
Heparinizados: sirve para tomar sangre capilar directamente.
No heparinizados: sirve para tomar sangre venosa anticoagulada
con EDTA.
Se debe disponer de centrfugas especiales que producen campos
centrfugos que oscila entre 10.000 y 13.000Ges.
MTODO
El tubo de hematocrito se llena por atraccin capilar a partir
del punto de puncin o de una sangre venosa bienmezclada. Los tubos
capilares deben llenarse al menos 5 cm. El extremo vaco se sella
con plstico moldeable(plastilina). Los tubos ya llenos se colocan
en los canales o servos radiales del aparato de centrifugacin conel
extremo cerrado dirigido hacia fuera.
Se coloca el fondo del tubo contra el relleno de goma para
evitar rupturas. La centrifugacin durante 5minutos a 10.000 a
12.000 Ges (11.000 RPM) es satisfactoria. A menos que el
hematocrito exceda del 50% eneste caso se centrfuga 5 minutos
adicionales con objeto de asegurar que se a reducido al mnimos la
cantidaddel plasma atrapado.
Los tubos capilares no estn grabados. La longitud de toda la
columna y de la columna de eritrocito se debemedir con una regla
milimetrada y una lupa o con un lector de hematocrito.
Para usar el lector de hematocrito se debe colocar el extremo
inferior de la columna de sangre en la lneacorrespondiente al 0 y
el superior al correspondiente al 100. En todo caso seguir las
instrucciones delfabricante.
La determinacin del hematocrito debe utilizarse por duplicado y
la diferencia entre los 2 valores no debe sersuperior a 0'01.
INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS
El hematocrito normal para valores adultos es de 0'41 a 0'51 y
par mujeres 0'36 a 0'45. Un valor por debajo delo normal en un
individuo indica anemia y un valor ms alto policitemia. El valor
del hematocrito es bajo enla hidriemia del embarazo (proporcin
desusada de suero en sangre en relacin a los corpsculos
sinincremento de la masa total de sangre).
El hematocrito puede ser normal o incluso elevado en el shock
acompaado por hemoconcentraccin debido ala prdida de sangre aunque
la masa total de eritrocitos puede estar considerablemen