Fabrício Freitas Maria do Carmo Thiago Malardo. Leishmaniasis Leishmaniasis is caused by protozoan parasites belonging to the genus Leishmania. The parasites.

Fabrício FreitasMaria do CarmoThiago Malardo

Leishmaniasis

Leishmaniasis is caused by protozoan parasites belonging to the genus Leishmania. The parasites are transmitted by the bite of an insect vector, the phlebotomine sandfly.

Leishmaniasis threatens about 350 million men, women and children in 88 countries around the world.

As many as 12 million people are believed to be currently infected, with about 1–2 million estimated new cases occurring every year.

Parasite's life cycle

– Cutaneous leishmaniasis - is the most common form. It usually produces ulcers on the exposed parts of the body, such as the face, arms and legs;

– Diffuse (disseminated) cutaneous leishmaniasis - is characterized by the presence of a large (>10) number of lesions at several anatomic sites (head, limbs, and trunk);

– Mucocutaneous leishmaniasis - the lesions can lead to partial or total destruction of the mucous membranes of the nose, mouth and throat cavities and surrounding tissues;

– Visceral leishmaniasis - is the most severe form, in which vital organs of the body are affected.

Forms of leishmaniasis

Global distribution of leishmaniasis

BMJ VOLUME 326 15 FEBRUARY 2003

Geographical distribution

• 90% of cutaneous leishmaniasis cases occur in Afghanistan, Brazil, Iran, Peru, Saudi Arabia and Syria;

• 90% of mucocutaneous leishmaniasis occurs in Bolivia, Brazil and Peru;

• 90% of all visceral leishmaniasis cases occur in Bangladesh, Brazil, India, Nepal and Sudan.

Geographical distribution of cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis in the

New World

www.who.int/leishmaniasis/leishmaniasis_maps

The main Leishmania species

Treatment regimens

Immune response against Leishmania

TLR and MyD88 pathway in Leishmania infection

TLR signaling pathway

K. Takeda, S. Akira / Seminars in Immunology 16 (2004) 3–9

Events that lead to susceptibility

Events that lead to resistance

NATURE REVIEWS / IMMUNOLOGY / VOLUME 2 / NOVEMBER 2002

Resistance and susceptibility in leishmaniasis

Suppressor of cytokine signalling (SOCS)

Thiago Malardo

Why some strains of Leishmania cause more severe injuries than others

Parasitized parasite

• Entamoeba histolytica (1960);

• Giardia lamblia (1986);

• Trichomonas vaginalis (1986);

• Most recently in Leishmania (1988).

Leishmania infected by virus

• Virus - Double-stranded RNA (dsRNA);

• Viruses of Leishmania have been identified in 13 strains of L. braziliensis or L. guyanensis;

• Are designated Leishmania RNA virus 1 (LRV1; Totiviridae).

Levels of RNA virus within the parasite affect the host`s immune

response

Cutaneous leishmaniasis

Mucocutaneous leishmaniasis

Fabrício Freitas

Analisar o papel do TLR 2 e MyD88 na ativação de células dentríticas durante a infecção por

Leishmania braziliensis

Objetivo

A produção de citocinas e ativação das MyD88-/- DC estão prejudicadas após a infecção por

Leishmania braziliensis ?

BMDC WT MyD88-/-

Infecção 8:1

L. braziliensis (Lb)L. amazonensis (La)

Citometria de fluxo

ELISA

24 horas

A produção de citocinas e ativação das MyD88-/- DC estão prejudicadas após a infecção por

Leishmania braziliensis ?

Produção de IL-12p40 e ativação da DC foi prejudicada na ausência de MyD88.

Camundongos MyD88-/- são mais susceptíveis à infecção por Leishmania braziliensis ?

WT ou MyD88-/-

2x106

Pata posterior

L. braziliensis

semanalmente

Lesão

Camundongos MyD88-/- são mais susceptíveis a infecção por L. braziliensis

Qual o mecanismo do MyD88 na susceptibilidade à infecção por Leishmania braziliensis ?

WT ou MyD88-/-

2x106

Pata posterior

L. braziliensis

4 e 8 semanas

Linfonodo drenante

1x106 cels.6 h

CitometriaCD4+ (IFN-γ, IL-17 e IL-10)

O mecanismo do MyD88 é mediar a produção de céls. TCD4+ produtoras de IFN-γ e IL-17, sendo necessário para uma efetiva

resposta imune contra L.braziliensis.

Toll 2 molécula chave na intereção hospedeiro-Leishmania.

Toll 2 está envolvido no reconhecimento da Leishmania braziliensis ?

BMDC WT Toll 2-/-

Infecção 8:1Citometria

de fluxo

ELISA

24 horas

L. braziliensis (Lb)L. amazonensis (La)

Toll 2 está envolvido no reconhecimento da Leishmania braziliensis ?

Na ausência de Toll2, DC são mais ativadas e produzem maiores quantidades de IFN-γ.

BMDC WT Toll 2-/-

Infecção 10:1Real-Time

PCR

4 horas

L. braziliensis (Lb)L. amazonensis (La)

O aumento da ativação de toll 2-/- DC está associada com a expressão de SOCS após a infecção por

Leishmania braziliensis ?

O aumento da ativação de toll 2-/- DC está associada com a expressão de SOCS após a infecção por

Leishmania braziliensis ?

Na ausência de Toll2, DC expressaram maiores níveis de SOCS 1 e 3.

Regulação positiva independente de toll 2.

Toll 2-/- DC infectadas com Leishmania braziliensis podem ativar células T CD4+produtoras de IFN-γ ?

BMDC WT Toll 2-/-

L. braziliensis (Lb)L. amazonensis (La)

Infecção 8:1 24 horas

Co-cultura

CD4+ baço 2x106

4 dias

Proliferação ELISA

Toll 2-/- DC infectadas com Leishmania braziliensis podem ativar células T CD4+produtoras de IFN-γ ?

A deficiência de toll 2 promove ativação da céls. T CD4+e a produção de IFN-γ.

WT ou Toll 2-/-

2x106

Pata posterior

L. braziliensis

semanalmente

Lesão

Camundongos Toll 2-/- são mais resistentes à infecção por Leishmania braziliensis ?

Camundongos Toll 2-/- são mais susceptíveis a

infecção por L. braziliensis.

WT ou MyD88-/-

2x106

Pata posterior

L. braziliensis

4 e 8 semanas Carga parasitária

Como estaria a carga parasitária em camundongos Toll 2-/- infectados com Leishmania braziliensis ?

No grupo WT e K.O, houve semelhante carga parasitária na quarta e oitava semana.

WT ou MyD88-/-

2x106

Pata posterior

L. braziliensis

4 e 8 semanas

Linfonodo drenante

1x106 cels.6 h

CitometriaCD4+ (IFN-γ, IL-17 e IL-10)

A proteção em animais toll 2-/- estaria associada com o aumento de céls. T CD4+ produtoras de IFN-γ?

A proteção em animais toll 2-/- estaria associada com o aumento de céls. T CD4+ produtoras de IFN-γ?

A proteção está associada com um aumento da população de céls. T CD4+ produtoras de IFN-γ

A proteção em animais toll 2-/- estaria associada com a alta produção de IFN-γ pelas céls. T CD4+ ?

WT ou MyD88-/-

2x106

Pata posterior

L. braziliensis

4 e 8 semanas

Linfonodo drenante

1x106 cels.SLA3 dias

Elisa(IFN-γ e IL-10)

A proteção em animais toll 2-/- estaria associada com a alta produção de IFN-γ pelas céls. T CD4+ ?

A proteção está associada com a alta produção de IFN-γ pelas céls. T CD4+

Conclusão2

A falta do MyD88 prejudica a imunidade protetora no combate à infecção por Leishmania braziliensis.

Elevada ativação e produção de IL-12 e aumento na população de células T CD4+ produtoras de IFN-γ.

PAPEL REGULADOR

Objetivo: Verificar a modulação da resposta imune por diferentes linhagens de

Leishmania guyanensis e o envolvimento do LRV1 nesta modulação.

As linhagens L.g.M+ e L.g.M- modulam diferencialmente a resposta dos MΦ hospedeiro?

L.g.M+L.g.M-M5313

BMMΦ (BALB/c)

6hDNA microarrays – expressão de genes (RI)

As linhagens L.g.M+ e L.g.M- modulam diferencialmente a resposta dos MΦ hospedeiro?

L.g.M+L.g.M-M5313

L.Major LV39

BMMΦ (BALB/c ou C57BL/6)

6hELISA

Linhagens isoladas CL e CLM também modulam diferencialmente a resposta dos MΦ hospedeiro?

L.g. h-CL (Lg1881)L.g. h-MCL (Lg1398)

BMMΦ (BALB/c ou C57BL/6)

6hELISA

L.g.M+M5313

L.g. h-MCL (Lg1398)

L.g.M-L.g. h-CL (Lg1881)

Metastáticas

Não- metastáticas

CXCL10, CCL5, TNF-α e IL-6

CXCL10, CCL5, TNF-α e IL-6

Os elevados níveis de citocinas e quimiocinas, depois da infecção, estão

associados com as linhagens de parasitas metastáticos.

A entrada do parasita e a formação de fagolisossomo são necessários para o desenvolvimento desta resposta?

ELISA L.g.M+L.g.M-M5313

BMMΦ (C57BL/6) Cloroquina ou Citocalasina D

6h

Existe envolvimento dos TLRs endossomais (TLR3, 7 e 9) nesta resposta?

ELISA L.g.M+L.g.M-M5313

BMMΦ C57BL/6 TLR3-/- TLR7-/-

TLR9-/-

6h

TLR3 é o receptor responsável pelo reconhecimento do parasita?

ELISA(IFN-β)

L.g.M+L.g.M-M5313

BMMΦ C57BL/6 TLR3-/-

TRIF-/-

MyD88-/-

6h

A via dependente de TRL3-TRIF foi essencial para o aumento da expressão dos mediadores proinflamatórios

Os MΦ reconhecem dsRNA das linhagens metastaticas?

ELISA

Ácidos nucléicosL.m.LV39

M5313L.g.M+L.g.M-

BMMΦ BALB/c

6hssRNAse ouDNAse/ssRNAse

L.g.M5313 (M+)L. guyanensis L. braziliensis Isolados de MCL humana

dsRNA Leishmania RNA virus 1 (LRV1)

O LRV1 esta presente nas linhagens metastaticas?

Ácidos nucléicosL.g.M-L.g.M+M5313

L.g. h-CL (Lg1881)L.g. h-MCL (Lg1398)

L.m.LV39

ssRNAse DNAse ou não

RNA total Real Time PCR

A

B

O LRV1 é o responsável pelo aumento de citocinas e quimiocinas na infecção com linhagens metastáticas?

dsRNA LRV1 Real Time PCRBMMΦ C57BL/6TLR3-/-

Estes resultados são similares para linhagens isogênicas?

Real Time PCRBMMΦ C57BL/6TLR3-/-

L.g.M4147-LRVhigh

L.g.M4147-LRVneg

TLR3 e LRV1 desenvolvem o mesmo papel na leishmaniose in vivo?

Carga parasitária (qRT-PCR)

Camundongos C57BL/6

TLR3-/- TLR7-/-

L.g.M+L.g.M-

Footpad swelling A

B

Conclusão