Elektrograwimetryczna detekcja wybranych metaloprotein w ...

Uniwersytet Warszawski

Wydział Chemii

Edyta Matysiak-Brynda

Elektrograwimetryczna detekcja

wybranych metaloprotein

w roztworach i płynach ustrojowych

Praca doktorska wykonana

w Pracowni Teorii i Zastosowań Elektrod

Zakładu Chemii Nieorganicznej i Analitycznej

promotor: dr hab. Anna M. Nowicka

Warszawa, 2017

Pracę dedykuję Mężowi oraz Rodzicom

Za wiarę i ciągłe wsparcie w dążeniu do celu

Pragnę serdecznie podziękować:

Dr hab. Annie M. Nowickiej za opiekę naukową,

nieocenioną pomoc, cenne uwagi, poświęcony czas i wyrozumiałość.

Dr Agacie Kowalczyk za współpracę,

cenne uwagi i pomoc przy oprawie graficznej pracy.

Prof. dr hab. Mikołajowi Dontenowi,

za cenne uwagi dotyczące wpływu pola magnetycznego

na paramagnetyczne białka.

Koleżankom i Kolegom z Pracowni Teorii i Zastosowań Elektrod

za serdeczną atmosferę.

Niniejsza praca była częściowo finansowana z grantu Narodowego

Centrum Nauki, Preludium 9 Nr 2015/17/N/ST4/03933

Dorobek naukowy wypracowany na podstawie wyników badań

opisanych w nniejszej rozprawie doktorskiej stał się podstawą uzyskania

stypendium Ministra Nauki i Szkolnictwa Wyższego za wybitne

osiągnięcia w roku akademickim 2016/2017

Spis treści

11

Spis treści

- Część literaturowa -

1. WSTĘP .............................................................................................................. 17

2. CEL PRACY ..................................................................................................... 19

3. PODZIAŁ PŁYNÓW USTROJOWYCH, ICH SKŁAD

ORAZ FUNKCJE PEŁNIONE W ORGANIZMIE ...................................... 21

3.1. Skład i funkcje krwi ..................................................................................... 22

3.2. Równowaga kwasowo-zasadowa płynów ustrojowych .............................. 29

4. BIAŁKA WAŻNE SKŁADNIKI ORGANIZMU ...................................... 31

4.1. Definicja i budowa metaloprotein ............................................................... 33

4.2. Charakterystyka wybranych metaloprotein obecnych we krwi ................... 37

4.2.1. Hemoglobina, czerwony barwnik krwi wiążący

tlen i tlenek węgla(IV) ..................................................................... 37

4.2.2. Ceruloplazmina, nośnik jonów miedzi w organizmie ....................... 43

4.2.3. Transferyna, białko transportujące jony żelaza w organizmie .......... 49

4.2.4. Ferrytyna, białko magazynujące żelazo w organizmie ..................... 54

4.3. Metody oznaczania zawartości białek w płynach ustrojowych ................... 59

5. ELEKTROAKTYWNOŚĆ METALOPROTEIN ......................................... 65

5.1. Sposoby transportu elektronów pomiędzy metaloproteiną

a powierzchnią elektrody ............................................................................ 65

5.1.1. Bezpośredni transport elektronów .................................................... 67

5.1.2. Transport elektronów z wykorzystaniem mediatora ......................... 70

5.1.3. Sposoby unieruchamiania białek na wybranej powierzchni

i ich konsekwencje ........................................................................... 72

6. NANOMATERIAŁY TYPU „RDZEŃ − POWŁOKA” ............................... 79

6.1. Nanocząstki magnetyczne typu „rdzeń – powłoka” .................................... 80

6.1.1. Nanokapsuły węglowe zawierające żelazo ....................................... 81

6.2. Zastosowanie magnetycznych nanokapsuł węglowych

z metalicznym rdzeniem ............................................................................. 83

Spis treści

12

7. UDZIAŁ POLA MAGNETYCZNEGO W TRANSPORCIE

SUBSTANCJI ELEKTROAKTYWNEJ DO POWIERZCHNI

ELEKTRODY ................................................................................................... 87

8. TECHNIKI BADAWCZE STOSOWANE W PRACY................................. 91

8.1. Woltamperometria cykliczna i liniowa ........................................................ 91

8.2. Woltamperometria pulsowa róźnicowa ....................................................... 93

8.3. Elektrochemiczna mikrowaga kwarcowa .................................................... 95

8.4. Elektrochemiczna spektroskopia impedancyjna .......................................... 97

8.5. Skaningowy mikroskop elektrochemiczny .................................................. 99

8.6. Spektroskopia UV-vis ................................................................................ 100

- Część eksperymentalna -

9. ODCZYNNIKI CHEMICZNE I APARATURA ......................................... 103

9.1. Charakterystyka nanocząstek magnetycznych: składnika warstwy

receptorowej czujników ............................................................................ 106

9.1.1. Niezmodyfikowane nanokapsuły węglowe zawierające żelazo ..... 106

9.1.2. Nanokapsuły węglowe zawierające żelazo zmodyfikowane

grupami karboksylowymi ............................................................... 107

10. ELEKTROGRAWIMETRYCZNY SENSOR DO

BEZPOŚREDNIEJ DETEKCJI HEMOGLOBINY

W PRÓBKACH KRWI .................................................................................. 109

10.1. Optymalizacja warunków występowania paramagnetycznej formy

hemoglobiny ............................................................................................ 110

10.2. Procedura przygotowania warstwy receptorowej czujnika i jej

elektrochemiczna charakterystyka ........................................................... 112

10.3. Elektrochemiczna i grawimetryczna charakterystyka sensora do

bezpośredniej detekcji hemoglobiny ....................................................... 116

10.4. Funkcjonalność sensora do bezpośredniej detekcji Hb w próbkach

naturalnych .............................................................................................. 121

10.5. Podsumowanie ......................................................................................... 123

Spis treści

13

11. WPŁYW POLA MAGNETYCZNEGO NA AKTYWNOŚĆ

ELEKTROCHEMICZNĄ I KATALITYCZNĄ

CERULOPLAZMINY .................................................................................... 125

11.1. Analityczna charakterystyka czujnika .................................................... 125

11.1.1. Jednoczesna ilościowa analiza ceruloplazminy i hemoglobiny

we krwi szczurzej ......................................................................... 133

11.2. Wpływ pola magnetycznego na aktywność katalityczną

ceruloplazminy unieruchomionej na podłożu złotym

zmodyfikowanym ferromagnetykiem...................................................... 136

11.2.1. Wpływ ferromagnetycznego modyfikatora powierzchni na

elektroaktywność złota ................................................................ 136

11.2.2. Aktywność katalityczna ceruloplazminy wobec

jonów żelaza(II) ........................................................................... 138

11.3. Podsumowanie ......................................................................................... 146

12. ELEKTROCHEMICZNY IMMUNOSENSOR DO DETEKCJI

TRANSFERYNY ........................................................................................... 147

12.1. Procedura konstrukcji warstwy receptorowej immunosensora ............... 148

12.2. Analityczna charakterystyka immunosensora

do elektrochemicznej detekcji Tf ............................................................ 153

12.2.1. Wykorzystanie oporności przeniesienia ładunku

do ilościowego opisu zakresu pracy immunosensora .................. 153

12.2.2. Grawimetryczna charakterystyka immunosensora ...................... 155

12.2.3. Woltamperometryczna detekcja transferyny ............................... 158

12.2.4. Stabilność, selektywność oraz odtwarzalność warstwy

receptorowej immunosensora ...................................................... 161

12.2.5. Zastosowanie immunosensora w analizie próbek krwi ............... 164

12.3. Wpływ pola magnetycznego i ferromagnetycznego modyfikatora

powierzchni elektrody na integralność konformacyjną

i elektroaktywność transferyny ............................................................... 165

12.3.1. Procedura syntezy koniugatu transferyna-nanocząstka

magnetyczna ................................................................................ 166

12.3.2. Charakterystyka spektroskopowa koniugatu Fe@C-COOH/Tf .. 167

12.3.3. Analiza termograwimetryczna koniugatu Fe@C-COOH/Tf ....... 170

Spis treści

14

12.3.4. Charakterystyka struktur białkowych na powierzchni

nanokapsuł węglowych przy użyciu mikrowagi kwarcowej

z dyssypacją energii ..................................................................... 172

12.3.5. Elektroaktywność transferyny kowalencyjnie związanej

z nanokapsułami Fe@C-COOH Nps ........................................... 176

12.4. Podsumowanie ......................................................................................... 177

13. ELEKTROCHEMICZNA DETEKCJA FERRYTYNY

Z WYKORZYSTANIEM WYSOCE SELEKTYWNEGO

ODDZIAŁYWANIA ANTYGEN–PRZECIWCIAŁO ................................ 179

13.1. Procedura konstrukcji immunosensora do elektrochemicznej

detekcji ferrytyny ..................................................................................... 181

13.2. Określenie wpływu ułożenia Ab w warstwie receptorowej

na ilość unieruchamianej ferrytyny przy użyciu technik

LA-ICP-MS i QCM ................................................................................. 184

13.3. Elektrochemiczna charakterystyka etapów tworzenia

warstwy receptorowej immunosensora .................................................... 187

13.3.1. Wpływ pola magnetycznego na sygnał prądowy ferrytyny ........ 191

13.3.2. Woltamperometryczna charakterystyka immunosensora

do detekcji ferrytyny .................................................................... 194

13.4. Selektywność immunosensora do detekcji ferrytyny .............................. 198

13.5. Oznaczenie ferrytyny w próbkach krwi ................................................... 200

13.6. Podsumowanie ......................................................................................... 201

14. STRESZCZENIE ............................................................................................ 203

15. STRESZCZENIE W JĘZYKU ANGIELSKIM .......................................... 209

16. SPIS PRAC NAUKOWYCH OPUBLIKOWANYCH

W TRAKCIE STUDIÓW DOKTORANCKICH ......................................... 215

17. BIBLIOGRAFIA ............................................................................................ 217

Alfabetyczny spis skrótów i symboli stosowanych w pracy

15

Alfabetyczny spis skrótów stosowanych w pracy:

Ab: przeciwciało

AΔf: amplituda oscylacji drgań kryształu

kwarcu

apo-Tf: apo-transferyna

Au: złota elektroda dyskowa

CD: spektroskopia dichroizmu kołowego

CEINs: nanocząstki żelaza enkapsulowane

węglem

Cp: ceruloplazmina

CSH: chlorowodorek cysteaminy

CV: woltamperometria cykliczna

deoksyHb: deoksyhemoglobina

DET: bezpośredni transport elektronów

DPV: woltamperometria pulsowa różnicowa

ECF: płyn zewnątrzkomórkowy

EDC: chlorowodorek 1-etylo-3-(dimetylo-

aminopropylo)karbodiimidu

EIS: elektrochemiczna spektroskopia

impedancyjna

EQCM: elektrochemiczna mikrowaga

kwarcowa

Fab: fragment wiążący przeciwciało

FB: tryb sprzężenia zwrotnego

Fc: fragment krystalizowalny przeciwciała

Fe@C Nps: nanokapsuły węglowe zawie-

rające żelazo

Fe@C-COOH Nps: nanokapsuły węglowe

zawierające żelazo zmodyfikowane grupami

karboksylowymi

ferryloHb: ferrylohemoglobina

Ft: ferrytyna

FTIR: spektroskopia w podczerwieni z trans-

formacją Fouriera

GC: elektroda z węgla szklistego

α-GP: α-glikoproteina

H: łańcuch ciężki białka

Hb: hemoglobina

holo-Tf: holo-transferyna

HSA: albumina surowicy ludzkiej

ICF: płyn wewnątrzkomórkowy

L: łańcuch lekki białka

LA-ICP-MS: spektrometria mas z jonizacją

w plazmie indukcyjnie sprzężonej z ablacją

laserową

LOD: granica wykrywalności

LSV: woltamperometria z liniowo zmienia-

jącym się potencjałem

MET: transport elektronów z użyciem

mediatora

metHb: methemoglobina

M Nps: nanocząstki magnetyczne

NHE: standardowa elektroda wodorowa

NHS: N-hydroksysukcynimid

oksoferryloHb: oksoferrylohemoglobina

oksyHb: oksyhemoglobina

PB: bufor fosforanowy

PLT: płytki krwi

QCM-D: mikrowaga kwarcowa z dyssypacją

energii

RBC: krwinki czerwone

SAM: samoorganizująca się monowarstwa

SECM: skaningowa mikroskopia elektroche-

miczna

SEM: skaningowa mikroskopia elektronowa

SPIONs: superparamagnetyczne nanocząstki

tlenku żelaza, Fe3O4

SPR: powierzchniowy rezonans plazmonowy

Tf: transferyna

TGA: analiza termograwimetryczna

WBC: krwinki białe

Skróty symboli stosowanych we wzorach:

A: powierzchnia elektrody

B: indukcja magnetyczna

C: stężenie substancji

Cf: stała charakterystyczna dla danego

kryształu kwarcu

COx: stężenie substancji elektroaktywnej

w formie utlenionej

CRed: stężenie substancji elektroaktywnej

w formie zredukowanej

Cdl: pojemność warstwy podwójnej

D: dyssypacja energii

Di: współczynnik dyfuzji substancji

elektroaktywnej

DOx: współczynnik dyfuzji substancji

w formie utlenionej

DRed: współczynnik dyfuzji substancji

w formie zredukowanej

Eapp.: potencjał przykładany do elektrody

w trakcie pomiaru

Ef: potencjał formalny układu redoks

Ep: amplituda pulsu

Ep, a: potencjał piku anodowego

Ep, k: potencjał piku katodowego

F: stała Faraday’a (96 486 C·mol-1

)

f: częstotliwość drgań kryształu kwarcu

FG: siła gradientu pola magnetycznego zwaną

również siłą Kelvina

FL: siła Lorentza

g: współczynnik geometryczny

H: natężenie pola magnetycznego

Ip, a: prąd piku anodowego

Ip, k: prąd piku katodowego

Iss: prąd stacjonarny

Alfabetyczny spis skrótów i symboli stosowanych w pracy

16

Jdyfuz.: strumień substancji wywołany

transportem dyfuzyjnym

Jkonwek.: strumień substancji wywołany

konwekcją

Jmigr.: strumień substancji wywołany migracją

n: liczba elektronów uczestniczących

w reakcji elektrodowej/ numer nadtonu

częstotliwości rezonansowej

Rct: opór przeniesienia ładunku

t: czas

T: temperatura

Tdl: parametr pojemnościowy elementu stało-

fazowego

Q: ładunek

W: impedancja Warburga

W0.5: szerokość piku w połowie wysokości

v: szybkość przemiatania potencjałem

Zf: impedancja faradajowska

zi: ładunek i-tej substancji

Yb: średnia wartość sygnału ślepej próby

Symbole greckie:

Δ: zmiana

: gradient

: molowy współczynnik absorpcji

: potencjał elektryczny w roztworze

dl: parametr potęgowy elementu stało-

fazowego

Γ: stężenie powierzchniowe

σb: odchylenie standardowe dla ślepej próby

Wstęp

17

1. Wstęp

Białka, często nazywane prawdziwymi „cząsteczkami życia”, są

podstawowym elementem budulcowym każdej komórki ludzkiego ciała. Większość

białek występujących w organizmie ludzkim to białka wewnątrzkomórkowe, których

poziom ekspresji jest zróżnicowany i zależy od typu komórek lub tkanek, w których

one powstają. Zsyntezowane w odpowiednich komórkach białka wydzielane są do

osocza oraz płynu śródmiąższowego, gdzie zaczynają pełnić swoje funkcje. Osocze

zawiera zdecydowanie więcej białek niż płyn śródmiąższowy. Dodatkowo, białka

osocza, jako jedyne z jego składników, nie przedostają się do płynu

śródmiąższowego. Poziom białek w płynach ustrojowych może ulegać zmianie wraz

z wiekiem, a także w różnych stanach fizjologicznych i patologicznych. Zatem są

one doskonałym wskaźnikiem stanu zdrowia organizmu. Ważną grupę wśród białek

stanowią metaloproteiny, czyli białka złożone, zawierające w swojej strukturze

atomy lub jony metali. Metaloproteiny od lat nieustająco cieszą się bardzo dużym

zainteresowaniem wśród badaczy. Ich popularność wynika przede wszystkim

z funkcji, jakie pełnią w organizmie. Detekcja tych molekuł w roztworach i płynach

ustrojowych ma istotne znaczenie w diagnostyce wielu zakażeń, stanów zapalnych,

chorób nowotworowych, jak również innych wszelkiego typu zaburzeń homeostazy

organizmu. Precyzyjne oznaczanie metaloprotein we krwi umożliwia szybką

diagnostykę oraz ocenę stopnia zaawansowania choroby. Pomimo znacznej

intensyfikacji badań dotyczących analizy ilościowej metaloprotein wciąż poszukuje

się bardziej wydajnych, niezawodnych, szybkich oraz mało kosztownych systemów

analizy tego typu białek. Zastosowanie do tego celu czujników elektrochemicznych

wydaje się być bardzo konkurencyjne w stosunku do powszechnie stosowanych

metod klinicznych z powodu niskich kosztów eksploatacji, braku konieczności

stosowania toksycznych substancji, jak również krótkiego czasu analizy.

Jony metalu obecne w strukturze metaloprotein gwarantują ich

elektroaktywność. Niestety uzyskanie dobrze wykształconych, a przede wszystkim

miarodajnych sygnałów prądowych związanych z procesami redoks metaloprotein

nie jest proste. Metaloproteiny, podobnie jak inne białka, wykazują niezwykle silną

tendencję do spontanicznej adsorpcji, szczególnie na podłożu metalicznym. Ponadto

bezpośredni kontakt białka z powierzchnią metaliczną może doprowadzić do

Wstęp

18

uszkodzenia jego struktury (denaturacja), a w konsekwencji do utraty aktywności

katalitycznej, czy też elektrochemicznej białka. Produkty powstałe w procesie

denaturacji białka utrudniają lub wręcz uniemożliwiają wymianę elektronów

pomiędzy centrami elektroaktywnymi białka a powierzchnią elektrody. Dodatkowo

szybkiemu i efektywnemu transportowi elektronu pomiędzy białkiem a powierzchnią

elektrody nie sprzyja fakt, że centra elektroaktywane ulokowane są głęboko w ich

otoczce białkowej, co znacznie spowalnia szybkość przeniesienia elektronów.

Uniknięcie dezaktywacji elektrody, w wyniku adsorpcji łańcuchów

aminokwasowych białka na jej powierzchni, możliwe jest dzięki zastosowaniu

różnego typu modyfikatorów, których zadaniem jest skuteczne zabezpieczanie białka

przed bezpośrednim kontaktem z elektrodą. „Idealny modyfikator” powierzchni

elektrody powinien możliwie jak najmniej wpływać na stałą szybkości przeniesienia

elektronu oraz gwarantować najlepszą, z elektrochemicznego punktu widzenia,

orientację białka względem powierzchni elektrody.

Cel pracy

19

2. Cel pracy

Unikalne właściwości katalityczne metaloprotein są szeroko wykorzystywane

w medycynie, biotechnologii, kosmetologii, rolnictwie, czy też przemyśle [1,2].

W przypadku badań wykonywanych w laboratoriach chemicznych udział

metaloprotein ogranicza się głównie do katalizy wybranych procesów, jak np.:

redukcja tlenu do wody. W tym celu modyfikuje się powierzchnię elektrody

białkiem. Takie modyfikacje coraz powszechniej stosowane są w konstrukcji

elektrochemicznych bioczujników, a także elektrod w ogniwach przetwarzających

energię chemiczną w elektryczną. O przydatności tego typu układów decyduje

aktywność metaloproteiny zawartej w warstwie modyfikującej oraz jak najdłuższe

zachowanie tej aktywności. Cel ten można uzyskać w wyniku utworzenia gęstej

siatki połączeń elektrycznych w warstwie modyfikującej poprzez zastosowanie

dobrze przewodzących nanocząstek metali lub nanocząstek węglowych. Innym

sposobem jest kontrola orientacji cząsteczek białka na powierzchni elektrody

w wyniku zastosowania odpowiedniej warstwy pośredniczącej.

Głównym celem niniejszej rozprawy doktorskiej była konstrukcja

elektrochemicznych czujników do detekcji paramagnetycznych metaloprotein

obecnych we krwi, takich jak: hemoglobina, ceruloplazmina, transferyna i ferrytyna.

Kluczowym etapem badań była odpowiednia funkcjonalizacja powierzchni elektrody

pozwalająca na wzmocnienie sygnału prądowego procesu redoks wybranych

metaloprotein, z jednoczesnym zachowaniem ich właściwości elektrokatalitycznych.

W tym celu w roli modyfikatora powierzchni elektrody zastosowano

ferromagnetyczne nanokapsuły węglowe zawierające żelazo. Tworzone warstwy

sensorowe scharakteryzowano poprzez zastosowanie różnorodnych technik

pomiarowych, pozwalających na uzyskanie ilościowego i jakościowego opisu

badanych układów. Realizacja powyższego celu wymagała wykonania szeregu

czynności badawczych, dotyczących:

a) optymalizacji układu badawczego i warunków pomiarowych:

opracowania procedury uzyskiwania jednorodnej i stabilnej warstwy

ferromagnetyka na powierzchni elektrody,

Cel pracy

20

opracowania efektywnego i selektywnego sposobu unieruchamiania

metaloprotein na powierzchni elektrody złotej lub ich transportu do

powierzchni elektrody,

zbadania wpływu zastosowanego pola magnetycznego na intensywność

uzyskiwanych sygnałów prądowych metaloprotein,

b) pełnej charakterystyki analitycznej zaproponowanych czujników:

wyznaczenia zakresu pracy czujnika i jego granicy wykrywalności,

określenia jego selektywności i stabilności,

sprawdzenia przydatności zaproponowanych czujników w próbkach

rzeczywistych – próbkach krwi.

Podział płynów ustrojowych, ich skład oraz funkcje pełnione w organizmie

21

3. Podział płynów ustrojowych, ich skład oraz

funkcje pełnione w organizmie

Utrzymanie prawidłowych parametrów środowiska poza- i śródkomórkowego

jest podstawowym wymogiem życiowym każdego organizmu. Jest to możliwe dzięki

obecności wody w organizmie, która pełni rolę rozpuszczalnika, zarówno dla

substancji organicznych, jak i nieorganicznych. Jest ona niezbędna do prawidłowego

funkcjonowania wszystkich biologicznie czynnych makrocząsteczek, takich jak:

białka, czy też kwasy nukleinowe. Woda bierze również udział w procesach

metabolicznych zachodzących w komórkach, uczestniczy w regulacji temperatury

organizmu oraz jest ważnym ośrodkiem transportującym [3]. Stanowi ona około 60%

całkowitej masy ciała dorosłego człowieka [4] i zawarta jest w płynach ustrojowych

stanowiących środowisko wewnętrzne organizmu [5].

Płyny ustrojowe organizmu ludzkiego można podzielić na dwie grupy: płyn

wewnątrzkomórkowy, zwany również śródkomórkowym (ICF) oraz płyny

zewnątrzkomórkowe, tzw. pozakomórkowe (ECF). Płyn wewnątrzkomórkowy, czyli

cytoplazma komórkowa, zlokalizowany jest we wnętrzu komórek całego organizmu

i zawiera ok. 66% całkowitej zawartości wody w organizmie. Stanowi on środowisko

dla różnych procesów, takich jak: (i) wytwarzanie, magazynowanie

i wykorzystywanie energii, (ii) procesy samonaprawcze komórki oraz (iii) replikacja

[3]. Pozostała ilość wody (ok. 30%) wchodzi w skład płynów

zewnątrzkomórkowych, do których zalicza się [3]:

płyn śródmiąższowy, zwany tkankowym, wypełniający przestrzenie między

komórkami i tkankami;

płyn mózgowo-rdzeniowy zlokalizowany w komorach mózgu, kanałach

mózgu i rdzenia kręgowego oraz w przestrzeni podpajęczynówkowej;

osocze krwi: krew żylna, tętnicza i włośniczkowa;

chłonkę;

płyny znajdujące się w kościach, stawach oraz tkance łącznej zbitej;

płyn transkomórkowy: ślina, pot, mocz, śluz oraz soki trawienne.

Główną funkcją płynów zewnątrzkomórkowych jest dostarczanie do komórek

substancji odżywczych (np. glukozy, aminokwasów, kwasów tłuszczowych),

regulujących (np. hormonów) oraz podtrzymujących i koordynujących funkcje


22

komórki (np. tlen, różne jony, czy białka). Płyny pozakomórkowe odpowiedzialne są

również za usuwanie z organów tlenku węgla(IV), substancji odpadowych oraz

składników toksycznych i produktów detoksykacji. Płyn wewnątrzkomórkowy różni

się od płynów zewnątrzkomórkowych zawartością zarówno substancji organicznych,

jak i nieorganicznych.

Objętość, skład płynów ustrojowych oraz ich właściwości fizykochemiczne

uzależnione są od środowiska zewnętrznego organizmu. Dążenie organizmu do

utrzymywania odpowiedniej temperatury ciała, składu chemicznego płynów

ustrojowych, ciśnienia osmotycznego, czy też ciśnienia tętniczego krwi nosi nazwę

homeostazy. Należy podkreślić, że homeostaza to nie tylko zdolność organizmu do

utrzymywania stałości parametrów wewnętrznych, ale również zbiór procesów

samonaprawczych odpowiadających za podtrzymanie stałości różnych parametrów

fizjologicznych [3]. W utrzymaniu stałych parametrów środowiska uczestniczy

m.in.: przewód pokarmowy, a także wiele narządów wewnętrznych, np. nerki

i wątroba oraz niektóre układy, takie jak: krążenia, nerwowy, immunologiczny,

hormonalny oraz oddechowy. Zmiana nawet jednego z parametrów może prowadzić

do poważnych zaburzeń w funkcjonowaniu organizmu, a nawet do jego śmierci.

Przeciwdziałanie negatywnym skutkom zmiany właściwych parametrów środowiska

organizmu skutkuje uruchomieniem odpowiednich mechanizmów prowadzących do

zniwelowania działania czynnika zewnętrznego na organizm i powrotu do stanu

równowagi [6]. Uszkodzenie mechanizmu regulacji danego organizmu jest głównym

powodem powstania wielu chorób. Szacuje się, że organizm człowieka posiada

około tysiąca systemów kontroli i regulacji [7].

3.1. Skład i funkcje krwi

Jednym z ważniejszych zewnątrzkomórkowych płynów ustrojowych

organizmu, obok płynu mózgowo-rdzeniowego, płynu międzykomórkowego oraz

chłonki, jest krew, czyli rodzaj płynnej tkanki krążącej w naczyniach krwionośnych.

U dorosłego człowieka występuje średnio około 5 litrów krwi, co stanowi

w przybliżeniu 7% całkowitej masy ciała [8]. Dla normalnej temperatury ciała

(36.6 C) pH krwi wynosi 7.4. Płyn ten posiada właściwości buforowe, dzięki czemu

kwasy, które powstają w procesach związanych z przemianą materii nie wpływają

istotnie na pH krwi. Zmiany odczynu krwi mogą nastąpić jedynie w wyniku choroby


23

i wówczas prowadzą do zaburzeń wielu procesów fizjologicznych [9]. Krew pełni

wiele bardzo ważnych funkcji w organizmie człowieka, które zależne są od

substancji w niej obecnych. Główną rolą krwi jest transport tlenu, tlenku węgla(IV)

oraz substancji odgrywających istotną rolę w prawidłowym funkcjonowaniu

wszystkich komórek organizmu. Dzięki nieustającemu krążeniu uczestniczy ona

także w procesach oddychania. Cząsteczki tlenu przenoszone są z pęcherzyków

płucnych do tkanek, zaś cząsteczki tlenku węgla(IV) w kierunku odwrotnym,

z tkanek do płuc. Transport CO2 następuje z miejsca o wyższej prężności tego gazu

w cytoplazmie komórek do niższej wartości w pęcherzykach płucnych. Krew bierze

także udział w funkcjach odżywczych oraz odpornościowych organizmu. Reguluje

ona także temperaturę ciała, gospodarkę wodno-elektrolitową, równowagę kwasowo-

zasadową i hormonalną oraz utrzymuje stałość środowiska wewnętrznego [7]. Krew

pełni istotną rolę w mechanizmach obronnych organizmu poprzez niszczenie obcych

antygenów [10]. Z uwagi na fakt, że uczestniczy ona w wymianie różnych substancji

między tkankami oraz usuwa z nich zbędne produkty przemiany materii, jest ona

najbardziej podatna na wpływ czynników zewnętrznych.

Krew składa się z części płynnej – osocza oraz zawieszonych w nim

elementów morfotycznych: czerwonych i białych krwinek oraz płytek krwi. Skład

krwi schematycznie został przedstawiony na rysunku 1.

ELEMENTY MORFOTYCZNE

ZWIĄZKI

NIEORGANICZNEWODA

KRWINKI

BIAŁE

KRWINKI

CZERWONE

PŁYTKI

KRWI

KREW

OSOCZE

KWASY TŁUSZCZOWE

CHOLESTEROL

KWAS MOCZOWY

HORMONY

MOCZNIK

WITAMINY

BIAŁKA

GLUKOZA

ROZPUSZCZONE GAZY

JONY

SOLE MINERALNE

ZWIĄZKI

ORGANICZNE

GRANULOCYTY AGRANULOCYTY

EOZYNOFILE

NEUTROFILE

MONOCYTY

LIMFOCYTY (B I T)

NEUTROFILE

Rysunek 1. Schemat przedstawiający skład krwi. W oparciu o dane z [11].


24

Osocze stanowi około 50÷60% objętości krwi i charakteryzuje się

słomkowożółtym zabarwieniem. Główną substancją występującą w osoczu (około

92%) jest woda. Osocze zawiera także białka, lipidy, hormony, witaminy, sole

mineralne i glukozę [12]. Białka występujące w osoczu różnią się między sobą

zarówno składem, jak i strukturą, a także budową chemiczną [13]. Spośród

wszystkich białek można wyróżnić trzy główne grupy: albuminy, globuliny

i fibrynogen. Albuminy, białka globularne o masie cząsteczkowej około 66 kDa, są

jednymi z najmniejszych białek i stanowią 55% białek osocza krwi. Są one zdolne do

wiązania i transportu wielu różnych substancji, mogą przenosić niektóre jony metali,

np. Mg2+

, jak również transportować toksyczne metale ciężkie, hormony lub leki

[11]. Drugimi, co do zawartości w osoczu białkami (stanowiącymi około 38% jego

całkowitej objętości) są globuliny, które odpowiadają nie tylko za transport

substancji, ale uczestniczą również w procesach odpornościowych organizmu. Białka

te dzielą się na cztery podgrupy: α1-globuliny, α2-globuliny, β-globuliny

i γ-globuliny. Najlżejszymi białkami w grupie globulin są α-globuliny o masie

cząsteczkowej 92 kDa, natomiast największą masą cząsteczkową charakteryzują się

γ-globuliny (około 120 kDa). Ostatnim białkiem stanowiącym 7% całkowitej ilości

białek w osoczu jest fibrynogen. Cząsteczka tego białka składa się z trzech

łańcuchów polipeptydowych o masie cząsteczkowej 340 kDa. Stężenie fibrynogenu

w osoczu wynosi od około 2.5 do 3.0 mgmL-1

. Białko to pełni kluczową rolę

w procesie krzepnięcia krwi, gdyż przyczynia się do agregacji płytek krwi [14] oraz

w wyniku przekształcenia go przez trombinę w nierozpuszczalną fibrynę, prowadzi

do tworzenia skrzepów krwi, które są niezbędne do gojenia się ran [15].

Innymi ważnymi składnikami osocza są lipidy stanowiące około 0.6% jego

objętości, występujące w postaci substancji związanych z białkami – lipoprotein.

Poziom lipidów we krwi zależy od wieku i płci, i może ulegać zmianom pod

wpływem hormonów oraz również podczas chorób. Ludzkie osocze zawiera lipidy

w trzech podstawowych formach: estrów kwasów tłuszczowych i gliceryny,

fosfolipidów i steroidów [16]. Z uwagi na obecność w tej grupie cholesterolu, ilość

lipidów jest silnie powiązana z chorobami krążenia i chorobami serca. Lipidy

odgrywają istotną rolę w budowie błon komórkowych oraz pełnią rolę

rozpuszczalnika dla niektórych witamin, takich jak: witamina K, A, E i D [7].

Ponadto w osoczu wyróżnić można również mocznik, glukozę, kwas moczowy,

rozpuszczone gazy, witaminy oraz hormony. Pozostałą część osocza, około 1%,


25

stanowią elektrolity, do których należą kationy sodu, potasu czy wapnia oraz aniony,

zawierające atomy siarki, chloru czy fosforu [9]. Zarówno kationy, jak

i aniony nie są wytwarzane przez osocze, i pobierane są przez organizm z produktów

żywnościowych, a w przypadku zapotrzebowania organizmu są one uwalniane do

osocza.

Z kolei, do zawieszonych w osoczu elementów morfotycznych krwi należą:

krwinki czerwone (RBC), krwinki białe (WBC) i płytki krwi (PLT). Elementy te

stanowią około 45% całkowitej objętości krwi, a pozostałe 55% to osocze [17].

Krwinki czerwone, inaczej zwane erytrocytami, są okrągłymi dwuwklęsłymi

dyskami pozbawionymi kwasu nukleinowego. Ich obecność nadaje

charakterystyczny czerwony kolor krwi. Stosunek ilości czerwonych krwinek do

całkowitej objętości krwi nazywana jest hematokrytem (Hct) i jego ilość zależna jest

od płci, wieku, aktywności fizycznej oraz środowiska życia człowieka. W przypadku

mężczyzn ilość czerwonych krwinek to zazwyczaj 5 mlnmm-3

, natomiast dla kobiet

liczba ta jest nieco niższa, około 4.5 mlnmm-3

. Średnica erytrocytu wynosi

zazwyczaj około 8 µm, natomiast jego grubość różni się w części środkowej

i obwodowej, i wynosi ona odpowiednio około 2 oraz 2.5 µm [11]. Budowa

czerwonych krwinek jest ściśle związana z pełnioną przez nie funkcją. Brak

w strukturze erytrocytów jądra komórkowego powoduje ich większą elastyczność,

dzięki czemu mogą one łatwo przenikać przez ściany naczyń włosowatych

i efektywnie transportować tlen z płuc do odpowiednich komórek i tkanek,

a następnie wiązać tlenek węgla(IV) oraz przenosić go z komórek do płuc [18].

Krwinki czerwone pozostają z osoczem w równowadze osmotycznej, tworząc

roztwór izotoniczny, w którym ich kształt nie ulega zmianie. Jednak w sytuacji

wzrostu ciśnienia osmotycznego otaczającego je środowiska następuje zjawisko

hipertonii, przejawiające się zmniejszeniem rozmiaru erytrocytów na skutek utraty

wody. Natomiast w przypadku zjawiska hipotonii, związanego ze zmniejszeniem

ciśnienia osmotycznego, erytrocyty w wyniku chłonięcia wody zaczynają pęcznieć,

aż do momentu pęknięcia i uwolnienia ich zawartości, której głównym składnikiem

jest hemoglobina. Proces polegający na zniszczeniu struktury czerwonych krwinek,

prowadzący do uwolnienia hemoglobiny i innych ich składników nazywany jest

hemolizą [19]. Proces ten może przebiegać w warunkach in vivo, gdzie może być

powodowany różnymi schorzeniami, jak również w warunkach in vitro, gdzie

hemoliza może być wywołana wieloma różnymi czynnikami, w tym obróbką próbki


26

krwi [20]. Zmiany morfologiczne erytrocytów w roztworze hipertonicznym,

izotonicznym i hipotonicznym schematycznie przedstawia rysunek 2.

Rysunek 2. Schemat przedstawiający zmiany morfologii erytrocytów w zależności od rodzaju

roztworu. Rysunek zmodyfikowany w oparciu o [21].

Spośród elementów morfotycznych krwi dużo mniej liczną grupę,

w porównaniu do erytrocytów, stanowią krwinki białe, zwane leukocytami. Na 1 µl

krwi przypada od 4 500 do 10 000 leukocytów [22]. Leukocyty występują w wielu

różnych rozmiarach i kształtach, zawierają w swojej strukturze jądro komórkowe

oraz posiadają zdolność poruszania się ruchem pełzakowatym. Krwinki białe z uwagi

na budowę i pełnione funkcje można podzielić na granulocyty, które posiadają

ziarenka cytoplazmatyczne oraz agranulocyty – niezawierające tego typu struktur.

Istnieją trzy rodzaje granulocytów: neutrofile, eozynofile i bazofile [11]. Rolą

neutrofili, czyli granulocytów obojętnych jest wydzielanie oraz uwalnianie substancji

bakteriobójczych do otoczenia. Z kolei eozynofile (granulocyty kwasochłonne)

zabijają pasożyty oraz biorą udział w reakcjach alergicznych organizmu.

Granulocyty zasadochłonne, czyli bazofile, podobnie jak eozynofile uczestniczą

w procesach alergicznych, ale również usuwają tłuszcze z krwi i przeciwdziałają

krzepnięciu krwi. Z kolei granulocyty można podzielić na monocyty oraz limfocyty.

Monocyty stanowią najliczniejszą grupę spośród białych krwinek. Ich rola polega na

niszczeniu obcych bakterii oraz niszczeniu starych, uszkodzonych i martwych

komórek ciała. Limfocyty natomiast stanowią kluczowy element układu

odpornościowego organizmu. Wyróżnia się dwa rodzaje limfocytów: komórki T

i komórki B. Komórki T kierują działaniem układu odpornościowego, natomiast

limfocyty B biorą udział w wytwarzaniu przeciwciał [23].

Ostatnimi z elementów morfotycznych krwi, powstającymi w szpiku

kostnym, są płytki krwi, zwane trombocytami. Liczba trombocytów w 1 µl krwi

H2O

H2O H2OH2O

HIPERTONICZNY IZOTONICZNY HIPOTONICZNY

H2O


27

wynosi 15 0000 45 0000 [22]. Płytki krwi są fragmentami cytoplazmy, mają

okrągły kształt i nie posiadają jądra komórkowego, a ich średnica wynosi średnio

2 µm. Trombocyty uczestniczą w procesach krzepnięcia krwi poprzez tworzenie

skrzepów, które mają za zadanie zamykać uszkodzenia powstałe w ścianach naczyń

krwionośnych [11].

Środowisko wewnętrzne organizmu wraz z krwią stanowi wspomniana

wcześniej chłonka. Chłonka, inaczej zwana limfą, jest rodzajem płynu tkankowego

powstającego w wyniku przedostawania się płynnych składników osocza do obszaru

międzykomórkowego. Objętość limfy w organizmie może ulegać zmianie w wyniku

intensywnego wysiłku fizycznego. Skład chłonki początkowo jest identyczny, jak

skład osocza. Natomiast w wyniku przepływu limfy przez węzły chłonne jej skład

może ulec zmianie [24]. Z krwi przepływającej przez węzły chłonne przedostają się

do chłonki limfocyty, które mogą wytwarzać immunoglobuliny (γ-globuliny), inaczej

zwane przeciwciałami [7].

Przeciwciała (Ab) mogą występować w surowicy w formie wolnej lub

związanej z błoną limfocytów B [25]. Mogą one tworzyć kompleksy typu

antygenprzeciwciało z dużym wzajemnym powinowactwem i selektywnością.

Kompleksy takie tworzone są na zasadzie oddziaływań elektrostatycznych,

wodorowych, hydrofobowych oraz van der Waalsa. Każde przeciwciało zbudowane

jest z dwóch lekkich łańcuchów polipeptydowych (L) o masie cząsteczkowej około

23 kDa oraz dwóch ciężkich łańcuchów (H) o masie 50 ÷ 60 kDa [26]. Łańcuchy

lekkie połączone są z łańcuchami ciężkimi za pomocą wiązań niekowalencyjnych

oraz za pośrednictwem mostków disiarczkowych. Wiązania takie występują również

między dwoma łańcuchami ciężkimi. Zarówno łańcuchy lekkie, jak również

łańcuchy ciężkie posiadają dodatkowo wewnątrz-łańcuchowe mostki disiarczkowe,

dzięki czemu istnieje możliwość tworzenia domen, które zbudowane są ze 110

aminokwasów. Oba łańcuchy zawierają części zmienne, które posiadają miejsca

wiązania antygenu oraz części stałe, które określają dalszy los antygenu [27].

Antygen wiązany jest przez fragment Fab (ang. Fragment antigen binding)

przeciwciała, natomiast fragment Fc (ang. Fragment crystallizable) odpowiedzialny

jest za jego właściwości biologiczne. Schemat budowy przeciwciała został

przedstawiony na rysunku 3.


28

S S

S S

NH2

NH2H2N

H2N

COOHCOOH

SS

SS

SS

SS

SS

SS

SS

SS

S

S

S

S

S

S

S

S

LYS-NH2

LYS-NH2

LYS-NH2

LYS-NH2

LYS-NH2

LYS-NH2

LYS-NH2

LYS-NH2

DOMENA

STAŁA

ŁAŃCUCHLEKKI

DOMENA

ZMIENNA

ŁAŃCUCHCIĘŻKI

reszty lizynowerozmieszczone losowo

w cząsteczce przeciwciała

CZĘŚĆ

ZMIENNA

CZĘŚĆ

STAŁA

COOH COOH

Rysunek 3. Schemat budowy przeciwciała. Rysunek zmodyfikowany w oparciu o [28].

W zależności od wiązanej części antygenu, przeciwciała można podzielić na

monoklonalne oraz poliklonalne. Przeciwciała monoklonalne są wysoce specyficzne

i rozpoznają tylko określony fragment antygenu, który się z nimi wiąże. Natomiast

przeciwciała poliklonalne wiążą różne części antygenu i wykazują wobec niego

różne powinowactwo [29,30]. Dla tego typu przeciwciał trwałość utworzonego

z antygenem kompleksu w dużym stopniu zależy od pH roztworu [31]. W zależności

od właściwości fizycznych i chemicznych immunoglobuliny dzieli się na pięć klas:

IgA, IgD, IgE, IgG i IgM [28,32]. Przynależność immunoglobuliny do danej klasy,

jak również jej aktywność zależy od struktury ciężkiego łańcucha [33].

Immunoglobuliny IgG odgrywają istotną rolę w zastosowaniach analitycznych,

biotechnologicznych, farmaceutycznych oraz immunoterapii [34]. Są one najbardziej

rozpowszechnionym typem przeciwciała, który obecny jest we wszystkich płynach

ustrojowych. Specyficzne wiązanie przeciwciała z antygenem rozpoczyna ciąg

reakcji, których zadaniem jest obrona organizmu przed infekcjami bakteryjnymi

i wirusowymi. Na podstawie poziomu IgG w organizmie możliwa jest ocena

funkcjonowania układu odpornościowego [35]. Przeciwciała te odpowiadają za

odporność wobec różnych czynników przenikających do organizmu przez krew.

Z uwagi na obecność w tego typu przeciwciałach dwóch fragmentów Fab, mogą one

wiązać dwie cząsteczki antygenu, co może znacząco wpływać na efektywność

tworzenia kompleksu antygen−przeciwciało [28].


29

3.2. Równowaga kwasowo-zasadowa płynów ustrojowych

Utrzymanie stałego składu płynów ustrojowych jest gwarantem

prawidłowego funkcjonowania organizmu. Stan, w którym zachowany jest swoisty

stosunek kationów i anionów w płynach ustrojowych nazywany jest równowagą

kwasowo-zasadową [3]. Jest to jeden z najważniejszych mechanizmów regulacji

organizmu, warunkujący odpowiednie pH niezbędne do prawidłowego przebiegu

procesów życiowych. Stężenie jonów wodorowych w płynach ustrojowych zależy

bezpośrednio od dysocjacji kwasów i pośrednio od nasilenia procesów

katabolicznych w organizmie. Głównymi produktami przemian materii

w organizmach żywych są przede wszystkim kwasy lotne, np. kwas węglowy oraz

kwasy nielotne, np.: mlekowy, pirogronowy, moczowy, siarkowy oraz fosforowy.

W płynie wewnątrzkomórkowym stężenie jonów H+ wynosi ok. 100 nmoli·L

-1,

natomiast tylko w przypadku komórek o zredukowanym metabolizmie

(np. erytrocyty) jest ono niższe i wynosi ok. 65 nmoli·L-1

. W płynach

zewnątrzkomórkowych, tzw. pozakomórkowych stężenie jonów wodorowych

utrzymywane jest na poziomie 35 ÷ 45 nmoli·L-1

, co daje wartość pH w zakresie

7.35 ÷ 7.45. W warunkach fizjologicznych pH ulega tylko nieznacznym zmianom,

które są szybko niwelowne dzięki sprawnie działającym mechanizmom regulującym.

Stałość środowiska wewnętrznego, czyli homeostazę, zapewniają trzy czynniki:

układy buforowe krwi, układ oddechowy oraz czynność nerek.

Podstawowe mechanizmy homeostazy ustrojowej, odpowiedzialne za

utrzymanie równowagi kwasowo-zasadowej to roztwory buforowe [3]:

bufor wodorowęglanowy, obecny w płynach zewnątrzkomórkowych,

stanowiący 70% pojemności buforowej krwi;

CO2 + H2O H2CO3 HCO3

+ H+anhydraza węglanowa (1)

bufor hemoglobinowy, obecny w płynie wewnątrzkomórkowym, stanowiący

21% pojemności buforowej krwi;

22 COHHbO w pęcherzykach płucnych

2OHb w aktywnie oddychającej tkance (2)

H

2CO


30

Wiązanie CO2 przez cząsteczkę Hb zachodzi za pośrednictwem grup –NH2

histydyny.

bufor fosforanowy, obecny w płynie wewnątrzkomórkowym, stanowiący

6% pojemności buforowej krwi;

0.12pKHPOHPO

8.6pKHHPOPOH

0.2pKPOHHPOH

POHHHPO

3

2

1

a34

24

a2442

a4243

4224

(3)

Bufor fosforanowy jest najważniejszym pod względem ilościowym buforem

moczu, biorącym udział w wytwarzaniu kwaśności miareczkowej, która

określa wydalanie jonu H+ przez nerki w postaci NaH2PO4.

bufor białczanowy, obecny w płynie wewnątrzkomórkowym i w płynach

zewnątrzkomórkowych, stanowiący 3% pojemności buforowej krwi;

NaCOOHRHCOONaR (4)

Białka, jako związki wielkocząsteczkowe, nie mogą przenikać przez błony

półprzepuszczalne, ale dzięki temu, że występują w formie kationów lub

anionów wpływają na rozmieszczenie dyfundujących przez błony

półprzepuszczalne elektrolitów.

Białka ważne składniki organizmu

31

4. Białka ważne składniki organizmu

Białka stanowią większość związków organicznych występujących

w organizmie ludzkim. Odgrywają one istotną rolę w przebiegu wielu procesów

biologicznych w żywych komórkach. Zbudowane są z co najmniej 100

aminokwasów, które łącząc się ze sobą za pomocą wiązania peptydowego tworzą

łańcuchy polipeptydowe [36]. Białka można podzielić na dwie odrębne grupy: białka

proste i złożone, co schematycznie przedstawia rysunek 4.

CHROMOPROTEINY

DO ŁAŃCUCH BIAŁKOWEGO

DOŁĄCZONE SĄ BARWNIKI

(np.: HEMOGLOBINA ,

CYTOCHROM C)

FOSFOPROTEINY

DO ŁAŃCUCHABIAŁKOWEGO

DOŁĄCZONA JEST RESZTA

KWASU FOSFOROWEGO

(np.: KAZEINA, PEPSYNA)

BIAŁKA PROSTE

BIAŁKA FIBRYLARNE

KOLAGEN

KREATYNA

FIBRYNA

BIAŁKA GLOBULARNE

ALBUMINY

GLOBULINY

HISTONY

BIAŁKA

BIAŁKA ZŁOŻONE

GLIKOPROTEINY


DOŁĄCZONE SĄ CUKROWCE

(np.: SKŁADNIKI WYDZIELIN

ŚLUZOWATYCH)

LIPOPROTEINY

WIELKOCZĄSTECZKOWE

KOMPLEKSY BIAŁEK Z LIPIDAMI

(SKŁADNIKI BŁON)

METALOPROTEINY


DOŁĄCZONE SĄ METALE (np.:

TRANSFERYNA, FERRYTYNA,

LICZNE ENZYMY)

Rysunek 4. Podział białek w oparciu o dane z [3].

Białka proste zbudowane są tylko z aminokwasów, natomiast białka złożone

zawierają w swojej strukturze oprócz podstawowego łańcucha białkowego (białko

proste) także inne grupy, tzw. grupy prostetyczne. Do białek prostych zalicza się

białka fibrylarne oraz białka globularne. Podział ten związany jest z różnicą

w kształcie cząsteczek, co ma swoje przełożenie na ich rozpuszczalność w wodzie

[37]. Białka fibrylarne są nierozpuszczalne w wodzie, mają strukturę włókien, które

mogą być połączone między sobą wiązaniami wodorowymi. Białka te spełniają

głównie rolę budulcową tkanek. Z ich włókien zbudowana jest keratyna, kolagen, jak

również miozyna [3]. Z kolei białka globularne mają często pofałdowaną, zwartą


32

strukturę i są dobrze rozpuszczalne w roztworach wodnych. Odgrywają one istotną

rolę w regulacji wielu procesów zachodzących w organizmie. Do tej grupy należą

enzymy, hormony, przeciwciała, jak również białka uczestniczące w transporcie

różnych substancji [38].

Różnorodność białek związana jest z możliwością tworzenia różnych struktur

przestrzennych, które determinują funkcje poszczególnych białek w organizmie.

Wyróżnia się strukturę pierwszo-, drugo-, trzecio- oraz czwartorzędową białek [3],

co schematycznie ilustruje rysunek 5.

Rysunek 5. Organizacja struktury białek. Rysunek w oparciu o [3].

Struktura pierwszorzędowa określa miejsce występowania oraz rodzaj aminokwasów

tworzących łańcuch białkowy. Łańcuchy polipeptydowe mogą przybierać różne

struktury przestrzenne w wyniku oddziaływania łańcuchów bocznych aminokwasów

lub poprzez oddziaływanie łańcuchów polipeptydowych między sobą i utworzenie

wiązania wodorowego między atomem wodoru z grupy –NH– oraz atomem tlenu

z grupy karbonylowej [39]. Ułożenie łańcuchów polipeptydowych w przestrzeni

określa struktura drugorzędowa. Wśród struktur drugorzędowych najczęściej

występuje alfa helisa oraz beta kartka [40]. Struktura trzeciorzędowa białka odnosi

się do przestrzennego ułożenia wszystkich aminokwasów tworzących dane białko,

natomiast w przypadku białek zawierających więcej niż jeden łańcuch

polipeptydowy istnieje również struktura czwartorzędowa, która określa ich

oddziaływania i wzajemne położenie [41].

Arg

Met

Cys CysProTyrGlu Lys

Gln Cys AspProTyrHis Val

Arg Ala

Pro

ProTyrGlu Val

Lys

alfa helisa

beta kartka

BIAŁKO I-RZĘDOWE BIAŁKO II-RZĘDOWE

BIAŁKO IV-RZĘDOWEBIAŁKO III-RZĘDOWE


33

4.1. Definicja i budowa metaloprotein

Niezwykle istotną rolę w prawidłowym funkcjonowaniu organizmu

odgrywają metale wchodzące w skład białek. Nadmiar jonów metali może wpływać

niekorzystnie na tkanki i dlatego ich ilość musi być precyzyjnie regulowana.

Polipeptydy zawierające jeden lub więcej jonów metali w swojej strukturze stanowią

prawie połowę wszystkich białek występujących w przyrodzie [42] i określane są

mianem metaloprotein [43]. Metalami najczęściej występującymi w ich strukturze

są: Ca, Mg, Mn, Fe, Cu, Zn, Na oraz K [44]. Niektóre z nich, zwłaszcza Mg, Fe i Co

mogą być różnie kompleksowane, tworząc w ten sposób chlorofil, hem lub korynę

[3]. Białka zawierające Co i Ni dopiero stosunkowo niedawno zostały uznane za

niezbędne w niektórych żywych organizmach. Istnieją również przypadki, w których

struktura białka zawiera metale ciężkie, takie jak Cd, V i W. Pomimo, że metale te

nie uczestniczą w procesach metabolicznych, to jednak są one istotne w przypadku

niektórych gatunków, takich jak bakterie beztlenowe [45]. Atomy lub jony metali

występujące powszechnie w białkach odgrywają w nich różnorodne funkcje. Metale

występujące w białkach służą jako przenośnik elektronów, ułatwiając transport tlenu

oraz odgrywają kluczową rolę w reakcjach katalitycznych [45]. W przypadku

zaburzenia homeostazy organizmu poprzez działanie różnych czynników

zewnętrznych, takich jak bakterie, wirusy czy promieniowanie jonizujące dochodzi

do zmiany stężenia jonów metali we krwi [46]. Zmiany te powiązane są ze zmianą

ilości białek, które zawierają dane atomy metali w swojej strukturze. Białka takie

noszą nazwę białek ostrej fazy i zalicza się do nich między innymi ceruloplazminę,

transferynę, ferrytynę czy też białko CRP [47]. Wzrost lub zmniejszenie ich ilości we

krwi skutkuje uruchomieniem odpowiednich mechanizmów mających na celu

powrót organizmu do stanu równowagi. Stan zapalny organizmu związany jest

zarówno ze zmianą stężenia wymienionych białek, jak również wpływa na ilość

erytrocytów, a tym samym na zmianę stężenia hemoglobiny [48,49]. Dlatego też

kontrola białek zawierających jony metali ma istotne znaczenie w prawidłowym

funkcjonowaniu komórek. W niektórych proteinach metal jest częścią miejsca

aktywnego w procesach katalitycznych, u innych odgrywa on istotną rolę

w utrzymaniu struktury białka. Wiedza oraz poznanie struktury białek jest niezbędna

w zrozumieniu ich funkcji [50]. Różnorodność białek zawierających jony metali

schematycznie ilustruje rysunek 6.


34

METALOPROTEINY

ENZYMY

OKSYDOREDUKTAZY

OKSYDAZY, Fe, Cu

REDUKTAZY, Fe, Cu, Mo

NITROGENAZY, Fe, Mo, V

HYDROKSYLAZY, Fe, Cu, Mo

HYDROGENAZY, Fe, Ni

DYSMUTAZA PONADTLENKOWA, Fe, Cu, Mn

HYDROLAZY

FOSFATAZY, Mg, Zn, Cu

AMINOPEPTYDAZY, Mg, Zn

KARBOKSYPEPTYDAZY, Zn

IZOMERAZY I SYNTETAZY

WITAMINA B12, KOENZYM, Co

BIAŁKA

TRANSPORT

I MAGAZYNOWANIE

PRZENOŚNIKI ELEKTRONÓW

CYTOCHROMY, Fe

BIAŁKAŻELAZO-SIARKOWE

NIEBIESKIE MIEDZIO-PROTEINY, Cu

GOSPODARKA METALAMI

FERRYTYNA, Fe

TRANSFERYNA, Fe

CERULOPLAZMINA, Cu

GOSPODARKA TLENEM

MIOGLOBINA, Fe

HEMOGLOBINA, Fe

HEMOERYTRYNA, Fe

HEMOCYJANINA, Cu

INNE FUNKCJE

Rysunek 6. Podział metaloprotein w oparciu o dane z [3].

Metaloproteiny biorą udział w wielu rodzajach biologicznych procesów.

Białka przyspieszające zachodzenie wielu reakcji chemicznych w organizmie

nazywane są enzymami. W strukturze enzymów wyróżnić można część białkową,

tak zwane centrum aktywne lub inaczej centrum katalityczne oraz fragment

niepeptydowy, zwany grupą prostetyczną [38]. Centrum aktywne enzymu

zbudowane jest z aminokwasów, które uczestniczą w wiązaniu substratu

z wytworzeniem kompleksu enzym−substrat [51]. Część enzymów wykazuje

aktywność tylko w przypadku, gdy w ich składzie znajduje się niebiałkowa część lub

grupa funkcyjna, określana mianem kofaktora. Kofaktorem mogą być zarówno jony

metali, jak również cząsteczki organiczne. Organiczne związki uczestniczące

w transporcie wodoru, grup funkcyjnych oraz wymianie elektronów między

substratami [52], takie jak dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD+), nazywa

się koenzymami. Część enzymu niezawierająca kofaktora, która zwykle jest

nieaktywna katalitycznie to apoenzym. Dopiero połączenie apoenzymu z częścią


35

niebiałkową, zwane holoenzymem nadaje takiemu białku aktywność katalityczną

[53]. Enzymy zawierające w swojej strukturze jony metali noszą nazwę

metaloenzymów i stanowią one około jedną trzecią wszystkich białek zawierających

jony metali [54].

Metaloproteiny, w tym metaloenzymy, do prawidłowego funkcjonowania

wymagają obecności atomów metali [55]. Miejsca, w których następuje wiązanie

jonów metali w białkach, można podzielić na pięć typów; podział ten opiera się na

funkcji, jaką pełni dany jon metalu:

strukturalna – udział w tworzeniu trzecio- i czwartorzędowych struktur

przestrzennych;

katalityczna – wiązanie substratu i jego aktywacja [56];

magazynująca – wychwytywanie, wiązanie i uwalnianie metali w formie

rozpuszczalnej;

transportowa elektronów;

wiązania cząsteczek tlenu [43].

Jony metali mogą uczestniczyć także w tworzeniu pofałdowanej struktury białek, czy

też zmianach konformacjnych [57]. Otoczenie chemiczne metali jest istotne dla

zrozumienia chemicznego zachowania białek. Jony metali mogą być połączone

z białkiem za pomocą wiązań kowalencyjnych lub koordynacyjnych, jak również

mogą one tworzyć kompleksy z białkami. Rolę ligandów w strukturze białka mogą

pełnić pojedyncze atomy lub grupy atomów. Ligandami grupowymi mogą być:

grupy imidazolowe histydyny (His) występujące w łańcuchu bocznym białka, grupy

karboksylowe pochodzące z kwasu asparginowego (Asp) i kwasu glutaminowego

(Glu), grupy wodorotlenowe seryny (Ser) i treoniny (Thr) oraz fenolany (analogi

tyrozyny (Tyr)), tiolany (cysteina (Cys)), jak również cząsteczki wody lub inne

cząsteczki niebiałkowe (węglany, wodorowęglany, itp.) obecne w miejscu wiązania

metalu. Stopień utlenienia metalu, liczba koordynacyjna, jak również charakter

ligandów mogą mieć wpływ na kąty i odległości pomiędzy atomami w cząsteczce

białka [58]. Z kolei atomy uczestniczące w koordynacji metalu przez białko to

głównie atomy tlenu z grupy karbonylowej łańcucha głównego, jak również tlen

z aminokwasowego łańcucha bocznego lub atomy azotu z histydyny, czy też atomy

siarki z cysteiny. W przypadku kompleksów chelatowych, w których ligand wiąże

się z jonem metalu za pośrednictwem więcej niż jednego wiązania koordynacyjnego,

pierścień chelatowy zawiera atom metalu i 3, 4 lub 5 innych atomów (C, N, O, S itp.)


36

[59]. Dla wybranych atomów metali w tabeli 1 przedstawione zostały typowe stopnie

utlenienia, atomy donorowe ligandów oraz liczba koordynacyjna.

Tabela 1. Wybrane jony metali, ich stopnie utlenienia, liczby koordynacyjne oraz atomy

donorowe wraz z uwzględniem ich pochodzenia, biorące udział w koordynacji danego metalu

przez białko w oparciu o dane z [50]. LK liczba koordynacyjna.

Metal LK

Typowy

dla białek stopień

utlenienia metalu

Główne atomy

donorowe

uczestniczące

w koordynacji metalu

Inne możliwe atomy

donorowe

uczestniczące

w koordynacji metalu

Fe 5, 6 Fe2+

, Fe3+

NHis

OAsp lub OGlu SCys

Co 6 Co2+

, Co3+

OAsp lub OGlu

NHis

OSer lub OThr

O z grupy karbonylowej

łańcucha głównego

SCys

Ni 6 Ni2+

NHis

OAsp lub OGlu

SCys



Cu 3, 4 Cu2+

, Cu+

NCys

SCys

OAsp lub OGlu



Zn 4 Zn2+

NHis

SCys

OAsp lub OGlu



OSer lub OThr

Metale takie jak V, Mo czy W są obecne w białkach w formie anionów

złożonych [60]. Bardzo często metale te powiązane są z kofaktorami. Ponad połowa

metali występujących w białkach ma liczbę koordynacyjną 5 lub 6. Dla liczb

koordynacyjnych większych niż 6 prawie zawsze metal związany jest z ligandami

wielokleszczowymi [60]. Z uwagi na fakt, że niniejsza rozprawa doktorska dotyczy,

takich białek jak: hemoglobina, ceruloplazmina, transferyna i ferrytyna w dalszej

części tego rozdziału zostaną dokładniej omówione tylko te białka.


37

4.2. Charakterystyka wybranych metaloprotein obecnych

we krwi

4.2.1. Hemoglobina, czerwony barwnik krwi wiążący tlen i tlenek

węgla(IV)

Hemoglobina (Hb) jest głównym białkiem odpowiedzialnym za przenoszenie

tlenu w układzie krwionośnym istot żywych [61]. Rozpuszczalność tlenu w wodzie

wynosi około 3·10-4

mol·L-1

, natomiast obecność hemoglobiny powoduje około

30-krotne zwiększenie jego rozpuszczalności we krwi [45]. Oprócz transportu tlenu

białko to uczestniczy także w przenoszeniu tlenku węgla(IV) z tkanek do płuc w celu

jego usunięcia z organizmu [62,3]. Udział hemoglobiny w przenoszeniu O2 i CO2

pomiędzy płucami a tkankami schematycznie przedstawia rysunek 7.

Rysunek 7. Rola hemoglobiny w organizmie.

Organizm ludzki zawiera około 750 g Hb, zlokalizowanej głównie w czerwonych

krwinkach [63]. Istnieje wiele przyczyn zaburzeń ilości tego białka we krwi, które

można podzielić na: (i) choroby genetycznie dziedziczone, jak np. anemia sierpowata

oraz (ii) schorzenia nabyte, jak methemoglobinemia polekowa, jak również

niedokrwistość spowodowana niedoborem żelaza w diecie [64]. Zatem zarówno

Fe2+

Fe2+

Fe2+

Fe2+

NHCOO-

NHCOO-

Fe2+

Fe2+

Fe2+

Fe2+

O2 O2

O2 O2

karbonylohemoglobina oksyhemoglobina

CO2 O2

CO2 O2

PŁUCA

TKANKA


38

zmiany funkcjonalne i strukturalne hemoglobiny związane są z wieloma chorobami

klinicznymi, takimi jak: białaczka, niedokrwistość czy choroby serca [65-67].

Dlatego też określenie ilości tego białka we krwi ma istotne znaczenie we wczesnym

wykrywaniu wielu chorób.

Hemoglobina zaliczana jest do kompleksów chelatowych, z uwagi na

obecność metalu wchodzącego w skład pierścienia tej cząsteczki [68]. Białko to jest

tetramerem, o masie cząsteczkowej wynoszącej ok. 67 kDa (67 000 g·mol-1

) [69],

który złożony jest z dwóch jednakowych łańcuchów polipeptydowych α oraz dwóch

identycznych łańcuchów β, nazwanych podjednostkami α i β. Łańcuch alfa złożony

jest ze 141 reszt aminokwasowych, gdzie N-koniec stanowi walina, zaś C-koniec

arginina. Z kolei łańcuch beta zawiera 146 reszt aminokwasowych, gdzie

N-końcowym aminokwasem jest walina, zaś C-końcowym histydyna. Każdy

z dwóch łańcuchów α pozostaje w kontakcie z dwoma łańcuchami β, natomiast

oddziaływania pomiędzy dwoma łańcuchami alfa lub beta są bardzo słabe [51,70].

Wszystkie cztery łańcuchy polipeptydowe zlokalizowane są w wierzchołkach

czworościanu [71]. Każdy z nich zawiera jedną grupę hemową, dzięki czemu

hemoglobina zdolna jest do wiązania czterech cząsteczek O2 [40,72]. Struktura

przestrzenna cząsteczki hemoglobiny przedstawiona została na rysunku 8.

Rysunek 8. Struktura przestrzenna cząsteczki hemoglobiny i hemu w oparciu o rysunek z [73].

Hem stanowi grupę prostetyczną hemoglobiny, ulokowany jest

w hydrofobowej kieszeni białka i jest to kompleks jonu żelaza z porfiryną, zwaną

protoporfiryną IX. To właśnie hem nadaje krwi charakterystyczny czerwony kolor;

w jego skład wchodzi cykliczny tetrapirol, w którym wszystkie cztery pierścienie

pirolowe połączone są za pomocą mostków α-metinowych, tworzących płaski

N

NN

N

CH3

O

OH

O

OH

CH3

CH3

Fe


39

cykliczny układ [3]. Żelazo utrzymywane jest w strukturze porfiryny głównie za

pośrednictwem oddziaływań hydrofobowych reszt aminokwasowych,

w szczególności izoleucyny, leucyny, fenyloalaniny i waliny, jak również za pomocą

jednego wiązania kowalencyjnego z resztą proksymalnej histydyny, oznaczanej jako

HisF8 [53]. Takie oznaczenie histydyny dotyczy jej umiejscowienia w łańcuchu

polipeptydowym, gdyż żelazo wiąże się z ósmą resztą tego aminokwasu w regionie F

α-helisy [53]. Atom żelaza zlokalizowany jest w centralnej części tego układu

i połączony jest on z czterema atomami azotu, piąte wiązanie koordynacyjne służy

do wiązania atomu żelaza z substancją białkową, natomiast szóste z cząsteczką tlenu.

Żelazo w hemoglobinie może występować w postaci jonu Fe2+

lub Fe3+

.

Natomiast tylko obecność żelaza na drugim stopniu utlenienia pozwala hemoglobinie

na transport tlenu w organizmie [74]. Podjednostki cząsteczki hemoglobiny

wykazują kooperatywność [75]; oznacza to, że każda z podjednostek ma inne

powinowactwo względem O2, co wynika z czwartorzędowej struktury Hb.

Przyłączenie jednej cząsteczki tlenu do jednej z grup hemowych powoduje, że

kolejne cząsteczki O2 coraz łatwiej przyłączają się do białka. Wzrost powinowactwa

pozostałych grup hemowych względem tlenu pozwala na wiązanie w płucach

maksymalnej ilości tlenu i uwalnianie go w tkankach. Utworzenie kompleksu

z tlenem prowadzi do zmian konformacyjnych cząsteczki hemoglobiny [3]. Zmiana

struktury przestrzennej hemoglobiny wynika z wsunięcia się atomu żelaza

w płaszczyznę pierścienia hemu w wyniku przyłączenia tlenu. W konsekwencji

oprócz żelaza wsunięciu ulega również histydyna proksymalna (bezpośrednio

związana z żelazem), co z kolei wymusza przemieszczenie się sąsiednich

aminokwasów łańcuchów globiny. W rezultacie następuje rozrywanie wiązań

poprzecznych występujących pomiędzy karboksylowymi końcami wszystkich

czterech podjednostek hemowych. Konformacja, w której hemoglobina jest tylko

częściowo utlenowana, określana jest jako stan T (z ang. taut – naprężony) [51].

Natomiast konformacja całkowicie utlenowanej hemoglobiny po wykonaniu przez

jedną z par podjednostki α/β obrotu o około 15° względem drugiej pary tej

podjednostki, w wyniku czego pary te zbliżają się do siebie i następuje wzrost

powinowactwa grup hemowych do O2 [3], określa się jako stan R (ang. relaxed –

rozluźniony) [51]. Przejście ze stanu T do stanu R wpływa na położenie par

podjednostek α/β. Najbardziej zauważalna jest zmiana położenia His HC3 na

C-końcach podjednostek β, które są zaangażowane w tworzenie par jonowych


40

w stanie T. W wyniku obrotu, będącego skutkiem przejścia Hb ze stanu T w R, His

HC3 przesuwa się w kierunku centrum cząsteczki. Innym skutkiem zmiany

konformacji hemoglobiny ze stanu T do R jest zwężenie kieszeni pomiędzy

podjednostkami β. Hemoglobina w stanie T wykazuje niskie powinowactwo do tlenu

oraz wysokie do protonów, chlorków, dwutlenku węgla i fosforanów organicznych.

Natomiast w stanie R posiada ona większe powinowactwo do tlenu, a mniejsze do

innych związków [76]. Zmiany konformacyjne hemoglobiny podczas procesu

przyłączania tlenu przedstawione są na rysunku 9.

Rysunek 9. Zmiany konformacyjne hemoglobiny. Rysunek zmodyfikowany w oparciu o [77].

Jon żelaza w hemie może występować w dwóch różnych pozycjach, które

uzależnione są od obecności związanego tlenu. Może być on wysunięty poza

płaszczyznę pierścienia porfiryny o około 0.04 nm lub też może znajdować się

w płaszczyźnie pierścienia [51]. W przypadku zredukowanej postaci hemoglobiny,

zwanej deoksyhemoglobiną (deoksyHb), jon żelaza wystaje ponad płaszczyznę

porfiryny, gdyż w tej formie żelazo jest zbyt duże, by przedostać się w dostępny

obszar w pierścieniu porfiryny. DeoksyHb wiąże tlen w płucach, co prowadzi do

O2His

Val

Leu

Leu

Hem

STAN T STAN R

His HC3

His HC3

2

2

1

1

2

2

1

1


41

utworzenia utlenowanej formy hemoglobiny, tzw. oksyhemoglobiny (oksyHb),

oznaczanej również jako HbFe2+

lub HbFe(II)O2 [78]. Po związaniu cząsteczki tlenu

z kationem żelaza, następuje zmiana układu elektronów w obrębie tego atomu. Po

utlenowaniu średnica jonu żelaza zmniejsza się, co pozwala na jego przemieszczenie

w głąb płaszczyzny hemu. OksyHb jest stosunkowo stabilną formą hemoglobiny,

jednak powoli ulega ona samorzutnemu procesowi utlenienia, w wyniku którego

powstaje anion ponadtlenkowy O2¯ (reaktywna forma tlenu) oraz methemoglobina –

metHb [HbFe(III)], inna forma hemoglobiny zawierająca jon Fe3+

. Forma ta nie

wykazuje zdolności wiązania tlenu, natomiast może wiązać cząsteczki wody [79,80].

W wyniku utleniania oksyHb może powstać również nadtlenek wodoru (H2O2), który

może być toksyczny i dlatego jego nadmiar zostaje usunięty przez katalazę oraz

peroksydazę glutationową, dzięki czemu jego ilość w czerwonych krwinkach

pozostaje stała [81]. Utlenianie żelaza za pomocą nadtlenku wodoru

w oksyhemoglobinie oraz deoksyhemoglobinie może również prowadzić do

powstawania ferrylohemoglobiny (ferryloHb, HbFe(IV)=O) [64,82]. Schemat

tworzenia różnych form hemoglobiny przedstawia rysunek 10.

oksyhemoglobina

(oksyHb, HbFe(II)O2)

utlenowana

deoksyhemoglobina

(deoksyHb, HbFe(II))

nieutlenowana

methemoglobina

(metHb, HbFe(III))

forma utleniona

ferrylohemoglobina

(ferryloHb, HbFe(IV)=O)

forma utleniona

HEMOGLOBINA

H2O2

H2O2

H2O2

oksoferrylohemoglobina

(oksoferryloHb, HbFe(IV)=O)

forma utleniona

H2O2

H2O2

Rysunek 10. Formy hemoglobiny. Schemat wykonany na podstawie danych zawartych w [83].

W przypadku utleniania oksyhemoglobiny za pomocą nadtlenku wodoru powstaje

oksoferrylohemoglobina (oksoferryloHb, HbFe(IV)=O). Zarówno ferrylo-

hemoglobina, jak również oksoferryloHb są związkami silnie utleniającymi. Procesy

utleniania oksyHb, metHb, ferryloHb oraz oksoferryloHb za pomocą H2O2

przedstawiają poniższe równania [64]:


42

22222 OOHO)IV(HbFeOHO)II(HbFe (5)

OHO)IV(HbFeOH)III(HbFe 222 (6)

2222 OOH)III(HbFeOHO)IV(HbFe (7)

2222 OOH)III(HbFeOHO)IV(HbFe (8)

Hemoglobina uwolniona z czerwonych krwinek lub chemicznie zmodyfikowana jest

podatna na utlenianie pod wpływem nadtlenku wodoru. Jednak zbyt długie

oddziaływanie Hb z H2O2 może prowadzić nawet do zniszczenia struktury hemu

i uwolnienia żelaza [84].

W przypadku związania hemoglobiny z tlenem zmianie ulega charakter

wiązania pomiędzy atomem żelaza a resztą grupy hemowej i łańcucha

polipeptydowego. W deoskyhemoglobinie wiązanie to ma charakter jonowy,

natomiast w formie utlenowanej hemoglobiny występuje wiązanie kowalencyjne

[85,86]. Dla utlenionej formy hemoglobiny, methemoglobiny (metHb), wiązanie

pomiędzy jonem Fe3+

a grupą porfirynową i łańcuchem peptydowym, tak jak

w przypadku deoksyhemoglobiny ma charakter jonowy [87]. Przyłączenie tlenu do

deoksyHb powoduje zmiany w strukturze elektronowej cząsteczki, a tym samym

zmiany we właściwościach magnetycznych form Hb. Z uwagi na kowalencyjne

wiązanie w oksyhemoglobinie, cząsteczka ta jest diamagnetyczna. Dla form

hemoglobiny, w których żelazo jest związane z histydyną w łańcuchu

polipeptydowym za pomocą wiązania jonowego, występują niesparowane elektrony.

Konsekwencją obecności w deoksyhemoglobinie czterech niesparowanych

elektronów oraz pięciu w metHb, jest ich paramagnetyczność. Łańcuch peptydowy

hemoglobiny nie wpływa na właściwości paramagnetyczne tych cząsteczek,

ponieważ ma on właściwości diamagnetyczne [88]. Hem w stanie niezwiązanym

wykazuje dużo większe powinowactwo do tlenku węgla(II) niż do tlenu. Z uwagi na

dużo większą trwałość kompleksu CO−Hb, tlen nie jest w stanie wyprzeć tlenku

węgla(II) z kompleksu. Połączenie białka z CO zmienia strukturę cząsteczki Hb,

powstaje wówczas zawada przestrzenna i hemoglobina nie jest w stanie związać

tlenu oraz dostarczyć go do komórek [89]. Hemoglobina oprócz transportu tlenu

i tlenku węgla(IV) bierze także udział w wielu innych procesach. W pewnych

warunkach białko to może wykazywać aktywność katalazy, która obecna jest

w czerwonych krwinkach i uczestniczy w rozkładzie nadtlenku wodoru [90]. Może


43

ona także mieć właściwości utleniające, jak również katalizuje proces kondensacji

aminofenoli [91,92].

4.2.2. Ceruloplazmina, nośnik jonów miedzi w organizmie

Ceruloplazmina (Cp) należy do rodziny multimiedziowych oksydaz, do

których zalicza się również oksydazę askorbinianu oraz lakazę. Oksydazy miedziowe

to białka wykazujące aktywność enzymatyczną w reakcjach, w których utlenianie

substratów związane jest z czteroelektronową redukcją tlenu cząsteczkowego do

dwóch cząsteczek wody [93]. Zarówno z uwagi na strukturę, funkcje, jak i udział

w reakcjach katalitycznych najbardziej złożoną multimiedziową oksydazą jest

właśnie ceruloplazmina (oksydoreduktaza ditlenu, EC 1.16.3.1). Białko to kodowane

jest tylko przez gen CPN, znajdujący się na dłuższym ramieniu chromosomu

3q23-q24 [94]. Ludzka ceruloplazmina jest glikoproteiną o masie cząsteczkowej

około 132 kDa (~131 976 g·mol-1

). Po raz pierwszy została ona wyizolowana

z frakcji białek osocza (globulin) przez Holmberga w 1944 roku [95]. Cząsteczka ta

składa się z pojedynczego łańcucha polipeptydowego zbudowanego z 1046

aminokwasów i zawiera od 7 do 8% węglowodanów [96]. Ceruloplazmina

syntezowana jest głównie w wątrobie, jednak może być również produkowana przez

kilka innych organów wydzielniczych, takich jak: nerki, gruczoł piersiowy, łożysko

czy splot naczyniówkowy mózgu [97]. W wątrobie biosynteza tego białka zachodzi

w aparacie Golgiego hepatocytów, gdzie enzym ATP7B uczestniczący w transporcie

miedzi w organizmie powoduje przyłączenie 6 atomów miedzi do nieaktywnej formy

białka, apo-ceruloplazminy (apo-Cp), tworząc holo-ceruloplazminę (holo-Cp). Ta

forma ceruloplazminy jest aktywna chemicznie i wydzielana jest do krwioobiegu

[98]. Ceruloplazmina jest głównym białkiem transportującym miedź w organizmie,

wiąże ponad 95% całkowitej jej ilości w osoczu krwi [99].

Struktura ludzkiej Cp jest znacznie bardziej złożona w porównaniu do innych

multimiedziowych oksydaz. Na podstawie badań krystalografii rentgenowskiej

udowodniono, że cząsteczka ceruloplazminy ma zwartą strukturę (około 214 x 85 Å)

z 3 homologicznymi regionami, z których każdy składa się z dwóch części [100].

Cząsteczka tego białka zbudowana jest z sześciu β-beczułkowych domen i zawiera

unikalne centrum aktywne, które tworzy grupa prostetyczna złożona z trzech różnych

typów centrów miedziowych: T1, T2 oraz T3, zawierających w sumie sześć atomów

miedzi. Poszczególne centra miedziowe są odzwierciedleniem budowy miejsc


44

wiązania jonów miedzi przez ceruloplazminę [101]. Trzy atomy miedzi są

jednojądrzaste, z czego dwa znajdują się w środkach wewnętrznych stron domen

4 i 6, które otoczone są czterema ligandami: dwoma resztami histydyny, jedną

metioniny oraz jedną cysteiny (centra T1A i T1B). Trzeci z tej grupy atomów Cu

zlokalizowany jest w centrum T1PR, które znajduje się w domenie 2. Centrum to

posiada inną strukturę niż pozostałe dwa centra T1, ponieważ nie występuje tam

reszta metioniny, gdyż została zamieniona w sekwencji aminokwasowej przez resztę

leucyny (Leu329), co może mieć wpływ na szybkość przeniesienia elektronów [102].

Kolejne trzy jony miedzi zlokalizowane są w klastrze, który znajduje się na granicy

dwóch domen: 1 i 6 [103]. Centrum T1A, zwane również centrum T1Remote znajduje

się w pobliżu klastra T3, w odległości 13 Å [104]. Jego nazwa nawiązuje do jego

odległości od środka cząsteczki Cp względem pozostałych miejsc wiązania miedzi.

W centrum tym ligand cysteiny otoczony jest przez dwie histydyny i każdy związany

jest z atomem miedzi klastra T2/T3. Natomiast pozostałe dwa centra T1 (T1B, zwane

T1CysHis oraz T1PR) znajdują się daleko od klastra T2/T3 [104]. Schemat cząsteczki

Cp ilustruje rysunek 11.

Rysunek 11. Struktura przestrzenna cząsteczki ceruloplazminy [99].

W pobliżu centrum T1CysHis, w domenach 4 oraz 6 znajdują się miejsca, w których

może nastąpić związanie żelaza. Miejsca te zbudowane są z dwóch cząsteczek kwasu

T2/T3

T1REMOTE

T1CysHis

T1PR

DOMENA 2

DOMENA 3

DOMENA 1

DOMENA 6

DOMENA 5

DOMENA 4


45

glutaminowego, jednej histydyny oraz jednej cząsteczki kwasu asparaginowego.

Oprócz tych miejsc w domenie 2 obecne są również obszary podobne do ligandów

w domenie 4 i 6, które złożone są z jednej cząsteczki kwasu asparaginowego, jednej

tyrozyny oraz dwóch cząsteczek kwasu glutaminowego [105]. Klaster T2/T3,

zawierający trzy atomy miedzi, otoczony jest przez cztery pary reszt histydyny. Dwie

pary pochodzą z domeny 1 i oddzielone są od siebie resztą seryny, natomiast kolejne

pary związane są z domeną 6 i oddzielone są resztami cysteiny oraz fenyloalaniny.

Dodatkowo, dwa atomy miedzi wchodzące w skład centrum T2/T3 związane są

z trzema parami reszt histydyny, podczas gdy najdalej położony w domenie 6 atom

miedzi związany jest tylko z dwoma resztami histydyny, z tego powodu miejsce to

oznaczane jest jako typ II [106,107]. Klaster T2/T3 łączy N-końcową i C-końcową

domenę cząsteczki Cp, dzięki czemu stabilizuje strukturę ceruloplazminy

i powoduje, że ma ona globularny kształt [99,100,108]. Według danych

literaturowych centra T1 są akceptorami elektronów, natomiast klaster T2/T3 wiąże

tlen cząsteczkowy i redukuje go do wody. Istotną cechą centrów miedziowych typu

T1 jest to, że wykazują one optyczną absorpcję przy długości fali 610 nm. Natomiast

centrum T2 nie absorbuje światła, ale wykazuje właściwości paramagnetyczne.

Z kolei centrum miedziowe T3 jest diamagnetyczne i jest ono niezbędne do wiązania

oraz redukcji tlenu. Właściwości paramagnetyczne posiadają kolejne dwa centra T1:

T1Remote i T1CysHis [106,109,110].

Ceruloplazmina jest wielozadaniowym enzymem. Jedną z najważniejszych

fizjologicznych funkcji Cp jest transport jonów miedzi w organizmie. Miedź

niezwiązana z białkiem może wiązać się z wolnymi grupami tiolowymi

pochodzącymi z cysteiny i powodować ich utlenianie, co w konsekwencji może

prowadzić do utraty aktywności enzymów oraz powodować uszkodzenie różnych

białek strukturalnych [111]. Kolejną ważną funkcją ceruloplazminy jest jej

aktywność katalityczna w reakcji utleniania jonów Fe(II) do Fe(III). Z uwagi na ten

fakt, enzym ten nazywany jest również ferroksydazą [112]. Poprzez utlenianie jonów

żelaza(II) Cp reguluje metabolizm tego pierwiastka, umożliwia wychwytywanie

i wiązanie żelaza(III) przez transferynę, która jest głównym białkiem uczestniczącym

w transporcie tego metalu w organizmie [113-115]. Ograniczenie ilości jonów Fe(II)

powoduje, że Cp bierze udział w jednym z głównych systemów antyoksydacyjnych

(system Cp-Tf), który przeciwdziała stresowi oksydacyjnemu [116] wywołanemu

działaniem reaktywnych form tlenu na organizm [117]. Proces powstawania


46

szkodliwych dla zdrowia form tlenu katalizują jony metali przejściowych, w tym

jony żelaza(II) oraz miedzi(I). Nagromadzenie jonów Fe2+

(katalizatora

w wolnorodnikowej reakcji Fentona) prowadzi do powstania rodnika

hydroksylowego, w wyniku ich oddziaływania z nadtlenkiem wodoru [118,119].

Utlenienie jonów Cu+ oraz Fe

2+ do form Cu

2+ i Fe

3+ powoduje, że w tej postaci są

one znacznie mniej szkodliwe dla organizmu [120]. Zatem Cp jest skutecznym

przeciwutleniaczem, zapobiegającym oksydacyjnemu uszkodzeniu białek, lipidów

i DNA [121]. Oprócz utleniania jonów żelaza(II) Cp, jako enzym należący do

oksydoreduktaz, jest w stanie utleniać także rozległą grupę związków organicznych,

takich jak hormony, aminofenole czy katechole [122]. Białko to wykazuje również

właściwości utleniające względem miedzi(I) oraz tlenku azotu(II) [99].

Ceruloplazmina, jako białko ostrej fazy, może być wskaźnikiem

diagnostycznym wielu chorób. Prawidłowe stężenie ceruloplazminy w ludzkim

osoczu w przypadku kobiet mieści się w przedziale od 25 do 47 mgdL-1

,

a dla mężczyzn zakres ten wynosi od 25 do 37 mgdL-1

[123]. W przypadku

narządów wewnętrznych najwyższe stężenie miedzi jest w nerkach (7÷12 µg·g-1

),

nieco niższe w wątrobie (4÷6 µg·g-1

) i mózgu (3÷5 µg·g-1

). Natomiast w mięśniach

zawartość Cu to jedynie około 1 µg·g-1

. Stężenie miedzi w osoczu krwi i surowicy u

dorosłych osobników różnych ssaków jest dużo bardziej zmienne i można podzielić

je na trzy grupy, z których pierwszą stanowią myszy i psy (25÷40 mg·dL-1

), do

drugiej grupy zalicza się ludzi, szczury, krowy i owce (~100 mg·dL-1

), natomiast do

trzeciej grupy należą świnie (150÷200 mg·dL-1

). Stężenie miedzi w osoczu ulega

zmianie w odpowiedzi na specyficzne warunki otoczenia. Głównym sposobem

dostarczania miedzi do organizmu jest pożywienie (40÷70%). Miedź pochodząca

z pokarmów jest wchłaniana głównie w dwunastnicy i jelicie cienkim. Pierwszy etap

pobierania i rozkładu miedzi związany jest z transportem miedzi do krwi, gdyż

praktycznie cała miedź zostaje związana z białkami osocza, które następnie

wbudowywane są do hepatocytów. Większość miedzi ulega rozpuszczeniu

w wątrobie i jest wprowadzana do nieaktywnej formy Cp: apo-Cp. W kolejnym

etapie następuje wydzielanie do krwioobiegu holo-Cp. Nadmiar miedzi wydalany

jest przez wątrobę do żółci, gdzie pierwiastek ten jest usuwany z organizmu przez

defekację [124]. Schemat wchłaniania miedzi, jej cyrkulacji w organizmie oraz

wydalania przedstawia rysunek 12.


47

MÓZG

KREW ŻÓŁĆ

CHOROBA

MENKESA

Cu ~ 6 mg

65 95%

miedzi w Cp

Cu ~ 2.5 mg/dzień

CHOROBA

WILSONA

CHOROBA

MENKESA

ORGANY

JE

LIT

OC

IEN

KIE

Cu ~ 0.5 2.5 mg/dzień

KAŁ

MIEDŹ Z POKARMU

PŁYNY WYDZIELNICZE

Cu ~ 2.0 mg/dzień

DWUNASTNICA

Cu ~ 4.5 mg/dzień

KRĄŻENIE WROTNE

Rysunek 12. Schemat procesu obiegu miedzi w organizmie [124].

Zmiany stężenia ceruloplazminy mają negatywny wpływ na zdrowie

człowieka. Spadek stężenia tego białka w osoczu krwi poniżej wartości 2 mgdL-1

związany jest z występowaniem choroby Menkesa lub choroby Wilsona [125].

Należy podkreślić, że ilość ceruloplazminy oraz całkowite stężenie miedzi maleją

także przy niedoborze miedzi w diecie [126]. Poziom Cp wzrasta w przypadku ciąży,

chorób nowotworowych, np. chłoniaka Hodgkina [127], jak również w stanie

zapalnym organizmu [128]. Białko to ma zatem duże znaczenie w diagnostyce

schorzeń, takich jak: białaczka, rak wątroby, gruźlica, zaburzenia neurologiczne

(np.: choroba Alzheimera, choroba Parkinsona) oraz udar [129]. Określenie stężenia

Cp w osoczu wymaga zastosowania bardzo czułych metod, z uwagi na fakt, że

w przypadku niektórych chorób jej stężenie jest zazwyczaj bardzo niskie.

Pacjenci z chorobą Menkesa (MNK, choroba krętych włosów) posiadają

zablokowany wychwyt miedzi, który spowodowany jest mutacją w genie ATP7A,

w wyniku niedoboru miedzi w układzie krążenia [123]. Choroba ta jest zaburzeniem

metabolizmu miedzi dziedziczonym recesywnie, prowadzącym do neurodegeneracji

organizmu [130]. Objawy tej choroby widoczne są już po urodzeniu i bardzo często

prowadzą do zgonu we wczesnych latach życia. Spadek aktywności białka

ATP7A-azy prowadzi do gromadzenia się miedzi w enterocytach, przez co następuje

obniżenie jej wchłaniania z pokarmu i kumulacja w nerkach [123]. Schorzenie to

występuje niezwykle rzadko, od 1/100 000 do 1/300 000 żywych urodzeń [131,132].


48

Nosicielami zmutowanego genu są kobiety, natomiast choroba ta pojawia się tylko

u chłopców. Typowymi objawami choroby Menkesa są kręte i szorstkie włosy oraz

zaburzenia neurologiczne, takie jak: brak kontroli głowy, zaburzenia wzroku,

napięcie mięśniowe kończyn oraz drgawki [123].

Niski poziom ilości Cp w osoczu krwi jest zwykle związany z chorobą

Wilsona (WD) [133], czyli dziedzicznym zaburzeniem metabolizmu miedzi

z poważnymi neurologicznymi objawami. Znana jest ona również pod nazwą

zwyrodnienia soczewkowo–wątrobowego. Nagromadzenie miedzi w różnych

narządach, głównie w wątrobie i ośrodkowym układzie nerwowym [134] może

prowadzić do marskości wątroby, zaburzeń neurologicznych oraz do innych

objawów powiązanych z zaburzeniem transportu miedzi [135]. Toksyczne

nagromadzenie miedzi w wątrobie jest związane z mutacją białka ATP7B, które

kontroluje równowagę miedzi w organizmie. Częstość występowania tego

zaburzenia wynosi od 1/30 000 do 1/ 100 000 [136]. U osób z tym zaburzeniem

często pojawia się marskość wątroby, przewlekłe zapalenie tego narządu oraz jego

niewydolność. Mogą wystąpić także objawy neurologiczne, w tym zaburzenia

ruchowe, drgawki, zmiany osobowości, depresja czy psychoza. Miedź może także

gromadzić się w innych tkankach, np. rogówce oka, powodując pojawienie się tzw.

pierścienia Kaysera-Fleischera, będącego objawem charakterystycznym tej choroby

[137].

Z kolei wzrost stężenia ceruloplazminy w osoczu krwi może być związany

głównie z chłoniakiem Hodgkina. Choroba ta nazywana jest również ziarnicą

złośliwą [127]. Chłoniak Hodgkina jest nowotworem układu limfatycznego, który

powoduje rozrost limfocytów B, które tworzą komórki nowotworowe Reed-

Sternberga (R-S). Nowotwór ten stanowi około 1% wszystkich występujących

nowotworów [138]. Przyczyną tej choroby są najprawdopodobniej uwarunkowania

genetyczne oraz różnego rodzaju infekcje. Rozpoznanie choroby jest niezwykle

trudne, ponieważ głównym jej objawem jest powiększenie węzłów chłonnych. Inne

objawy, takie jak gorączka, czy spadek masy ciała pojawiają się w znacznie

późniejszym okresie i związane są z zaawansowanym stadium nowotworu. Oprócz

układu chłonnego Chłoniak Hodgkina może zająć również wątrobę, płuca oraz szpik

kostny [139,140].


49

4.2.3. Transferyna, białko transportujące jony żelaza w organizmie

Transferyny to grupa białek uczestniczących w wiązaniu i transporcie żelaza

w organizmie. Do rodziny tej należą: laktoferyna (LF), owotransferyna (OTf),

melanotransferyna (MTf) oraz ludzka transferyna osocza (Tf). Laktoferyna jest

białkiem występującym głównie w mleku, łzach, białych krwinkach, żółci i soku

trzustkowym. Z kolei owotransferyna spotykana jest głównie w jajach kurzych,

a melanotransferyna jest białkiem membranowym obecnym w bardzo małej ilości na

powierzchni zdrowych komórek [141]. Najbardziej rozpowszechnionym białkiem

z tej grupy, występującym u wszystkich kręgowców, a także u krabów i owadów jest

transferyna [142].

U ssaków transferyna jest składnikiem krwi, limfy oraz płynów mózgowo-

rdzeniowego i owodniowego [143]. Białko to składa się z pojedynczego

glikoproteinowego łańcucha, zawierającego około 700 aminokwasów, o masie

cząsteczkowej bliskiej 80 kDa (~79 985 g·mol-1

) [144]. Łańcuch polipeptydowy Tf

tworzą dwie globularne podjednostki, nazywane podjednostkami N- oraz

C-końcowymi, wiążące w sumie dwa atomy żelaza. Strukturalnie podjednostki te są

do siebie bardzo podobne, masa każdej z nich wynosi około 40 kDa i połączone są ze

sobą za pomocą krótkiego peptydu. Strukturę przestrzenną cząsteczki transferyny

przedstawia rysunek 13.

Rysunek 13. Struktura przestrzenna cząsteczki transferyny oraz schemat budowy miejsc wiązania

jonów Fe(III) w domenach C- i N-końcowej. W nawiasach podano aminokwasy domeny

N-końcowej. Kolor niebieski symbolizuje atom azotu, zielony – atom tlenu, zaś szary – atom

węgla. Rysunek wykonano na podstawie danych literaturowych [143,145].

Każda z podjednostek Tf podzielona jest na dwie domeny o podobnym rozmiarze,

które zawierają fragmenty α-helisy oraz β-kartki [146]. Podjednostki te posiadają

Fe(III)

Fe(III)

domena C-końcowa

domena N-końcowa

Tyr188 (517)Tyr95 (426)

His249 (585) Asp63 (392)

CO32-

Fe3+


50

po jednym miejscu wiązania żelaza(III), składającego się z: kwasu

asparginowego, dwóch cząsteczek tyrozyny, jednej histydyny oraz anionu

węglanowego, nazywanego także anionem synergistycznym [147]. Miejsca te są

do siebie bardzo podobne zarówno pod względem budowy, jak i długości

wiązania metal-ligand, która zawiera się w przedziale od około 1.9 do 2.2 Å

[148]. Ligandy pochodzą z czterech różnych części transferyny. Jeden z ligandów

pochodzi z domeny 1 (Asp63), kolejny z domeny 2 (Tyr188), a ostatnie dwa

ligandy (Tyr95 i His249) z dwóch łańcuchów polipeptydowych, które występują

pomiędzy tymi domenami [147]. Jony Fe3+

wiązane są w domenie N-końcowej za

pośrednictwem Asp392, His585, Tyr426, Tyr517 oraz jonów CO32-

. Natomiast

wiązanie żelaza w domenie C-końcowej zachodzi poprzez atomy tlenu Asp63,

Tyr95, Tyr188, atom azotu His249 oraz dwa atomy tlenu pochodzące z jonu CO32-

[143]. Domeny mogą przemieszczać się względem siebie i prowadzić do zmiany

konformacji cząsteczki transferyny z zamkniętej, zawierającej jony Fe(III), do

otwartej – pozbawionej jonów żelaza [147]. Zmiany konformacyjne cząsteczki Tf

mogą mieć funkcjonalne znaczenie i odgrywają kluczową rolę w rozpoznawaniu

oraz wiązaniu receptora Tf. Schematycznie zmiany konformacyjne cząsteczki

transferyny ilustruje rysunek 14.

Fe(III)

KONFORMACJA OTWARTA KONFORMACJA ZAMKNIĘTA

Rysunek 14. Konformacja otwarta oraz konformacja zamknięta transferyny [149].

Silne wiązanie jonów żelaza(III) przez transferynę występuje tylko

w przypadku obecności anionu węglanowego, który odgrywa niezwykle istotną rolę

w tworzeniu miejsca wiązania żelaza. Brak tego jonu powoduje, że wiązanie żelaza

jest dużo słabsze [150]. W osoczu krwi tylko około 30% całkowitej ilości transferyny

występuje w postaci związanej z jonami żelaza(III), podczas gdy 70% pozostaje

w formie apo-transferyny (apo-Tf), która może również wiązać inne jony metali

w tych samych miejscach, co jony żelaza. Forma Tf zawierająca żelazo nosi nazwę

holo-transferyny (holo-Tf) [151,152] i może ona transportować jeden jon Fe3+


51

(Nt(Fe)Tf oraz Tf(Fe)Ct) lub też dwa jony tego metalu (Tf(Fe)2) [153]. Główna

funkcja transferyny polega na wiązaniu jonów żelaza(III), co ułatwia transport żelaza

z miejsc jego magazynowania do miejsc, w których następuje zapotrzebowanie na

ten metal [154]. Stężenie transferyny w osoczu utrzymuje się na stałym poziomie od

momentu urodzenia i wynosi około 0.2 ÷ 0.3 g·dL-1

[155]. Odpowiedni poziom tego

białka jest niezwykle ważny dla prawidłowego wzrostu komórek. Tf, podobnie jak

Cp, należy do białek ostrej fazy i spadek jej ilości w osoczu krwi poniżej 0.01 g·dL-1

może być związany z występowaniem zakażenia, opóźnienia wzrostu oraz

niedokrwistości [156].

Z uwagi na fakt, że żelazo może być zarówno akceptorem, jak i donorem

elektronów oraz dodatkowo może oddziaływać z różnymi cząsteczkami, jest ono

jednym z najbardziej rozpowszechnionych metali w organizmie człowieka,

pełniącym różnorodne funkcje. Metal ten może odwracalnie wiązać różne ligandy,

przez co uczestniczy w przemianach metabolicznych organizmu [157]. Żelazo

przenoszone przez transferynę trafia przede wszystkim do białek oddechowych, czyli

hemoglobiny znajdującej się w erytrocytach oraz mioglobiny, która obecna jest

w mięśniach. Metal ten jest niezbędny do pełnienia przez te białka ich funkcji

fizjologicznych [157]. Cześć żelaza trafia również do ferrytyny, czyli białka

magazynującego ten metal w organizmie [158]. Żelazo bierze także udział

w syntezie różnych związków, takich jak hormony czy kolagen. Może ono również

uczestniczyć w replikacji DNA i przemianie energii [159-161]. Obecność żelaza

w cząsteczce Tf sprawia, że białko to działa jako środek przeciwbakteryjny, gdyż

zapobiega dostarczaniu niezbędnych substancji odżywczych do komórek

bakteryjnych, jak również przeciwdziała powstawaniu toksycznych form tlenu

powstających w reakcji Fentona [162,163]. Transferyna może również pełnić rolę

wskaźnika informującego o przewlekłym nadużywaniu alkoholu [164]. Spożywanie

alkoholu ma wpływ na strukturę cząsteczki Tf [165] i prowadzi do zmniejszenia

ilości kwasu sialowego w cząsteczce transferyny, a powstała izoforma Tf nosi nazwę

transferyny desialowanej (CDT) [166]. Jednak zmiany te w strukturze białka są

odwracalne i w przypadku odstawienia alkoholu, po kilku dniach transferyna wraca

do wyjściowej formy [165]. Schematycznie funkcje transferyny i transport żelaza

w organizmie przedstawiono na rysunku 15.


52

TRANSFERYNA

(transport żelaza)

Ferrytyna (przechowywanie/magazynowanie żelaza w wątrobie i sercu)

inne procesyHemoglobina

(Erytropoeza)

75% 10 20% 5 15%

Rysunek 15. Rola transferyny i obieg żelaza w organizmie. Rysunek zmodyfikowany w oparciu

o [157-159].

Transport żelaza przez transferynę do określonych miejsc w organizmie

odbywa się za pomocą receptora transferyny (TfR) [167], który występuje na

powierzchni aktywnie dzielących się komórek [168]. Wiązanie i uwalnianie żelaza

przez Tf związane jest z kilkoma różnymi czynnikami, takimi jak: temperatura,

stężenie jonów czy też pH środowiska [169]. Oprócz jonu węglanowego, zasadnicze

znaczenie w stabilizacji miejsca wiązania żelaza odgrywają również inne jony, np.

jon chlorkowy. W neutralnym pH jony chlorkowe hamują proces uwalniania żelaza,

natomiast w pH kwaśnym ich obecność przyspiesza ten proces [170]. Kompleks

transferyny z receptorem (Fe2-Tf/TfR) ulega endocytozie [167], w wyniku której

formowany jest endosom, czyli pęcherzyk transportujący. W całkowicie

uformowanym endosomie pH wynosi 5.5 i następuje uwolnienie żelaza oraz jego

transport w postaci jonów Fe(II) do cytoplazmy za pośrednictwem DMT1, czyli

transportera metali dwuwartościowych w organizmie [162]. Uwolnienie żelaza(II)

z transferyny związane jest z niską stałą wiązania jonów Fe(II), która jest 17 razy

mniejsza niż w przypadku jonów Fe(III) [171]. Powstała apo-transferyna w kwaśnym

pH wiąże się z receptorem, tworząc kompleks apo-Tf-TfR, który wraca na

powierzchnię komórek. W pH fizjologicznym cząsteczka apo-Tf jest uwalniana

z receptora i wraca do krwioobiegu [147,168], gdzie ponownie wiąże żelazo

powstałe z rozpadu hemoglobiny utlenione przez ceruloplazminę [170,172]. Czas


53

życia apo-transferyny wynosi około 7.6 dnia, a transferyny związanej z jonami

Fe(III) około 1.7 godziny. W trakcie tego czasu Tf wykonuje około 100 cykli

wiązania i uwalniania żelaza [173]. Obieg żelaza w organizmie schematycznie


Rysunek 16. Schemat aktywności żelaza w organizmie. Rysunek zmodyfikowany w oparciu

o [174].

Oprócz jonów Fe3+

, transferyna może również wiązać inne jony metali dwu-, trój-

i czterowartościowe, takie jak: Cu2+

, Zn2+

, Eu3+

, Nd3+

i Th4+

[175]. Z kolei wiązanie

przez transferynę takich jonów metali, jak: Bi3+

, Ru3+

, Ti4+

, In3+

oraz leków daje

możliwość wykorzystania tego białka w terapii celowanej [143,147]. Do najbardziej

popularnych połączeń Tf z metalami należą kompleksy transferyny z bizmutem.

W wyniku utworzenia koniugatu Bi(III)-Tf dochodzi do zmian strukturalnych

cząsteczki transferyny, co prowadzi do zmiany konformacji białka z otwartej na

zamkniętą i w konsekwencji możliwy jest transport takiego połączenia do komórek

[176]. Połączenie transferyny z jonami bizmutu wykorzystywane jest w terapii

nowotworowej oraz w terapii bakteriobójczej [177,178]. W terapii

przeciwnowotworowej wykorzystuje się również połączenia transferyny z rutenem

[179] oraz doksorubicyną (DOX) [180]. Kompleks Ru(III)-Tf zmniejsza liczbę

komórek nowotworowych w guzach litych, a z kolei połączenie DOX-Tf powoduje,

że koniugat ten trafia głównie do chorobowo zmienionych komórek, wówczas

niszczenie zdrowych komórek jest znacznie ograniczone, w porównaniu do działania

wolnej doksorubicyny [179,180]. W przypadku niszczenia komórek białaczkowych

skuteczny okazał się kompleks transferyny z tytanem (Ti(IV)-Tf). Możliwość

transportu jonów Ti4+

w organizmie jest również istotna w przypadku wzrostu

Fe3+

Fe2+

DcytBDMT1

Fe2+

Fe3+

ENTEROCYTY

Fe2+

Fe3+

ceruloplazmina

CZERWONE KRWINKI

MAKROFAGI

HEPATOCYTY

Fe2+

Fe3+

Tf – Fe3+

ceruloplazmina

TfR1

NTBI


54

stężenia tych jonów z powodu obecności implantów tytanowych, środków

obrazujących opartych na tytanie oraz dodatków do żywności [181,182].

Dostarczanie przez transferynę leków do komórek nowotworowych możliwe jest

dzięki wykorzystaniu faktu, że na powierzchni chorych komórek występuje

zwiększona ilość receptorów Tf, co zwiększa również możliwość odpowiedniej

lokalizacji zmian nowotworowych [183].

4.2.4. Ferrytyna, białko magazynujące żelazo w organizmie

Ferrytyny to grupa białek zdolnych do wiązania, magazynowania

i uwalniania żelaza w miejscach, w których pojawia się zapotrzebowanie na ten

pierwiastek. Do rodziny tej zalicza się białka magazynujące żelazo (Ftn), ferrytyny

bakteryjne zawierające hem (Bfr) oraz białka wiążące DNA (Dps). Ferrytyny

uczestniczą w szlakach biochemicznych regulujących apoptozę, jak również

translację białek [184], co sprawia, że mają one istotne znaczenie w prawidłowym

funkcjonowaniu organizmów.

Ferrytyna (Ft) została po raz pierwszy odkryta i wyizolowana ze śledziony

konia przez Laufbergera w 1937 roku [185], jest ona obecna również u ludzi,

ssaków, roślin, grzybów i bakterii [186]. Ferrytyna odgrywa kluczową rolę

w utrzymaniu odpowiedniego stężenia żelaza wewnątrz komórek [187], poprzez jego

magazynowanie oraz kontrolowane uwalnianie [188]. Wiążąc wolne jony żelaza

zapobiega zarówno peroksydacji lipidów, zmianom w płynności błon komórkowych,

jak również rozrywaniu błony i śmierci komórek [189]. Białko to reguluje również

rozwój organizmu [190] oraz pełni rolę wskaźnika różnych procesów zapalnych

[191]. Dodatkowo ferrytyna zabezpiecza organizm przed stresem oksydacyjnym

poprzez ograniczenie nadmiaru wolnych jonów żelaza generujących reaktywne

formy tlenu w reakcji Fentona [192] oraz bierze udział w reakcjach obronnych

komórek [193].

Cząsteczka ferrytyny przypomina kształtem kulę zbudowaną z powłoki

białkowej, której wnętrze wypełniają związki żelaza, a jej masa cząsteczkowa

wynosi około 450 kDa (~449 920 g·mol-1

) [185]. Jedna cząsteczka ferrytyny może

związać ok. 4500 atomów Fe, przy czym zazwyczaj wiąże od 1000 do 2000 atomów

Fe [194]. Cząsteczka ferrytyny posiada powłokę białkową łączącą się z jądrem

żelaznym poprzez kanały wzdłuż 2, 3 i 4-krotnych osi symetrii [194]. Zewnętrzna

średnica cząsteczki ferrytyny wynosi około 12 nm, natomiast średnica wewnętrznej


55

kapsuły, w której tworzy się jądro rdzenia żelaznego, ma wielkość około 8 nm [195].

Schemat struktury cząsteczki ferrytyny przedstawiony został na rysunku 17.

Rysunek 17. Struktura przestrzenna cząsteczki ferrytyny [196].

Powłoka białkowa ferrytyny składa się z 24 podjednostek (łańcuchów) dwóch

typów: ciężkich (H) oraz lekkich (L) [197,198]. Rola łańcuchów H i L jest

zróżnicowana. Łańcuchy ciężkie, których masa cząsteczkowa wynosi około 24 kDa,

odpowiedzialne są za transport żelaza do wnętrza ferrytyny i na zewnątrz molekuły.

Biorą one udział w utlenianiu jonów Fe(II) do Fe(III) [194], dzięki obecności

w swojej strukturze ferroksydazy. Ferroksydaza zlokalizowana jest w czterech

spiralnych fragmentach łańcuchów polipeptydowych podjednostek H w odległości

7÷8 Å od wewnętrznej i 12÷13 Å od zewnętrznej granicy otoczki białkowej,

w regionie o charakterze silnie hydrofobowym [196]. Ludzka ferroksydaza składa się

z dwóch centrów wiązania żelaza (FeA i FeB), które są osłonięte przez następujące

aminokwasy: His65, Glu27, Glu107, Glu61 i Glu62, co pokazuje rysunek 18.

ZEWNĘTRZNA STRONA

OTOCZKI BIAŁKOWEJ

WEWNĘTRZNA STRONA

OTOCZKI BIAŁKOWEJ

OH

O

O

NH

O

Tyr - 34

Glu - 107

Gln - 141

Glu - 27

Glu - 62Glu - 61

O

O O O O+

H H

O

O

N+

N

H

His - 65FeB FeA

Rysunek 18. Położenie ferroksydazy w cząsteczce ferrytyny [195].

= 12 nm

= 8 nm


56

Dodatkowo łańcuchy H posiadają znaczną ilość reszt kwasu glutaminowego, które

łatwo reagują z reaktywnymi formami tlenu. Mutacje w aminokwasach Glu62 oraz

His65 mogą blokować wiązanie żelaza przez cząsteczkę ferrytyny. Z kolei łańcuch

lekki (L), o masie 19 kDa, z uwagi na obecność wielu grup karboksylowych nie

uczestniczy w utlenianiu żelaza [199], natomiast bierze udział w tworzeniu

wewnętrznej struktury ferrytyny, mineralnego rdzenia, który zbudowany jest głównie

z cząsteczek uwodnionego tlenku żelaza(III) [FeIII

10O14(OH)2] [200]. Dodatkowo

łańcuchy L stabilizują strukturę tego białka [194]. Struktura FeIII

10O14(OH)2 złożona

jest z pojedynczej fazy heksagonalnej i zawiera ona około 20% tetraedrycznie

skoordynowanego żelaza(III) oraz około 80% oktaedrycznie skoordynowanych

jonów Fe3+

[201].

Stężenie żelaza w cytoplazmie jest dużo większe niż innych metali

przejściowych. Otoczenie cytoplazmy o charakterze redukującym sprzyja obecności

żelaza na drugim stopniu utlenienia, gdzie jego stężenie wynosi od 10-7

do 10-18

M

[202]. Żelazo(II) wychwytywane jest najpierw przez apo-ferrytynę (cząsteczkę

niezawierającą w swojej strukturze jonów żelaza), która obecna jest głównie

w cytoplazmie [203]. Ujemnie naładowane kanały w ferrytynie przyciągają jony

Fe2+

, powodując tym samym wciąganie ich do wnętrza struktury ferrytyny [204],

gdzie następnie ulegają one utlenianiu do jonów Fe3+

i w tej postaci żelazo jest

przechowywane w cząsteczce Ft [205]. Reakcja utleniania jonów Fe(II) zachodzi

przy udziale tlenu i katalizowana jest przez podjednostkę ciężką ferrytyny, a ściślej

mówiąc przez ferroksydazę wchodzącą w skład łańcucha H. W reakcji tej wolne

miejsca ferroksydazy (P) oddziałują z jonami Fe(II), w wyniku czego tworzą się

odpowiednie tlenki żelaza oraz nadtlenek wodoru. Reakcję utleniania żelaza(II)

w cząsteczce ferrytyny ilustruje następujące równanie [206]:

H4OHFeOOH2P

)OH(OFePOFePPOH4OFe2

22

222

22222

2

(9)

W kolejnym etapie powstaje jądro rdzenia żelaznego i następuje jego wzrost

w wyniku oddziaływania z łańcuchem L. Powstawaniu rdzenia żelaznego

w ferrytynie mogą sprzyjać niektóre jony, jak np. jony fosforanowe [207].

W przypadku, kiedy rdzeń żelazny jest już dobrze uformowany i osiągnie

wystarczającą wielkość, a jony żelaza(II) dalej dostarczane są do wnętrza ferrytyny;

ich utlenianie może odbywać się bezpośrednio na powierzchni rdzenia żelaznego

za pośrednictwem tlenu, zgodnie z równaniem [194]:


57

H8FeOOH4OH6OFe4 222 (10)

Reakcja bezpośredniego utleniania żelaza jest reakcją dominującą. Schemat

mineralizacji żelaza w powłoce białkowej cząsteczki ferrytyny przedstawia rysunek

19.

Fe3+

Fe3+

Fe2+

Fe2+

Fe3+ łańcuch ciężki (H) łańcuch lekki (L)

UTLENIANIE Fe2+

PRZEZ FERROOKSYDAZĘ

W ŁAŃCUCHU CIĘŻKIM

TWORZENIE SIĘ

I WZROST MINERALNEGO

RDZENIA FERRYTYNY

UTLENIANIE Fe2+

NA POWIERZCHNI

MINERALNEGO RDZENIA

FERRYTYNY

WZROST MINERALNEGO

RDZENIA FERRYTYNY

Rysunek 19. Schemat mineralizacji żelaza w powłoce białkowej cząsteczki ferrytyny.

Prawidłowe funkcjonowanie cząsteczki Ft oparte jest na współdziałaniu dwóch

procesów pozwalających na szybkie i efektywne magazynowanie żelaza oraz jego

kontrolowane uwalnianie. Uwalnianie żelaza w postaci jonów Fe(II) z wnętrza

ferrytyny w warunkach fizjologicznych następuje w momencie, gdy stężenie żelaza

w cytoplazmie ulega znacznemu zmniejszeniu [208]. Ferrytyna oprócz jonów żelaza

może wiązać i magazynować również inne jony metali. Niektóre z tych jonów, takie

jak Zn(II), wiążąc się z ferrytyną hamują proces wiązania żelaza przez to białko

[209]. Z kolei jony miedzi(II), oddziałując z ferrytyną, katalizują wychwyt żelaza

przez cząsteczki tego białka. Ferrytyna może również oddziaływać z różnymi

biomolekułami, takimi jak: glutation (GSH), oksydaza ksantynowa i dysmutaza

ponadtlenkowa (SOD) [208].

Ferrytyna jest niezwykle stabilną cząsteczką, jest odporna na zmiany

temperatury aż do 70 °C i wartości pH w zakresie od 3 do 10. Przy pH poniżej 3

poszczególne podjednostki mogą odłączać się od reszty Ft, jednak zmiany te są

odwracalne, przy powrocie do pH większego od 3 cząsteczka wraca do wyjściowej

formy [210]. Ilość poszczególnych łańcuchów w organach zawierających ferrytynę

jest odmienna. W wątrobie i śledzionie dominują łańcuchy lekkie, a z kolei w mózgu

i sercu przeważa ilość łańcuchów ciężkich [211,212]. Łańcuchy L charakteryzują się


58

większą stabilnością niż łańcuchy H nawet w warunkach kwasowych i redukujących

[213].

Synteza podjednostek H i L ferrytyny oraz metabolizm żelaza regulowane są

przez dwa białka: IRP1 oraz IRP2 [214]. Białka te wiążą się do odpowiednich

sekwencji RNA, np. mRNA kodujących ferrytynę lub do receptorów transferyny.

Przy wzroście stężenia żelaza w cytoplazmie białko IRP1 tworzy klaster Fe-S.

Z kolei, gdy poziom żelaza jest niski białko to przyjmuje konformację otwartą

pozbawioną klastra Fe-S, która wiąże się z sekwencjami reagującymi na żelazo

(IRE) występującymi w mRNA ferrytyny i powodującymi blokowanie translacji

mRNA [214]. Obecność IRP2 w komórkach reguluje ich degradację spowodowaną

zbyt dużą ilością żelaza [215]. Regulacja stężenia żelaza przez białka IRP

w warunkach niedoboru oraz nadmiaru tego metalu w komórkach sprawia, że

organizm szybko powraca do stanu, w którym stężenie żelaza jest odpowiednie do

prawidłowego funkcjonowania komórek [216].

Zaburzenia funkcji ferrytyny mogą powodować typowe choroby powiązane

ze wzrostem lub zmniejszeniem ilości żelaza w organizmie. Poziom ferrytyny ma

istotne znaczenie w przypadku wystąpienia anemii, jak również może odgrywać

kluczową rolę w niektórych zaburzeniach neurologicznych, takich jak choroba

Parkinsona lub choroba Alzheimera [217]. Podstawowym elementem pozwalającym

na wprowadzenie skutecznego leczenia niedokrwistości jest ustalenie stężenia

ferrytyny w surowicy. Niedobór żelaza występuje przy stężeniu tego białka poniżej

2 µgdL-1

. Jednak przy stanach zapalnych nerek stężenie ferrytyny w osoczu wzrasta

i jest niezależne od ilości żelaza w surowicy. U osób z chorobą nerek niedobór żelaza

występuje, gdy ilość ferrytyny spada poniżej 10 µgdL-1

[218]. Przyjmuje się, że

prawidłowe stężenie żelaza występuje w przypadku, kiedy stężenie ferrytyny

w surowicy krwi mieści się w przedziale od 10 do 40 µgdL-1

[219]. Około 20%

całkowitej ilości żelaza zmagazynowane jest w ferrytynie. Synteza tego białka

wzrasta wraz ze wzrostem stężenia żelaza w organizmie [220]. Stężenie ferrytyny

w surowicy mężczyzn jest wyższe niż stężenie tego białka u kobiet [221]. Niższe

stężenie ferrytyny u kobiet prawdopodobnie związane jest z regularną utratą krwi

podczas miesiączki [222]. Wzrost stężenia żelaza, które zmagazynowane jest

w łańcuchach lekkich ferrytyny może prowadzić do peroksydacji lipidów, co

w konsekwencji powoduje zmiany miażdżycowe [223]. Wzrost stężenia ferrytyny

związany jest ze zwiększonym ryzykiem chorób sercowo-naczyniowych [224], np.


59

wzrost ilości tego białka u mężczyzn powoduje większe ryzyko zawału serca

w porównaniu do osób, u których stężenie ferrytyny było dużo niższe [225].

Wchłanianie żelaza, magazynowanie i przechowywanie przez ferrytynę może

stanowić informację przydatną w projektowaniu nowych środków terapeutycznych

opartych na metabolizmie żelaza [226]. Białko to, z uwagi na swoje unikalne

właściwości i możliwość zmian struktury w zależności od wartości pH może być

zastosowane, jako potencjalny nośnik leków przeciwnowotworowych, takich jak np.

cis-platyna [227]. Ferrytyna znalazła również zastosowanie w obrazowaniu metodą

rezonansu magnetycznego oraz w terapii radiofarmaceutykami [226]. Możliwości

zastosowania ferrytyny ilustruje rysunek 20.

Rysunek 20. Potencjalne możliwości zastosowania ferrytyny [228].

4.3. Metody oznaczania zawartości białek w płynach

ustrojowych

Z uwagi na fakt, że białka odgrywają niezwykle istotną rolę w każdym

organizmie, określenie zmian ich stężenia w płynach ustrojowych jest niezwykle

ważne. Istnieje wiele metod wykrywania i oznaczania stężenia białek (w tym

metaloprotein), które różnią się między sobą zakresem detekcji, czułością

i selektywnością. Do ilościowej analizy białek w płynach ustrojowych wykorzystuje

się najczęściej następujące techniki: immunonefelometrię, immunoturbidymetrię, test

ELISA, immunodyfuzję radialną, immunoelektroforezę, technikę Western Blot oraz

metody spektroskopowe. Zdecydowanie rzadziej używa się w tym celu technik

elektrochemicznych.

FERRYTYNA

MEDYCYNA URZĄDZENIAELERKTRONICZNE

MRI

SYSTEMY DOSTARCZANIA

LEKÓW

DIAGNOSTYKA BIOSENSORY

TRANZYSTOR POLOWY

URZĄDZENIA

PAMIĘCI


60

Metody immunoturbidymetryczne oraz immunonefelometryczne oparte są na

pomiarze zmian rozproszenia wiązki światła przechodzącej przez roztwór

zawierający badane białko oraz przeciwciało. W wyniku specyficznej reakcji białka

z przeciwciałem następuje utworzenie kompleksu antygen (białko)przeciwciało,

w wyniku czego roztwór ulega zmętnieniu, powodując większe rozproszenie wiązki

światła, niż w przypadku roztworów zawierających sam antygen lub tylko

przeciwciało [229]. Oznaczenie ilości białka opiera się na założeniu, że natężenie

światła rozproszonego jest wprost proporcjonalne do stężenia białka w analizowanej

próbce. Założenie to jest jednak prawdziwe wyłącznie w przypadku rozcieńczonych

roztworów, w których nie występuje możliwość całkowitego rozproszenia wiązki

światła przez duże stężenie cząsteczek znajdujących się blisko źródła światła, co

uniemożliwiałoby pomiar w głębi roztworu. Duże stężenie cząsteczek koloidu może

również powodować uzyskiwanie zaniżonych ilości białka [229]. W metodzie

immunoturbidymetrycznej w wyniku tworzenia się kompleksów

antygenprzeciwciało zwiększa się przenikalność wiązki światła przez roztwór, która

związana jest z ilością białka w próbce [230]. W technice tej detektor umieszczony

jest na wprost wiązki światła, podczas gdy w metodzie immunonefelometrycznej

detektor znajduje się pod kątem 90° w stosunku do wiązki światła.

W przeciwieństwie do immunoturbidymetrii detekcja w immunonefelometrii opiera

się na pomiarze światła rozproszonego [229]. Schematycznie zasadę pomiaru

w technice immunoturbidymetrycznej oraz immunonefelometrycznej ilustruje

rysunek 21.

Rysunek 21. Schemat układu pomiarowego do detekcji białek w metodzie immunoturbidy-

metrycznej i immunonefelometrycznej.

Test Elisa stosowany jest do wykrywania konkretnych białek w próbce

z użyciem przeciwciał mono- lub poliklonalnych, połączonych z enzymem. Odmianą

IMMUNOTURBIDYMETRIA IMMUNONEFELOMETRIA

ŹRÓDŁO ŚWIATŁAFOTODETEKTOR

FOTODETEKTOR

ŹRÓDŁO ŚWIATŁA

90


61

tej metody jest test podwójnego wiązania, zwany „Sandwich ELISA” lub też

„kanapkowa ELISA”. Test ten można wykonać metodą bezpośrednią lub pośrednią.

W metodzie bezpośredniej wykrywanie badanego białka odbywa się przy użyciu

jednego przeciwciała wyznakowanego enzymem. W metodzie pośredniej używa się

natomiast zarówno przeciwciał pierwszo-, jak i drugorzędowych. Znakuje się

wówczas przeciwciało drugorzędowe, które wiąże się z pierwszorzędowym

przeciwciałem wykrywającym dany antygen [231]. Zaletą zastosowania metody

pośredniej jest brak konieczności znakowania specyficznych przeciwciał względem

danego antygenu, dzięki czemu możliwe jest wykorzystanie różnych

pierwszorzędowych przeciwciał, co pozwala na szybszy pomiar i mniejsze koszty

analizy. Przeciwciała pierwszorzędowe związane z antygenem wykrywane są

następnie za pomocą zawsze tych samych znakowanych przeciwciał

drugorzędowych [232], co schematycznie ilustruje rysunek 22.

BEZPOŚREDNI TEST ELISA POŚREDNITEST ELISA

przeciwciało antygen znacznik

Rysunek 22. Schemat postępowania w teście Elisa wykorzystywanym do bezpośredniej

i pośredniej detekcji białek.

Kolejną techniką analityczną do oznaczania białek jest metoda

immunodyfuzji, której zasada działania opiera się na procesie tworzenia się

immunoprecypitatów w żelu agarowym lub agarozowym, w wyniku reakcji między

antygenem i specyficznym w stosunku do niego przeciwciałem. Istnieje kilka odmian

tej techniki, które różnią się między sobą ilością dyfundujących reagentów.

W metodzie immunodyfuzji jeden z reagentów może być związany z żelem,

natomiast drugi może dyfundować w żelu lub też oba reagenty mogą przemieszczać

się w żelu agarozowym [233]. Jedną z odmian immunodyfuzji jest technika


62

immunodyfuzji radialnej, zwana również testem Mancini, która służy do oznaczania

stężenia antygenu w próbce. Metoda ta opiera się na oddziaływaniu przeciwciała

umieszczonego w żelu agarozowym z roztworem zawierającym oznaczane białko

[234], w wyniku czego tworzy się nierozpuszczalny kompleks

antygenprzeciwciało, który widoczny jest w postaci tzw. pierścienia

precypitacyjnego [229]. Oznaczanie stężenia białka opiera się na pomiarach średnicy

utworzonego pierścienia precypitacyjnego, który jest wprost proporcjonalny do ilości

oznaczanego białka [235].

Z kolei technika immunoelektroforezy pozwala na określenie stężenia białek

w surowicy krwi i jest połączeniem techniki elektroforezy i immunodyfuzji [236].

Metoda ta opiera się na rozdziale białek na podstawie ich wielkości i ruchliwości

w żelu agarozowym pod wpływem pola elektrycznego. Mieszaninę specyficznych

dla białek przeciwciał umieszcza się w agarze i obserwuje się ich migrację

w kierunku określonych białek. W wyniku tworzenia kompleksu

antygenprzeciwciało powstają charakterystyczne linie związane z wytworzeniem

się osadu pochodzącego od utworzonego kompleksu [237].

Technika Western Blot, inaczej zwana również immunoblottingiem, jest

stosowana do identyfikacji poszczególnych białek ze złożonej mieszaniny [238].

Technika ta oparta jest na trzech elementach: rozdzieleniu białek według ich

wielkości, przeniesieniu ich na podłoże stałe oraz oznaczeniu białka docelowego za

pomocą odpowiedniego przeciwciała. W technice tej białka oddziela się od siebie

w oparciu o ich masę cząsteczkową [239]. Rozdzielanie białek prowadzi się za

pomocą elektroforezy w żelu, czyli pod wpływem pola elektrycznego. Białka o dużej

masie cząsteczkowej rozdzielane są na żelach charakteryzujących się niższą

gęstością, niż w przypadku białek o mniejszej masie cząsteczkowej. Ujemnie

naładowane białka pod wpływem pola elektrycznego wędrują w kierunku elektrody

o ładunku dodatnim. Początkowo odpowiednia ilość próbki rozcieńczana jest za

pomocą odpowiedniego buforu zawierającego glicerynę i następnie próbka jest

podgrzewana. W wyniku tych procesów następuje przecinanie mostków

disiarczkowych, co prowadzi do denaturacji drugorzędowej struktury białka. Ma to

na celu ograniczenie szybszej wędrówki białek o dużej masie cząsteczkowej,

charakteryzujących się bardziej zwartą strukturą w przeciwieństwie do lżejszych

białek, o rozluźnionej strukturze [239]. Po rozdzieleniu elektroforetycznym białka

przenoszone są z żelu na specjalną membranę pod wpływem prądu elektrycznego


63

[240], na której następuje proces migracji białek w kierunku dodatnio naładowanej

elektrody. Następnie białka ulegają zatrzymaniu na membranie znajdującej się za

żelem agarozowym [241]. Po przeniesieniu na membranę widoczny jest obraz

rozdzielonych w żelu białek. W celu zablokowania niespecyficznego wiązania

przeciwciała z membraną stosuje się środki blokujące. Z uwagi na cenę i dostępność

najczęściej stosowanym środkiem tego typu jest rozcieńczone, odtłuszczone mleko.

Po wysyceniu membrany stosuje się przeciwciało pierwszorzędowe, które wykazuje

powinowactwo do danego białka. Po tym etapie następuje odmycie nadmiaru

przeciwciała pierwszorzędowego, a w kolejnym etapie dodaje się przeciwciała

drugorzędowe, które mogą być znakowane radioaktywnie lub enzymem, np.

peroksydazą chrzanową, która wywołuje reakcję barwną [242]. Schemat działania

metody Western Blot przedstawiony został na rysunku 23.

-

+BUFORBUFOR

ŻEL

MEMBRANA

BIBUŁA

GĄBKA

BIBUŁA

GĄBKA

Rysunek 23. Schemat układu pomiarowego w metodzie Western Blot. Rysunek zmodyfikowany

w oparciu o [243].

Oznaczenia stężenia białek można dokonać również za pomocą metod

spektrofotometrycznych. Najbardziej popularną metodą spektroskopową jest pomiar

absorbancji w ultrafiolecie, przy długości fali 280 nm. Przy badanej długości fali

światło pochłaniane jest przez aminokwasy aromatyczne występujące w białkach.

W celu dokonania oznaczenia wykonuje się pomiary zarówno przy długości fali

280 nm, jak również przy ok. 260 nm. Stosunek absorbancji przy wspomnianych

długościach fali (A280 : A260) określany jest za pomocą litery F, której wartości są

stałe i stabelaryzowane. Stężenie białka uzyskuje się poprzez pomnożenie wartości F

i wartości absorbancji przy 280 nm [244]. W technice tej ilościowemu oznaczaniu

białek przeszkadzają obecne w próbce kwasy nukleinowe. Kolejną metodą

wykorzystywaną w oznaczaniu metaloprotein jest metoda Bradford’a, w której

następuje wiązanie białka z barwnikiem Coomassie Brillant Blue [245]. Po


64

związaniu się oznaczanego białka z barwnikiem zachodzi zmiana barwy roztworu,

a pomiar oparty jest na pomiarze absorbancji przy długości fali 595 nm. Natężenie

barwy roztworu jest wprost proporcjonalne do ilości białka w badanej próbce [245].

Większość opisanych powyżej metod niestety wykorzystuje często toksyczne

i rakotwórcze substancje, które są trudne do utylizacji. Charakteryzują się one

również dość niską czułością, są stosunkowo drogie oraz często wymagają

wcześniejszego przetworzenia próbki do pomiaru, co znacznie wydłuża czas analizy

[246]. Dobrą alternatywą dla powszechnie stosowanych technik w analizie klinicznej

białek są metody elektrochemiczne. Metody te można zastosować jedynie

w przypadku białek wykazujących elektroaktywność. Problematyka transportu

elektronów pomiędzy elektrodą a elektroaktywnym białkiem przedstawiona została

w rozdziale 5.

Elektroaktywność metaloprotein

65

5. Elektroaktywność metaloprotein

Transport elektronów w układach biologicznych jest jednym z najczęściej

badanych zjawisk w ciągu ostatnich 25 lat, obejmującym zagadnienia z pogranicza

biologii i elektrochemii [247]. Obecność jonów metali w strukturze metaloprotein

sprawia, że białka te są elektroaktywne, czyli mogą wymieniać elektrony z elektrodą

na drodze procesu elektroredukcji i/lub elektroutleniania. Poznanie procesu

transportu elektronów w tego typu układach oraz jego kontrola są bardzo ważne,

z uwagi na bardzo szeroki wachlarz zastosowań metaloprotein. Związki te biorą

udział w procesach metabolicznych, fotosyntezie, oddychaniu, jak również są one

ważnym elementem w bioogniwach paliwowych, urządzeniach elektronicznych,

biochipach, czy też w biosensorach [248]. Jednakże uzyskanie dobrze

wykształconych sygnałów prądowych pochodzących od metaloproteiny jest wciąż

dużym wyzwaniem dla elektrochemików. Białka nie ulegają łatwo reakcjom redoks

na powierzchni elektrody, ponieważ ich centra elektroaktywne są głęboko osadzone

w otoczce białkowej, co zdecydowanie utrudnia proces wymiany elektronów

pomiędzy elektrodą a białkiem [249]. Zatem ważną rolę w procesie elektroutleniania

lub elektroredukcji białka odgrywa jego orientacja względem powierzchni elektrody,

a ściślej mówiąc odległość centrum aktywnego od powierzchni materiału

przewodzącego. Niestety, bezpośrednia adsorpcja białka na powierzchni materiału

przewodzącego może doprowadzić do uszkodzenia jego wyższorzędowych struktur,

prowadząc jednocześnie do jego denaturacji, a tym samym do utraty aktywności

katalitycznej, czy też elektrochemicznej białka. Powstałe w tym procesie produkty

denaturacji białka utrudniają lub wręcz uniemożliwiają komunikację między

centrami elektroaktywnymi a powierzchnią elektrody [250].

5.1. Sposoby transportu elektronów pomiędzy

metaloproteiną a powierzchnią elektrody

Struktura metaloprotein, których znaczną część stanowią enzymy, generalnie

składa się z dwóch części: (i) miejsca biokatalitycznego, czyli apoenzymu służącego

do rozpoznania substratu oraz (ii) centrum elektrokatalitycznego, czyli grupy

prostetycznej, w której następuje przeniesienie elektronów. Z uwagi na budowę


66

metaloprotein wyróżnia się dwa mechanizmy transportu elektronów pomiędzy takimi

związkami a powierzchnią elektrody: bezpośredni transport elektronów (DET; z ang.

direct electron transfer) oraz transport elektronów z udziałem mediatora (MET;

z ang. mediated electron transfer) [251]. Podczas bezpośredniej wymiany

elektronów z powierzchnią elektrody grupa prostetyczna lub centrum redoks

metaloproteiny ulega zmianom konformacyjnym. Natomiast w przypadku białek,

w których ten sam fragment struktury pełni zarówno rolę bio- i elektrokatalityczną

transport elektronów odbywa się zazwyczaj za pomocą rozpuszczonej w roztworze

substancji redoks, zwanej mediatorem [252]. W celu zwiększenia efektywności

katalitycznej metaloproteiny (głównie enzymu) względem danego substratu bardzo

często unieruchamia się kilka enzymów na wybranej powierzchni (np. niebieskie

oksydazy mulitimiedziowe: lakaza, ceruloplazmina, oksydaza askorbinianowa czy

oksydaza bilirubiny) katalizujących ten sam proces. Należy jednak pamiętać, że

bardzo często wiąże się to z koniecznością wprowadzenia do układu kilku różnych

mediatorów charakterystycznych dla danego enzymu, co zdecydowanie komplikuje

układ [252]. Schemat transportu elektronów w funkcji liczby enzymów

unieruchomionych na danej powierzchni ilustruje rysunek 24.

P

S

E1 E2 E3

E4

Ee- e- e- e- e-

M1 M2 M3

M4S

P

Rysunek 24. Schemat transportu elektronów w zależności od ilości unieruchomionych na

powierzchni elektrody enzymów. S oznacza substrat, P – produkt, En – enzym, Mn – mediator

charakterystyczny dla danego enzymu, e- – elektron [252].

Zgodnie z teorią Marcusa [253] kinetyka przeniesienia elektronu pomiędzy dwoma

substancjami redoks określona jest za pomocą siły napędowej (czyli różnicy

potencjałów), energii reorganizacji oraz odległości pomiędzy dwoma centrami

redoks. Oczywiste jest, że odległość pomiędzy grupą prostetyczną metaloproteiny

a powierzchnią elektrody jest raczej dość duża ze względu na występowanie otoczki

białkowej, co powoduje, że bezpośredni transport elektronów na drodze tunelowania

jest rzadko spotykany. Dodatkowo, trudno jest jednoznacznie wyznaczyć granicę


67

pomiędzy bezpośrednim transportem elektronów a transportem elektronów

z użyciem mediatora [251]. W tabeli 2 zestawiono przykłady woltamperometrycznej

detekcji metaloprotein, których dotyczy niniejsza rozprawa doktorska, wraz

z najważniejszymi parametrami analitycznymi.

Tabela 2. Wybrane elektrochemiczne sposoby detekcji hemoglobiny, ceruloplazminy, transferyny

oraz ferrytyny.

Technika

pomiarowa Typ detekcji

Zakres

liniowości

[g·dL-1

]

Granica

wykrywalności

[g·dL-1

]

Hemoglobina

(Hb)

CV [254] DET (2.4 ÷ 50.9)·10-3

6.2·10-4

AdSV [255] DET (6.7 ÷ 335)·10-5

3.2·10-4

DPV [256] MET

(Fe(CN)63-/4-

) 1·10

-14 ÷ 1·10

-3 7.8·10

-14

Ceruloplazmina

(Cp)

QCM [257] DET (3.1 ÷ 270)·10-5

1.5·10-5

DPV [258] DET (0.1 ÷ 1000)·10-4

4.0·10-6

ChA [259] MET

(HQ, H2O2) (0.07 ÷ 250)·10

-4 2.1·10

-6

Transferyna

(Tf)

pomiar Cp

[260] DET (1.3 ÷ 80)·10

-7 1.2·10

-8

ChA [261] MET

(HQDP) (1.0 ÷ 6.0)·10

-5 6.2·10

-6

EIS (Cp)

[262]

MET

(Fe(CN)63-/4-

) (1.0 ÷ 100)·10

-7 1.5·10

-8

Ferrytyna

(Ft)

DPV [263] DET (5.0 ÷ 50.0)·10-6

1.5 10-6

DPV [264] MET

(Fe(CN)63-/4-

) (0.2 ÷ 5.0)·10

-5 7.0·10

-7

DPSV [265] DET (2.0 ÷ 23.4)·10-7

6.5·10-8

AdSV – adsorpcyjna woltamperometria stripingowa; ChA – chronoamperometria; CV – woltamperometria

cykliczna; Cp – pojemność warstwy podwójnej; DPSV – stripingowa woltamperometria pulsowa różnicowa;

DPV – woltamperometria pulsowa różnicowa; EIS – elektrochemiczna spektroskopia impedancyjna;

HQ – hydrochinon; HQDP – fosforan(V) hydrochinonu

5.1.1. Bezpośredni transport elektronów

Najprostszym i najbardziej pożądanym procesem transportu elektronów

pomiędzy metaloproteiną a elektrodą jest ich bezpośrednia wymiana [266], co

schematycznie przedstawia rysunek 25.


68

Rysunek 25. Bezpośredni transport elektronów w oparciu o [267].

W celu uzyskania bezpośredniego transportu elektronów konieczne jest właściwe

unieruchomienie białka na powierzchni elektrody tak, aby odległość centrum

elektroaktywnego tego związku od powierzchni elektrody była możliwie jak

najmniejsza [268]. Zatem cząsteczki muszą posiadać odpowiednią orientację,

gwarantującą najmniejszą odległość pomiędzy grupą prostetyczną metaloproteiny

a materiałem przewodzącym [248]. Jak już wcześniej wspomniano, w przypadku

unieruchomienia metaloproteiny na niezmodyfikowanej elektrodzie, zwłaszcza

metalicznej, bardzo trudno jest osiągnąć bezpośredni transport elektronów, z uwagi

na niewłaściwą orientację białka oraz możliwy proces jego denaturacji [269], co

w konsekwencji blokuje wymianę elektronów pomiędzy centrum redoks białka

a elektrodą [270]. W celu uniknięcia denaturacji i/lub deaktywacji metaloproteiny

powierzchnię elektrody pokrywa się różnego typu modyfikatorami [271], które

wpływają zarówno na orientację unieruchamianej za ich pośrednictwem

metaloproteiny, jak również zabezpieczają elektrodę przed utratą jej właściwości

przewodzących [272]. Najczęściej w roli tego typu modyfikatorów powierzchni

elektrody, umożliwiających kontrolę orientacji metaloproteiny, wykorzystuje się

samoorganizujące się monowarstwy tiolowe zawierające odpowiednie grupy

funkcyjne (np. COOH; NH2) [273], polimery przewodzące [274], czy też

nanomateriały [275], takie jak: nanocząstki złota [276] oraz nanorurki węglowe

[277]. Schematycznie wpływ procesu unieruchomienia metaloproteiny na

efektywność transportu elektronów ilustruje rysunek 26.

SUBSTRAT PRODUKT

e-


69

centrum

elektroaktywne

e

centrum

elektroaktywne

Rysunek 26. Wpływ orientacji białka na efektywność transportu elektronów do powierzchni

elektrody [248].

Pierwsze doniesienia literaturowe na temat bezpośredniego transportu

elektronów pomiędzy elektroaktywnym białkiem a elektrodą pojawiły się ponad 30

lat temu [278]. Obecnie w literaturze opisanych jest około 40 białek, dla których

możliwa jest obserwacja DET, są to m.in. lakaza [252], cytochrom c [251],

hemoglobina [279], czy ceruloplazmina [280]. Przykład cyklicznej krzywej

woltamperometrycznej ilustrującej proces bezpośredniego transportu elektronów dla

hemoglobiny unieruchomionej na węglowej elektrodzie drukowanej (SPCE)

zmodyfikowanej nanokompozytem (MHAMS@FIOMNs) ilustruje rysunek 27.

11

6

1

-4

-9

-14-0.7 -0.5 -0.3 -0.1

I / m

A

E / V

Rysunek 27. Cykliczne krzywe woltamperometryczne zarejestrowane w 0.1 M buforze

fosforanowym o pH 7.0 dla elektrody zmodyfikowanej nanokompozytem i hemoglobiną

SPCE/FIONs@MHAMS-Hb, dla różnych szybkości polaryzacji elektrody: 20, 50, 100, 150 oraz

200 mV·s-1

[281].


70

SUBSTRAT PRODUKT

DYFUZJA DYFUZJA

+e-

MEDIATOR

(forma red.)

MEDIATOR

(forma ox.)

5.1.2. Transport elektronów z wykorzystaniem mediatora

Bardzo często unieruchomienie metaloproteiny we właściwej orientacji

(korzystnej dla bezpośredniego przeniesienia elektronu) na powierzchni elektrody

jest trudne do osiągnięcia. Wówczas w celu poprawy przewodnictwa ładunku

w badanym układzie stosuje się mediatory, czyli związki redoks, których rolą jest

pośredniczenie w transporcie elektronów [282]. Mechanizm transportu elektronów

pomiędzy metaloproteiną a powierzchnią elektrody z użyciem mediatora przedstawia

rysunek 28.

Rysunek 28. Transport elektronów z użyciem mediatora w oparciu o [267].

Związek pełniący rolę mediatora musi być przede wszystkim stabilny oraz

szybko i odwracalnie ulegać procesom elektroutlenienia i elektroredukcji [283].

Ponadto powinien on szybko i odwracalnie reagować z białkiem i być odporny na

zmiany pH roztworu [282]. Substancja pełniąca rolę mediatora powinna także

szybko dyfundować przez kanały znajdujące się w białku, co w konsekwencji

pozwala na efektywny transport elektronów z centrum elektroaktywnego białka do

elektrody [284]. Transport elektronów z wykorzystaniem mediatora może być typu

homogenicznego lub heterogenicznego. Homogeniczne przeniesienie elektronów ma

miejsce w sytuacji, gdy zarówno mediator, jak i białko znajdują się w jednej fazie

i mogą swobodnie dyfundować w roztworze [252]. W przypadku heterogenicznego

transportu elektronów jedna z substancji, mediator lub metaloproteina,


71

unieruchomiona jest na powierzchni elektrody, natomiast druga znajduje się

w roztworze [282].

Niezbędnym warunkiem szybkiego transportu elektronów w MET jest

utrzymanie komunikacji pomiędzy mediatorem a białkiem. Jeśli mediator obecny

jest na powierzchni elektrody, nie zaś w roztworze, wówczas trwałość takiego

połączenia jest niezwykle istotna. Aby uzyskać trwałe połączenie mediatora

z powierzchnią materiału przewodzącego zazwyczaj wprowadza się go przy udziale

takich substancji, jak: pasta węglowa, związki koloidalne, materiały kompozytowe,

hydrożele, czy też polimery przewodzące [252]. Należy jednak podkreślić, że

w układach biologicznych pożądanym procesem transportu elektronów jest

bezpośrednia ich wymiana pomiędzy centrum elektroaktywnym metaloproteiny

a elektrodą. Brak mediatora w układzie zdecydowanie zwiększa selektywność

procesu wymiany elektronów, w wyniku zmniejszenia jego podatności na zakłócenia

oraz uproszczenia zapisu równania chemicznego, w porównaniu do sytuacji

z użyciem mediatora [278]. Z drugiej strony, obecność mediatora może potencjalnie

zwiększyć maksymalną szybkość transportu elektronów. Dodatkowo, dzięki

zastosowaniu mediatorów metaloproteina nie musi być w bezpośrednim kontakcie

z elektrodą, przez co zmniejsza się ryzyko procesu denaturacji białka.

W przypadku elektrochemicznej detekcji białek stosuje się wiele różnych

mediatorów redoks, różniących się liczbą przenoszonych elektronów oraz

wartościami potencjałów redoks. Przykładowo do oznaczania transferyny zazwyczaj

stosuje się takie mediatory, jak wiologen metylu [285], czy też barwniki cyjankowe

[286], natomiast dla ceruloplazminy mediatorami mogą być: hydroksyacetanilid,

hydroksybenzotriazol oraz kwas wiolurowy [287], Z kolei dla ferrytyny są to:

fenosafranina, indygokarmin, jak również błękit metylenowy [288]. Jeśli chodzi

o hemoglobinę często spotykanymi mediatorami są błękit metylenowy, metosiarczan

fenazyny oraz tionina [289], dzięki którym obserwuje się odwracalne sygnały

redoks, które zmieniają intensywność wraz z dodatkiem do roztworu oznaczanego

białka. Przykładowa krzywa zarejestrowana dla błękitu metylenowego, w obecności

hemoglobiny rozpuszczonej w roztworze przedstawiona została na rysunku 29.


72

Rysunek 29. Cykliczne krzywe woltamperometryczne uzyskane w 0.1 M buforze PBS (pH=7.0)

dla odpowiednio zmodyfikowanych elektrod: GC/MWNTs (linia przerywana), GC/MWNTs+Hb

(linia kropkowana), GC/MWNTs-MB (linia ciągła) i GC/MWNTs-MB+Hb (pogrubiona linia

ciągła) przy szybkości polaryzacji elektrody 100 mV·s-1

[290]. MWNTs – wielościenne nanorurki

węglowe.

5.1.3. Sposoby unieruchamiania białek na wybranej powierzchni

i ich konsekwencje

Metaloproteiny, jak i pozostałe białka, są zazwyczaj mało stabilne w czasie,

a ich żywotność jest ograniczona. Zatem z punktu widzenia ich potencjalnego

zastosowania w różnego typu układach bardzo istotne jest zachowanie ich trwałości

przez długi okres czasu [291]. Unieruchomienie metaloprotein na stałych matrycach

jest skuteczną metodą utrzymania ich stabilności i żywotności. W ten sposób białka

chronione są przed negatywnym wpływem warunków zewnętrznych, takich jak:

zmiany pH środowiska, zmiany temperatury, rozpuszczalniki organiczne

i toksykanty [292]. Ponadto unieruchomienie metaloproteiny na powierzchni

matrycy pozwala na uzyskanie jej wysokiego stężenia na powierzchni elektrody oraz

zwiększa możliwość jej ponownego użycia [252]. Należy jednak pamiętać, że proces

ten ma swoje konsekwencje, mianowicie w wyniku kontaktu metaloproteiny

z wybraną matrycą może dojść do zmiany jej konformacji, czy też zakotwiczenie

nastąpi w niekorzystnej orientacji. Co więcej, jeśli połączenie metaloproteiny

z wybranym podłożem nie jest trwałe, to jej orientacja względem podłoża może

ulegać zmianie w czasie. Zarówno odpowiednie ustawienie cząsteczki

1.5

0.0

-1.5

-3.0

-4.5

E vs (Ag/AgCl) / V

I / m

A

GC/MWNTs-MBGC/MWNTs-MB + Hb

GC/MWNTs + HbGC/MWNTs

-0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2


73

metaloproteiny względem wybranej powierzchni, jak i jej konformacja są gwarantem

zachowania jej naturalnych funkcji, a także w przypadku białek elektroaktywnych

decydują o mechanizmie transportu elektronów pomiędzy taką cząsteczką

a powierzchnią elektrody.

Ilość unieruchamianego białka, szybkość przebiegu tego procesu oraz

stabilność formowanej warstwy zależą od: fizycznej charakterystyki białek

(rozmiaru, elastyczności, ładunku), morfologii matrycy, na której następuje

osadzanie białka i środowiska, w którym zachodzi ten proces [293,294]. Proces

wiązania białka z wybraną matrycą następuje zasadniczo w trzech etapach, które

występują w różnej skali czasowej [295]. Pierwszym krokiem jest dyfuzja cząsteczek

metaloproteiny z głębi roztworu do powierzchni matrycy. Następnie białko ulega

związaniu z matrycą, a w końcowym etapie może nastąpić zmiana orientacji oraz

konformacji białka w czasie [296]. Ilość zmian konformacyjnych unieruchomionego

białka zależna jest od stabilności jego struktury. Białka posiadające wysoką

stabilność znacznie rzadziej ulegają zmianom konformacyjnym w porównaniu do

mniej stabilnych białek, u których zmiany konformacyjne mogą być znaczne i mogą

nawet prowadzić do utraty ich aktywności biologicznej. Istnieją jednak przypadki,

gdy zmiana konformacyjna wzmacnia funkcjonalność metaloprotein, jednak jest to

niezwykle rzadkie zjawisko. Na ilość unieruchamianego białka ma wpływ charakter

materiału, na którym następuje ten proces. W przypadku hydrofobowych matryc

występuje silniejsze związanie cząsteczek białka niż dla matryc o właściwościach

hydrofilowych, co wpływa na większą ilość zaadsorbowanych cząsteczek

metaloprotein na powierzchni elektrody [297,298]. Możliwe zmiany orientacji oraz

konformacji białka po jego unieruchomieniu na powierzchni elektrody

schematycznie ilustruje rysunek 30.

ZMIANA KONFORMACJI

czas

ZMIANA ORIENTACJI

Rysunek 30. Zmiany orientacji oraz konformacji białka w czasie [296].


74

Informacja na temat zmian strukturalnych metaloprotein w wyniku kontaktu

z wybranym podłożem jest niezwykle ważna z punktu widzenia ich potencjalnych

biotechnologicznych zastosowań. Zmiany konformacyjne białka zachodzące podczas

procesu jego unieruchamiania na powierzchni wybranej matrycy można badać za

pomocą wielu metod, do których zalicza się: spektroskopię Ramana, spektroskopię

w podczerwieni (IR), spektroskopię w podczerwieni z transformacją Fouriera

(FTIR), spektroskopię UV-Vis, dichroizm kołowy (CD), fluorescencję oraz

powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) [299].

W zależności od charakteru matrycy, stabilności biocząsteczki i jej

właściwości stosuje się różne metody unieruchamiania białek, do których zalicza się:

adsorpcję fizyczną, wiązanie kowalencyjne, pułapkowanie, sieciowanie

i oddziaływanie na zasadzie powinowactwa [252,300]. Wybierając odpowiedni

sposób modyfikacji matrycy białkiem należy wziąć pod uwagę takie czynniki, jak:

utrzymanie aktywności białka, odporność na zmiany czynników fizykochemicznych,

czas życia białka, jego preferowaną orientację i konformację [292]. Modyfikacja

chemiczna powierzchni elektrody zdecydowanie zwiększa stabilność białka oraz

wprowadza możliwość kontroli jego orientacji i gęstości upakowania [301]. Sposoby

unieruchamiania białek na wybranej powierzchni schematycznie ilustruje rysunek

31.

ADSORPCJAFIZYCZNA WIĄZANIEKOWALENCYJNE POWINOWACTWO

PUŁAPKOWANIE SIECIOWANIE

Rysunek 31. Metody unieruchamiania białek na powierzchni elektrody [252].

W przypadku fizycznej adsorpcji wiązanie białka z daną powierzchnią jest

stosunkowo słabe i z reguły nie prowadzi do zmian konformacyjnych cząsteczki

metaloproteiny [302]. Dodatkowo, niemożliwe jest uzyskanie identycznej orientacji

wszystkich unieruchomionych cząsteczek, dlatego też bardzo często powierzchnię


75

matrycy modyfikuje się różnego typu związkami ułatwiającymi kontrolę orientacji

unieruchamianego białka. Z uwagi na rozwiniętą powierzchnię właściwą oraz

wysoką chemiczną i termiczną stabilność, dużą popularnością cieszą się materiały na

bazie węgla, którymi może być sadza, grafit, włókna węglowe oraz różnego typu

nanostruktury węglowe [252]. Modyfikacja elektrody nanostrukturami, takimi jak

nanocząstki, nanowłókna, nanodziury, nanorurki czy też nanokompozyty, na ogół

prowadzi do wyższej gęstości prądu spowodowanej większym upakowaniem białka

na elektrodzie. Tego typu nanostruktury mogą przedłużać także żywotność białka,

zwiększać jego stabilność oraz aktywność. Umieszczenie nanostruktur w innych

materiałach (np.: polimery, żele) może prowadzić do poprawy ich właściwości

[303-305]. Z uwagi na niepowtarzalne właściwości chemiczne i fizyczne szeroko

badane są również nanocząstki metali. Struktury te zazwyczaj oparte są na złocie,

srebrze czy platynie [306,307] oraz na tlenkach metali, np. tlenku żelaza [308].

Popularność tego typu materiałów związana jest z możliwością łatwej kontroli ich

rozmiarów oraz powstawaniem dobrze zdefiniowanych struktur [309]. Szczególną

grupę nanstruktur stanowią nanocząstki magnetyczne, które charakteryzują się

wysoką zdolnością wiązania białek, w szczególności paramagnetycznych

metaloprotein. Dodatkowo, można je łatwo wyodrębnić z mieszaniny reakcyjnej za

pomocą magnesu [308].

Ostatnio dużo uwagi poświęca się cieczom jonowym, które posiadają wysoką

lepkość, hydrofobowość, strukturę jonową, charakteryzują się również

przewodnictwem jonowym i biozgodnością [310]. Ciecze jonowe składają się

z anionów lub kationów i możliwe są różne kombinacje kationów lub anionów

organicznych z nieorganicznymi [311]. Jedną z najważniejszych zalet tego typu

modyfikatorów, w przypadku zastosowania w elektrochemicznych układach, jest

posiadanie przez te struktury szerokiego okna potencjałowego [310].

Jako modyfikatory elektrod wykorzystuje się również materiały polimerowe,

np. nafion, chitozan, polipirol, polianilinę, alkohol winylowy i wiele innych [252].

Użycie biokompatybilnych polimerów gwarantuje transport elektronów pomiędzy

białkiem a elektrodą oraz zachowanie katalitycznej funkcji badanych białek [312].

Elektrody modyfikuje się także za pomocą kompozytów, dzięki czemu możliwe jest

poprawienie własności fizycznych lub chemicznych poszczególnych składników.

Zazwyczaj stosuje się układy zol-żel z nanocząstkami lub polimery z materiałami

węglowymi. Mieszanina dwóch lub więcej związków może wpływać na aktywność


76

enzymatyczną białek, stabilność oraz szybkość transportu elektronów do elektrody

[313]. Struktury na bazie zol-żel są porowatymi matrycami polimerowymi

o zwiększonej powierzchni. Materiały te są biokompatybilne, dzięki czemu tworzą

stabilne środowisko dla prawidłowego funkcjonowania białek [314]. Stosuje się je do

pułapkowania białek wewnątrz ich struktury. Uważa się, że w celu efektywnej

adsorpcji metaloprotein wielkość porów powinna być podobna lub większa od

średnicy białek. Związek między wielkością porów i średnicą cząsteczki ma istotne

znaczenie, gdyż duży rozmiar porów zazwyczaj prowadzi do małej stabilności

białek. W stabilności układu ważną rolę odgrywa również ładunek wewnątrz porów.

W sytuacji, gdy ładunek ten jest przeciwny do ładunku białka, wówczas układ jest

stabilny, natomiast w przypadku ładunków jednoimiennych następuje odpychanie

między powierzchnią porów a białkiem. Kontrola ładunku możliwa jest poprzez

monitorowanie pH środowiska lub też poprzez modyfikację powierzchni porów

różnymi grupami funkcyjnymi, np. aminowymi lub karboksylowymi [315].

Kolejną metodą unieruchamiania metaloprotein jest kowalencyjne

przyłączenie białka do nośnika, np. polimeru syntetycznego, jak poliglikolu

etylenowego lub polimerów naturalnych – celulozy lub sacharozy [316]. Technika ta

pozwala na otrzymanie stabilnych układów, odpornych na podwyższoną temperaturę

[317]. Zazwyczaj kowalencyjne związanie metaloproteiny następuje poprzez grupę

karboksylową nośnika oraz grupę aminową białka, z użyciem karbodiimidu [316].

Zaletą zastosowania tego odczynnika jest jego dobra rozpuszczalność w wodzie,

dzięki czemu może być on bezpośrednio zastosowany w mieszaninie wodnej, bez

wstępnego rozpuszczania w związkach organicznych. W wyniku reakcji

karbodiimidu z grupami karboksylowymi wytwarza się reaktywny produkt pośredni,

którym jest acyloaminoester, który następnie reaguje z grupą aminową białka,

tworząc wiązanie amidowe [318]. Trwałe związanie białka z nośnikiem powoduje

usztywnienie konformacji białka, a tym samym zwiększa odporność na denaturację,

jednak sposób ten może prowadzić do nieodpowiedniej orientacji białka względem

elektrody i spowolnić proces transportu elektronów [316].

Atrakcyjnym podejściem wydaje się być również tworzenie

samoorganizujących się monowarstw (SAM) [319]. Warstwy takie są łatwe do

przygotowania, gdyż grupy -SH alkanotioli łatwo oddziałują z metaliczną

powierzchnią elektrody z wytworzeniem wiązania kowalencyjnego, a wolna grupa

funkcyjna znajdująca się na drugim końcu łańcucha węglowego jest zdolna do


77

przyłączenia cząsteczek białka [320]. Warstwy takie charakteryzują się wysoką

organizacją i jednorodnością. Dodatkowo, przy użyciu samoorganizujących się

monowarstw możliwe jest kontrolowanie długości łańcucha hydrofobowego, co

pozwala na pożądane zmiany właściwości warstwy [321].

Kolejną metodą unieruchamiania białek jest ich pułapkowanie w sieci

polimerowej. Technika ta polega na zmieszaniu monomeru lub polimeru

z roztworem metaloproteiny w obecności czynnika sieciującego. Warunki

zachodzenia polimeryzacji mogą niestety prowadzić do denaturacji białka [316].

Alternatywą tej metody jest stosowanie polimerów pochodzenia naturalnego, np.

agarozy lub żelatyny [322], lub też hydrożeli [323]. Sieciowanie białek polega na

utworzeniu wielu wiązań kowalencyjnych w trzech wymiarach pomiędzy

cząsteczkami białka z użyciem substancji sieciującej, którą może być aldehyd

glutarowy. Zastosowanie tej substancji związane jest z jej dużą stabilnością, niską

ceną oraz łagodnymi warunkami procesu sieciowania, jak również wysoką

wydajnością [322]. Metoda ta ma jednak pewne ograniczenia, gdyż często może

prowadzić do utraty aktywności białka oraz dodatkowo problemem jest stosunkowo

mała powtarzalność wyników [316].

Ostatnią z często wykorzystywanych metod wiązania białek jest

wykorzystanie powinowactwa danej substancji do unieruchamianego białka

i związanie go w sposób trwały z substancją [324]. Proces ten w określonych

warunkach może być odwracalny. Za pomocą metody powinowactwa otrzymuje się

korzystną orientację białka niezbędną do procesu przeniesienia elektronu.

Substancjami kowalencyjnie wiążącymi metaloproteiny są zazwyczaj przeciwciała

mono- lub polikolonalne [325].

Nanomateriały typu „rdzeń – powłoka”

79

6. Nanomateriały typu „rdzeń – powłoka”

Nanotechnologia jest obecnie jednym z najszybciej rozwijających się

obszarów nauki, który łączy w sobie różne dziedziny, takie jak: elektronika, chemia,

fizyka, biologia czy inżynieria materiałowa [326]. Unikalne właściwości

nanomateriałów związane są głównie z ich niezwykle małymi rozmiarami,

mieszczącymi się zazwyczaj w przedziale od 1 do 100 nm [327,328]. Dzięki

niezwykle małemu rozmiarowi, nanostruktury posiadają zupełnie odmienne

właściwości, w porównaniu do ich odpowiedników w skali „makro”. Zmiany

właściwości fizykochemicznych nanomateriałów są konsekwencją dwóch zjawisk:

(i) zwiększonego stosunku liczby atomów/jonów powierzchniowych lub

przypowierzchniowych względem liczby atomów zlokalizowanych wewnątrz

nanomateriału oraz (ii) kwantowego ograniczenia elektronów w cząstkach rozmiaru

„nano”. Charakterystyczną cechą tego typu materiałów jest przede wszystkim duża

powierzchnia właściwa cząstek, wysoka aktywność oraz tendencja do procesu

aglomeracji [329]. Z uwagi na swój niezwykle mały rozmiar, nanomateriały cieszą

się dużą popularnością w nowatorskich rozwiązaniach technologicznych

obejmujących takie dziedziny, jak: biotechnologia, farmacja, elektronika czy linie

produkcyjne w przemyśle. Nanomateriały odgrywają również znaczącą rolę

w zwalczaniu zanieczyszczeń i zagrożeń środowiska, umożliwiając zaawansowane

oczyszczanie wody i innych mediów z jonów metali ciężkich: Hg2+

, Pb2+

, Cd2+

[330]. Najbardziej popularne nanomateriały to: fulereny [331], nanorurki węglowe

[332], nanodruty [333], nanocząstki złota [334], srebra [335], jak również

nanocząstki typu rdzeń – powłoka (z ang. core – shell), do których zalicza się m.in.

kropki kwantowe [336], czy coraz bardziej popularne nanocząstki magnetyczne

(M Nps) [337].

Najlepiej poznanym i najszerzej opisanym przedstawicielem nanocząstek

magnetycznych są superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza – Fe3O4

(SPIONs). Liczne doniesienia literaturowe opisują skuteczne metody syntezy

stabilnych, biokompatybilnych, monodyspersyjnych oraz kontrolowanych kształtem

nanostruktur tlenku żelaza [338]. Najpopularniejsze metody obejmują

współstrącanie, rozkład termiczny, syntezy hydrotermalne, mikroemulsje, czy

syntezy sonochemiczne. Ponadto omawiane nanocząstki można również wytwarzać

innymi sposobami, takimi jak: synteza elektrochemiczna [339], technika pirolizy


80

laserowej [340], synteza bakteryjna (zwłaszcza bakterie żelaza redukującego) [341].

Niestety nanocząstki oparte na tlenku żelaza bardzo trudno jest uchronić przed

procesem nieodwracalnego utleniania w środowisku komórek [342], co z kolei

znacznie wpływa na wzrost toksyczności tego typu układów. Ogromnego znaczenia

nabiera tutaj tzw. kapsułkowanie nanocząstek magnetycznych, które prowadzi do

uzyskania różnych pod wzglądem stabilności, heterogennych układów typu „rdzeń –

powłoka”.

6.1. Nanocząstki magnetyczne typu „rdzeń – powłoka”

Nanocząstki magnetyczne typu „rdzeń – powłoka” składają się z co najmniej

dwóch faz, różniących się między sobą strukturą i składem chemicznym. Schemat

budowy nanocząstki typu „rdzeń – powłoka” przedstawia rysunek 32.

Rysunek 32. Schemat budowy nanocząstki typu „rdzeń – powłoka”.

Rdzeń takiej nanocząstki stanowi zazwyczaj substancja pochodzenia

nieorganicznego pokryta jedną lub kilkoma powłokami o odmiennym składzie

chemicznym. W zależności od potrzeb, właściwości rdzenia można kontrolować

poprzez odpowiedni dobór substancji go budujących. Obecność magnetytu Fe3O4

nadaje takiej nanocząstce właściwości magnetyczne [343]. Z kolei zastosowanie

w roli rdzenia półprzewodnikowych kropek kwantowych, np.: ZnO, CdSe, CdS

nadaje tego typu materiałom właściwości luminescencyjne [344]. Powłoka może być

zarówno substancją prostą lub związkiem nieorganicznym, np.: C, TiO2 czy też SiO2,

jak i polimerem organicznym [345]. Taka powłoka powinna być obojętna lub

aktywna tylko w stosunku do określonych ugrupowań chemicznych lub może zostać

odpowiednio zmodyfikowana, w zależności od planowanych zastosowań.

Dodatkowo, powinna być mało czuła na zmiany pH i działanie czynników

agresywnych oraz nie powinna łatwo ulegać negatywnym wpływom środowiska

zewnętrznego. W grupie materiałów powłokowych pierwsze miejsce zdecydowanie

zajmują materiały węglowe [346].

OTOCZKA

RDZEŃ


81

6.1.1. Nanokapsuły węglowe zawierające żelazo

Nanokapsuły węglowe zawierające żelazo (Fe@C Nps), zwane również

nanocząstkami żelaza enkapsulowanymi węglem (CEINs), zbudowane są

z nieorganicznego rdzenia (zazwyczaj o sferycznym kształcie), którym jest żelazo,

kobalt, nikiel, czy też ich stopy oraz otaczającej rdzeń powłoki węglowej [346].

Struktury te zostały odkryte w 1993 roku podczas badań nad fulerenami, w wyniku

wyładowania w łuku węglowym [347]. Metaliczny rdzeń ma zazwyczaj średnicę od

10 do 100 nm, a powłoka węglowa składa się z 5 warstw grafenowych, o grubości od

5 do 15 nm [348,349]. Węgiel jest jednym z najlepszych materiałów do tworzenia

takich powłok, ze względu na to, że jest materiałem lekkim, ma niską wrażliwość

magnetyczną oraz posiada dużą odporność termiczną oraz chemiczną w stosunku do

wielu związków [350]. Dodatkowo, powłoka węglowa zabezpiecza nanocząstki

przed ich utlenianiem oraz procesem korozji, dzięki czemu zachowują one swoje

właściwości. Zastosowanie powłoki węglowej zabezpiecza nanocząstki również

przed procesem agregacji oraz sprawia, że są one biokompatybilne i stabilne w wielu

nieorganicznych oraz organicznych roztworach [348].

Synteza nanokapsuł węglowych zawierających nanocząstki metaliczne może

być prowadzona przy użyciu takich metod, jak: plazma łuku węglowego,

przepływowa plazma termiczna, synteza spaleniowa, a nawet kontrolowana reakcja

egzotermiczna oparta na termolizie prostych związków chemicznych. Zasada

działania tych metod opiera się na etapie wytworzenia gazu zawierającego pary

węgla i metalu, który ma ulec zakapsułkowaniu. Jednakże duża ilość parametrów

procesowych (ciśnienie, moc, stechiometria reagentów, źródło węgla, geometria

reaktora, etc.) utrudnia znalezienie warunków idealnych do wzrostu nanokapsuł

węglowych. Metoda plazmy łuku węglowego zapewnia stabilne środowisko

reakcyjne i polega na wytworzeniu łuku węglowego pomiędzy katodą i grafitową

anodą z domieszką proszku zawierającego żelazo. Wysoka temperatura prowadzi do

odparowania węgla i żelaza, a ich pary szybko kondensują, tworząc nanokapsuły

węglowe zawierające żelazo. Powstałe w ten sposób materiały umieszcza się we

wrzącym 4 M HCl na 24 h, w celu usunięcia z ich powierzchni niepokrytego węglem

żelaza [351]. Kolejny etap polega na kilkukrotnym przemywaniu uzyskanego

produktu wodą i etanolem. Zabiegi te mają na celu usunięcie wszelkich innych

pozostałości z powierzchni nanokapsuł. Oczyszczone w ten sposób nanocząstki


82

suszy się w atmosferze powietrza. Niestety jest to metoda periodyczna, co mocno

ogranicza możliwości powiększania skali procesu; w trakcie pojedynczego

eksperymentu można otrzymać zaledwie kilka gramów produktu. Drugą z często

stosowanych metod, pozwalających wyeliminować konieczność wymiany

zużywających się anod, jest metoda tworzenia Fe@C Nps w strumieniu plazmy

termicznej. W tym przypadku mieszaninę proszku metalicznego Fe14Nd2B oraz

proszku grafitowego wprowadza się do otworu znajdującego się w środku anody.

Następnie pod wpływem plazmy elektrody ulegają procesowi sublimacji. W celu

oddzielenia powstałych w tej metodzie produktów niepożądanych od nanokapsuł

węglowych zawierających żelazo, powstałe materiały umieszcza się we wrzącym

2 M HCl na 24 h, a następnie przemywa się je wodą destylowaną i etanolem oraz

suszy w atmosferze powietrza w temperaturze 350 K [352]. Metody wykorzystujące

plazmę jako środowisko reakcyjne mają dwie zasadnicze wady: wymagają

skomplikowanego i kosztownego sprzętu oraz są energochłonne.

Z ekonomicznego punktu widzenia najskuteczniejszą metodą syntezy

nanocząstek metalicznych zakapsułkowanych w węglu jest wysokoenergetyczna

termoliza opracowana przez dr hab. Bystrzejewskiego z WCh UW [349].

W metodzie tej proces syntezy Fe@C Nps prowadzi się w prostym reaktorze, który

nie wymaga ani systemów próżniowych, ani zaawansowanych zasilaczy. Siłą

napędową tego procesu jest reakcja pomiędzy dwoma prostymi i tanimi związkami

chemicznymi: azydkiem sodu i sześciochlorobenzenem [353]. Źródłem metalu mogą

być proste związki organiczne (np. ferrocen), czy nawet drobny proszek żelaza.

Termoliza jest procesem szybkim, reakcja zwykle nie trwa dłużej niż kilka sekund.

Schemat syntezy nanokapsuł węglowych podczas termolizy układu NaN3-C6Cl6-Fe


Rysunek 33. Schemat syntezy nanokapsuł węglowych zawierających żelazo metodą

wysokoenergetycznej termolizy układu NaN3-C6Cl6-Fe.

+ 6 Na–N=N=N ++ –

(10 20 μm)Fe@C Nps

(30 80 nm)

2366 N9NaCl6C6NaN6ClC

Fe

a-C Nps(20 100 nm)


83

Powłoka węglowa nadaje nanokapsułom szczególne cechy, takie jak: dobra

aktywność elektrokatalityczna, jak również możliwość chemicznego

sfunkcjonalizowania powierzchni (np. COOH) [354], które może być wymagane

w procesach koniugacji niektórych cząsteczek, jak związki biologicznie ważne.

Modyfikacji powierzchni nanokapsuł węglowych za pomocą grup –COOH można

dokonać poprzez ich zanurzenie w 8 M HNO3 na czas 12 h. Następnie nanocząstki

przemywa się kilkukrotnie wodą, aż do momentu osiągnięcia neutralnego pH.

Utlenianie Fe@C Nps nie powoduje zmiany ich wielkości oraz kształtu, jak również

nie prowadzi do zmian właściwości chemicznych [355]. Otoczka węglowa oprócz

możliwości modyfikacji powierzchni nanocząstek poprawia również ich właściwości

magnetyczne. W przypadku SPIONs (superparamagnetycznych nanocząstek tlenku

żelaza) osiągalne maksymalne namagnesowanie wynosi pomiędzy 80 a 90 emug-1

,

natomiast dla nanokapsuł węglowych zawierających żelazo możliwe jest uzyskanie

nanomateriału z prawie dwukrotnie zwiększoną magnetyzacją (150 emug-1

) [356].

Dodatkowo, właściwości magnetyczne nanokapsuł zależą od ich rozmiarów [357].

W przypadku bardzo małych rozmiarów, gdy średnica pojedynczej nanokapsuły jest

mniejsza od średnicy pojedynczej domeny magnetycznej, nanocząstki takie mogą

posiadać właściwości superparamagnetyczne w temperaturze pokojowej [358]. Takie

nanokapsyły węglowe ulegają wysyceniu magnetycznemu w stosunkowo niewielkim

polu magnetycznym [349].

6.2. Zastosowanie magnetycznych nanokapsuł węglowych

z metalicznym rdzeniem

Właściwości magnetyczne nanocząstek mogą być wykorzystane w wielu

dziedzinach, np. do przechowywania danych [359], jako sorbenty [360], mobilne

katalizatory [361], w czujnikach [362] oraz do celów biomedycznych [363], w tym

również w obrazowaniu metodą rezonansu magnetycznego (MRI) [364].

Zastosowanie nanokapsuł węglowych, jako mobilnych sorbentów metali

ciężkich, takich jak: miedź, kobalt czy kadm ma zasadniczą zaletę w porównaniu do

standardowych sorbentów, z uwagi na fakt, że można je łatwo i szybko wyodrębnić

z roztworu przy użyciu magnesu. W celu wykorzystania nanokapsuł węglowych jako

sorbentów do wiązania metali należy je wcześniej zmodyfikować grupami

karboksylowymi poprzez poddanie ich procesowi utlenienia. Wiązanie metali


84

z sorbentem opiera się na elektrostatycznym oddziaływaniu zdeprotonowanych grup

funkcyjnych na powierzchni nanocząstek z kationami metali ciężkich [365].

Nanokapsuły węglowe z powodzeniem stosowane są również, jako

modyfikatory powierzchni elektrod, m.in. z węgla szklistego. Tego typu materiały

można wykorzystać do monitorowania efektów elektrokatalitycznych

paramagnetycznych enzymów (np. lakazy względem tlenu) w obecności

i nieobecności zewnętrznego źródła pola magnetycznego. Obserwuje się wówczas

wzrost uzyskiwanych sygnałów prądowych, który zależny jest od zastosowanej

wartości natężenia pola magnetycznego; im jest ono silniejsze, tym intensywność

rejestrowanych sygnałów prądowych jest większa. Ten wzrost jest wynikiem

zwiększonego transportu paramagnetycznej substancji elektroaktywnej do

powierzchni elektrody. Modyfikacja powierzchni elektrody z węgla szklistego

warstwą nanocząstek magnetycznych oraz unieruchomienie na takim podłożu lakazy,

pozwala na około dwukrotne zwiększenie prądu redukcji tlenu, w porównaniu do

elektrody niezmodyfikowanej nanocząstkami [366]. Zjawisko to może być

potencjalnie wykorzystane w przyszłości do konstrukcji bioogniw paliwowych. Efekt

silnego wzmocnienia intensywności woltamperometrycznych pików utleniania oraz

redukcji został również zaobserwowany dla paramagnetycznej pochodnej ferrocenu

(Fc-CH2COONa). Modyfikacja elektrody z węgla szklistego za pomocą nanokapsuł

węglowych oraz wprowadzenie do układu zewnętrznego źródła pola magnetycznego,

o stosunkowo małym natężeniu (około 3.4 mT), pozwoliło na znaczne

przyspieszenie procesu utlenienia oraz redukcji pochodnej ferrocenu, co skutkowało

wzrostem prądów pików o około 165%, w porównaniu do czystej elektrody z węgla

szklistego [366].

Fundamentalnie ważną zasadą zastosowania nanocząstek jest wielkość

i powierzchnia obszaru reakcji, które są do siebie odwrotnie proporcjonalne; wraz ze

zmniejszeniem się wielkości cząstek, powierzchnia tych nanostruktur wzrasta.

Z literatury wiadomo, że umieszczenie nanocząstek we krwi czy osoczu sprawia, że

oddziałują one z różnymi białkami [367]. W wyniku związania białka

z powierzchnią nanocząstki zmianie może ulec jej konformacja, co może wpływać

na oddziaływania pomiędzy poszczególnymi białkami [368]. Głównymi czynnikami

decydującymi o różnicy w wiązaniu białek z nanocząstkami, jest ich rozmiar oraz

ładunek powierzchniowy [369]. W celu selektywnego wiązania nanokapsuł

węglowych zawierających żelazo z białkami prowadzi się badania z wykorzystaniem


85

np. poliklonalnych przeciwciał. Modyfikacja nanokapsuł węglowych za pomocą

różnej długości łączników, zawierających grupy karboksylowe pozwala, po ich

aktywacji, na utworzenie wiązania kowalencyjnego z przeciwciałem, które następnie

oddziałuje z bydlęcymi i ludzkimi gamma globulinami. Koniugaty Fe@C Nps/Ab

mogą być wykorzystane do zastosowań biomedycznych, w tym w rezonansie

magnetycznym oraz terapii celowanej [370].

Niezwykłe fizyczne-, chemiczne- oraz biologiczne właściwości nanocząstek

magnetycznych otwierają również nowe możliwości projektowania różnorodnych

klinicznych aplikacji, takich jak, np. diagnostyka chorób czy terapia fotodynamiczna

[368]. Nanocząstki można również wykorzystać jako nośniki leków [371] oraz do

obrazowania diagnostycznego, czyli rezonansu magnetycznego z kontrastem, jako

środki fluorescencyjne lub jako struktury do wykrywania zmian patologicznych

w organizmie, czyli odróżnieniu guza od zdrowych tkanek [372]. Dodatkowo,

magnetyczne nanokapsuły o średnicy 10 100 nm mogą być potencjalnie

zastosowane w magnetofekcji, czyli dostarczaniu leków w obecności pola

magnetycznego [373]. Technika ta daje duże możliwości szybkiego i skutecznego

transportowania różnych leków bezpośrednio do chorych komórek pod wpływem

gradientu pola magnetycznego [348].

Udział pola magnetycznego w transporcie substancji elektroaktywnej…

87

7. Udział pola magnetycznego w transporcie

substancji elektroaktywnej do powierzchni

elektrody

W układzie elektrochemicznym wyróżnia się trzy zasadnicze rodzaje

transportu jonów oraz cząsteczek w roztworze do powierzchni elektrody, do których

zalicza się dyfuzję, migrację oraz konwekcję, co ilustruje poniższe równanie:

vCφCDRT

FzCDJJJJ r. iii

iiikonwek.migdyfuz.n (11)

gdzie: Jdyfuz. oznacza strumień substancji spowodowany transportem dyfuzyjnym,

Jmigr. dotyczy transportu migracyjnego, natomiast Jkonwek. to strumień substancji

wywołany konwekcją, Di – współczynnik dyfuzji i-tej substancji, Ci – stężenie i-tej

substancji w roztworze, F – stała Faradaya, R – stała gazowa, zi – ładunek i-tej

substancji, – potencjał elektryczny w roztworze, v – szybkość poruszania się

roztworu [374].

Transport dyfuzyjny substancji elektroaktywnej do powierzchni elektrody

towarzyszy wszystkim procesom elektrodowym, w konsekwencji następuje

wyrównanie stężeń depolaryzatora w roztworze, jak i potencjału chemicznego [375].

W przypadku naładowanych elektrycznie cząsteczek oraz w warunkach niedoboru

elektrolitu podstawowego, czyli dla niskiej mocy jonowej roztworu, proces

transportu może być wzmacniany lub osłabiany poprzez migrację. Proces migracji

ma miejsce w sytuacji, gdy transport depolaryzatora do powierzchni elektrody

wymuszony jest działaniem pola elektrycznego lub wynika on z różnicy potencjałów

[374]. Zjawisko migracji można wyeliminować poprzez dodanie do roztworu

nadmiaru elektrolitu podstawowego. Transport jonów lub cząsteczek może odbywać

się również pod wpływem gradientu gęstości, generowanego elektrochemicznie lub

termicznie lub pod wpływem zewnętrznych sił mechanicznych, czyli ruchu elektrody

lub roztworu. Zjawisko to nosi nazwę konwekcji [375].

Z literatury wiadomo, że pole magnetyczne może wpływać na procesy

zachodzące zarówno w pobliżu elektrody, jak również na jej powierzchni [376].

Zewnętrzne źródło pola magnetycznego może również mieć duży wpływ na

transport substancji [376]. W sytuacji, gdy w pobliżu elektrody umieszczony


88

zostanie magnes, wówczas substancja może być transportowana do powierzchni

elektrody na drodze magnetycznego transportu migracyjnego. W przypadku

występowania w roztworze tego typu zjawisk, w układzie eksperymentalnym

pojawiają się dwa rodzaje sił magnetycznych: siła magnetohydrodynamiczna,

nazywana również siłą Lorentza oraz siła gradientu pola magnetycznego, zwana siłą

Kelvina. Siła Lorentza związana jest z istnieniem w pobliżu elektrody pola

magnetycznego (najczęściej o stałym natężeniu) i określana jest za pomocą

równania:

BJF L (12)

gdzie:

J to strumień obdarzonych ładunkiem elektrycznym molekuł wyrażany

w A·m-2

, natomiast

B to wektor indukcji magnetycznej wyrażony w teslach (T)

[377]. Z równania (12) wynika, że siła Lorentza działa wyłącznie na poruszające się

indywidua chemiczne obdarzone ładunkiem. Wkład tej siły w transport

depolaryzatora do powierzchni elektrody jest proporcjonalny do ładunku, jakim

obdarzona jest cząsteczka oraz jej prędkości, czyli zależy od natężenia prądu.

W zależności od wzajemnego usytuowania wektora strumienia

J i wektora indukcji

magnetycznej

B , siła ta może wpływać na kierunek poruszania się jonów, przez co

może przyspieszać lub hamować ich transport do powierzchni elektrody. Z uwagi na

fakt, że równanie (12) zawiera iloczyn wektorowy

BJ , największą wartość siły

Lorentza obserwuje się w sytuacji, gdy strumień substancji elektroaktywnej jest

prostopadły do wektora indukcji pola magnetycznego. Siła Lorentza zupełnie zanika

w przypadku, gdy substancja elektroaktywna nie jest obdarzona ładunkiem, jest

w stanie spoczynku lub wektory

J i

B są względem siebie równoległe [376]. Dużo

bardziej skomplikowany jest efekt związany z działaniem na procesy elektrodowe

pola magnetycznego o natężeniu gradientowym. W tym przypadku obserwuje się

efekty wywołane również oddziaływaniem pola z cząsteczkami obojętnymi

elektrycznie. Siłę gradientu pola magnetycznego (FG) opisuje równanie:

χμ

BB

μ

BχF

2

00

G

2 (13)


89

gdzie: jest bezwymiarową podatnością magnetyczną, a 0m to przenikalność

magnetyczna próżni ( ]AN[104]mH[104 2717

0

m ) [377]. Pojawienie

się w układzie siły Kelvina najczęściej związane jest z obecnością gradientu wektora

indukcji magnetycznej, w mniejszym stopniu gradientu podatności magnetycznej

[378]. Gradient wektora indukcji magnetycznej (

B ) w dużej mierze zależy od

zastosowanych warunków eksperymentalnych i pojawia się w przypadku, gdy

w naczynku elektrochemicznym zewnętrzne pole magnetyczne jest niejednorodne

lub w sytuacji, gdy powierzchnia elektrody składa się z ferromagnetycznej substancji

lub jest nią zmodyfikowana [377]. Ten przypadek opisany jest pierwszym

składnikiem sumy, przedstawionym w równaniu (13) i najczęściej stanowi

dominujący wkład do wartości siły Kelvina. Drugi człon równania (13) opisującego

powstawanie siły Kelvina na skutek niejednorodności podatności magnetycznej ( )

ośrodka jest zwykle mniej znaczący i często zaniedbywalny. Istnienie gradientu

podatności magnetycznej ( ) jest konsekwencją występowania w roztworze

gradientu stężenia substancji paramagnetycznej ( C ) i określany jest on za pomocą

równania [377]:

Cm (14)

gdzie: m to podatność molowa w [m

3·mol

-1].

Przyczyną niejednorodności podatności magnetycznej roztworu może być np.

zachodząca w układzie reakcja redoks, w wyniku której może nastąpić zmiana

właściwości magnetycznych substancji w pobliżu powierzchni elektrody [379].

Zatem wartość siły Kelvina silnie powiązana jest z właściwościami magnetycznymi

molekuł, które powinny posiadać trwały moment magnetyczny, natomiast jest ona

w mniejszym stopniu zależna od orientacji pola magnetycznego względem

powierzchni elektrody [380].

Oprócz podatności molowej substancji istnieje także bezwymiarowa

podatność objętościowa oraz podatność masowa. Ogólnie podatność magnetyczną

definiuje się za pomocą równania:

B0

Mμ

H

Mχ (15)

gdzie: M oznacza namagnesowanie, H to natężenie pola, ǀ Bǀ określa wartość

indukcji pola magnetycznego, a 0m to przenikalność magnetyczna próżni. W


90

zależności od wartości podatności magnetycznej substancje można podzielić na:

diamagnetyki, paramagnetyki oraz ferromagnetyki [381]. Substancje

diamagnetyczne, które są wypychane z pola magnetycznego, takie jak np. grafit,

posiadają ujemną podatność magnetyczną, gdyż indukowany przez zewnętrzne pole

magnetyczne diamagnetyczny moment magnetyczny zwrócony jest przeciwnie do

pola magnetycznego. Oddziaływania te są tak słabe, że nie mają praktycznego

wpływu na transport substancji w kierunku elektrody. W przypadku niektórych

jonów, takich jak: jony Fe2+

lub Co3+

, podatność magnetyczna zależna jest od

temperatury i wraz

z jej wzrostem przechodzi ona w podatność paramagnetyczną [381]. Właściwości

paramagnetyczne wykazują substancje, które posiadają niesparowane elektrony,

takie jak np.: tlen, wolne rodniki oraz metaloproteiny [382]. Substancje

paramagnetyczne są wciągane w obszar silniejszego pola i charakteryzują się

dodatnią podatnością magnetyczną nawet w przypadku braku zewnętrznego pola

magnetycznego. Natomiast po wprowadzeniu pola do układu, paramagnetyki

wykazują moment magnetyczny mający niezerową składową równoległą do

zewnętrznego pola [383].

Gradientowe pole magnetyczne wpływa nie tylko na transport substancji do

powierzchni elektrody, ale również decyduje o wydajności reakcji elektrodowych

oraz ich mechanizmach. Gradient podatności magnetycznej może wywoływać

konwekcję i powodować wciąganie paramagnetycznych substancji w kierunku pola

o większej indukcji magnetycznej lub wypychać z pola substancje o właściwościach

diamagnetycznych [384]. Transport paramagnetycznej substancji ulegającej

procesom redoks do powierzchni elektrody, spowodowany działaniem pola

magnetycznego, może być w pewnych warunkach silniejszy niż transport

zachodzący podczas konwekcji naturalnej [385].

Techniki badawcze stosowane w pracy

91

8. Techniki badawcze stosowane w pracy

W badaniach własnych, przedstawionych w niniejszej rozprawie doktorskiej,

do ilościowej i jakościowej charakterystyki zaproponowanych elektrochemicznych

czujników do detekcji wybranych metaloprotein w próbkach krwi zastosowano

szereg technik elektrochemicznych i spektroskopowych. Parametry analityczne, takie

jak: zakres pracy czujnika, jego granicę wykrywalności, powtarzalność

uzyskiwanych wyników, stabilność oraz selektywność wyznaczono na podstawie

eksperymentów wykonanych przy użyciu woltamperometrii z liniowo zmieniającym

się potencjałem (LSV), woltamperometrii cyklicznej (CV), woltamperometrii

pulsowej różnicowej (DPV), elektrochemicznej mikrowagi kwarcowej (EQCM) oraz

elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej (EIS). Informacji na temat jakości

i morfologii warstw analitycznie czynnych (tzw. warstw receptorowych)

konstruowanych czujników dostarczyły pomiary wykonane przy użyciu:

spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR), spektroskopii

dichroizmu kołowego (CD), spektroskopii UV-vis, spektrometrii mas

z plazmą indukcyjnie sprzężoną z ablacją laserową (LA-ICP-MS), analizy

termograwimetrycznej (TGA), mikrowagi kwarcowej z dyssypacją energii

(QCM-D), powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) oraz skaningowego

mikroskopu elektronowego (SEM). Natomiast wpływ zastosowanych modyfikacji

oraz obecności zewnętrznego źródła pola magnetycznego na aktywność

elektrokatalityczną analizowanych metaloprotein zbadano za pomocą skaningowego

mikroskopu elektrochemicznego (SECM). W niniejszym rozdziale zostały

omówione tylko te techniki pomiarowe, które osobiście stosowałam

w prowadzonych badaniach.

8.1. Woltamperometria cykliczna i liniowa

Woltamperometria cykliczna (CV) jest techniką analityczną, w której

mierzona jest zależność pomiędzy natężeniem prądu (I) płynącego przez elektrodę

pracującą a potencjałem tej elektrody (E) [374]. W trakcie pomiaru do elektrody

pracującej przykładany jest zmieniający się liniowo w czasie potencjał od wartości,

przy której nie zachodzi reakcja elektrodowa (E1) do wartości, przy której ma

miejsce proces elektrodowy (E2), zgodnie z rysunkiem 34A. Jeśli kierunek


92

przykładanego do elektrody potencjału zostanie zmieniony, wówczas produkty

powstałe w trakcie procesu elektrodowego ulegają procesowi odwrotnemu,

odpowiednio elektroredukcji lub elektroutlenianiu. Zależność I=f(E) uzyskiwana dla

zmian potencjału tylko w jednym kierunku nosi nazwę liniowej krzywej

woltamperometrycznej (LSV). Kształt uzyskiwanych sygnałów prądowych zależy od

rozmiaru elektrody. Dla elektrod o konwencjonalnych rozmiarach rejestrowana

zależność (I=f(E)) ma kształt piku (rysunek 34B), natomiast w przypadku

mikroelektrod otrzymuje się falę o kształcie sigmoidalnym, rysunek 34C.

E / V

I / A

C

t / s

E /

V

E1

E2

Cykl 1 Cykl 2 Cykl 3

A

E / V

I /

A

D

reakcja odwracalna

reakcja nieodwracalna

reakcja quasi-odwracalna

E / V

I /

A

B

Ip,a

Ip,k

Rysunek 34. Zależność przykładanego do elektrody pracującej potencjału w funkcji czasu (A),

cykliczne krzywe woltamperometryczne zarejestrowane na elektrodzie o konwencjonalnych

rozmiarach (B) i mikroelektrodzie (C); oraz cykliczne krzywe wltamperometryczne uzyskane dla

reakcji odwracalnej, quasi-odwracalnej i nieodwracalnej w warunkach dyfuzji liniowej [374].

Prąd piku w woltamperometrii z użyciem klasycznych (o konwencjonalnych

rozmiarach) elektrod dla procesów odwracalnych opisuje równanie Randlesa–Ńevčika

[374]:

i

2/1

i2/12/1

2/3446.0CvADn

TR

FI 1/23/2

p (16)

gdzie: Ip oznacza prąd piku [A], 0.446 – bezwymiarowy współczynnik liczbowy,

F – stała Faraday’a (96 485 C·mol-1

), R – stała gazowa (8.31 J·K-1

·mol-1

),

T – temperatura wyrażona w K, n – liczba elektronów uczestniczących w reakcji


93

elektrodowej, A – powierzchnia elektrody [cm2], Di – współczynnik dyfuzji

substancji elektroaktywnej [cm2s

-1], v – szybkość przemiatania potencjałem [Vs

-1],

Ci – stężenie depolaryzatora w głębi roztworu [molcm-3

]. Dla temperatury

pokojowej (T = 298 K) równanie Randlesa–Ńevčika upraszcza się do postaci:

i

2/1

i

5

p 1069.2 CvADnI 1/23/2 (17)

W sytuacji, gdy warunki eksperymentalne nie ulegają zmianie, wartość prądu piku

jest proporcjonalna do stężenia substancji elektroaktywnej ulegającej procesom

redoks na powierzchni elektrody. W przypadku mikroelektrod, mierzony prąd

określany jest mianem prądu stacjonarnego (Iss; ang. steady-state current), który

opisuje poniższe równanie:

iiss CgnFrDI (18)

gdzie: g to współczynnik geometryczny (g = 4 dla dyskowej mikroelektrody),

a r – promień mikroelektrody.

Potencjały, przy których obserwowane są sygnały prądowe, związane

z zachodzącymi procesami elektrodowymi są charakterystyczne dla danego

badanego układu redoks, a ich położenie związane jest z potencjałem formalnym

tego układu. Potencjał formalny (Ef) określany jest za pomocą równania:

2

kp,ap,

f

EEE

(19)

gdzie: Ep,a to potencjał piku anodowego [V], a Ep,k – potencjał piku katodowego [V].

W przypadku odwracalnych reakcji redoks stosunek wartości Ip,a do Ip,k jest równy

jedności, natomiast różnicę potencjałów (Ep,a – Ep,k) dla T = 20 ºC określa się za

pomocą równania:

]mV[58

22.2k,pa,pnnF

RTEE (20)

W sytuacji jakichkolwiek odstępstw od odwracalnego przebiegu reakcji elektrodowej

wzrasta różnica potencjałów piku anodowego i katodowego, a także zmienia się

kształt krzywej woltamperometrycznej, zgodnie z rysunkiem 34D.

8.2. Woltamperometria pulsowa róznicowa

Technika woltamperometrii pulsowej różnicowej (DPV) jest niezwykle

użyteczna w analizie chemicznej ze względu na możliwość uzyskiwania niskiej

granicy oznaczalności substancji, poniżej 0.05 mM [386]. W metodzie tej, dzięki


94

dwukrotnemu próbkowaniu prądu: tuż przed przyłożeniem pulsu oraz pod koniec

jego trwania następuje eliminacja prądu pojemnościowego [387]. Amplituda

przykładanych pulsów jest jednakowa podczas trwania całego eksperymentu. Zmianę

potencjału w woltamperometrii pulsowej różnicowej przedstawia rysunek 35.

t / s

E /

V

Eptp

Rysunek 35. Zmiany potencjału elektrody w czasie w metodzie woltamperometrii pulsowej

różnicowej w oparciu o rysunek z [386].

Woltamperogramy otrzymane za pomocą techniki DPV ilustrują zmianę prądu

ΔI [ΔI = I(t2) – I(t1)] względem przyłożonego potencjału. Rejestrowane sygnały

pradowe mają kształt pików, a wysokość prądu piku dla układu odwracalnego (Ip)

jest proporcjonalna do stężenia oznaczanej substancji i opisana jest poniższym

równaniem:

ζ

ζ

t

CnFADI

0.5

1

1iip (21)

gdzie:

RT

EnF p

2exp , t to czas trwania pulsu, natomiast ΔEp oznacza amplitudę

pulsu [387].

Technika woltamperometrii pulsowej różnicowej charakteryzuje się dobrą

rozdzielczością i pozwala na jednoczesny pomiar sygnałów różniących się względem

siebie o 50 mV. W metodzie tej elektronowość badanego procesu odwracalnego

wyznacza się na podstawie szerokości piku w połowie wysokości (W0.5), którą

określa równanie:

nF

RTW

52.35.0 (22)

Dzięki możliwości rejestracji sygnałów prądowych o kształcie pików oraz małemu

prądowi tła technika DPV jest niezwykle użyteczna w analizowaniu mieszanin [387].


95

8.3. Elektrochemiczna mikrowaga kwarcowa

Mikrowaga kwarcowa (QCM) po raz pierwszy została wykorzystana do

pomiarów masy przez Sauerbrey’a w roku 1959 [388]. W porównaniu do

komercyjnych mikrowag analitycznych wykrywających substancje na poziomie

10-10

kg, technika QCM pozwalała na detekcję substancji nawet na poziomie 10-16

kg

[389]. Zastosowanie mikrowagi kwarcowej w pomiarach elektrochemicznych in situ

daje możliwość jednoczesnego rejestrowania parametrów elektrochemicznych

układu i zmian masy elektrody wywołanych procesem adsorpcji indywiduów

chemicznych na jej powierzchni. Wówczas stosuje się określenie elektrochemicznej

mikrowagi kwarcowej (EQCM). Metoda ta wykorzystywana jest do monitorowania

przebiegu procesu adsorpcji na powierzchni stałej.

Najważniejszym elementem każdej mikrowagi kwarcowej jest rezonator

kwarcowy, którego zasada działania oparta jest na zjawisku piezoelektrycznym

[388], a ściślej mówiąc na odwrotnym zjawisku piezoelektrycznym kryształu

kwarcu, polegającym na zmianie jego częstotliwości rezonansowej wywołanej

zmianą jego masy. Stosowany w przypadku elektrochemicznej mikrowagi

kwarcowej kryształ kwarcu pokryty jest z obu stron warstewką tlenku chromu bądź

tytanu, w celu zapewnienia dobrego przewodnictwa elektrycznego, na którą z obu

stron napylona jest cienka warstwa metalu, np. złota lub platyny [390]. Schemat

kryształu kwarcu stosowanego w pomiarach EQCM ilustruje rysunek 36.

ELEKTRODA ZŁOTA

KRYSZTAŁ KWARCU

KONTAKT

ELEKTRYCZNY

Rysunek 36. Schemat kryształu kwarcu. Rysunek oparty o [388].

Częstotliwość rezonansowa kryształu kwarcu zależy od całkowitej ilości

cząsteczek zaadsorbowanych na jego powierzchni. Jeśli zaadsorbowana na

powierzchni kryształu warstwa jest cienka, twarda, nie wykazuje właściwości


96

wiskoelastycznych (fvis. 0) oraz jej masa jest dużo mniejsza od masy kryształu

(< 5 %), wówczas zmiana częstotliwości rezonansowej (Δf) kryształu kwarcu jest

proporcjonalna do zmian jego masy, zgodnie z równaniem Sauerbrey’a [391-394]:

qq

2

02

ρμA

mnff

(23)

gdzie: Δf jest zmianą częstotliwości drgań kryształu kwarcu [Hz],

Δm − zmiana masy kryształu kwarcu [g], mq − współczynnik sprężystości

poprzecznej kryształu kwarcu (2.947·1011

g·cm-1

·s-2

), q – gęstość kwarcu

(2.648·1011

g·cm-3

), natomiast n − numer nadtonu częstotliwości rezonansowej.

Równanie Sauerbrey’a jest spełnione tylko dla cienkich, stabilnych i sztywnych

warstw jednorodnie rozmieszczonych na powierzchni kryształu kwarcu. Znak

ujemny w równaniu Sauerbrey’a wskazuje, że wzrost masy kryształu kwarcu

związany jest ze spadkiem jego częstotliwości rezonansowej. Równanie to często

przedstawiane jest w skróconej formie:

fC

mnf

(24)

gdzie: Cf jest stałą charakterystyczną dla danego kryształu kwarcu. Całkowitą zmianę

częstotliwości rezonansowej kryształu kwarcu, uwzgledniającą właściwości

wiskoelastyczne otoczenia, takie jak: gęstość ( lρ ) i lepkość cieczy ( lη ), opisuje

równanie [395]:

2/1

qq

ll2/3

0

qq

2

0.vis.mas.cał

2

μρ

ηρf

ρμA

mffff (25)

W przypadku pomiaru masy miękkich i sprężystych warstw niezwykle

pomocna jest mikrowaga kwarcowa z możliwością monitorowania dyssypacji energii

(ΔD), związanej z właściwościami wiskoelastycznymi zaadsorbowanej warstwy.

Wzrost wartości ΔD świadczy o utworzeniu na powierzchni kryształu kwarcu

miękkiej, elastycznej warstwy, podczas gdy niewielka zmiana dyssypacji energii

wskazuje na powstanie sztywnego filmu [396]. Wkład efektu wiskoelastycznego

w zmianę częstotliwości rezonansowej kryształu kwarcu może zostać pominięty, gdy

nDn/fn << 2.6·10-7

lub 4·10-7

Hz-1

, odpowiednio dla 6- i 5 MHz kryształu kwarcu

[397]. Metoda QCM-D cieszy się dużym powodzeniem w badaniach procesu

adsorpcji układów o znaczeniu biologicznym, gdyż pozwala określić orientację oraz

konformację zaadsorbowanych cząsteczek [398,399]. QCM-D umożliwia również


97

badanie wpływu wielu czynników, takich jak: pH, siła jonowa oraz stężenie, na ilość

zaadsorbowanych molekuł. Należy podkreślić, że pomiar prowadzony jest w czasie

rzeczywistym.

8.4. Elektrochemiczna spektroskopia impedancyjna

W metodzie elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej (EIS) rejestruje

się liniową, elektryczną odpowiedź elektrody po przyłożeniu do niej potencjału

o małej amplitudzie, zmieniającego się sinusoidalnie w czasie i nie powodującego

zaburzeń badanej próbki. Na podstawie pomiarów EIS można uzyskać informacje na

temat kinetyki procesów elektrodowych, transportu zarówno ładunku pomiędzy

powierzchnią elektrody a substancją elektroaktywną, jak również masy

(substancji elektroaktywnej) do powierzchni elektrody [400]. Dodatkowo, metoda ta

pozwala na określenie stopnia porowatości utworzonej warstwy, jak i na ocenę

jakości warstwy utworzonej na powierzchni elektrody. Wadą tej techniki są bardzo

często problemy związane z właściwą interpretacją wartości uzyskanych parametrów

impedancyjnych [401].

Impedancja faradajowska jest wielkością zespoloną, złożoną z części

rzeczywistej (Z') oraz części urojonej (-Z'') [402], co przedstawia rysunek 37.

-Z"

Z'

ǀZǀ

oś u

rojo

na

oś rzeczywista

Rysunek 37. Wektor impedancji w przestrzeni zespolonej dla wybranej częstotliwości ω.

Impedancję faradajowską opisuje poniższe równanie matematyczne:

2s

2

s

0

f

1

ωCR

I

φZ

(26)

gdzie: ǀ Zfǀ to moduł impedancji, I0 − prąd wymiany w potencjale równowagowym

danego procesu elektrodowego, Δ − kąt przesunięcia fazowego, Rs − całkowita

oporność warstwy reakcyjnej, ω − częstość kątowa, natomiast Cs − całkowita


98

pojemność elektryczna granicy faz. Wartość impedancji faradajowskiej w dużej

mierze zależy od szybkości reakcji elektrodowej, która związana jest

z przeniesieniem ładunku pomiędzy substancją elektroaktywną a powierzchnią

elektrody oraz od procesu dyfuzji substancji do elektrody i produktów w głąb

roztworu, co opisuje poniższe równanie:

ω

δRZ

22

ctf

2 (27)

gdzie: Rct określa oporność przeniesienia ładunku, natomiast człon (2δ2/)

0.5 oznacza

impedancję Warburga (Zw lub W), która związana jest z procesem dyfuzji substancji

elektroaktywnej w kierunku powierzchni elektrody. Parametr δ występujący

w równaniu (23) to parametr Warburga, a jego wartość można wyznaczyć według

równania:

RedRedOxOx DCDCFn

RTδ

11

222 (28)

gdzie: COx i CRed oznaczają stężenia substancji elektroaktywnej w głębi roztworu,

odpowiednio w formie utlenionej oraz zredukowanej, a DOx oraz DRed to

odpowiednio współczynniki dyfuzji substancji w formie utlenionej i zredukowanej

[403]. Uzyskane wyniki pomiarów impedancyjnych przedstawiane są zazwyczaj

w postaci wykresu Nyquist’a, którego przebieg ilustruje rysunek 38.

OBSZAR KONTROLOWANY

SZYBKOŚCIĄPRZENOSZENIA ŁADUNKU

OBSZAR KONTROLOWANY

SZYBKOŚCIĄPRZENOSZENIA MASY

Rs

Rs + Rct

Rs + ½Rct

ω↓

Rysunek 38. Typowy diagram Nyquist’a dla reakcji elektrodowej kontrolowanej przeniesieniem

ładunku oraz kontrolowanej dyfuzją [403]. Rs – całkowita oporność roztworu, Rct – opór

przeniesienia ładunku.

Dla reakcji elektrodowych kontrolowanych przeniesieniem ładunku wykres

Nyquist’a ma postać półkola, o średnicy proporcjonalnej do wartości oporu


99

przeniesienia ładunku, natomiast w przypadku reakcji kontrolowanych dyfuzją

zależność ta ma charakter liniowy [404]. W celu dokonania ilościowej interpretacji

uzyskanych wyników eksperymentalnych, impedancję badanego układu opisuje się

za pomocą odpowiedniego obwodu zastępczego. W niniejszej rozprawie doktorskiej

w analizie wyników EIS stosowano obwód zastępczy, przedstawiony na rysunku 39.

RsTdl , dl

WRct

Rysunek 39. Obwód zastępczy opisujący badany układ pomiarowy. Rs – całkowita oporność

roztworu, Rct – opór przeniesienia ładunku, Tdl – parametr pojemnościowy elementu stało-

fazowego, dl – parametr potęgowy elementu stało-fazowego, W – impedancja Warburga.

8.5. Skaningowy mikroskop elektrochemiczny

W technice skaningowej mikroskopii elektrochemicznej (SECM)

wykorzystuje się mikroelektrody dyskowe najczęściej o średnicy od 0.6 do 25 µm

wykonane z platyny, złota lub węgla, które umożliwiają badanie profili stężeniowych

próbnika redoks w roztworze nad powierzchnią próbki [405]. W trakcie pomiaru

położenie mikroelektrody zmieniane jest zarówno w kierunku prostopadłym (z), jak

i w płaszczyźnie równoległej (x-y) do powierzchni próbki [406]. W ten sposób

uzyskuje się mapę elektroaktywnych miejsc badanej powierzchni [407]. W celu

wyeliminowania efektów związanych z dyfuzją z obszaru okołoelektrodowego,

stosunek średnicy mikroelektrody wraz z obudową do średnicy samej elektrody

powinien wynosić około 10. Tak dobrany rozmiar mikroelektrody czyni ją bardziej

czułą na procesy zachodzące na badanej powierzchni [407].

Obrazowanie za pomocą SECM prowadzi się zazwyczaj w trybie sprzężenia

zwrotnego (z ang. feedback mode, FB), w którym próbnik redoks umieszczony jest w

roztworze elektrolitu podstawowego. W sytuacji, gdy próbnik redoks jest w formie

zredukowanej, wówczas w wyniku przyłożenia wystarczająco dodatniego potencjału

na mikroelektrodzie następuje jego utlenienie. Szybkość zachodzącego procesu

kontrolowana jest przez szybkość dyfuzji sferycznej. Dla dostatecznie dużej

odległości mikroelektrody od badanej powierzchni dyfuzja zachodzi z obszaru

półnieskończonego i ustala się prąd stacjonarny (Iss), opisany równaniem (18).

W sytuacji, gdy mikroelektroda umieszczona jest w pobliżu powierzchni

nieprzewodzącej, rejestrowany prąd faradajowski maleje ze względu na utrudnioną


100

dyfuzję próbnika redoks do mikroelektrody. Obserwowane zjawisko określane jest

mianem ujemnego sprzężenia zwrotnego. Jeśli natomiast mikroelektroda znajduje się

w pobliżu substratu przewodzącego następuje zwiększenie wartości rejestrowanego

prądu faradajowskiego, co określa się mianem dodatniego sprzężenia zwrotnego.

Obserwowane wzrosty prądu związane są z regeneracją próbnika redoks na

powierzchni mikroelektrody [408]. W metodzie SECM wyniki przedstawia się

w postaci krzywych zbliżania opisujących zmiany prądowe mikroelektrody w funkcji

jej odległości od powierzchni analizowanej próbki. Schemat działania skaningowego

mikroskopu elektrochemicznego w trybie sprzężenia zwrotnego ilustruje rysunek 40.

RedRed

RedRed

Red

e‒

Red

RedRed

Red

Red

Red

Red Ox

RedRed

RedRed

Red RedRed Ox

IZOLATOR PRZEWODNIK

e‒ e‒

A B C

e‒

Rysunek 40. Schemat działania skaningowego mikroskopu elektrochemicznego w trybie

sprzężenia zwrotnego dla różnych przypadków: półnieskończonego obszaru dyfuzji sferycznej

(A), umieszczenia w pobliżu mikroelektrody izolatora elektrycznego (B) oraz przewodnika (C),

w oparciu o [408].

8.6. Spektroskopia UV-vis

Spektroskopia w zakresie ultrafioletu (UV; 200 380 nm) oraz światła

widzialnego (vis; 380 780 nm) jest szeroko stosowaną techniką do ilościowej

analizy substancji absorbujących promieniowanie elektromagnetyczne z zakresu

charakterystycznego dla tej metody, jak również do analizy strukturalnej związków

organicznych. Absorpcja promieniowania elektromagnetycznego przez związki

związana jest z występowaniem w ich strukturze wiązań podwójnych, potrójnych

oraz sprzężonych układów wiązań. Te nienasycone ugrupowania określane są

mianem chromoforów [409]. W metodzie UV-vis rejestruje się zależność zmiany

absorbancji próbki (A) w funkcji długości fali (). Intensywność zaabsorbowanego

promieniowania zależy od: stężenia badanej substancji (C), grubości warstwy

absorbującej (l wyrażonej w cm) oraz molowego współczynnika absorpcji

(, wyrażonego w jednostce dm3·mol

-1·cm

-1), a jego miarą jest absorbancja lub


101

transmitancja (T). Zależność tą w sposób matematyczny opisuje prawo Lamberta –

Beera, zgodnie z równaniem:

εlCI

I

TA 0log

1log (29)

gdzie: I0 i I to odpowiednio natężenie wiązki promieniowania padającego i po jego

przejściu przez ośrodek absorbujący. Molowy współczynnik absorpcji jest

wielkością stałą, charakterystyczną dla danej substancji, niezależną od jej stężenia,

natomiast zależną od długości fali i stosowanego rozpuszczalnika [410]. Obecność

w strukturze związku podstawników elektronodonorowych, takich jak np.: –OH,

–NH2 lub –OCH3 określanych jako auksochromy, powoduje przesunięcie położenia

pasma absorpcji w kierunku większych wartości długości fali oraz wzrost

intensywności pasma. Efekty te nazywane są odpowiednio tzw. przesunięciem

batochromowym oraz efektem hiperchromowym. Z kolei obecność nasyconych grup

elektronoakceptorowych, takich jak np.: –CHO, –NO, –NO2 powoduje przesunięcie

pasma absorpcji w kierunku mniejszych wartości długości fali (tzw. przesunięcie

hipsochromowe) oraz zmniejszenie intensywności pasma (tzw. efekt

hipochromowy).

Dla roztworów wieloskładnikowych, zgodnie z prawem addytywności,

absorbancja układu jest równa sumie absorbancji poszczególnych jego składników,

co opisuje poniższe równanie:

lCεCεCεAA nn2211

ni

1i

i ...

(30)

Prawo to jest spełnione tylko wtedy, gdy poszczególne składniki obecne w roztworze

nie oddziałują ze sobą i zależność A = f(C) ma charakter prostoliniowy [411].

Odczynniki chemiczne i aparatura

103

9. Odczynniki chemiczne i aparatura

Badania naukowe zawarte w niniejszej rozprawie doktorskiej wykonane

zostały z wykorzystaniem wielu odczynników chemicznych (o stopniu czystości co

najmniej klasy cz.d.a.), z których najważniejsze przedstawione zostały w tabeli 3.

Tabela 3. Odczynniki chemiczne stosowane w badaniach eksperymentalnych wraz z ich skrótami

i pełnionymi funkcjami.

Odczynnik Wzór

sumaryczny

Producent Pełniona

funkcja

Acetonitryl

(ACN) CH3CN POCh rozpuszczalnik

4-aminoetylobenzeno

diazoniowa sól tetrafluoro-

boranu

(AEBD)

C8H10N3+BF4

-

Zsyntezowana przez

dr Agatę Kowalczyk

WCh UW

substrat do

preparacji

warstwy

pośredniczącej

Azotan(III) sodu NaNO2 Sigma Aldrich

substrat do

syntezy soli

diazoniowej

Apo-transferyna

(apo-Tf) − Sigma Aldrich

analit /

depolaryzator

Ceruloplazmina

(Cp) − Sigma Aldrich

analit /

depolaryzator

Chlorek potasu KCl POCh składnik buforu

Chlorek sodu NaCl POCh składnik buforu

Chlorowodorek cysteaminy

(CSH) C2H7NS·HCl Sigma Aldrich

składnik warstwy

receptorowej

Chlorowodorek 1-etylo-3-

(3-dimetyloaminopropylo)-

karbodiimidu (EDC)

C6H17N3·HCl Sigma Aldrich aktywator grup

–COOH

Diwodorofosforan(V) potasu

lub sodu

KH2PO4

NaH2PO4 Sigma Aldrich składnik buforu

Etylowy alkohol 99.9%

(EtOH) C2H5OH POCh rozpuszczalnik

Hemoglobina

(Hb) − Sigma Aldrich depolaryzator


104

Nanocząstki magnetyczne: 1)

Fe@C Nps 2)

Fe@C-COOH Nps

−

Zsyntezowane przez

dr hab. Michała

Bystrzejewskiego

WCh UW

składnik warstwy

receptorowej

Ferrytyna

(Ft) − Sigma Aldrich

analit /

depolaryzator

Heksacyjanożelazian(II) potasu K4[Fe(CN)6] POCh próbnik redoks

Heksacyjanożelazian(III)

potasu K3[Fe(CN)6] POCh próbnik redoks

Holo-transferyna

(holo-Tf) − Sigma Aldrich

analit /

depolaryzator

Kwas 4-aminobenzoesowy C7H7O2N Sigma Aldrich

substrat do

syntezy soli

diazoniowej

Ludzka transferyna

(Tf) − Sigma Aldrich

analit /

depolaryzator

Nadtlenek wodoru H2O2 Sigma Aldrich utleniacz

hemoglobiny

N-hydroksysukcynimid

(NHS) C4H5NO3 Sigma Aldrich

aktywator grup

–COOH

Przeciwciała ferrytyny

(AbFt) − Sigma Aldrich

substancja

selektywnie

wiążąca ferrytynę

Przeciwciała transferyny

(AbTF) − Thermo Scientific

substancja

selektywnie

wiążąca

transferynę

Siarczan(VI) potasu K2SO4 Sigma Aldrich składnik buforu

Tetrafluorek

tetrabutyloamoniowy

(NBu4BF4)

C16H36BF4N Sigma Aldrich elektrolit

podstawowy

Tween-20 − Sigma Aldrich

substancja

uszczelniająca

warstwę

receptorową

Wodorofosforan(V) dipotasu

lub disodu

K2HPO4

Na2HPO4 Sigma Aldrich składnik buforu

Wszystkie pomiary elektrochemiczne prowadzono przy użyciu potencjostatu

PGSTAT 30 marki AUTOLAB w układzie trójelektrodowym. Funkcję elektrody

pracującej pełniła dyskowa elektroda złota (Au; = 1.6 mm) o powierzchni


105

0.0201 cm2 lub kryształ kwarcu z napyloną po obu stronach warstwą złota

(Au-EQCM) o powierzchni ok. 0.485 cm2. Jako elektrody odniesienia użyto

chlorosrebrową elektrodę z podwójnym płaszczem (Ag/AgCl/3 M KCl/0.1 M

KNO3), zaś elektrodę pomocniczą stanowiła blaszka platynowa lub złota

o powierzchni co najmniej 1 cm2.

W przypadku sensorów tworzonych na powierzchni wybranego materiału,

niezwykle ważny jest stan takiej powierzchni. Zatem konstrukcję poszczególnych

czujników zawsze poprzedzał etap właściwego przygotowania powierzchni materiału

przewodzącego. W zależności od typu elektrody pracującej zastosowano w tym celu

metody mechaniczne i/lub elektrochemiczne. Elektrody dyskowe najpierw

polerowano na kółku polerskim z użyciem tlenku glinu, o średnicy ziaren 1 μm,

poprzez wielokrotne wykonywanie ruchów ósemkowych. Następnie w celu usunięcia

pozostałości tlenku glinu z powierzchni elektrody, opłukiwano ją silnym-,

prostopadłym do powierzchni strumieniem wody destylowanej (o przewodnictwie

równym 0.056 mS·cm-1

z aparatu Hydrolab). Następnie tak przygotowaną elektrodę

poddawano elektrochemicznej procedurze czyszczenia. Pierwszy jej etap polegał na

zarejestrowaniu woltamperogramu w 0.1 M roztworze wodorotlenku sodu,

w zakresie potencjałowym 0 ÷ 1.8 ÷ 0 V z szybkością przemiatania potencjału 100

mV·s-1

. Kolejno rejestrowano woltamperogramy cykliczne w 0.1 M roztworze kwasu

siarkowego(VI), w zakresie potencjałów -0.3 ÷ 1.5 ÷ -0.3 V z szybkością polaryzacji

elektrody 50 mV·s-1

. Cykliczne krzywe rejestrowano do momentu uzyskania

stabilnego woltamperogramu charakterystycznego dla czystej elektrody złotej [412].

Końcowym etapem elektrochemicznej procedury czyszczenia elektrod złotych była

ich aktywacja w wyniku cyklizacji w 0.1 M roztworze kwasu chlorowego(VII),

w zakresie potencjałów -0.65 ÷ 0.95 ÷ -0.65 V, z szybkością polaryzacji elektrody

1 V·s-1

. Z uwagi na łatwość zniszczenia i uszkodzenia kryształu kwarcu, tego typu

elektrody poddawano tylko i włącznie elektrochemicznej procedurze czyszczenia,

analogicznej jak w przypadku elektrod dyskowych. Pomiary wykonywano

w temperaturze pokojowej, wynoszącej 21 °C, w roztworach odtlenionych za

pomocą argonu (czas odtleniania około 30 minut). W zależności od oznaczanego

białka stosowano różne bufory pomiarowe, które dobierane były tak, aby uzyskiwać

maksymalną aktywność danego białka. W badaniach zastosowano następujące

bufory pomiarowe:


106

0.02 M bufor PBS: 0.02 M NaH2PO4, 0.02 M Na2HPO4, 2 mM KCl

i 150 mM NaCl o pH 6.0; w przypadku pomiarów dotyczących hemoglobiny,

0.02 M bufor PB: 0.02 M KH2PO4, 0.02 M K2HPO4 z dodatkiem 150 mM

K2SO4 o pH 7.4; w przypadku pomiarów dotyczących ceruloplazminy,

transferyny i ferrytyny.

9.1. Charakterystyka nanocząstek magnetycznych:

składnika warstwy receptorowej czujników

Podstawowym elementem warstw receptorowych opisanych w niniejszej

rozprawie czujników do detekcji wybranych metaloprotein w próbkach krwi były

magnetyczne nanokapsuły węglowe zawierające żelazo, które zostały zsyntezowane

przez dr hab. Michała Bystrzejewskiego z Wydziału Chemii Uniwersytetu

Warszawskiego. W badaniach wykorzystano niezmodyfikowane nanocząstki

magnetyczne (Fe@C Nps), jak i nanocząstki magnetyczne, których powierzchnia

zmodyfikowana została grupami karboksylowymi (Fe@C-COOH Nps).

9.1.1. Niezmodyfikowane nanokapsuły węglowe zawierające żelazo

Wykorzystane w eksperymentach nanokapsuły węglowe zawierające żelazo

charakteryzują się słabymi właściwościami ferromagnetycznymi. Magnetyczna pętla

histerezy Fe@C Nps została przedstawiona na rysunku 41. Analizując poniższy

histogram można zauważyć, że zastosowane nanocząstki osiągają maksymalny

moment magnetyczny (121 emu·g-1

) przy stosunkowo niskim polu magnetycznym,

o natężeniu ok. 8 kOe. W przeprowadzonych badaniach jako źródło pola

magnetycznego zastosowano magnesy neodymowe (Fe14Nd2B) o różnym kształcie,

których indukcja magnetyczna mieściła się w zakresie 40÷90 mT. Wiadomo, że

przenikalność magnetyczna wody jest praktycznie identyczna jak przenikalność

magnetyczna powietrza, dlatego też wartość indukcji pola magnetycznego

o natężeniu 10 Oe wynosi 1 mT. Zatem zastosowane w badaniach magnesy stałe

wytwarzały pole magnetyczne o natężeniu w zakresie wartości: 400÷900 Oe.

Analizując dane uzyskane z magnetycznej pętli histerezy nanokapsuł Fe@C można

stwierdzić, że w warunkach pomiarowych nanocząstki magnetyczne osiągają

moment magnetyczny rzędu 21÷36 emu·g-1

. Rozkład wielkości nanokapsuł Fe@C

Nps (dolny wykres wewnętrzny na rysunku 41) pokazuje, że ich średnica mieści się


107

zakresie od 5 do 65 nm, a główną ich frakcję stanowią nanokapsuły o względnie

wąskim rozkładzie wielkości (5÷30 nm). Średnia wartość rozmiaru zastosowanych

nanokapsuł węglowych zawierających żelazo wynosiła ok. 20 nm.

pole magnetyczne / Oe

-10000 -5000 0 5000 10000

mag

ne

tyza

cja

/ e

mu

g

-1

-120

-80

-40

0

40

80

120

Hc / Oe

-500 0 500

Ms /

em

ug

-1

-40

-20

0

20

40

Ms = 121 emug

-1

/ nm

0 20 40 60 80 100

Zlicze

nia

0

50

100

150

200

śred. = 19 nm

Rysunek 41. Magnetyczna pętla histerezy (zmierzona w 25 °C) dla nanokapsuł Fe@C Nps.

Górny wykres wewnętrzny: powiększona magnetyzacja w obszarze -1000 ÷ 1000 Oe. Dolny

wykres wewnętrzny: rozkład wielkości nanokapsuł węglowych zawierających żelazo. Badania

wykonał dr hab. Michał Bystrzejewski.

9.1.2. Nanokapsuły węglowe zawierające żelazo zmodyfikowane

grupami karboksylowymi

Jedną z zalet nanokapsuł węglowych zawierających żelazo jest możliwość

modyfikacji ich powierzchni odpowiednimi grupami funkcyjnymi. W badaniach

zastosowano również nanocząstki magnetyczne zmodyfikowane grupami

karboksylowymi (Fe@C-COOH Nps). Rozkład wielkości tego typu nanokapsuł

mieścił się w zakresie od 5 do 140 nm, a główną ich frakcję stanowiły nanokapsuły

o średnicy 40 nm [413]. Maksymalna magnetyzacja nanocząstek wynosiła

ok. 54 emu·g-1

przy polu magnetycznym równym około 7 kOe. Nanokapsuły

węglowe Fe@C-COOH w warunkach pomiarowych, w których zastosowano pole

magnetyczne o indukcji magnetycznej wynoszącej 45÷90 mT, osiągały moment

magnetyczny od 8 do 26 emu·g-1

. Magnetyczną pętlę histerezy uzyskaną dla

Fe@C-COOH Nps przedstawia rysunek 42.


108

pole magnetyczne / Oe

-10000 -5000 0 5000 10000

ma

gn

ety

za

cja

/ e

mu

g

-1

-80

-40

0

40

80

Hc / Oe

-500 0 500M

s /

em

ug

-1-30

-20

-10

0

10

20

30

Ms = 54 emug

-1

/ nm

0 20 40 60 80 100 120 140

Zliczen

ia

0

5

10

15

20

25

śred.

= 40 nm

Rysunek 42. Magnetyczna pętla histerezy (zmierzona w 25 °C) dla nanokapsuł Fe@C-COOH.

Górny wykres wewnętrzny: powiększona magnetyzacja w obszarze -1000 ÷ 1000 Oe. Dolny

wykres wewnętrzny: rozkład wielkości nanokapsuł węglowych Fe@C-COOH. Badania wykonał

dr hab. Michał Bystrzejewski.

Nanocząstki te w swojej strukturze zawierają cztery fazy krystaliczne, takie jak:

grafit, bcc Fe, fcc Fe-C i Fe3C, a powierzchnia właściwa nanocząstki wynosiła

95 m2·g

-1. Z uwagi na obecność na ich powierzchni różnych grup kwasowych, takich

jak grupy karboksylowe, laktonowe czy fenolowe wykazują one właściwości

kwasowe, a przy wartości pH 4.5 osiagają punkt zerowego ładunku elektrycznego

[413].

Elektrograwimetryczny sensor do bezpośredniej detekcji hemoglobiny…

109

10. Elektrograwimetryczny sensor do bezpośredniej

detekcji hemoglobiny w próbkach krwi

W analizie klinicznej zawartość hemoglobiny w próbkach krwi określa się

głównie przy użyciu metod spektrofotometrycznych [414], kolorymetrycznych lub za

pomocą procedur immunologicznych [415]. Niestety, niejednokrotnie metody te

wykorzystują toksyczne i często rakotwórcze substancje, jak np. odczynnik

Drabkina, składający się z K3[Fe(CN)6], NaHCO3 i KCN [416]. Dodatkowo,

charakteryzują się one niską wrażliwością na dyskretne zmiany ilości hemoglobiny

we krwi. Kolejną wadą powszechnie stosowanych metod do oznaczeń Hb w analizie

klinicznej jest ich czasochłonność, której główną przyczyną jest konieczność

wstępnej obróbki próbki krwi i relatywnie długi czas reakcji z odczynnikiem

charakterystycznym dla danej metody [417]. Elektrochemiczne czujniki do oznaczeń

hemoglobiny we krwi mogą być zatem dobrą alternatywą w stosunku do obecnie

stosowanych metod klinicznych, ze względu na krótki czas analizy, niski koszt oraz

brak konieczności stosowania toksycznych odczynników.

Opisane w literaturze procedury elektrochemicznej detekcji Hb zasadniczo

dotyczą dwóch typów układów: (i) elektroda pracująca/warstwa pośrednicząca/

Hbadsorpcja lub (ii) elektroda/mediator/Hbroztwór. Przy czym doniesienia literaturowe

dotyczące bezpośredniej elektrochemicznej detekcji Hb rozpuszczonej w roztworze

są znikome. Wynika to z faktu, że centra elektroaktywne Hb, czyli grupy hemowe, są

głęboko osadzone w otoczce białkowej i w konsekwencji przeniesienie elektronu jest

zbyt powolne. Jednym z zadań badawczych postawionych w celu niniejszego

projektu doktorskiego było opracowanie procedury woltamperometrycznego

oznaczania ilości tego białka w analizowanym roztworze, w tym również

w próbkach naturalnych, w szybki i prosty sposób, bez konieczności stosowania

mediatorów. Ideą zaproponowanej metody detekcji hemoglobiny z roztworu było

wykorzystanie magnetycznych właściwości białka i jego oddziaływania

z ferromagnetycznym składnikiem warstwy receptorowej w obecności zewnętrznego

źródła pola magnetycznego, dzięki czemu możliwa była bezpośrednia

elektrochemiczna detekcja Hb z roztworu.


110

10.1. Optymalizacja warunków występowania

paramagnetycznej formy hemoglobiny

Jak wspomniano w rozdziale 4.2.1. hemoglobina, w zależności od warunków,

może występować w roztworze w różnych formach różniących się między sobą

stopniem utlenienia żelaza, zawartością w swojej strukturze tlenu, stabilnością, czy

też właściwościami magnetycznymi. W celu uzyskania stabilnej, paramagnetycznej

pochodnej hemoglobiny (methemoglobiny), zdolnej do oddziaływania

z ferromagnetycznym modyfikatorem powierzchni elektrody oraz z zewnętrznym

źródłem pola magnetycznego, nieodtleniony roztwór hemoglobiny poddano

działaniu nadtlenku wodoru. Nadtlenek wodoru został zastosowany w 10-krotnym

nadmiarze w stosunku do stężenia Hb, np.: dla roztworu Hb o stężeniu 0.10 µM,

stężenie H2O2 w tej samej objętości próbki wynosiło 1 µM. Takie stężenie H2O2

pozwoliło na całkowite przeprowadzenie Hb w stabilną, paramagnetyczną formę

– methemoglobinę, bez zniszczenia grup hemowych [418]. Skuteczność działania

zastosowanej procedury sprawdzono wykonując pomiary przy użyciu techniki

UV-vis. Uzyskane widma przedstawiono na rysunku 43.

długość falinm

300 400 500 600

A

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

długość fali / nm

480 500 520 540 560 580 600 620 640

A

0.0000

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020Hb

Hb + H2O

2 (1:10)

Hb+H2O

2 po 10 minutach

Rysunek 43. Widma UV-vis zarejestrowane dla 0.10 µM roztworu Hb przed i po dodaniu 1 µM

H2O2 w 0.02 M buforze PBS o pH 6.0. Rysunek wewnętrzny: powiększona część widma UV-Vis

w zakresie długości fali 460 ÷ 650 nm.

Widma UV-vis zarejestrowano dla roztworu hemoglobiny zarówno przed dodatkiem

nadtlenku wodoru, zaraz po jego dodaniu, jak i po 10 minutach oddziaływania


111

hemoglobiny z H2O2. Na uzyskanych widmach dobrze widoczne jest pasmo

absorpcji, charakterystyczne dla Hb, przy długości fali ok. 400 nm. Występowanie

tego pasma na widmie UV-vis potwierdza obecność nienaruszonych grup hemowych

w strukturze hemoglobiny [419]. Z literatury wiadomo, że położenie tego pasma jest

ściśle powiązane z formą hemoglobiny [420,421]. W tabeli 4 podano wartości

długości fali, przy których pojawia się pasmo absorpcji związane

z obecnością grup hemowych w strukturze Hb, w zależności od formy hemoglobiny

obecnej w roztworze. Należy podkreślić, że jego intensywność zależy nie tylko od

stężenia Hb, ale również od wartości molowego współczynnika absorpcji, wielkości

charakterystycznej dla danej formy hemoglobiny.

Tabela 4. Różne formy hemoglobiny występujące w roztworze i charakterystyczne dla nich

maksimum absorpcji przy danej długości fali w technice UV-vis [420,421].

Forma hemoglobiny Maksimum absorpcji

Deoksyhemoglobina

(deoksyHb) 430 nm

Oksyhemoglobina

(oksyHb) 415 nm

Methemoglobina

(metHb) 405 nm

Ferrylohemoglobina

(ferryloHb) 418 nm

Widmo UV-vis uzyskane dla roztworu hemoglobiny przed dodatkiem nadtlenku

wodoru (krzywa czarna na rysunku 43) pokazuje, że maksimum absorpcji pasma

pochodzącego od grup hemowych występuje przy długości fali ok. 412 nm.

Położenie tego pasma, zgodnie z danymi literaturowymi, wskazuje na obecność

w roztworze utlenowanej formy hemoglobiny, oksyhemoglobiny (oksyHb). Dodanie

do roztworu oksyHb 10-krotnego nadmiaru H2O2 spowodowało przesunięcie tego

pasma w kierunku mniejszych wartości długości fali, co potwierdza pojawienie się

w roztworze methemoglobiny (metHb). Zmiana intensywności tego pasma związana

jest ze zmianą formy Hb, jednakże jego obecność jest dowodem na brak destrukcji

grup hemowych w wyniku kontaktu Hb z taką ilością nadtlenku wodoru.

Dodatkowo, na widmach widoczne są zmiany intensywności pasm przy wartościach

długości fal: 540, 580 i 630 nm. Wzrost intensywności pasma przy długości fali 580

nm może wskazywać na utworzenie, w wyniku kontaktu hemoglobiny z nadtlenkiem


112

wodoru, mało stabilnej formy Hb, oksoferrylohemoglobiny (•HbFe(IV)=O) [420].

Rejestrując widma w funkcji czasu reakcji H2O2 z oksyHb widać również, że wzrost

intensywności absorbancji przy tej długości fali miał miejsce tylko w pierwszych

minutach reakcji H2O2 z oksyHb. W miarę wydłużania się czasu reakcji oksyHb

z nadtlenkiem wodoru następował spadek intensywności tego pasma, co wskazuje na

przejście mało stabilnej oksoferrylohemoglobiny w metHb. Badania spektroskopowe

pokazały, że pełne przejście oksyHb w metHb następuje w ciągu 10 minut

oddziaływania oksyHb z H2O2.

10.2. Procedura przygotowania warstwy receptorowej

czujnika i jej elektrochemiczna charakterystyka

Maksymalna elektroaktywność metaloprotein docierających do powierzchni

elektrody jest bezpośrednio związana z ich orientacją względem powierzchni

materiału przewodzącego. Zatem czynnikiem limitującym jest odległość centrów

redoks białka od powierzchni elektrody. Aby zapewnić maksymalną

elektroaktywność cząsteczek Hb docierających do przewodnika, w badaniach

wykorzystano pole magnetyczne wokół elektrody w trakcie przebiegu procesu

elektrodowego. W tym celu w roli modyfikatora powierzchni, umożliwiającego

kontrolę orientacji cząsteczek metHb, wykorzystano warstwę nanocząstek o silnych

właściwościach magnetycznych oddziałującą z paramagnetykiem (centrami

elektroaktywnymi białka). Schemat układu pomiarowego do bezpośredniej

woltamperometrycznej detekcji Hb w roztworze przedstawiony został na rysunku 44.

Hb(FeII)Hb(FeIII)

S

N

Au-EQCM/C/Fe@C Nps

e-

Rysunek 44. Schemat układu pomiarowego do detekcji Hb z roztworu.

Należy pamiętać, że jakość warstwy nanocząstek magnetycznych decyduje

o skuteczności działania takiej warstwy. Najbardziej popularną metodą tworzenia

warstwy nanocząstek magnetycznych na powierzchni elektrody jest ich adsorpcja

fizyczna. Jak powszechnie wiadomo, adsorpcja fizyczna nie prowadzi do


113

całkowitego i równomiernego pokrycia powierzchni elektrody modyfikującym

materiałem. Ze względu na możliwość denaturacji hemoglobiny w wyniku jej

kontaktu z powierzchnią złota, powierzchnia elektrody w pierwszym etapie pokryta

została warstwą amorficznego węgla, o grubości ok. 25 nm. Dopiero na tak

przygotowaną powierzchnię nakładano 100-µL kroplę zawiesiny nanocząstek

magnetycznych o stężeniu 0.125 mg·mL-1

i pozostawiano do wyschnięcia

w temperaturze pokojowej. Taka wartość stężenia nanocząstek w zawiesinie, zgodnie

z danymi literaturowymi, gwarantowała uzyskanie najbardziej jednorodnej i stabilnej

warstwy nanocząstek magnetycznych [422]. Nanokapsuły węglowe zawierające

żelazo dyspergowano w wodzie na dwa sposoby: (i) przy użyciu łaźni

ultradźwiękowej przez czas ok. 10 minut oraz (ii) homogenizatora

ultradźwiękowego. Morfologię uzyskanej warstwy badano za pomocą skaningowego

mikroskopu elektronowego. Zgodnie z uzyskanymi zdjęciami SEM,

przedstawionymi na rysunku 45 B, w przypadku zastosowania łaźni ultradźwiękowej

powierzchnia elektrody była nierównomiernie pokryta nanocząstkami

magnetycznymi, które tworzyły skupiska o różnej wielkości. Dużo lepszy stopień

pokrycia elektrody, bez widocznych agregatów nanocząstek, otrzymano przy użyciu

homogenizatora ultradźwiękowego, rysunek 45 C.

100 nm

A

10 mm

B

10 mm

C

1 mm

D

Rysunek 45. Zdjęcia SEM powierzchni elektrody Au-EQCM pokrytej amorficznym węglem

przed (A) i po modyfikacji warstwą nanocząstek magnetycznych, których zawiesinę otrzymano

przy użyciu łaźni ultradźwiękowej (B) oraz homogenizatora ultradźwiękowego po

rozmagnesowaniu (C) i po ponownym namagnesowaniu (D). Zdjęcia SEM wykonał prof. dr hab.

Mikołaj Donten.


114

Na podstawie uzyskanych zdjęć SEM można stwierdzić, że stopień pokrycia

powierzchni elektrody silnie zależy od sposobu przygotowania wodnej zawiesiny

Fe@C Nps. Wykorzystanie w tym celu homogenizatora ultradźwiękowego

pozwoliło uzyskać warstwę Fe@C Nps na powierzchni elektrody o zdecydowanie

lepszych parametrach. Procedura przygotowywania takiej zawiesiny polegała na

zastosowaniu 1-sekundowych pulsów o mocy 80 W, przerywanych pulsami

„spoczynkowymi” przez 90 s. Oczywiście przed procesem rozpraszania nanocząstki

Fe@C poddano samoistnemu rozmagnesowaniu poprzez zastosowanie ciągłego,

intensywnego strumienia ultradźwiękowego, o mocy 50 W, z jednocześnie

zanikającym polem magnetycznym. Powstała w opisany sposób jednorodna

zawiesina nanocząstek magnetycznych wykazywała zmniejszoną skłonność do

aglomeracji, co w konsekwencji pozwoliło na uzyskanie cienkiej i stosunkowo

równomiernej warstwy ferromagnetycznego modyfikatora na powierzchni elektrody.

Ponowne namagnesowanie Fe@C Nps następowało w wyniku przyłożenia magnesu

do elektrody. Wprowadzenie zewnętrznego źródła pola magnetycznego skutkowało

reorganizacją warstwy nanokapsuł, które układały się wzdłuż linii sił pola

magnetycznego (rysunek 45 D).

Elektrochemicznej charakterystyki uzyskanej warstwy receptorowej

(Au-EQCM/C/Fe@C Nps) dokonano przy użyciu elektrochemicznej spektroskopii

impedancyjnej. Pomiary prowadzono w obecności próbnika redoks, którym była

równomolowa (5 mM) mieszanina heksacjanożelazianu(III) i (II) potasu w 0.02 M

buforze PBS o pH 6.0, przy potencjale formalnym układu redoks [Fe(CN)6]3-/4-

wynoszącym 0.243 V. Przykładowe wykresy Nyquist’a dla chemicznie

niezmodyfikowanego kryształu kwarcu (Au-EQCM) oraz kryształu pokrytego

warstwą amorficznego węgla (Au-EQCM/C) i następnie warstwą nanocząstek

magnetycznych (Au-EQCM/C/Fe@C Nps) przedstawiono na rysunku 46. Jak

wynika z uzyskanych widm EIS, pokrycie złota napylonego na kryształ kwarcu

warstwą amorficznego węgla zdecydowanie utrudnia wymianę elektronów, czego

dowodem jest wzrost półkola na widmie Nyquist’a. Porównując ze sobą widma EIS

uzyskane dla chemicznie niezmodyfikowanej elektrody złotej i elektrody wykonanej

z węgla szklistego można stwierdzić, że utworzona warstwa węgla była zwarta,

cienka i szczelnie pokrywała modyfikowaną powierzchnię.


115

Z' /

0 100 200 300 400

-Z'' /

0

100

200

300 Au-EQCM (1)

Au-EQCM/C (2)

Au-EQCM/C/Fe@C Nps (3)

Z' /

0 400 800 1200

-Z'' /

0

400

800

1200GC

12

3

Rysunek 46. Wykresy Nyquist’a otrzymane dla chemicznie niezmodyfikowanej elektrody

Au-EQCM (1) oraz elektrod zmodyfikowanych warstwą węgla Au-EQCM/C (2), a następnie

warstwą nanocząstek magnetycznych (0.125 mg·mL-1

) Au-EQCM/C/Fe@C Nps (3). Rysunek

wewnętrzny: wykres Nyquist’a dla chemicznie niezmodyfikowanej elektrody GC.

Warunki pomiarowe: 5 mM Fe(CN)63−/4−

; 0.02 M bufor PBS o pH 6.0; Eapp. = 0.243V. Linie ciągłe

– krzywe dopasowane teoretycznie przy użyciu programu FRA; punkty – wyniki eksperymentalne.

W celu uzyskania informacji ilościowych z zarejestrowanych widm EIS, do każdej

krzywej eksperymentalnej dopasowano krzywą teoretyczną odpowiadającą

przyjętemu obwodowi zastępczemu, przedstawionemu na rysunku 39. Tabela 5

przedstawia wartości liczbowe parametrów impedancyjnych uzyskanych w wyniku

dopasowania krzywej teoretycznej do krzywej eksperymentalnej.

Tabela 5. Podstawowe parametry impedancyjne: parametr pojemnościowy elementu stało-

fazowego (Tdl); parametr potęgowy elementu stało-fazowego (dl); opór przeniesienia ładunku

(Rct); współczynnik Warburga (σ) i pojemność warstwy podwójnej (Cdl) uzyskane dla chemicznie

niezmodyfikowanej elektrody Au-EQCM oraz GC, jak również elektrody Au-EQCM pokrytej

warstwą węgla (Au-EQCM/C) i następnie nanokapsułami węglowymi (Au-EQCM/C/Fe@C Nps).

Tdl

[μFs(1-)

cm-2

]

dl Rct

[Ωcm2]

σ

[Ω rad1/2

s-1/2

cm2]

Cdl

[μFcm-2

]

GC 19.2 2.5 0.91 0.02 60.4 3.4 43.5 0.4 7.23 0.9

Au-EQCM 48.3 0.4 0.94 0.12 24.9 0.5 58.6 0.9 28.4 1.5

Au-EQCM/C 37.5 2.4 0.85 0.15 123.6 8.4 41.5 0.4 9.9 1.9

Au-EQCM/C/

Fe@C Nps 39.4 1.8 0.75 0.09 118.5 6.8 46.8 0.6 7.6 1.1


116

Jednym z tych parametrów jest parametr Rct opisujący wartość oporności

przeniesienia ładunku. Wartość tego parametru, po modyfikacji elektrody warstwą

amorficznego węgla, początkowo znacząco wzrasta w stosunku do wartości

uzyskanej dla chemicznie niezmodyfikowanego kryształu kwarcu, a następnie

w wyniku dalszej modyfikacji nanokapsułami węglowymi nieznacznie spada.

Jednorodność i szczelność warstwy napylonego węgla potwierdza nieznaczna

zmiana wartości potęgowego elementu stało-fazowego (dl). Tylko dla idealnych

monokrystalicznych powierzchni elektrod jego wartość jest równa jedności [423].

Jak widać z uzyskanych danych przedstawionych w tabeli 5, wartość tego parametru

osiąga minimum dla elektrody Au-EQCM z napylonym węglem i nanokapsułami

węglowymi. Należy jednak podkreślić, że spadek wartości parametru dl stanowi

jedynie 20% jego początkowej wartości, uzyskanej dla chemicznie

niezmodyfikowanego kryształu kwarcu. Fakt ten wskazuje na równomierne pokrycie

elektrody zarówno warstwą węgla, jak również warstwą ferromagnetyka.

Dodatkowo, modyfikacja elektrody miała również niewielki wpływ na szybkość

transportu próbnika redoks, gdyż wartość parametru Warburga tylko nieznacznie

zmalała w porównaniu do wartości dla niezmodyfikowanej elektrody.

10.3. Elektrochemiczna i grawimetryczna charakterystyka

sensora do bezpośredniej detekcji hemoglobiny

W celu otrzymania informacji o wpływie pola magnetycznego

i ferromagnetycznego modyfikatora powierzchni elektrody na elektrochemiczny

sygnał paramagnetycznej formy hemoglobiny, przeprowadzono pomiary

woltamperometryczne w obecności i nieobecności zewnętrznego źródła pola

magnetycznego. Uzyskane wyniki, przedstawione na rysunku 47, stanowią

niezaprzeczalny dowód, że obecność pola magnetycznego nie tylko zwiększa

intensywność rejestrowanego sygnału prądowego, ale również powoduje jego

przesunięcie o ok. 120 mV w kierunku bardziej dodatnich wartości potencjału.


117

E / V vs. Ag/AgCl/3 M KCl/0.1 M KNO3

-0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0

I Hb /

A

-150

-100

-50

0

Au-EQCM/C/Fe@C Nps

E / V vs. Ag/AgCl

-0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4

I Hb /

A

-60

-40

-20

0

10 M H2O

2

Hb + H2O

2

(1 : 10)

Rysunek 47. Woltamperogramy liniowe zarejestrowane na elektrodzie Au-EQCM/C/Fe@C Nps

w 0.02 M buforze PBS o pH 6.0 zawierającym: 10 µM H2O2 (linie czarne) i Hb (6.4510-5

gdL-1

10 nM) z dodatkiem 100 nM H2O2 (linie czerwone), w obecności (linie ciągłe) i nieobecności

(linie przerywane) zewnętrznego pola magnetycznego (40 mT). Rysunek wewnętrzny:

woltamperogram cykliczny zarejestrowany w 0.02 M buforze PBS w obecności zewnętrznego

pola magnetycznego, szybkość przemiatania potencjałem: 20 mV·s-1

.

Przesunięcie to świadczy o łatwiejszej redukcji jonów Fe(III) do jonów Fe(II)

w obecności pola magnetycznego podczas pomiaru woltamoperometrycznego.

Łatwiejszy proces redukcji jest konsekwencją konformacji metHb. Z literatury

wiadomo, że konformacja metHb określana jest jako stan R, czyli jest to luźna forma

Hb, w której grupy hemowe usytuowane są blisko zewnętrznej powłoki białkowej

[76]. Obecność pola magnetycznego sprawia, że grupy hemowe są jeszcze bardziej

wyeksponowane na zewnątrz otoczki białkowej. Z kolei wzrost intensywności tego

sygnału z jednej strony związany jest ze wzrostem strumienia paramagnetycznych

cząsteczek hemoglobiny do powierzchni elektrody w obecności pola magnetycznego,

a z drugiej zaś z optymalnym ustawieniem cząsteczek metHb względem powierzchni

elektrody, umożliwiającym zajście reakcji elektrochemicznej. Brak sygnału

utleniania w zakresie potencjałów 0 ÷ 0.4 V na woltamperogramie cyklicznym,

przedstawionym na wykresie wewnętrznym rysunku 47, potwierdza brak destrukcji

grup hemowych w wyniku ich kontaktu z nadtlenkiem wodoru. W związku z tym, że

obecność nadtlenku wodoru w roztworze może dawać sygnał w podobnym zakresie

potencjałowym jak methemoglobina, wykonano eksperyment kontrolny w 0.02 M

buforze fosforanowym, zawierającym tylko nadtlenek wodoru. Zarejestrowane

krzywe, oznaczone kolorem czarnym na głównym wykresie rysunku 47, wyraźnie


118

wskazują, że dodatek nadtlenku wodoru nie ma widocznego wpływu na

intensywność prądu w zakresie, w którym obserwuje się sygnał pochodzący od

elektroredukcji metHb.

Charakterystyki analitycznej sensora do bezpośredniej detekcji Hb

w próbkach krwi dokonano przy użyciu woltamperometrii liniowej i mikrowagi

kwarcowej w zakresie stężeń Hb 3.2·10-9

6.5·10-4

g·dL-1

(co odpowiada 0.5 pM

0.1 µM). Na podstawie przeprowadzonych pomiarów wyznaczono zakres stężeń Hb

w roztworze, dla którego uzyskiwano liniową odpowiedź sensora oraz granicę

wykrywalności. Otrzymane liniowe krzywe woltamperometryczne uzyskane dla

różnych stężeń Hb w roztworze w obecności zewnętrznego pola magnetycznego

ilustruje rysunek 48. W analizowanym zakresie stężeń Hb następował wzrost

intensywności sygnału prądowego elektroredukcji metHb przy potencjale ok. -0.3 V.

Z uwagi na fakt, że produkt redukcji metHb silnie i trwale adsorbował się na

zmodyfikowanej powierzchni elektrody pomiary dla każdego ze stężeń

przeprowadzono na świeżo przygotowanej elektrodzie.


-0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0

I Hb /

A

-120.0

-100.0

-80.0

-60.0

-40.0

-20.0

0.0

20.0

krew szczurza

tło

krew ludzka

CHb

= 3.210-9 gdL

-1

CHb

= 6.510-4 gdL

-1

Rysunek 48. Woltamperogramy liniowe zarejestrowane na elektrodzie Au-EQCM/C/Fe@C Nps

dla Hb o różnym stężeniu rozpuszczonej w 0.02 M PBS (pH 6.0) oraz dla Hb obecnej we krwi

ludzkiej (niebieska krzywa) i szczurzej (czerwona krzywa) rozcieńczonej 106-krotnie, w obecności

zewnętrznego pola magnetycznego (40 mT). Szybkość przemiatania potencjałem: 20 mV·s-1

.

Dla wybranego stężenia metHb przeprowadzono badania dotyczące wpływu wartości

szybkości polaryzacji elektrody na uzyskiwane wartości prądu. Ze wzrostem

szybkości polaryzacji elektrody obserwowano wzrost wartości sygnału prądowego


119

i jego przesuniecie w kierunku bardziej ujemnych wartości potencjału. Wartość

prądu katodowego wzrastała liniowo, proporcjonalnie do pierwiastka kwadratowego

z szybkości polaryzacji, w zakresie od 5 do 500 mV·s-1

. Współczynnik korelacji

zależności I = f(v0.5

) wynosił 0.997. Uzyskane wyniki potwierdziły, że proces

redukcji metHb na zmodyfikowanej powierzchni elektrody

(Au-EQCM/C/Fe@C Nps), w przypadku niskich stężeń hemoglobiny w roztworze,

w obecności zewnętrznego pola magnetycznego, kontrolowany jest transportem

depolaryzatora do powierzchni elektrody. Porównanie masy hemoglobiny

zaadsorbowanej na powierzchni elektrody po procesie elektroredukcji (wyznaczonej

z pomiarów QCM) z wartością ładunku procesu elektrodowego pozwoliło

wyznaczyć liczbę elektronów biorących udział w procesie redukcji metHb.

Z uzyskanych danych wynika, że pojedyncza grupa hemowa podczas procesu

elektrodowego wymienia z powierzchnią przewodnika jeden elektron.

Zastosowanie elektrochemicznej mikrowagi kwarcowej pozwoliło na

jednoczesny pomiar zmian natężenia prądu w funkcji przykładanego potencjału, jak

i zmian częstotliwości drgań kryształu kwarcu w czasie przebiegu procesu

elektrodowego. Przykładowe krzywe ilustrujące zmiany częstotliwości drgań

kryształu kwarcu przedstawione zostały na rysunku 49.

czas / s

0 20 40 60 80 100 120 140

f

/ H

z

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0 CHb

= 3.210-9 gdL

-1

krew szczurza

krew ludzka

CHb

= 6.510-4

gdL-1

Rysunek 49. Zmiany częstotliwości drgań kryształu kwarcu zarejestrowane na elektrodzie

Au-EQCM/C/Fe@C Nps w trakcie redukcji Hb rozpuszczonej w buforze PBS o pH 6.0 oraz Hb

obecnej we krwi ludzkiej (niebieska krzywa) i szczurzej (czerwona krzywa) rozcieńczonej

106-krotnie, w obecności zewnętrznego pola magnetycznego (40 mT).


120

Wraz ze wzrostem stężenia hemoglobiny w roztworze zmniejszała się częstotliwość

drgań kryształu kwarcu, a zatem produkt elektroredukcji metHb silniej i szybciej

adsorbował się na powierzchni zmodyfikowanej elektrody. Proces adsorpcji Hb

potwierdzały nieznaczne zmiany częstotliwości drgań kryształu kwarcu (na poziomie

10 Hz) podczas rejestracji prądów anodowych.

Na podstawie danych uzyskanych z eksperymentów przeprowadzonych za

pomocą techniki LSV oraz EQCM sporządzono krzywe kalibracyjne w funkcji

logarytmu ze stężenia hemoglobiny w roztworze, przedstawione na rysunku 50.

Liniowe zmiany odpowiedzi skonstruowanego czujnika obserwowano w szerokim

zakresie stężeń hemoglobiny w roztworze od 6.5·10-9

do 6.5·10-4

g·dL-1

, co

opowiada zakresowi od 1 pM do 0.1 µM. Należy jednak podkreślić, że w przypadku

wykreślenia zależności IHb = f(CHb) obserwowano dwa różne przebiegi. Pierwszy

idealnie liniowy dla stężeń metHb w zakresie od 1 pM do 0.1 nM oraz drugi dla

stężeń metHb w roztworze powyżej 0.1 nM, charakteryzujący się coraz większymi

odchyleniami od liniowości. Ta utrata liniowości zależności IHb = f(CHb)

najprawdopodobniej związana jest z efektem blokowania powierzchni elektrody

przez produkt redukcji metHb, który nieodwracalnie adsorbował się na powierzchni

zmodyfikowanej elektrody.

CHb / gdL-1

1e-8 1e-7 1e-6 1e-5 1e-4 1e-3

I Hb /

A

-120.0

-100.0

-80.0

-60.0

-40.0

-20.0

0.0

f

/ H

z-100

-80

-60

-40

-20

0

Rysunek 50. Krzywe kalibracyjne skonstruowanego sensora do detekcji Hb otrzymane na

podstawie danych uzyskanych za pomocą techniki elektrochemicznej mikrowagi kwarcowej

i woltamperometrii liniowej (oś X: skala logarytmiczna).


121

Granica wykrywalności hemoglobiny została wyznaczona z dolnego zakresu

prostoliniowości krzywej kalibracyjnej, zgodnie z równaniem:

bb 3LOD ζY (31)

gdzie: Yb oznacza średnią wartość sygnału ślepej próby (0.02 M PBS o pH 6.0),

natomiast b to odchylenie standardowe dla ślepej próby z 5 pomiarów. Wyznaczona

w ten sposób granica wykrywalności wynosiła 5·10-9

g·dL-1

(0.7 pM). W przypadku

wszystkich stężeń metHb z zakresu liniowego krzywej kalibracyjnej powtarzalność

wyników była bardzo dobra, a względne odchylenie standardowe wynosiło około

9.5% (n = 5). Sprawdzono również powtarzalność wyników uzyskanych dla tego

samego stężenia Hb, ale na sześciu różnych, niezależnie zmodyfikowanych

elektrodach i w tym przypadku względne odchylenie standardowe wynosiło około

5.2%.

10.4. Funkcjonalność sensora do bezpośredniej detekcji Hb

w próbkach naturalnych

Funkcjonalność zaproponowanego sensora do bezpośredniej

elektrochemicznej detekcji hemoglobiny w roztworze sprawdzono względem próbek

naturalnych, ludzkiej i szczurzej krwi. Próbki krwi otrzymano z Warszawskiego

Uniwersytetu Medycznego od prof. dr hab. I.P. Grudzińskiego. Hemoglobina jest

głównym składnikiem czerwonych krwinek (RBC, elementów morfotycznych krwi).

W pierwszej kolejności należało przeprowadzić hemolizę krwi w celu uwolnienia Hb

z RBC, w wyniku której następuje przejście hemoglobiny do osocza krwi na skutek

zniszczenia erytrocytów. Hemoliza może być wywołana różnego typu czynnikami,

np.: toksykantami, obniżeniem pH krwi lub też w wyniku kontaktu próbki krwi

z hipotonicznym roztworem (o niskiej zawartości jonów). W prowadzonych

badaniach hemolizę krwi przeprowadzono poprzez jej 106-krotne rozcieńczenie

0.02 M buforem PBS o pH 6.0 oraz późniejszą 20-minutową inkubację. Postęp

procesu hemolizy kontrolowano za pomocą skaningowego mikroskopu

elektronowego. Na podstawie uzyskanych zdjęć SEM, przedstawionych na rysunku

51, można stwierdzić, że czas 10 minut nie był wystarczający do całkowitego

uwolnienia hemoglobiny z czerwonych krwinek. Na zdjęciu SEM (rysunek 51A)

wciąż widoczne są czerwone krwinki. Optymalny czas hemolizy, pozwalający na


122

całkowite uwolnienie hemoglobiny z wnętrza czerwonych krwinek wynosił 20

minut.

A B C

Rysunek 51. Zdjęcia SEM roztworów krwi szczurzej wykonane po pomiarach

elektrochemicznych dla dwóch czasów hemolizy: (A) 10 minut oraz (B, C) 20 minut. Zdjęcia

zostały wykonane przez prof. dr hab. Mikołaja Dontena.

Po zakończeniu procesu hemolizy, do rozcieńczonych próbek krwi dodawano

nadtlenek wodoru o stężeniu 0.10 mM, odczekiwano 10 minut i przeprowadzano

jednocześnie pomiary woltamperometryczne i grawimetryczne w obecności

zewnętrznego źródła pola magnetycznego. Schemat postępowania w przypadku

oznaczania hemoglobiny w próbkach krwi ilustruje rysunek 52.

e-1)hemoliza

2)H2O2

3)LSV/EQCM

detekcja

przed po

HbFe(III) HbFe(II)

MAGNES

Rysunek 52. Schemat procedury postępowania w oznaczeniach hemoglobiny w próbkach krwi.

Uzyskane krzywe LSV oraz QCM dla próbek krwi przedstawiają linie oznaczone

kolorem niebieskim i czerwonym na rysunkach 48 i 49, odpowiednio dla krwi

ludzkiej i szczurzej. Dla obu analizowanych próbek krwi zaobserwowano

przesunięcie sygnałów prądowych redukcji Hb o około 0.2 V w kierunku bardziej

ujemnych wartości potencjału, w odniesieniu do sygnałów otrzymanych dla

roztworów z wyizolowaną Hb. Powodem tej różnicy jest fakt, że próbka naturalna

ma znacznie bardziej skomplikowany skład w porównaniu z roztworem

wyizolowanej Hb. Złożoność matrycy próbek krwi wpływa na położenie sygnałów

prądowych, natomiast nie ma wpływu na ich intensywność. Zatem zależność

kalibracyjna otrzymana dla roztworów wyizolowanej hemoglobiny może być

wykorzystywana do analizy ilościowej próbek krwi. Otrzymane wyniki porównano

z danymi uzyskanymi za pomocą standardowej analizy klinicznej, co przedstawia

tabela 6.


123

Tabela 6. Porównanie danych zawartości Hb w próbkach naturalnych uzyskanych na podstawie

analizy klinicznej i proponowanego sensora.

Krew ludzka [g·dL-1

] Krew szczurza [g·dL-1

]

Analiza kliniczna 14.5 0.2 13.2 0.4

Bezpośrednia elektrochemiczna detekcja

LSV 13.9 0.8 13.1 0.6

EQCM 13.1 1.4 13.2 1.2

Analiza kliniczna zawartości hemoglobiny w próbkach krwi ludzkiej i szczurzej

przeprowadzona została na Warszawskim Uniwersytecie Medycznym przez grupę

prof. dr hab. I.P. Grudzińskiego. Wyniki zaprezentowane w tabeli 5 są wartością

średnią z trzech niezależnych pomiarów dla różnych próbek krwi. Oznaczenia

stężenia hemoglobiny w badanych próbkach krwi dokonano metodą

kolorymetryczną przy długości fali 546 nm, przy użyciu kompaktowego analizatora

hematologicznego BC-2800 VET (Mindray) i systemu ADVIA 120 Hematology

(Siemens) dla całej próbki krwi ludzkiej i szczurzej. Otrzymane wyniki pokazują, że

stężenia hemoglobiny w próbkach naturalnych wyznaczone za pomocą

zaproponowanego sensora oraz analizatora klinicznego są w bardzo dobrej

zgodności.

10.5. Podsumowanie

Opisany w niniejszym rozdziale sensor do bezpośredniej elektrochemicznej

detekcji hemoglobiny pozwolił z dużą dokładnością, w prosty i szybki sposób

oznaczyć zawartość Hb w skomplikowanych matrycach, takich jak krew ludzka

i szczurza. Jego zasada działania oparta była na oddziaływaniu paramagnetycznego

białka (hemoglobiny) z ferromagnetycznym składnikiem warstwy receptorowej

sensora w obecności zewnętrznego źródła pola magnetycznego. Zastosowanie

nanokapsuł węglowych zawierających żelazo oraz zewnętrznego źródła pola

magnetycznego zapewniło odpowiednią, do zajścia procesu elektrodowego,

orientację cząsteczek Hb względem powierzchni elektrody. Dużą zaletą

zaproponowanego sensora był brak konieczności specjalnego przygotowania próbek

krwi przed pomiarem. Ponadto przedstawione wyniki pokazują, że proponowany

sensor pozwolił na oznaczenie zawartości Hb w analizowanej próbce z dużą


124

czułością, dobrą powtarzalnością i bardzo niską granicą wykrywalności, rzędu pM.

Należy podkreślić, że połączenie techniki LSV oraz QCM pozwoliło na uzyskanie

bardziej kompletnych informacji na temat przebiegu procesu detekcji. Z kolei analiza

zdjęć uzyskanych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego wykazała,

że proces adsorpcji cząsteczek hemoglobiny ma miejsce głównie na

ferromagnetycznym modyfikatorze powierzchni elektrody. Opracowana procedura

może być z powodzeniem stosowana do analizy różnego typu paramagnetycznych

białek, zarówno w buforze, jak i w płynach ustrojowych.

Wpływ pola magnetycznego na aktywność elektrochemiczną i katalityczną…

125

11. Wpływ pola magnetycznego na aktywność

elektrochemiczną i katalityczną ceruloplazminy

Jednoczesna elektrochemiczna analiza kilku białek zawartych we krwi jest

niezwykle trudna do osiągnięcia, gdyż często produkty ich procesów elektrodowych,

jak również one same łatwo adsorbują się na powierzchni elektrody, blokując ją

i uniemożliwiając tym samym dalsze pomiary. Dodatkowo, analiza kilku białek przy

użyciu tego samego czujnika woltamperometrycznego jest możliwa tylko wtedy, gdy

sygnały prądowe pochodzące od procesów elektrodowych poszczególnych białek

różnią się położeniem na osi potencjału. Badania woltamperometryczne

hemoglobiny pokazały, że odpowiednie rozcieńczenie roztworu (CHb < 0.1 nM)

pozwala zminimalizować na tyle efekt blokowania powierzchni elektrody przez

produkt redukcji metHb, że możliwe jest wykonanie kolejnej analizy, bez

konieczności użycia świeżo przygotowanego czujnika. Zatem kolejny etap badań

dotyczył jednoczesnej analizy ilościowej ceruloplazminy i hemoglobiny w trakcie

pojedynczego pomiaru, bez konieczności specjalnego przygotowania analizowanej

próbki krwi. Taka analiza jest możliwa, z uwagi na fakt, że w skład ich struktury

wchodzą inne jony metali (hemoglobina zawiera jony Fe, zaś ceruloplazmina jony

Cu). Zatem, zgodnie z doniesieniami literaturowymi, sygnały prądowe Hb i Cp

pojawiają się w zupełnie innych miejscach na skali potencjałowej. Dodatkowo,

obecne w warstwie receptorowej (Au-EQCM/C/Fe@C Nps) magnetyczne

nanokapsuły węglowe w połączeniu z polem magnetycznym powinny zapewniać

maksymalną elektroaktywność cząsteczek białek docierających do powierzchni

czujnika.

11.1. Analityczna charakterystyka czujnika

Analogicznie, jak w przypadku czujnika do detekcji hemoglobiny, przed

przystąpieniem do badań próbek krwi, w pierwszej kolejności dokonano

charakterystyki analitycznej czujnika. Uściślając, wyznaczono: zakres pracy czujnika

oraz osiąganą przy jego użyciu granicę wykrywalności. Ta część badań została

wykonana na roztworach zawierających tylko ceruloplazminę w szerokim zakresie

stężeń tego białka od 2 do 500 mg·dL-1

. Ceruloplazmina, jak i inne białka, wykazuje


126

również dużą tendencję do adsorpcji na różnego typu podłożach, dlatego też dobrze

wykształcone i odtwarzalne sygnały prądowe Cp uzyskano tylko w przypadku

znacznie rozcieńczonych roztworów, których stężenie nie przekraczało wartości

5 mg·dL-1

. Dla bardziej stężonych roztworów ceruloplazminy proces adsorpcji był tak

szybki, że uzyskanie dobrze zdefiniowanych i odtwarzalnych sygnałów prądowych

było niemożliwe. Wpływ stężenia Cp w roztworze na efektywność adsorpcji tego

białka dobrze ilustrują mapy rozkładu izotopów (65

Cu i 57

Fe, pochodzące

odpowiednio z białka i modyfikatora powierzchni elektrody) na monitorowanym

obszarze elektrody przy użyciu techniki LA-ICP-MS, przedstawione na rysunku 53.


-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

I /

A

-0.3

0.0

0.3

0.6

0.9

tło

5 gdL-1

0.2 gdL-1

CCp

Cp: 5 gdL-1

Cp: 0.2 gdL-1

65Cu65 Fe57

Cu65 Fe57

Rysunek 53. Cykliczne krzywe woltamperometryczne Cp o różnym stężeniu zarejestrowane na

elektrodzie Au-EQCM/C/Fe@C Nps. Warunki eksperymentalne: 0.02 M bufor PB

(pH 7.4) zawierający 150 mM K2SO4 w obecności zewnętrznego źródła pola magnetycznego

(magnes neodymowy 40 mT); szybkość przemiatania potencjałem: 25 mV·s-1

. Rysunek

wewnętrzny: mapy rozkładu izotopów (65

Cu i 57

Fe) na obserwowanym obszarze elektrody po

zarejestrowaniu pojedynczego woltamperogramu. Pomiary LA-ICP-MS wykonała dr hab. Barbara

Wagner.

Otrzymane mapy stanowią niepodważalny dowód, że wraz ze wzrostem stężenia

białka coraz skuteczniej i szybciej blokuje ono powierzchnię elektrody. Dodatkowo,

badania te wykazały, że adsorpcja ceruloplazminy miała miejsce głównie na

powierzchni nanocząstek magnetycznych.

Badania woltamperometryczne wykazały, że wraz ze wzrostem stężenia

ceruloplazminy w roztworze, w zakresie od 0.2 mgdL-1

do 5 mgdL-1

, następował

wzrost intensywności sygnałów procesów elektrodowych Cp, co ilustrują


127

odpowiednie krzywe woltamperometryczne na rysunku 53. Należy zaznaczyć, że

zmiany intensywności sygnałów prądowych w funkcji stężenia Cp są bardziej

widoczne w przypadku sygnałów anodowych, niż sygnałów katodowych.

Najprawdopodobniej, produkt utleniania Cp adsorbując się na powierzchni elektrody

w istotnym stopniu zaburzał przebieg reakcji katodowej. Ponadto kształt piku

anodowego (pik szeroki i rozmyty) wskazuje na złożoność tego procesu. Z literatury

wiadomo, że wszystkie centra miedziowe obecne w strukturze ceruloplazminy są

zdolne do wymiany elektronu z elektrodą, jednak szybkość tej wymiany jest ściśle

powiązana z ich otoczeniem. Ma to swoje odzwierciedlenie w wartościach

potencjałów redoks poszczególnych centrów, które znacznie się od siebie różnią.

Wartości potencjałów centrów redoks Cp przedstawione zostały w tabeli 7.

Tabela 7. Potencjały redoks poszczególnych centrów miedziowych ceruloplazminy wyznaczone

względem elektrody wodorowej (NHE) w buforze fosforanowym.

CENTRA MIEDZIOWE

T1CysHis T1Remote T1PR T2/T3

E v

s. N

HE

[mV

]

490 [424]

580 [109]

~1000 [106]

491/415 [109]

brak jonów Cl–

448 [109]

brak jonów Cl– 539/482 [109]

jony Cl– obecne w roztworze 434 [109]

jony Cl– obecne w roztworze

W celu uzyskania informacji, od którego z centrów T1 ceruloplazminy pochodzi

anodowy sygnał prądowy widoczny w zakresie potencjałów 0.08 ÷ 0.44 V,

wykonano pomiary z użyciem woltamperometrii fali prostokątnej.

Woltamperometria fali prostokątnej, z uwagi na sposób pomiaru prądu, jest

zdecydowanie bardziej czułą techniką niż woltamperometria cykliczna.

Zastosowanie tej techniki pozwoliło na rozdzielenie sygnałów prądowych

pochodzących od centrów T1 ceruloplazminy, co ilustruje rysunek 54. Sygnały

anodowe pojawiające się przy potencjałach 0.12 oraz 0.22 V względem elektrody

Ag/AgCl/3 M KCl/0.1 M KNO3 (0.40 i 0.50 V względem NHE), zgodnie z literaturą

odpowiadają sygnałom utleniania centrów miedziowych T1CysHis i T1Remote [109].

Sygnały te występują jednak przy bardziej ujemnych potencjałach w odniesieniu do

danych literaturowych przedstawionych w tabeli 7. Najprawdopodobniej, różnice

w położeniach tych sygnałów względem danych literaturowych wynikają ze zmian

konformacyjnych cząsteczki Cp zachodzących pod wpływem pola magnetycznego.


128

Zgodnie z klasyfikacją według Norde ceruloplazmina, która posiada budowę

domenową, zaliczana jest do grupy białek „miękkich” [425-427], wykazujących dużą

tendencję do zmian konformacyjnych pod wpływem różnych czynników.


0.00 0.20 0.40 0.60

I /

A

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

20 gdL-1

0.2 gdL-1

CCp

E / V

0.0 0.2 0.4 0.6I

/

A

0.0

0.1

0.2

0.3bez magnesu

z magnesem

Rysunek 54. Woltamperogramy SWV zarejestrowane na zmodyfikowanej ferromagnetykiem

elektrodzie (GC) dla różnych stężeń Cp w 0.02 M PB z dodatkiem 150 mM K2SO4 o pH 7.4,

w obecności pola magnetycznego (40 mT). Wykres wewnętrzny: krzywe SWV zarejestrowane

w obecności i nieobecności pola magnetycznego.

Analogicznie, jak w przypadku pomiarów z użyciem woltamperometrii cyklicznej

zastosowanie bardziej stężonych roztworów Cp (CCp > 20 mgdL-1

) prowadziło do

nakładania się sygnałów prądowych centrów T1CysHis i T1Remote. Istotny jest również

fakt, że usunięcie magnesu z otoczenia elektrody w trakcie pomiaru

elektrochemicznego skutkowało zanikiem sygnałów prądowych tych centrów.

Z uwagi na powszechność zjawiska adsorpcji białek nawet z roztworów

o niskiej ich zawartości, kolejny etap badań dotyczył uzyskania odpowiedzi, czy

w danych warunkach (CCp > 5 mgdL-1

) proces elektrodowy Cp kontrolowany jest

transportem białka do powierzchni elektrody, czy też może szybkością wymiany

elektronu. W tym celu wykonano pomiary wpływu szybkości przemiatania

potencjałem na intensywność sygnałów prądowych. Analizę przeprowadzono dla

roztworu zawierającego ceruloplazminę na poziomie 0.5 mgdL-1

, taki poziom białka

znaczenie spowalniał jego proces adsorpcji. Następnie wykreślono zależności

intensywności uzyskanych sygnałów prądowych w funkcji pierwiastka


129

kwadratowego z szybkości przemiatania potencjałem i w funkcji szybkości.

Uzyskane wyniki przedstawiono na rysunku 55.

v0.5

/ (mVs-1

)0.5

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

I p, a /

A

0.0

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

1.8

v / mVs-1

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

I p, k /

A

-0.12

-0.09

-0.06

-0.03

0.00

Rysunek 55. Zależność intensywności prądów anodowych i katodowych w obecności pola

magnetycznego (40 mT) odpowiednio od pierwiastka kwadratowego z szybkości skanowania i od

szybkości polaryzacji elektrody. Warunki eksperymentalne: CCp = 0.5 mg·dL-1

; 0.02 M PB

z dodatkiem 150 mM K2SO4, pH 7.4.

W przypadku piku utleniania, jego intensywność wzrastała liniowo, proporcjonalnie

do pierwiastka kwadratowego z szybkości polaryzacji w zakresie 5 200 mV·s-1

.

Wyznaczony współczynnik korelacji Ip,an = f(v0.5

) wynosił 0.998. Natomiast

intensywność sygnałów katodowych była wprost proporcjonalna do szybkości

polaryzacji elektrody, a wyznaczony dla tej zależności współczynnik korelacji

wynosił 0.999. Uzyskane wyniki dowodzą, że proces elektroutleniania Cp na

elektrodzie zmodyfikowanej warstwą receptorową (Au-EQCM/C/Fe@C Nps),

w obecności zewnętrznego źródła pola magnetycznego, jest kontrolowany

transportem depolaryzatora (Cp) do powierzchni elektrody. Niestety produkty tego

procesu adsorbują się na powierzchni elektrody, utrudniając rejestrację sygnałów

katodowych. Z tego powodu każdy pomiar elektrochemiczny prowadzony był na

świeżo przygotowanej warstwie receptorowej. Dla każdej szybkości polaryzacji

elektrody pomiar powtarzano co najmniej 3-krotnie. Zgodność uzyskanych wyników


130

była bardzo dobra; uzyskiwane odchylenia standardowe dla danej szybkości

polaryzacji nie przekraczały 10%.

Częściowe blokowanie powierzchni elektrody związane z procesem adsorpcji

ceruloplazminy i jej produktów utleniania, szczególnie w przypadku roztworów Cp

o stężeniach większych niż 2 mgdL-1

, potwierdzają również wyniki uzyskane przy

użyciu elektrochemicznej mikrowagi kwarcowej, przedstawione na rysunku 56.

czas / s

0 20 40 60 80 100 120

f

/ H

z

-20

-15

-10

-5

01 cykl CV 2 cykl CV


0.0 0.2 0.4 0.6

I /

A

-0.2

0.0

0.2

0.4

1 cykl CV

2 cykl CV

Rysunek 56. Zmiany częstotliwości drgań kryształu kwarcu oraz odpowiadające im

woltamperogramy cykliczne skorygowane o tło (pierwszy i drugi cykl), zarejestrowane na

elektrodzie Au-EQCM/C/Fe@C Nps dla roztworów Cp o stężeniu 3 mg·dL-1

w 0.02 M PB

z dodatkiem 150 mM K2SO4 o pH 7.4, w obecności pola magnetycznego (40 mT); szybkość

przemiatania potencjałem: 25 mV·s-1

.


131

Pik utleniania Cp występuje jedynie w przypadku pierwszego cyklu

woltamperometrycznego, a w kolejnych cyklach zanika, ponieważ jak już

wspomiano, produkt utleniania Cp, jak i samo białko osadzone podczas pierwszego

cyklu efektywnie blokują powierzchnię elektrody. Obserwowane zmiany

częstotliwości drgań kryształu kwarcu podczas drugiego cyklu są znacznie mniejsze

w odniesieniu do pierwszego cyklu.

Zakres pracy czujnika do bezpośredniej elektrochemicznej detekcji

ceruloplazminy z roztworu określono na podstawie liniowego przedziału zmian

intensywności sygnału prądowego utleniania ceruloplazminy w funkcji jej stężenia

w roztworze, przedstawionego na rysunku 57.

CCp / gdL-1

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0

I E=

0.2

2 V

/

A

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

Rysunek 57. Krzywa kalibracyjna wyznaczona na podstawie zmian intensywności sygnału

utleniania Cp w zależności od stężenia ceruloplazminy w roztworze. Warunki eksperymentalne:

0.02 M bufor PB (pH 7.4) zawierający 150 mM K2SO4 w obecności zewnętrznego źródła pola

magnetycznego (40 mT); szybkość przemiatania potencjałem: 25 mV·s-1

.

Otrzymana zależność charakteryzowała się liniową zmianą odpowiedzi prądowej

(Ip = (8.31 ± 0.15)CCp + (0.05 ± 0.004); r = 0.999) w zakresie stężeń od 0.2 mgdL-1

do ok. 5 mgdL-1

. Dla wszystkich stężeń Cp z zakresu liniowego krzywej

kalibracyjnej otrzymano dobrą powtarzalność wyników, a względne odchylenie

standardowe wynosiło około 8% (n = 5). Sprawdzono również powtarzalność

wyników uzyskanych dla tego samego stężenia ceruloplazminy, na dziesięciu

niezależnie zmodyfikowanych elektrodach, wówczas względne odchylenie

standardowe wynosiło około 4.7%.


132

Granicę wykrywalności ceruloplazminy przy użyciu opisanego czujnika

wyznaczono dwoma różnymi sposobami. Według pierwszego sposobu,

najprostszego i najczęściej używanego, wartość LOD wyznaczono, analogicznie jak

w przypadku hemoglobiny, z dolnego zakresu prostoliniowości krzywej

kalibracyjnej, zgodnie z równaniem (31) i wynosił on 0.23 ± 0.06 mg·dL-1

. W drugim

podejściu, LOD obliczono za pomocą metody Hubaux-Vos [428]. Sposób

postępowania w metodzie Hubaux-Vos [429] opiera się na przewidywaniu

przedziału krzywej kalibracji, z której odrzuca się zarówno dodatnie, jak i ujemne

błędy pomiarowe, fałszujące uzyskiwany wynik. W metodzie tej wykorzystano dane

uzyskane z pięciu niezależnych pomiarów dla każdego stężenia obejmującego zakres

prostoliniowości krzywej kalibracyjnej. Wartość LOD oblicza się stosując metodę

najmniejszych kwadratów. Wyznaczona w ten sposób granica wykrywalności

wynosiła 1.14 ± 0.24 mg·dL-1

. Różnice pomiędzy wynikami otrzymanymi za pomocą

pierwszego i drugiego sposobu najprawdopodobniej związane są z tym, że

odchylenia standardowe dla poszczególnych wartości stężeń Cp były różne.

W diagnostyce klinicznej zawartość ceruloplazminy określa się na podstawie

analiz immunologicznych. W tabeli 8 porównano parametry pracy proponowanego

czujnika do bezpośredniej detekcji Cp z parametrami pracy popularnych

komercyjnych testów immunologicznych.

Tabela 8. Porównanie parametrów pracy komercyjnych testów immunochemicznych do

oznaczania ceruloplazminy we krwi [125] z danymi otrzymanymi przy użyciu czujnika opisanego

w niniejszym rozdziale.

TEST

IMMUNOLOGICZNY

ZAKRES

STĘŻEŃ

[mgdL-1

]

LIMIT

DETEKCJI

[mgdL-1

]

CZAS

ANALIZY

ELISA Kit PRO-20074F 0.19 ÷ 25 brak danych 4 h

ELISA Kit(Uscn E90909Hu96 0.94 ÷ 60 < 0.34 3 h 45 min

Abanova KA0470 0.125 ÷ 32 ~ 0.1 2 h 47 min

Mybiosource MBS701656 (1.5 ÷ 50)103 750 1 h 45 min

Opracowany sensor 0.2 ÷ 5 0.23

a

1.14b

30 min

awynik wyznaczony z dolnego zakresu krzywej kalibracyjnej, zgodnie z równaniem (31)

aLOD wyznaczony metodą Hubaux-Vos


133

Analizując dane zawarte w niniejszej tabeli można stwierdzić, że metody

elektrochemiczne znacznie skracają czas analizy, a dodatkowo pozwalają na

oznaczenie ceruloplazminy w roztworze na bardzo niskim poziomie.

11.1.1. Jednoczesna ilościowa analiza ceruloplazminy i hemoglobiny

we krwi szczurzej

Funkcjonalność opracowanego czujnika sprawdzono względem próbek krwi

szczurzej, dostarczonych przez grupę prof. dr hab. I.P. Grudzińskiego

z Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. Krew szczurza została wybrana do

badań, ponieważ jest bardzo dobrym analogiem krwi ludzkiej. W skład krwi poza

hemoglobiną i ceruloplazminą wchodzą również inne paramagnetyczne

makrocząsteczki, takie jak: transferyna, ferrytyna, czy niektóre formy wolnych

rodników [110]. W celu sprawdzenia, czy hemoglobina zawarta w czerwonych

krwinkach nie zaburza sygnału woltamperometrycznego ceruloplazminy, pomiary

przeprowadzono zarówno dla próbki krwi o pełnym składzie (zhemolizowana krew

zawierająca hemoglobinę), jak i próbki zawierającej jedynie osocze krwi szczurzej

(brak hemoglobiny). Sposób przygotowania próbek krwi szczurzej do pomiarów

został schematycznie przedstawiony na rysunku 58.

KRWINKI BIAŁE

KRWINKI CZERWO NE

PŁYTKI KRWI

E / V -0.5 0.0 0.5

I /

A

KREW

OSOCZE KRWI

WIRÓWKA

DETEKCJACV

Rysunek 58. Schemat przygotowania próbek krwi szczurzej do jednoczesnej

woltamperometrycznej detekcji Hb i Cp.


134

Czynnikiem powodującym hemolizę (rozpad czerwonych krwinek) było wielokrotne

rozcieńczenie próbki krwi. W celu oddzielenia elementów morfotycznych

(czerwonych i białych krwinek oraz płytek krwi) od osocza, krew szczurzą

zawierającą antykoagulant w postaci cytrynianu sodu poddano wirowaniu.

Otrzymany w ten sposób roztwór osocza krwi (wolny od hemoglobiny) rozcieńczono

milion razy buforem fosforanowym. Rozcieńczenie miało na celu przede wszystkim

eliminację konkurencyjnego procesu adsorpcji białek obecnych we krwi (głównie

albumin i globulin) na powierzchni elektrody. Tak przygotowane próbki poddano

analizie woltamperometrycznej. Uzyskane podczas analizy próbek krwi szczurzej

cykliczne krzywe woltamperometryczne przedstawione zostały na rysunku 59.

E / V vs. Ag/AgCl/3 M KCl/0.1M KNO3

-0.60 -0.40 -0.20 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80

I /

A

-60.0

-40.0

-20.0

0.0tło

E / V 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80

I /

A

-2.0

0.0

2.0

4.0

6.0

osocze krwi szczurzej

zhemolizowana krew (1)

zhemolizowana krew + Hb (2)

zhemolizowana krew

+ Hb + Cp (3)

osocze krwi szczurzej + Tf (5)

1

2

12

3

3

4

4

5

Rysunek 59. Cykliczne krzywe woltamperometryczne skorygowane o tło uzyskane na elektrodzie

Au-EQCM/C/Fe@C Nps dla krwi szczurzej bez (czerwona linia ciągła) i z dodatkiem: (1) 0.064

gdL-1

Hb (czerwona linia przerywana) oraz (2) 0.064 gdL-1

Hb + 10 mgdL-1

Cp (niebieska linia

przerywana) i osocza bez (czarna linia ciągła) i z dodatkiem 0.05 gdL-1

Tf (czarna linia

przerywana), w obecności zewnętrznego pola magnetycznego (40 mT). Warunki pomiarowe:

krew/osocze rozcieńczone 106-krotnie 0.02 M buforem PB (pH 7.4) zawierającym 150 mM

K2SO4; szybkość przemiatania potencjałem: 25 mVs-1

.

Analiza krzywej woltamperometrycznej uzyskanej dla osocza krwi szczurzej

pokazuje, że przy potencjale o wartości 0.22 V widoczny jest pik anodowy związany

z utlenianiem ceruloplazminy (czarna linia ciągła na wykresie wewnętrznym).

Dodatkowo, przy potencjale -0.20 V można zaobserwować dobrze widoczny sygnał

prądowy (czarna linia ciągła na głównym wykresie). Proces wirowania próbki

pozwala na eliminację z roztworu osocza tylko hemoglobiny, natomiast nie usuwa


135

innych paramagnetycznych substancji, takich jak: transferyna czy też ferrytyna.

W celu uzyskania informacji, od jakiej substancji paramagnetycznej pochodzi ten

sygnał prądowy, wykonano eksperyment kontrolny, w którym do roztworu osocza

dodano transferyny o stężeniu 0.05 g·dL-1

(czarna linia przerywana w głównym

wykresie). Otrzymana krzywa CV wyraźnie wskazuje, że sygnał przy -0.20 V

związany jest z obecnością w roztworze Tf. W przypadku analizy zhemolizowanej

próbki krwi (czerwona linia ciągła) sygnał redukcji Tf był niewidoczny, ponieważ

pokrywał się z sygnałem methemoglobiny pojawiającym się na skali potencjałowej

przy wartości ok -0.44 V. Aby uzyskać pewność, że obserwowany sygnał związany

jest z procesem elektroredukcji Hb wykonano pomiar kontrolny z dodatkiem

hemoglobiny do zhemolizowanej próbki krwi (czerwona linia przerywana). Po

wprowadzeniu znanej ilości Hb do próbki krwi, zaobserwowano nie tylko wzrost

intensywności sygnału katodowego po ujemnej stronie na skali potencjałowej, ale

również jego nieznaczne przesunięcie (ok. 15 mV) w kierunku bardziej dodatnich

wartości potencjałów. Dodatek Hb do próbki krwi miał wpływ tylko na sygnał

pochodzący od procesu elektrodowego tego białka, natomiast w żaden sposób nie

zaburzał sygnału elektroutleniania Cp (czerwona linia ciągła i przerwana na

wewnętrznym wykresie na rysunku 59). Dopiero dodatek ceruloplazminy

spowodował wzrost wartości prądu przy potencjale 0.22 V (niebieska linia

przerywana na wykresie wewnętrznym rysunku 59). Wyniki analizy zawartości Hb

i Cp w badanej próbce krwi szczurzej przy użyciu zaproponowanego czujnika

porównano z zakresami oznaczalności tych białek, uzyskanymi podczas typowej

analizy klinicznej wykonanej dla próbki krwi kobiety (K) i mężczyzny (M).

Odpowiednie wartości zostały podane w tabeli 9.

Tabela 9. Porównanie wyników jednoczesnej analizy ceruloplazminy i hemoglobiny w próbkach

krwi szczurzej przy użyciu zaproponowanego czujnika.

SKONSTRUOWANY

CZUJNIK

ANALIZA

KLINICZNA

ZAKRES

W LUDZKIEJ KRWI

Hb [g·dL-1

] 12.9 ± 1.8 14 ÷ 18 (M)

12 ÷ 16 (K) 11.5 ÷ 18

Cp [mg·dL-1

] 36.0 ± 2.0 30 ÷ 58 25.0 ÷ 47.0


136

Zgodność wyników była bardzo dobra, co przemawia za tym, że skonstruowany

czujnik może być z powodzeniem stosowany do bezpośredniego, jednoczesnego

oznaczania ceruloplazminy i hemoglobiny w próbkach krwi.

11.2. Wpływ pola magnetycznego na aktywność

katalityczną ceruloplazminy unieruchomionej na

podłożu złotym zmodyfikowanym ferromagnetykiem

Multimiedziowe ferroksydazy, których przedstawicielem jest ceruloplazmina,

ulegają ekspresji w wielu tkankach. Są one zdolne do utleniania szerokiej gamy

substratów. Obserwacje dotyczące skutków fenotypowych związanych z brakiem,

bądź uszkodzeniem genów kodujących multimiedziowe ferroksydazy pozwalają

przypuszczać, że najważniejszą rolą tych białek jest udział w metabolizmie żelaza

[112]. Główną funkcją ceruloplazminy w gospodarce żelaza w organizmie jest

utlenianie jonów Fe2+

do Fe3+

, co warunkuje wiązanie żelaza z transferyną (głównym

białkiem transportującym żelazo), jak i z ferrytyną (głównym białkiem

magazynującym żelazo). Unieruchomienie ceruloplazminy na powierzchni elektrody

we właściwej orientacji, odgrywa kluczową rolę nie tylko w transporcie elektronów

pomiędzy elektrodą a enzymem, ale również ma istotny wpływ na jego aktywność

katalityczną.

11.2.1. Wpływ ferromegnetycznego modyfikatora powierzchni

na elektroaktywność złota

Pierwszy etap badań dotyczył określenia wpływu ferromagnetycznego

modyfikatora powierzchni na elektrochemiczne parametry dyskowej elektrody złotej.

Pomiary przeprowadzono przy użyciu elektrochemicznej spektroskopii

impedancyjnej w obecności próbnika redoks w roztworze (równomolowa mieszanina

[Fe(CN)6]3-/4-

), przy potencjale formalnym zastosowanego układu redoks

wynoszącym 0.243 V, na niezmodyfikowanym chemicznie złotcie (Au) oraz

zmodyfikowanym nanokapsułami węglowymi zawierającymi żelazo

(Au/Fe@C Nps) oraz nanocząstkami węgla (Au/C Nps). Przykładowe wykresy

Nyquist’a (widma impedancyjne) otrzymane dla niezmodyfikowanej elektrody Au

oraz elektrod zmodyfikowanych odpowiednio Fe@C Nps i C Nps przedstawiono na


137

rysunku 60. Krzywe oznaczone liniami ciągłymi dopasowywano przy użyciu

programu FRA, zgodnie z obwodem zastępczym, którego schemat przedstawiony

został w rozdziale 8.3. na rysunku 39.

Z' /

0 200 400 600

-Z" /

0

100

200

300

400

Au

Au/Fe@C Nps

Au/C Nps

Rysunek 60. Wykresy Nyquist’a otrzymane dla chemicznie niezmodyfikowanej elektrody Au

oraz elektrod zmodyfikowanych Fe@C Nps (0.5 mg·mL-1

) i C Nps (0.5 mg·mL-1

). Linie ciągłe –

krzywe dopasowane do danych eksperymentalnych. Warunki pomiarowe: 5 mM Fe(CN)63−/4−

w 0.02 M buforze PB zawierającym 150 mM K2SO4 o pH 7.4; Eapp. = 0.243 V; Au = 1.6 mm.

Wpływ zastosowanego modyfikatora powierzchni elektrody na właściwości

elektrochemiczne złota można określić na podstawie analizy przebiegu widm EIS

oraz na podstawie zmiany wartości parametrów impedancyjnych, które

przedstawiono w tabeli 10.

Tabela 10. Wartości parametrów EIS dla chemicznie niezmodyfikowanej elektrody złotej

i zmodyfikowanej ferromagnetykiem (Au/Fe@C Nps) oraz nanocząstkami węgla (Au/C Nps).

Tdl − parametr pojemnościowy elementu stało-fazowego, dl − parametr potęgowy elementu stało-

fazowego, Rct − opór przeniesienia ładunku, σ − współczynnik Warburga, Cdl − pojemność

warstwy podwójnej.

Tdl

[μFs(1-)

cm-2

]

dl Rct

[Ωcm2]

σ

[Ω rad1/2

s-1/2

cm2]

Cdl

[μFcm-2

]

Au 68.1 0.4 0.92 0.02 310 25 40.8 0.1 20.7 0.9

Au/Fe@C Nps 64.6 0.2 0.88 0.02 325 16 42.4 0.2 19.2 0.8

Au/C Nps 55.4 1.0 0.75 0.02 360 13 52.5 1.8 19.7 1.2


138

To, czy modyfikator powierzchni elektrody w znaczący sposób wpływa na jej

elektroaktywność, najłatwiej zauważyć kontrolując zmiany wartości oporu

przeniesienia ładunku (Rct). Dane przedstawione w tabeli 10 pokazują, że

modyfikacja powierzchni złota nanokapsułami węglowymi zawierającymi żelazo,

czy też nanocząstkami węgla, nie wpływała na wartości parametru Rct. Ze wszystkich

wyznaczonych parametrów impedancyjnych tylko wartość potęgowego elementu

stało-fazowego ulega niewielkiemu zmniejszeniu, od 6 do 18%, w stosunku do

niezmodyfikowanej chemicznie elektrody złotej, odpowiednio w przypadku

nanocząstek zawierających żelazo i nanoczastek węgla. Małe odchylenia parametru

φdl w przypadku warstwy utworzonej przez Fe@C Nps wskazują, że nanocząstki te

dość równomiernie pokrywają powierzchnię elektrody. W sytuacji zastosowania

nanocząstek węgla parametr ten w większym stopniu różnił się od wartości

otrzymanej dla czystej elektrody złotej, dlatego też w dalszych badaniach stosowano

wyłącznie nanokapsuły węglowe zawierające żelazo. Na podstawie zmian wartości

parametru Warburga można wywnioskować, że modyfikacja powierzchni elektrody

warstwą Fe@C Nps nie utrudniała w żaden sposób transportu próbnika redoks do

powierzchni elektrody.

11.2.2. Aktywność katalityczna ceruloplazminy wobec

jonów żelaza(II)

W przypadku badań nad aktywnością katalityczną ceruloplazminy zarówno

proces tworzenia warstwy ferromagnetyka na powierzchni elektrody, jak również

sam proces unieruchamiania enzymu na tak zmodyfikowanej elektrodzie

prowadzone były w najprostszy sposób, czyli w wyniku nałożenia kropli

i pozostawienia jej do wyschnięcia. Etap modyfikacji podłoża cząsteczkami

ceruloplazminy prowadzony był w obecności pola magnetycznego. Wiadomo, że

modyfikacja podłoża na drodze adsorpcji fizycznej nie prowadzi do jego całkowitego

pokrycia. Dlatego też w celu uzyskania informacji na temat rozmieszczenia enzymu

na zmodyfikowanej powierzchni elektrody, wykonane zostały pomiary

z zastosowaniem techniki LA-ICP-MS, których wyniki ilustruje rysunek 61.

Analizując rozkład intensywności sygnałów uzyskanych dla izotopów miedzi oraz

żelaza można stwierdzić, że adsorpcja ceruloplazminy zachodzi głównie na

ferromagnetycznym modyfikatorze powierzchni elektrody. Na odsłoniętej


139

powierzchni złota proces ten jest znacznie ograniczony. Gwarantem adsorpcji

ceruloplazminy na ferromagnetycznym modyfikatorze elektrody jest obecność

paramagnetycznych centrów miedziowych w strukturze tego enzymu, które silnie

oddziałują z ferromagnetycznymi nanocząstkami.

liczba zliczeń

0 1000 2000 3000 4000 5000

inte

nsyw

no

ść s

yg

nału

dla

65C

u /

cp

s

inte

nsyw

no

ść s

yg

nału

dla

57F

e / 1

000 +

cp

s10

-3

0

1000

2000

3000

57Fe

65Cu

65Cu57Fe

< 35·104

< 5·104

< 1400

< 200

Rysunek 61. Intensywności sygnałów izotopów 65

Cu i 57

Fe zarejestrowane za pomocą techniki

LA-ICP-MS dla elektrody złotej zmodyfikowanej nanocząstkami Fe@C i Cp. Rysunek

wewnętrzny: mapy rozkładu izotopów (65

Cu i 57

Fe) na monitorowanym obszarze elektrody.

Badania wykonała dr hab. Barbara Wagner.

Kolejny etap badań dotyczył sprawdzenia, czy tak unieruchomiony enzym nie ulega

denaturacji, czyli czy nadal wykazuje elektroaktywność. Z literatury wiadomo, że

skład roztworu ma istotny wpływ na położenie sygnałów prądowych ceruloplazminy

[106,109,424]. Wprowadzenie jonów chlorkowych do roztworu nie tylko zmienia

położenie rejestrowanych sygnałów prądowych na osi potencjałowej, ale również

hamuje aktywność katalityczną tego enzymu [109]. Dodatkowo wiadomo, że centra

T1 Cp nie oddziałują z tlenem, w przeciwieństwie do klastra T2/T3, który jest bardzo

wrażliwy na obecność O2 [280]. Mając świadomość tych procesów pomiary

wykonano w obecności i nieobecności pola magnetycznego oraz w roztworze

odtlenionym i natlenionym stosując elektrodę odniesienia z podwójnym płaszczem

(Ag/AgCl/3 M KCl/0.1 M KNO3). Uzyskane w tych warunkach cykliczne krzywe

woltamperometryczne zostały przedstawione na rysunku 62.


140


-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

I /

A

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

tło (Au/Fe@C Nps)

Au/Cp w polu magnetycznym

Au/Fe@C Nps/Cp bez pola magnetycznego

Au/Fe@C Nps/Cp w polu magnetycznym

E / V0.0 0.2 0.4 0.6

I /

A

-0.1

0.0

0.1

0.2Au/Fe@C Nps/Cp w powietrzuAu/Fe@C Nps/Cp w atmosferze Ar

Rysunek 62. Cykliczne krzywe woltamperometryczne zarejestrowane na elektrodzie Au/Cp

w obecności pola magnetycznego (ciągła linia czarna) oraz na elektrodzie Au/Fe@C Nps/Cp bez

pola magnetycznego (przerywana linia czerwona) i w obecności pola magnetycznego (ciągła linia

czerwona) w 0.02 M buforze PB (pH 7.4) zawierającym 150 mM K2SO4; szybkość polaryzacji

elektrody: 25 mV·s-1

. Rysunek wewnętrzny: cykliczne krzywe woltamperometryczne

skorygowane o tło zarejestrowane na elektrodzie Au/Fe@C Nps/Cp w nieodtlenionym roztworze

(ciągła linia niebieska) oraz w odtlenionym za pomocą Ar roztworze (przerywana linia niebieska)

w obecności pola magnetycznego (40 mT).

Zarejestrowane krzywe woltamperometryczne pokazują, że dobrze ukształtowane

sygnały prądowe ceruloplazminy można zaobserwować tylko w przypadku, gdy

enzym unieruchamiany jest na zmodyfikowanej ferromagnetykiem powierzchni

złota. W przypadku bezpośredniej adsorpcji białka na powierzchni złota

prawdopodobnie dochodzi do denaturacji enzymu lub był on w niekorzystnej dla

wymiany elektronu orientacji, co skutecznie uniemożliwia rejestrację sygnałów

prądowych tego białka. Obecność pola magnetycznego ewidentnie zwiększa

intensywność zarówno katodowych, jak i anodowych sygnałów prądowych. Wzrost

ten świadczy o odpowiedniej orientacji cząsteczek Cp względem powierzchni

elektrody, dzięki czemu centra redoks ceruloplazminy są usytuowane bliżej

zewnętrznej powłoki białkowej i w konsekwencji wzrasta efektywność procesu

wymiany elektronów. Usunięcie tlenu z roztworu praktycznie nie powodowało

żadnej zmiany intensywności tylko w przypadku sygnału anodowego położonego

przy potencjale około 0.25 V. Można na tej podstawie wnioskować, że sygnał ten

pochodzi od elektroutleniania centrum T1 ceruloplazminy. Pozostałe sygnały

prądowe: anodowy przy wartości potencjału powyżej 0.60 V, jak i katodowe


141

położone przy ok. 0.56 V i 0.16 V wykazywały większą czułość na obecność tlenu

w roztworze. Obserwowany w warunkach tlenowych wzrost wartości rejestrowanego

prądu przy potencjale około 0.60 V najprawdopodobniej związany jest z utlenianiem

jonu miedzi(I) w centrum T1PR, który następnie ulega redukcji przy potencjale około

0.56 V. Znając stężenie Cp oraz wartość ładunku uzyskanego z krzywej

woltamperometrycznej (1.03·10-8

C) możliwe było wyznaczenie liczby elektronów

przenoszonych z elektrody do centrów T1CysHis i T1Remote w cząsteczce

ceruloplazminy. Dane literaturowe donoszą, że podczas tego procesu następuje

wymiana dwóch elektronów [280]. Z obliczeń natomiast wynika, że liczba ta jest

równa 2.4 ± 0.5. Przyjmując, że masa cząsteczkowa ceruloplazminy wynosi

132 kDa, można wyznaczyć stężenie powierzchniowe Cp unieruchomionej na

warstwie nanocząstek magnetycznych, zgodnie z równaniem:

nFA

QCp (32)

gdzie: ΓCp to stężenie powierzchniowe Cp, Q – ładunek sygnału utleniania z zakresu

potencjałowego 0.10.5 V , n – liczba elektronów wymienianych w procesie redoks

Cp, F – stała Faraday’a, zaś A – powierzchnia elektrody. Podstawiając uzyskane

wartości do równania (31) wyznaczono stężenie powierzchniowe białka, które

wynosiło 2.22 ± 0.6 pmol·cm-2

. Znając powierzchnię, jaką zajmuje pojedyncza

cząsteczka ceruloplazminy (7.5 x 4.0 6.6 nm) [430] można wyznaczyć teoretyczne

maksymalne stężenie powierzchniowe ceruloplazminy; wynosi ono

3.45÷5.5 pmol·cm-2

. Na podstawie wyznaczonych wartości stężeń

powierzchniowych Cp z danych eksperymentalnych i teoretycznych, można

powiedzieć, że utworzona warstwa enzymu na powierzchni nanocząstek

magnetycznych była dość gęsto upakowana.

Zdolność unieruchomionej ceruloplazminy na powierzchni nanocząstek

magnetycznych do katalitycznego utleniania jonów żelaza(II) do żelaza(III) zbadana

została przy wykorzystaniu skaningowego mikroskopu elektrochemicznego. Metoda

ta jest niezwykle użytecznym narzędziem wykorzystywanym do badań

enzymatycznie modyfikowanych elektrod, gdyż produkty i substraty reakcji

enzymatycznej wykrywane są z wysoką specyficznością. Źródłem jonów żelaza(II)

był 20 mM roztwór heksacyjanożelazianu(II) potasu. Obrazowanie SECM

przeprowadzono w trybie sprzężenia zwrotnego (ang. feedback mode, FB). Złota

elektroda dyskowa zmodyfikowana warstwą ferromagnetycznych nanocząstek oraz


142

ceruloplazminą umieszczona została wewnątrz kolistego magnesu o natężeniu pola

40 mT, w celu zwiększenia szybkości bezpośredniego przeniesienia elektronów

pomiędzy centrum T1 Cp a powierzchnią elektrody. Z uwagi na fakt, że tylko jony

miedzi(II) są zdolne do utleniania jonów żelaza(II) do jonów Fe3+

, w celu utrzymania

centrum miedziowego Cp na +II stopniu utlenienia, w trakcie badań do elektrody

przykładano stały dodatni potencjał wynoszący 0.25 V. Generowane w ten sposób

jony Fe(CN)63-

wykrywane były poprzez monitorowanie prądu redukcji tych jonów

przy potencjale 80 mV za pomocą mikroelektrody Pt o średnicy 10 µm. Schemat

ilustrujący zasadę pomiaru za pomocą skaningowego mikroskopu

elektrochemicznego przedstawia rysunek 63.

WE2: Pt ( = 10 µm)

MAGNES: Fe14Nd2B (40 mT)

x

yz

WE1:

Au/Fe@C Nps/Cp

(E = 250 mV)

ELEKTROLIT:

0.02 M PB (pH 7.4)

150 mM K2SO4

20 mM K4[Fe(CN)6]

Fe(CN)63-

ELEKTROLIT

Fe(CN)64-

WE1: Au ( = 2 mm)

WE2:

Pt (E = 80 mV)

Rysunek 63. Schemat układu pomiarowego aktywności elektrokatalitycznej Cp zaadsorbowanej

na Fe@C Nps w obecności zewnętrznego pola magnetycznego.

W celu uzyskania informacji, czy nanokapsuły Fe@C mogą również generować jony

Fe(CN)63-

zarejestrowane zostały krzywe zbliżania dla chemicznie

niezmodyfikowanej elektrody złotej oraz elektrody zmodyfikowanej warstwą

nanocząstek magnetycznych w obecności pola magnetycznego i 20 µM roztworu

K4[Fe(CN)6] w buforze fosforanowym, co ilustruje rysunek 64A. Uzyskane krzywe

zbliżania wyraźnie pokazują, że w przypadku modyfikacji powierzchni elektrody

warstwą nanocząstek magnetycznych jony Fe(CN)63-

praktycznie nie są generowane.

Dopiero wprowadzenie do układu ceruloplazminy miało zdecydowany wpływ na

ilość powstających jonów Fe(CN)63-

, gdyż następował gwałtowny wzrost wartości

prądu redukcji tych jonów, zgodnie z rysunkiem 64B. W sytuacji braku


143

zewnętrznego źródła pola magnetycznego w układzie, wzrost ten wynosił około 25%

w stosunku do wartości prądu w głębi roztworu. W celu określenia specyficzności

wykazywanej przez ceruloplazminę aktywności katalitycznej wobec jonów żelaza(II)

wykonane zostało doświadczenie kontrolne, w którym do roztworu dodany został

fluorek potasu. Z literatury wiadomo, że jony fluorkowe są inhibitorem aktywności

Cp, ponieważ oddziałując z centrum T2 enzymu skutecznie blokują jego aktywność

katalityczną [106]. Wykonany eksperyment pokazał, że w obecności jonów

fluorkowych, jony Fe(CN)64-

nie są utleniane do jonów Fe(CN)63-

, czego dowodem

jest zarejestrowana krzywa zbliżania przedstawiona na rysunku 64B (czerwona linia

ciągła). Wprowadzenie zewnętrznego źródła pola magnetycznego do układu

pomiarowego, skutkowało ok. 180-krotnym wzrostem prądu redukcji Fe(CN)63-

w pobliżu enzymu (powierzchni elektrody) w stosunku do głębi roztworu na

mikroelektrodzie Pt, co ilustruje rysunek 64C. Bezpośrednia adsorpcja Cp na

powierzchni elektrody złotej obniża jej aktywność katalityczną względem jonów

Fe(II), co może być związane z denaturacją otoczki białkowej ceruloplazminy lub też

jej niekorzystną orientacją do wymiany elektronów pomiędzy centrum T2 enzymu

a jonami Fe(CN)64-

. Zastosowanie skaningowego mikroskopu elektrochemicznego

pozwoliło udowodnić, że zarówno obecność ferromagnetycznego modyfikatora

elektrody (nanokapsuły węglowe zawierające żelazo: Fe@C Nps) i zewnętrznego

źródła pola magnetycznego jest niezbędna dla zapewnienia najwyższej aktywności

elektrokatalitycznej ceruloplazminy w stosunku do utleniania jonów Fe2+

.

dz, rel / m

0 5 10 15

I/I b

ulk

0

30

60

90

120

150

180

dz, rel

/ m0 5 10 15

I/I b

ulk

1.0

1.1

1.2

1.3

Au

Au/Fe@C Nps

A


144

dz, rel / m

0 5 10 15

I/I b

ulk

0

30

60

90

120

150

180

dz, rel

/ m0 5 10 15

0

4

8

12

16

20

24

28

aktywna Cp na Au/Fe@C Nps

nieaktywna Cp na Au/Fe@C Nps

B

dz, rel / m

0 5 10 15

I/I b

ulk

0

30

60

90

120

150

180aktywna Cp na Au/Fe@C Nps

nieaktywna Cp na Au/Fe@C Nps

aktywna Cp na Au

C

Rysunek 64. Krzywe zbliżania (prądy mikroelektrody Pt w funkcji jej odległości od powierzchni

próbki) uzyskane dla: (A) Au i Au/Fe@C Nps w obecności magnesu; (B) Au/Fe@C Nps/Cp

w nieobecności magnesu oraz (C) Au/Fe@C Nps/Cp w obecności magnesu. Warunki pomiarowe:

20 mM K4[Fe(CN)6]; 0.02 M bufor PB z dodatkiem 150 mM K2SO4 o pH 7.4.

W celu uzyskania dokładniejszych informacji na temat mechanizmu

przeniesienia elektronu pomiędzy zmodyfikowaną powierzchnią elektrody

a unieruchomionym na jej powierzchni białkiem, zarejestrowano krzywe

woltamperometryczne w 20 mM roztworze K4[Fe(CN)6] w obecności i nieobecności

tlenu w układzie. Uzyskane woltamperogramy cykliczne przedstawione zostały na

rysunku 65.


145


0.0 0.2 0.4 0.6

I /

A

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

roztwór natleniony

roztwór odtleniony

Rysunek 65. Cykliczne krzywe woltamperometryczne skorygowane o tło zarejestrowane na

elektrodzie Au/Fe@C Nps/Cp w obecności pola magnetycznego (40 mT) w natlenionym (linia

czerwona) i odtlenionym (linia czarna) 20 mM roztworze Fe(CN)64−

w 0.02 M buforze PB (pH 7.4)

zawierającym 150 mM K2SO4; szybkość polaryzacji elektrody: 25 mV·s-1

.

Odwracalne sygnały prądowe widoczne w zakresie potencjałów 0 ÷ 0.40 V związane

są z procesami utleniania/redukcji pary redoks Fe(CN)63-/4-

. Uzyskane krzywe

cykliczne pokazały, że obecność tlenu wpływa na intensywność piku katodowego,

który był wówczas wyższy niż pik anodowy. Większy prąd redukcji jonów Fe(CN)63-

jest konsekwencją wykazywania przez ceruloplazminę aktywności katalitycznej oraz

regeneracji miejsc elektroaktywnych tego enzymu. Natomiast usunięcie tlenu

z roztworu skutkowało zanikiem różnicy w wartościach prądu katodowego

i anodowego próbnika redoks. Dodatkowo, w warunkach tlenowych pojawia się

dobrze wykształcony sygnał prądowy przy potencjale około 0.64 V, który związany

jest z utlenianiem Cu(I) do Cu(II) w centrum T1PR ceruloplazminy, które następnie

w wyniku obecności w roztworze jonów Fe(II) ulega redukcji. Dodatkowo,

wprowadzenie do roztworu jonów Fe(CN)64-

przyczynia się do zmiany potencjału

centrum T1PR, przy którym następuje utlenianie Cu(I), w kierunku mniejszych

wartości potencjałów, co prowadzi do zwiększenia wartości prądu anodowego.

Uzyskane podczas badań wyniki pokazują, że ceruloplazmina katalizuje redukcję

tlenu bezpośrednio, jak również za pomocą mediatora. W omówionym przypadku

jon Fe(CN)63-

jednocześnie pełnił rolę donora elektronów oraz mediatora redoks.


146

11.3. Podsumowanie

Przeprowadzone badania udowodniły, że możliwa jest bezpośrednia

elektrochemiczna detekcja ceruloplazminy (Cp) i hemoglobiny (Hb) w trakcie

pojedynczego pomiaru, bez konieczności specjalnego przygotowania analizowanej

próbki krwi. Zaproponowana metoda oparta była na ferromagnetycznym

modyfikatorze elektrody (nanokapsułach węglowych zawierających żelazo) oraz

obecności zewnętrznego źródła pola magnetycznego. Nanocząstki ferromagnetyka

na powierzchni elektrody pełniły rolę bardzo specyficznego i selektywnego filtru,

który w ciągu pierwszych kilku minut przyśpieszał i zwiększał transport tylko

paramagnetycznych molekuł do powierzchni elektrody. Dodatkowo, wszystkie

paramagnetyczne cząsteczki docierające do powierzchni ferromagnetyka były

elektroaktywne. Co więcej, bezpośredni kontakt metaloproteiny z ferromagnetykiem

nie prowadził do jej deaktywacji. Opracowana metoda pozwala oznaczać

paramagnetyczne białka na poziomie granicy wykrywalności rzędu pM.

Dodatkowo, badania przeprowadzone przy użyciu skaningowego mikroskopu

elektrochemicznego (SECM) udowodniły, że zarówno obecność ferromagnetycznego

modyfikatora elektrody (nanokapsuły węglowe zawierające żelazo: Fe@C Nps), jak

i zewnętrznego źródła pola magnetycznego jest niezbędna w celu zapewnienia

najwyższej aktywności elektrokatalitycznej ceruloplazminy w stosunku do jonów

Fe2+

.

Elektrochemiczny immunosensor do detekcji transferyny

147

12. Elektrochemiczny immunosensor do detekcji

transferyny

Kolejną ważną z diagnostycznego punktu widzenia metaloproteiną obecną we

krwi jest transferyna. W klasycznej analizie medycznej ilościowego oznaczania tego

białka w osoczu krwi dokonuje się przy użyciu metod immunologicznych, których

zasada działania opiera się na bardzo selektywnym i specyficznym wiązaniu

antygenu (białka) przez charakterystyczne dla niego przeciwciało [431]. Niestety,

metody immunologiczne mają kilka znaczących wad. Największą z nich jest brak

możliwości zastosowania tych metod przy oznaczeniach białek na niskim poziomie,

ponadto są one bardzo często żmudne, czasochłonne oraz kosztowne [432].

Interesującą koncepcją i jednocześnie dobrą alternatywą dla klasycznych metod są

immunosensory z detekcją elektrochemiczną [433]. Ich prostota konstrukcji, bardzo

wysoka czułość oraz łatwość miniaturyzacji sprawiły, że coraz częściej sięga się po

tego typu narzędzia analityczne w nowoczesnej nanomedycynie [434,435].

Dodatkowo, immunosensory oparte na wykorzystaniu różnego typu nanomateriałów

charakteryzują się niższą granicą wykrywalności oraz szerszym zakresem

odpowiedzi liniowej w stosunku do tradycyjnych testów immunologicznych [436].

Z uwagi na fakt, że transferyna, podobnie jak hemoglobina, czy też ferrytyna,

zawiera w swoje strukturze jony żelaza, oznaczanie tego białka przy użyciu

elektrody zmodyfikowanej wyłącznie nanocząstkami magnetycznymi jest

niemożliwe. Jest to spowodowane silnymi interferencjami pochodzącymi od

hemoglobiny i ferrytyny. O ile hemoglobinę można łatwo oddzielić od osocza krwi

poprzez odwirowanie elementów morfotycznych, to jednak taki sposób

postępowania nie prowadzi do usunięcia z roztworu ferrytyny, która jest głównym

interferentem w analizie transferyny w osoczu krwi. Dlatego też, zastosowanie

wysoce selektywnego oddziaływania antygenprzeciwciało stanowiło podstawę

oznaczania transferyny we krwi.


148

12.1. Procedura konstrukcji warstwy receptorowej

immunosensora

Głównym elementem budującym warstwę receptorową immunosensora, poza

nanocząstkami magnetycznymi, były cząsteczki przeciwciała monoklonalnego typu

IgG charakterystyczne dla ludzkiej transferyny. Z literatury wiadomo, że orientacja

przeciwciała względem powierzchni bezpośrednio wynikająca z faktu, które grupy

funkcyjne przeciwciała biorą udział w procesie unieruchamiania, decyduje

o skuteczności jego działania [437]. W cząsteczce przeciwciała można wyróżnić

kilka potencjalnych grup, które mogą uczestniczyć w procesie jego unieruchamiania

na wybranej powierzchni. Najczęściej wykorzystuje się w tym celu grupy aminowe

zlokalizowane na końcach łańcuchów polipeptydowych w części zmiennej

przeciwciała, czy też grupy aminowe reszt lizyny obecne w części stałej Ab [438].

Zakotwiczenie przeciwciała na powierzchni elektrody za pośrednictwem grup

aminowych może prowadzić do pochylonego lub/i równoległego oraz pionowego

odwróconego ułożenia cząsteczek Ab względem jej powierzchni [437]. Z punktu

widzenia elektrochemii taki sposób ułożenia przeciwciała jest niezwykle korzystny,

gdyż zapewnia najkrótszy dystans pomiędzy centrum elektroaktywnym oznaczanego

białka a powierzchnią elektrody. Z kolei w sytuacji, gdy w procesie unieruchamiania

przeciwciała biorą udział grupy karboksylowe, znajdujące się na końcu łańcuchów

polipeptydowych domeny stałej [438], cząsteczki Ab są wówczas zorientowane

prostopadle względem powierzchni elektrody [437]. Taki sposób ułożenia

przeciwciała na wybranej powierzchni, zwany pionowym powoduje, że detekcja

elektrochemiczna białek jest znacznie utrudniona. W takim ustawieniu przeciwciało

stanowi największą barierę w transporcie elektronów. Możliwe sposoby ułożenia

przeciwciała na powierzchni elektrody ilustruje rysunek 66.


149

NH

2

SSSS

NH

2

H2 N

H2 N

CO

OH

HO

OC

SS

SS

SS

SS

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

LY

S-NH

2

H2 N

-LY

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

NH2

S S

S S

NH2H2N

H2N

COOHHOOC

SS

SS

SS S

S

SS

SS

S

S

S

S

S

S

LYS-NH2H2N-LYS S

S

SS

SS

PIONOWE ODWRÓCONEUŁOŻENIE

Ab vs Aelektrody

S S

S S

NH2

NH2H2N

H2N

COOHHOOC

SS

SS

SS

SS

SS

SS

SS

SS

S

S

S

S

S

S

S

S LYS-NH2H2N-LYS

POCHYLONEUŁOŻENIE

Ab vs Aelektrody

RÓWNOLEGŁE (ZWANE PŁASKIM)

UŁOŻENIE Ab vs Aelektrody

S SS S

NH2

H2NH

2N

COOH

HOOC

S

S

S

S

S

S

S

S

S S

S S

S S

S S

S

SS

S

S

S

S

S

LYS-NH2

H2N-LYS

PIONOWE UŁOŻENIE

Ab vs Aelektrody

WIĄZANIE PRZECIWCIAŁA Z POWIERZCHNIĄ PRZY UDZIALE JEGO GRUP COOH

WIĄZANIE PRZECIWCIAŁA Z POWIERZCHNIĄ PRZY UDZIALE JEGO GRUP NH2

Rysunek 66. Możliwe sposoby ułożenia cząsteczek przeciwciała w stosunku do powierzchni

elektrody. Rysunek wykonany w oparciu o dane literaturowe [437].

Orientacja przeciwciała względem powierzchni elektrody wpływa nie tylko na jego

efektywność działania, ale także na jego gęstość upakowania w warstwie. Znając

wymiary przeciwciała typu IgG (fragmentu Fab: 6.5×3.5 nm oraz fragmentu Fc:

5×3.5 nm) [439], przy założeniu maksymalnego upakowania Ab w płaszczyźnie,

można wyznaczyć teoretyczne maksymalne stężenie powierzchniowe przeciwciała,

które wynosi 7.30, 4.52 i 2.43 pmol·cm-2

, odpowiednio dla pionowego, pochylonego

oraz równoległego ułożenia Ab względem powierzchni elektrody.

W celu trwałego związania przeciwciała z powierzchnią złota, elektrodę

pokryto najpierw monowarstwą cysteaminy (CSH). Warstwa taka została utworzona

na drodze samoorganizacji, w wyniku umieszczenia elektrody złotej w 0.5 mM

etanolowym roztworze cysteaminy na czas 12 godzin. Po tym czasie elektrodę

delikatnie opłukiwano 96% alkoholem etylowym i osuszano bardzo delikatnym

strumieniem argonu. Kolejny etap polegał na związaniu z monowarstwą CSH

nanocząstek magnetycznych za pośrednictwem wiązania amidowego, utworzonego

pomiędzy grupami aminowymi cysteaminy i grupami karboksylowymi nanokapsuł

Fe@C-COOH. W celu ograniczenia procesu aglomeracji nanocząstek


150

magnetycznych oraz utworzenia równomiernej warstwy pod elektrodą umieszczony

został płaski magnes. Następnie, w celu wprowadzenia warstwy monoklonalnego

przeciwciała, elektrodę (Au-CSH/Fe@C-COOH Nps) zanurzono na 12 h do

20 mgmL-1

roztworu Ab w buforze fosforanowym z dodatkiem 0.2% v/v Tween-20.

Takie stężenie Ab gwarantowało związanie maksymalnej ilości przeciwciał

z powierzchnią nanocząstek magnetycznych. Niejonowy detergent, Tween-20, został

zastosowany w celu zablokowania powierzchni elektrody oraz wyeliminowania

niespecyficznych oddziaływań pomiędzy cząsteczkami przeciwciała a podłożem.

Aby usunąć z powierzchni elektrody nadmiar nieprzereagowanego przeciwciała,

elektrodę delikatnie opłukiwano buforem fosforanowym z dodatkiem Tweenu-20.

Przeciwciało unieruchamiane było na powierzchni nanocząstek magnetycznych

również za pośrednictwem wiązań amidowych utworzonych pomiędzy grupami

aminowymi Ab i grupami karboksylowymi nanocząstek. Tak zmodyfikowaną

elektrodę zanurzano do roztworu transferyny o różnym stężeniu w zakresie od 5·10-7

do 5·10-2

g·dL-1

(5·10-3

- 500 mg·mL-1

), na czas 60 minut w obecności zewnętrznego

źródła pola magnetycznego. Schemat ilustrujący poszczególne etapy konstrukcji

immunosensora do detekcji transferyny przedstawia rysunek 67.

czas / s

f

/ H

z

3) Ab

Au

4) Tf

CO

NH

C

O

NHCO

NH

CO

NH

2) zaktywowane

Fe@C-COOH Nps

1) CSH

E / V

I /

A

5) detekcja

Rysunek 67. Schemat ilustrujący etapy konstrukcji immunosensora do detekcji transferyny.

Związanie cząsteczek Tf z warstwą sensorową (Au-CSH/Fe@C-COOH

Nps/Ab) za pośrednictwem specyficznego oddziaływania antygenprzeciwciało

zostało potwierdzone za pomocą techniki powierzchniowego rezonansu

plazmonowego (SPR). Dzięki temu, że pomiary prowadzono w ciągłym przepływie

możliwe było zoptymalizowanie czasu oddziaływania transferyny

z charakterystycznym dla niej przeciwciałem. Typowe sensogramy SPR

zarejestrowane podczas formowania warstwy sensorowej oraz wiązania się do niej


151

Tf ilustruje rysunek 68. Wprowadzenie do komory reakcyjnej poszczególnych

substancji wchodzących w skład warstwy sensorowej, skutkowało wzrostem

wartości współczynnika załamania światła, który ulegał stabilizacji po ok. 30

minutach, co świadczyło o maksymalnym upakowaniu danej substancji w warstwie.

Po każdym etapie modyfikacji niezwiązane z powierzchnią reagenty były odmywane

z układu. Masa cząsteczkowa użytej w badaniach ludzkiej transferyny wynosiła

około 80 kDa [440]. Ponieważ masa cząsteczkowa monoklonalnego przeciwciała

charakterystycznego dla tego białka wynosiła około 115 kD (według danych

podanych przez producenta), zmiana kąta SPR odpowiadająca etapowi tworzenia

kompleksu Ab-Tf powinna być o około 30% niższa niż w odniesieniu do etapu

kowalencyjnego przyłączania przeciwciała do nanocząstek magnetycznych. Stężenia

powierzchniowe przeciwciała (Ab) oraz związanej z nim transferyny (Tf) obliczone

z pomiarów SPR wynosiły odpowiednio 1.35 0.30 i 0.80 0.24 pmol·cm-2

. Należy

zauważyć, że stosunek Tf do Ab wynosi 0.60 a nie 1, co oznacza, że część

cząsteczek przeciwciała transferyny została przyłączona do nanocząstek

magnetycznych w niekorzystnej orientacji, która uniemożliwiała związanie

transferyny na drodze oddziaływania antygenprzeciwciało.

czas / h

0 5 10 15 20 25

R

U

0

200

400

600

800

1000

1200

M N

ps

H2O

Au

-CS

H/F

e@

C-C

OO

H N

ps Au-CSH/Fe@C-COOH Nps/Ab

Ab

H2O

PB bufor

Au

-CS

H/F

e@

C-C

OO

H N

ps

/Ab

/Tf

wiązanie Tf

H2O

PB bufor

Warstwa sensorowa

Rysunek 68. Sensogramy SPR zarejestrowane podczas każdego etapu modyfikacji elektrody

złotej pokrytej warstwą cysteaminy (Au-CSH). Warunki eksperymentalne: CM Nps = 0.03 mgmL-1

(zaktywowane za pomocą mieszaniny EDC/NHS); CAb = 2.5 mgmL-1

; CTf = 200 mgmL-1

; 0.02 M

bufor PB z dodatkiem 150 mM K2SO4 i 0.2% v/v Tween-20, pH 7.4. Pomiary zostały wykonane

przez dr hab. Agnieszkę Więckowską.


152

W celu potwierdzenia wysokiej specyficzności wiązania Tfprzeciwciało

przeprowadzono eksperyment kontrolny z użyciem przeciwciała

charakterystycznego dla innego białka. Wartości współczynników załamania światła

przed i po etapie oddziaływania Tf z warstwą sensorową zawierającą cząsteczki

przeciwciała charakterystycznego dla innego białka nie uległy zmianie, co świadczy

o tym, że etap odmywania usunął całkowicie cząsteczki Tf z powierzchni warstwy

receptorowej czujnika, ponieważ nie uległy one związaniu z warstwą przeciwciała.

Przeprowadzone eksperymenty pokazały, że opracowana procedura prowadzi do

związania transferyny z warstwą sensorową czujnika tylko na drodze wysokiego

powinowactwa białka do charakterystycznego dla niego przeciwciała, natomiast

wszelkie niespecyficzne oddziaływania praktycznie nie mają miejsca. Każdy etap

konstrukcji immunosensora do elektrochemicznej detekcji transferyny kontrolowany

był dodatkowo przy użyciu skaningowego mikroskopu elektronowego. Zmiany

morfologii powierzchni elektrody podczas kolejnych etapów jej modyfikacji


200 nm

NIEZMODYFIKOWANE CHEMICZNIE Au

Au-CSH Au-CSH/Fe@C-COOH Nps

200 nm 200 nm

Au-CSH/Fe@C-COOH Nps/Ab Au-CSH/Fe@C-COOH Nps/Ab/Tf

200 nm 200 nm

Rysunek 69. Zdjęcia SEM powierzchni złota po kolejnych etapach jej modyfikacji. Zdjęcia

zostały wykonane przez prof. dr hab. Mikołaja Dontena.


153

12.2. Analityczna charakterystyka immunosensora

do elektrochemicznej detekcji Tf

12.2.1. Wykorzystanie oporności przeniesienia ładunku do

ilościowego opisu zakresu pracy immunosensora

Jedną z technik, przy użyciu której dokonano analitycznej charakterystyki

proponowanego immunosensora do bezpośredniej elektrochemicznej detekcji

transferyny była elektrochemiczna spektroskopia impedancyjna. Przykładowe

wykresy Nyquist’a otrzymane dla chemicznie niezmodyfikowanej elektrody złotej

i po kolejnych etapach modyfikacji jej powierzchni przedstawiono na rysunku 70.

Z' /

0 20 40 60 80

-Z'' /

0

10

20

30

40

50

60

CTf

/ gdL-1

1e-7 1e-6 1e-5 1e-4 1e-3 1e-2

R

ct /

0

15

30

45

60

Rysunek 70. Wykresy Nyquist’a otrzymane dla elektrody złotej zmodyfikowanej: monowarstwą

cysteaminy (Au-CSH, czarne symbole), M Nps (Au-CSH/Fe@C-COOH Nps; czerwone symbole),

przeciwciałem transferyny (Au-CSH/Fe@C-COOH Nps/Ab; zielone symbole), Tf

(Au-CSH/Fe@C-COOH Nps/Ab/Tf) o różnym stężeniu: 5·10-7

(niebieskie symbole), 5·10-6

(fioletowe symbole), 5·10-5

(szarozielone symbole), 5·10-4

(szare symbole) oraz 5·10-3

g·dL-1

(pomarańczowe symbole). Białe symbole – 1000-krotnie rozcieńczone osocze krwi szczurzej.

Rysunek wewnętrzny: krzywa kalibracyjna ilustrująca zmiany wartości Rct w funkcji stężenia Tf

(oś X: skala logarytmiczna); czarny symbol trójkątny odnosi się do analizy próbki osocza krwi

szczurzej). Warunki pomiarowe: 1 mM [Fe(CN)6]3−/4−

w 0.02 M buforze PB zawierającym 150

mM K2SO4 i 0.2% v/v Tween-20 o pH 7.4; Eapp. = 0.245 V; Au = 1.6 mm. Linie ciągłe – krzywe

dopasowane teoretycznie przy użyciu programu FRA; punkty – wyniki eksperymentalne.

Rct = Rct(Au-CSH/Fe@C-COOH Nps/Ab/Tf) - Rct(Au-CSH/Fe@C-COOH Nps/Ab).

Otrzymane widma Nyquist’a pokazują, że półkole, które jest miarą oporu

przeniesienia ładunku (Rct), wzrasta w kolejnych etapach modyfikacji powierzchni

elektrody złotej. Dodatkowo, półkole na widmach Nyquist’a wzrastało również wraz


154

ze wzrostem stężenia transferyny związanej z warstwą sensorową. Wzrost ten jest

konsekwencją coraz bardziej utrudnionej wymiany elektronów pomiędzy elektrodą

a próbnikiem redoks obecnym w roztworze. Ilościowo zmiany parametrów

impedancyjnych uzyskanych dla kolejnych etapów konstrukcji czujnika oraz dla

warstwy receptorowej z różną ilością związanej z nią Tf przedstawia tabela 11.




niezmodyfikowanej elektrody złotej, elektrody pokrytej warstwą cysteaminy (Au-CSH), elektrody

zmodyfikowanej nanocząstkami magnetycznymi (Au-CSH/Fe@C-COOH Nps), przeciwciałem

(Au-CSH/Fe@C-COOH Nps/Ab) oraz transferyną o różnym stężeniu (Au-CSH/Fe@C-COOH

Nps/Ab/Tf).

Tdl

[μFs(1-)

cm-2

]

dl Rct

[Ωcm2]

σ

[Ω rad1/2

s-1/2

cm2]

Cdl

[μFcm-2

]

Au 82.1 ± 3.4 0.91 ± 0.02 6.5 ± 0.2 250.2 ± 0.3 23.0 ± 0.9

Au-CSH 63.8 ± 4.2 0.82 ± 0.04 15.6 ± 1.6 253.8 ± 20.1 14.2 ± 0.8

Au-CSH/

Fe@C-COOH

Nps

55.4 ± 1.0 0.78 ± 0.02 17.1 ± 1.4 264.2 ± 18.3 10.5 ± 1.2

Au-CSH/Fe@C-

COOH Nps/Ab 32.2 ± 4.5 0.87 ± 0.09 23.4 ± 2.2 381.3 ± 28.4 8.7 ± 1.3

Au-CSH/Fe@C-COOH Nps/Ab/Tf

Tf (0.5 mg·dL-1

) 40.5 ± 4.2 0.83 ± 0.03 26 ± 3.4 246 ± 40.2 8.2 ± 1.1

Tf (5 mg·dL-1

) 46.8 ± 3.6 0.86 ± 0.04 32 ± 4.4 241 ± 24.1 7.4 ± 1.3

Tf (50 mg·dL-1

) 52.6 ± 5.1 0.86 ± 0.02 38 ± 3.6 235 ± 32.5 6.7 ± 1.5

Tf (500 mg·dL-1

) 53.4 ± 4.8 0.85 ± 0.05 42 ± 3.9 246 ± 19.6 5.3 ± 1.3

Tf (5000 mg·dL-1

) 60.8 ± 4.5 0.87 ± 0.03 53 ± 4.2 259 ± 21.2 4.4 ± 1.2

Analizując uzyskane wartości parametrów EIS można zauważyć, że kolejne etapy

modyfikacji elektrody złotej prowadzą do utworzenia na powierzchni złota dość

równomiernych warstw, co potwierdzają zmiany wartości elementu stało-fazowego

(dl). Wartości te były nieco niższe, o ok. 25% od sytuacji idealnej, w której dla

elektrody monokrystalicznej wartość tego parametru jest równa 1. Największe

zmiany, w porównaniu do niezmodyfikowanej chemicznie powierzchni elektrody

złotej, zaobserwowano w wartościach: oporu przeniesienia ładunku (Rct), parametru

Warburga (σ) i pojemności warstwy podwójnej (Cdl). Zmiany wartości oporu

przeniesienia ładunku dla warstwy receptorowej immunosensora o różnym stopniu


155

wysycenia transferyną wykorzystano do konstrukcji krzywej kalibracyjnej

(Rct = Rct(Au-CSH/Fe@C-COOH Nps/Ab/Tf) - Rct(Au-CSH/Fe@C-COOH Nps/Ab) górny rysunek

wewnętrzny na wykresie 70). W szerokim zakresie stężeń transferyny od 5·10-7

do

5·10-2

g·dL-1

(5·10-3

÷ 500 mg·mL-1

) obserwowano liniową zależność wartości oporu

przeniesienia ładunku (Rct) w funkcji stężenia transferyny. Wyznaczona na podstawie

danych impedancyjnych, metodą Hubaux-Vos, granica wykrywalności wynosiła

15.0 2.4 ng·dL-1

.

12.2.2. Grawimetryczna charakterystyka immunosensora

Zastosowanie podczas pomiarów kryształu kwarcu z napyloną warstwą złota

(Au-EQCM) umożliwiło jednoczesną grawimetryczną i woltamperometryczną

charakterystykę zaproponowanego immunosensora do detekcji Tf. Pomiary

z użyciem elektrochemicznej mikrowagi kwarcowej przeprowadzono dla różnych

stężeń transferyny z zakresu od 5·10-7

do 5·10-2

g·dL-1

. Zależność zmian

częstotliwości drgań złotego kryształu kwarcu podczas procesu wiązania transferyny

z warstwą sensorową, w wyniku wysoce specyficznego oddziaływania

antygenprzeciwciało, przedstawia rysunek 71.

czas / s

0 5000 10000 15000

f

/ H

z

0.00510-4 gdL

-1

0.0510-4

gdL-1

0.510-4 gdL

-1

510-4 gdL

-1

5010-4 gdL

-1

-100 Hz

1000-krotnie rozcieńczone osocze

Rysunek 71. Zależności zmian częstotliwości drgań kryształu kwarcu podczas procesu

oddziaływania transferyny z warstwą sensorową w obecności zewnętrznego źródła pola

magnetycznego (90 mT). Czerwona krzywa ilustruje proces unieruchamiania transferyny

znajdującej się w 1000-krotnie rozcieńczonym osoczu krwi szczurzej. Warunki pomiarowe:

0.02 M bufor PB z dodatkiem 150 mM K2SO4 oraz 0.2 % v/v Tween-20, pH 7.4.


156

Zarejestrowane krzywe charakteryzują się dobrze widocznymi oscylacjami, których

amplituda (AΔf) silnie zależała od zastosowanego stężenia transferyny. Dodatkowo,

oscylacje te widoczne były tylko podczas procesu unieruchamiania transferyny

w warstwie sensorowej. Wyjaśnienie obserwowanych oscylacji nie jest proste.

W początkowym etapie wiązania Tf z warstwą receptorową immunosensora

widoczny jest spadek częstotliwości drgań kryształu kwarcu. Najprawdopodobniej

w wyniku obecności pola magnetycznego ma miejsce zmiana: (i) konformacji

paramagnetycznej cząsteczki transferyny i (ii) gęstości jej upakowania w warstwie.

To z kolei mogło skutkować utratą otoczki hydratacyjnej i zmianą

wiskoelastyczności warstwy Tf. W konsekwencji obserwowany był wzrost

częstotliwości drgań kryształu kwarcu. Następnie warstwa białka ulegała ponownie

uwodnieniu i znów obserwowany był spadek częstotliwości drgań kryształu kwarcu.

Wzrost stopnia wysycenia warstwy receptorowej cząsteczkami transferyny

skutkował znacznie wolniejszymi zmianami częstotliwości drgań kryształu kwarcu,

gdyż tworzona warstwa była bardziej upakowana. Z uwagi na fakt, że roztwór

transferyny był odtleniany podczas pomiaru, obserwowane oscylacje można

przypisać jedynie oddziaływaniu pola magnetycznego z paramagnetyczną

transferyną.

W celu uzyskania informacji na temat wpływu natężenia pola magnetycznego

na wartości amplitudy oscylacji częstotliwości drgań kryształu kwarcu

przeprowadzono eksperyment, w którym zmieniano odległość magnesu względem

powierzchni elektrody. Zarejestrowane krzywe ilustrujące zmiany częstotliwości

drgań kryształu kwarcu ilustruje rysunek 72. Na podstawie uzyskanych krzywych

można stwierdzić, że obecność pola magnetycznego oraz jego natężenie silnie

wpływają na kształt pojawiających się oscylacji drgań kryształu kwarcu, jak również

na ich amplitudę. Usunięcie magnesu skutkowało całkowitym zanikiem oscylacji.


157

0.005 g/ml

0.05 g/ml

0.5 g/ml

5 g/ml

50 g/ml

czas/s vs f/Hz

czas / s

0 2000 4000 6000 8000

f

/ H

z

-200

-150

-100

-50

0

wiązanie Tf z warstwą

sensorową (Au-CSH/M Nps/Ab)

czysty bufor PB

T = 90 mT(d= 0.5 cm)

T = 50 mT(d =2.5 cm)

bez magnesu

Rysunek 72. Zależności zmian częstotliwości drgań kryształu kwarcu przed (linia przerywana)

oraz w trakcie procesu unieruchamiania transferyny w warstwie sensorowej

(Au-CSH/Fe@C-COOH Nps/Ab) w nieobecności i obecności pola magnetycznego o różnym

natężeniu. CTf = 5 mg·dL-1

(0.05 mg·mL-1

).

Z uwagi na występowanie ścisłego związku pomiędzy amplitudą oscylacji

a ilością transferyny związanej z warstwą sensorową, zależność ta została

wykorzystana do konstrukcji krzywej kalibracyjnej przedstawionej na rysunku 73.

CTf / gdL

-1

1e-7 1e-6 1e-5 1e-4 1e-3 1e-2

A

f /

Hz

0

20

40

60

80

100

120

czas / s0 3000 6000 9000 12000

f

/ H

z

-100

-80

-60

-40

-20

0

Af

Rysunek 73. Zależność amplitudy oscylacji drgań kryształu kwarcu od stężenia transferyny.

Warunki pomiarowe: 0.02 M bufor PB z dodatkiem 150 mM K2SO4, pH 7.4. Czerwony trójkąt na

krzywej dotyczy próbki 1000-krotnie rozcieńczonego osocza krwi szczurzej (oś X: skala

logarytmiczna).


158

Uzyskana w ten sposób krzywa kalibracyjna charakteryzowała się liniowością

w zakresie stężeń transferyny od 5·10-7

(0.005 mg·mL-1

) do 5·10-2

g·dL-1

(500 mg·mL-1

). Granica wykrywalności wyznaczona metodą Hubaux–Vos wynosiła

12.0 1.8 ng·dL-1

.

12.2.3. Woltamperometryczna detekcja transferyny

Biorąc pod uwagę fakt, że transferyna zawiera w swojej strukturze jony

Fe(III), które są odpowiedzialne za jej elektroaktywność, kolejny etap badań

dotyczył sprawdzenia możliwości woltamperometrycznej detekcji transferyny.

Rejestracja dobrze wykształconych sygnałów prądowych transferyny możliwa jest

tylko w przypadku osiągnięcia odpowiedniej jej orientacji względem powierzchni

elektrody, która umożliwia bezpośredni transport elektronów pomiędzy centrum

redoks białka a elektrodą. Ze względu na przynależność transferyny do grupy

paramagnetycznych białek zastosowanie zewnętrznego pola magnetycznego

w połączeniu z ferromagnetycznym modyfikatorem powierzchni elektrody

umożliwia osiągnięcie wymaganej orientacji transferyny. Z kolei zastosowana

procedura wiązania przeciwciała z powierzchnią elektrody zapewniała odpowiednie

ułożenie przeciwciała w warstwie sensorowej, które pozwalało na bezpośredni

transport elektronów pomiędzy centrum elektroaktywnym transferyny a elektrodą.

Pomiary woltamperometryczne przeprowadzone zostały w obecności oraz

nieobecności zewnętrznego źródła pola magnetycznego w układzie. W celu

potwierdzenia, że uzyskany sygnał prądowy pochodzi od transferyny związanej

z warstwą sensorową immunosensora jedynie na drodze jej oddziaływania

z przeciwciałem, wykonano eksperyment kontrolny, w którym niezmodyfikowana

chemicznie elektroda złota, elektroda zmodyfikowana warstwą cysteaminy

(Au-CSH), następnie nanocząstkami magnetycznymi (Au-CSH/Fe@C-COOH Nps)

i ostatecznie przeciwciałem (Au-CSH/Fe@C-COOH Nps/Ab) została zanurzona na

60 minut do roztworu transferyny w obecności pola magnetycznego. Po tym czasie

elektroda była opłukiwana delikatnym strumieniem buforu PB z dodatkiem 0.15 M

K2SO4 i 0.2% v/v Tweenu-20, a następnie przeprowadzany był pomiar przy użyciu

woltamperometrii liniowej w odtlenionym 0.02 M buforze fosforanowym

z dodatkiem 0.15 M K2SO4. Uzyskane krzywe woltamperometryczne przedstawia

rysunek 74.


159


-0.7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0.0

I /

A

-4.0

-3.0

-2.0

-1.0

0.0

a

b

d

c

Rysunek 74. Skorygowane o tło krzywe woltamperometryczne redukcji transferyny związanej

z chemicznie niezmodyfikowaną elektrodą złotą (a) oraz zmodyfikowaną: Au-CSH (b);

Au-CSH/Fe@C-COOH Nps (c); Au-CSH/Fe@C-COOH Nps/Ab (d) zarejestrowane

w odtlenionym za pomocą Ar 0.02 M bufor PB z dodatkiem 150 mM K2SO4 i 0.2% v/v Tween-20

o pH 7.4 w obecności zewnętrznego źródła pola magnetycznego (90 mT). Stężenie Tf w roztworze

5·10-4

g·dL-1

; szybkość przemiatania potencjałem: 25 mVs-1

.

Przeprowadzony eksperyment udowodnił, że transferyna nie wykazuje aktywności

elektrochemicznej w przypadku jej unieruchomienia na chemicznie

niezmodyfikowanej elektrodzie złotej oraz elektrodzie zmodyfikowanej tylko

cysteaminą. Sygnał pochodzący od redukcji jonów żelaza(III) obecnych w strukturze

Tf widoczny był jedynie w przypadku białka związanego z nanocząstkami

magnetycznymi obecnymi na powierzchni elektrody (krzywa c na rysunku 74) lub

z przeciwciałem (krzywa d na rysunku 74). Dobrze widoczny szeroki sygnał

prądowy przy wartości potencjału ok. -0.53 V odpowiada procesowi elektroredukcji

Fe(III) do Fe(II) w cząsteczce transferyny unieruchomionej na skutek oddziaływania

antygenprzeciwciało. Związanie transferyny z nanocząsteczkami magnetycznymi

(Au-CSH/Fe@C-COOH Nps) skutkuje przesunięciem sygnału prądowego

elektroredukcji jonów żelaza(III) znajdujących się w strukturze transferyny

o ok. 0.09 V w kierunku mniej ujemnych wartości potencjału oraz zwiększeniem

jego intensywności. Niestety, czujnik oparty na oddziaływaniu Tf tylko z warstwą

nanocząstek magnetycznych nie może być zastosowany do oznaczania tego białka

we krwi. Wynika to z faktu, że próbka krwi oprócz transferyny zawiera szereg

paramagnetycznych składników, które również mogą oddziaływać z nanocząstkami


160

magnetycznymi. Z tego powodu, w celu określenia ilości transferyny we krwi

niezbędne jest zastosowanie warstwy sensorowej zawierającej przeciwciało, które

selektywnie zwiąże tylko oznaczane białko.

Krzywe woltamperometryczne transferyny związanej z warstwą sensorową

immunosensora, w wyniku jego zanurzenia do roztworu Tf z zakresu stężeń od 5·10-7

(0.005 mg·mL-1

) do 5·10-2

g·dL-1

(500 mg·mL-1

) przedstawia rysunek 75.


-0.7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0.0

I /

A

-3.0

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.00510-4

gdL-1

5010-4 gdL

-1

1000-krotnie rozcieńczone osocze

CTf

/ gdL-1

1e-7 1e-6 1e-5 1e-4 1e-3 1e-2

I /

A-3.0

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

Rysunek 75. Skorygowane o tło krzywe woltamperometryczne elektroredukcji transferyny

związanej z immunosensorem w obecności zewnętrznego źródła pola magnetycznego (magnes

neodymowy, 90 mT). Rysunek wewnętrzny: krzywa kalibracyjna (oś X: skala logarytmiczna);

czerwony trójkąt dotyczy analizy próbki 1000-krotnie rozcieńczonego osocza krwi szczurzej.

Warunki pomiarowe: 0.02 M bufor PB z dodatkiem 150 mM K2SO4 i 0.2% v/v Tween-20, pH 7.4;

v = 25 mVs-1

.

Intensywność sygnału prądowego przy potencjale ok. -0.53 V pochodzącego od

elektredukcji jonów Fe(III) jest wprost proporcjonalna do ilości Tf związanej

z warstwą sensorową. Wyznaczona granica wykrywalności transferyny przy użyciu

metody Haubox-Vos wynosiła 24.0 5.2 ng·dL-1

. Dla wszystkich badanych stężeń

transferyny z zakresu linowego krzywej kalibracyjnej powtarzalność wyników była

bardzo dobra, a względne odchylenie standardowe było mniejsze niż 15% dla

wszystkich badanych stężeń (n = 6). Względne odchylenie standardowe wyników

uzyskanych dla tego samego stężenia Tf na sześciu różnych, niezależnie

zmodyfikowanych elektrodach wynosiło ok. 10%.


161

Zaproponowany immunosensor charakteryzował się granicą wykrywalności

na podobnym poziomie, jak inne czujniki opisane w literaturze, które przedstawiono

w tabeli 12.

Tabela 12. Porównanie immunosensorów do detekcji transferyny z wykorzystaniem

nieelektrochemicznych i elektrochemicznych metod.

Czujnik Sygnał

analityczny

Technika

detekcji

LOD

(ng·dL-1

) Literatura

Techniki nieelektrochemiczne

Au/GO/AuNR/Ab/Tf SPR 1 [441]

Au/białko A/Ab/Tf QCM 1 [442]

Au NCS/Ab/Tf Fluorescencja 0.1 [443]

Techniki elektrochemiczne

IrOx/anty-Ab/Ab/antyAb-

Tf HQDP ChA (MET) 0.62 [261]

Au/-Al2O3 film zol-

żel/C10H25SH/Au

Nps/Ab/Tf

Fe(CN)63-/4-

EIS (MET) 5·10-4

[444]

CCPE/Ab/Tf-HRP HQ/H2O2 ChA (MET) 0.2 [445]

Au/CSH/Fe@C-COOH

NPs/Ab/Tf Tf

EIS

QCM

LSV (DET)

15

12

24

Skonstruowany

sensor

AuNR – nanodruty złote; GO – tlenek grafenu; Ab – przeciwciało transferyny; SPR – powierzchniowy

rezonans plazmonowy; QCM – mikrowaga kwarcowa; Au NCS – nanoklastry złota; IrOx – tlenek irydu;

MET – transport elektronów z wykorzystaniem mediatora; DET – bezpośredni transport elektronów;

HQDP – fosforan(V) hydrochinonu; ChA – chronoamperometria; EIS – elektrochemiczna spektroskopia

impedancyjna; CCPE – elektroda z pasty węglowej zmieszanej z chitosanem; HRP – peroksydaza

chrzanowa; HQ – hydrochinon; Au Nps – nanocząstki złota.

12.2.4. Stabilność, selektywność oraz odtwarzalność warstwy

receptorowej immunosensora

Analizy stabilności immunosensora do bezpośredniej woltamperometrycznej

detekcji transferyny dokonano na podstawie kontroli zmian wartości oporu

przeniesienia ładunku (Rct) w funkcji czasu, jaki upłynął od momentu konstrukcji

immunosensora do momentu jego użycia – oddziaływania z Tf (500 mg·dL-1

).

Pomiary wykonywane było co 24 h przez 14 dni. Po etapie konstrukcji, jak również

pomiędzy pomiarami immunosensor przetrzymywany był w lodówce (4 °C). Na


162

podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, że skonstruowany immunosensor

do detekcji Tf charakteryzował się bardzo dobrą stabilnością, a zastosowana

procedura unieruchomienia przeciwciała pozwala na zachowanie jego specyficznej

aktywności względem transferyny. Różnice w wartościach oporu przeniesienia

ładunku w ciągu pierwszych 5 dni nie były większe niż 7%. Przez kolejne 8 dni

obserwowano coraz większe spadki wartości Rct, aż do ok. 35%, w odniesieniu do

wartości początkowej. Po czasie dłużyszm niż 13 dni uzyskiwane wartości oporu

przeniesienia ładunku były mniejsze niż 50% wartości początkowej.

Selektywność narzędzia analitycznego określana jest jako pewnego rodzaju

"przedział ufności", w którym może być ono stosowane do oznaczania substancji

poszukiwanej w obecności innych składników próbki bez występowania

interferencji, czyli bez wpływu składników matrycy na sygnał analitu. Selektywność

zaproponowanego immunosensora sprawdzono w obecności potencjalnych

substancji występujących we krwi, które mogą zakłócać oznaczanie transferyny.

W badaniach wykorzystano hemoglobinę (Hb), albuminę surowicy ludzkiej (HSA),

-glikoproteinę z ludzkiego osocza (-GP) i apo-transferynę (apo-Tf).

Eksperymenty zostały przeprowadzone dla dwóch różnych stężeń transferyny:

0.5·10-4

oraz 50·10-4

g·dL-1

, dzięki czemu uzyskano różne wysycenie warstwy

sensorowej cząsteczkami białka. Miało to na celu sprawdzenie, czy ilość transferyny

wpływa na oddziaływanie substancji zakłócających z immunosensorem oraz czy

substancje te mogą tworzyć bardziej stabilne kompleksy z przeciwciałem niż Tf.

W tym celu immunosensor (Au-CSH/Fe@C-COOH Nps/Ab) zanurzany był na czas

2 h do buforu PB zawierającego Tf oraz interferent, oba o tym samym stężeniu. Po

tym czasie elektroda była opłukiwana delikatnym strumieniem buforu PB

z dodatkiem 150 mM K2SO4 i 0.2% v/v Tween-20, a następnie przeprowadzany był

pomiar przy użyciu woltamperometrii liniowej w czystym odtlenionym 0.02 M

buforze fosforanowym z dodatkiem 0.15 M K2SO4. Wpływ substancji zakłócających

na sygnał elektroredukcji Tf (ITf + interferent / ITf) przedstawiony został na rysunku 76.


163

I Tf+

in

terf

ere

nt /

I Tf

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4 Tf: 5010-4 gdL

-1

Tf: 0.510-4

gdL-1

-GPHSA apo-Tf Hb

Rysunek 76. Wpływ obecności interferentów na prąd redukcji jonów Fe(III) obecnych

w strukturze transferyny.

Obecność HSA, -GP oraz apo-Tf tylko w nieznacznym stopniu wpływała na

intensywność rejestrowanego sygnału redukcji Tf związanej z warstwą sensorową

immunosensora. Sygnał elektroredukcji transferyny związanej z immunosensorem

w obecności powyższych substancji zakłócających nie uległ zmianie, zarówno pod

względem kształtu, jak i położenia na osi potencjałowej. Niewielkie zmiany,

w granicach statystycznego błędu, obserwowane były w przypadku intensywności

rejestrowanego sygnału. Największe różnice wartości sygnału prądowego

elektroredukcji transferyny, rzędu 30%, obserwowano w przypadku mieszaniny Tf

z Hb. Najprawdopodobniej, hemoglobina, jako jedyna z badanej grupy interferentów

ulegała adsorbcji na warstwie nanocząstek magnetycznych niepokrytych

przeciwciałem Tf. Uzyskane dane świadczą, że zaproponowany immunosensor może

być wykorzystany do oznaczania transferyny w próbce krwi, ale tylko po uprzednim

usunięciu z niej hemoglobiny.

Kolejny etap badań dotyczył sprawdzenia możliwości odtworzenia warstwy

sensorowej immunosensora, czyli zbadania czy po usunięciu Tf z warstwy jest ona

w takim samym stopniu zdolna do ponownego związania Tf. Transferyna została

usunięta z warstwy sensorowej przy użyciu roztworu chlorowodorku glicyny o pH

2.8 [446], do którego zanurzano elektrodę na czas 15 minut. Po tym czasie,

cząsteczki Tf związane z warstwą receptorową immunosensora na drodze

oddziaływań antygenprzeciwciało powinny zostać usunięte z powierzchni


164

immunosensora. Kontroli wydajności tego procesu dokonano na podstawie zmian

wartości oporu przeniesienia ładunku świeżo przygotowanej warstwy sensorowej

(Au-CSH/Fe@C-COOH Nps/Ab) i po etapie jej regeneracji w roztworze

chlorowodorku glicyny. Wykresy Nyquist’a zarejestrowane dla dwóch kolejnych

etapów regeneracji warstwy receptorowej immunosensora przedstawia rysunek 77.

Z' /

0 20 40 60 80 100 120 140

-Z'' /

0

20

40

60

80

100 świeżo przygotowana warstwa sensorowa

I regeneracja warstwy sensorowej

II regeneracja warstwy sensorowej

Rysunek 77. Wykresy Nyquist’a uzyskane dla pomiarów po oddziaływaniu transferyny

ze świeżo przygotowanym immunosensorem Au-CSH/Fe@C-COOH Nps/Ab i po jego

regeneracji. Warunki eksperymentalne: CTf = 0.05 µg·mL-1

; 0.02 M bufor PB z dodatkiem

150 mM K2SO4 i 0.2% v/v Tween-20 o pH 7.4, zawierający 1 mM [Fe(CN)6]3−/4−

; Eapp = 0.245 V.

Wykonane dwa testy regeneracyjne wykazały, że wydajność procesu

odtwarzania warstwy receptorowej immunosensora jest bardzo wysoka i wynosiła

około 90% w porównaniu do świeżo przygotowanego immunosensora do detekcji Tf.

W kolejnych cyklach regeneracji wartość Rct wzrosła (o około 25%) w odniesieniu

do wartości Rct zarejestrowanej dla świeżo przygotowanego czujnika. Oznacza to, że

skuteczność usuwania Tf z warstwy receptorowej uległa zmniejszeniu. Uzyskane

dane pozwalają stwierdzić, że skonstruowany immunosensor może być używany

trzykrotnie bez znacznej utraty czułości.

12.2.5. Zastosowanie immunosensora w analizie próbek krwi

Funkcjonalność skonstruowanego immunosensora do woltamperometrycznej

detekcji Tf została sprawdzona na dwóch niezależnych próbkach krwi szczurzej.

Z przeprowadzonych eksperymentów (rysunek 74) wynika, że tylko hemoglobina


165

(obecna w czerwonych krwinkach) może zakłócić określenie ilości transferyny

w analizowanej próbce krwi. Biorąc pod uwagę powyższy fakt, przed pomiarami

próbkę krwi, stabilizowaną jonami cytrynianu sodu, poddawano wirowaniu w celu

oddzielenia elementów morfotycznych od osocza. Następnie do osocza

rozcieńczonego 1000-krotnie buforem fosforanowym zanurzano immunosensor na

czas 60 minut. Po upływie tego czasu elektrodę delikatnie opłukiwano strumieniem

wody destylowanej, a następnie przeprowadzano pomiar w czystym odtlenionym

0.02 M buforze PB z dodatkiem 150 mM K2SO4 określoną metodą analityczną.

Stężenie transferyny w badanych próbkach krwi zostało wyznaczone na podstawie

pomiarów z użyciem elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej oraz

elektrochemicznej mikrowagi kwarcowej i wynosiło: 0.45 0.09 (EIS) i 0.42 0.08

(QCM) i 0.31 0.1 g·dL-1

(LSV) (uwzględniając 1000-krotne rozcieńczenie próbki

krwi). Poziom transferyny we krwi szczurzej, zgodnie z literaturą, mieści się

w zakresie od 0.356 do 0.550 g·dL-1

[447]. Zatem uzyskane wyniki zawartości Tf we

krwi przy użyciu zaproponowanego immunosensora dowodzą, że metoda ta może

z powodzeniem być wykorzystywana w oznaczeniach tego białka również we krwi

ludzkiej.

12.3. Wpływ pola magnetycznego i ferromagnetycznego

modyfikatora powierzchni elektrody na integralność

konformacyjną i elektroaktywność transferyny

Spośród wszystkich paramagnetycznych białek obecnych we krwi transferyna

jest najbardziej podatna na zmiany konformacyjne, prowadzące nawet do uwolnienia

jonów Fe(III) z otoczki białkowej [448-450]. Cząsteczka transferyny wiążąc

i uwalniając jony żelaza ulega cyklicznym zmianom konformacyjnym, dzięki czemu

możliwe jest jej rozpoznanie przez receptory znajdujące się w błonach

plazmatycznych [143]. Z uwagi na fakt, że komórki nowotworowe posiadają na

powierzchni swoich błon zwiększoną liczbę receptorów transferyny, w porównaniu

do komórek prawidłowych, obecność tego białka na powierzchni nośnika leku

przeciwnowotworowego może ułatwiać jego transport do jądra komórkowego [180].

Z literatury wiadomo, że kontakt Tf z powierzchnią superparamagnetycznych

nanocząstek tlenku żelaza prowadzi do uwalniania żelaza ze struktury Tf [451].


166

Proces ten jest tym efektywniejszy, im mniejsza jest wartość stosunku stężenia

transferyny względem stężenia nanocząstek magnetycznych. Powstaje zatem pytanie,

jaki wpływ na konformację transferyny, a tym samym na jej elektroaktywność, mają

nanokapsuły węglowe zawierające żelazo w połączeniu z polem magnetycznym?

12.3.1. Procedura syntezy koniugatu transferyna-nanocząstka

magnetyczna

W badaniach związanych z tym zagadnieniem zastosowano nanokapsuły

węglowe zawierające żelazo, których powierzchnię zmodyfikowano grupami

karboksylowymi. Transferyna unieruchamiana była na powierzchni takiej

nanocząstki za pośrednictwem wiązania amidowego utworzonego pomiędzy grupami

aminowymi białka i grupami karboksylowymi nanocząstek magnetycznych. Synteza

koniugatu nanocząstka magnetyczna – transferyna (Fe@C-COOH/Tf) przebiegała

w trzech prostych etapach. Pierwszy etap związany był z aktywacją grup

karboksylowych znajdujących się na powierzchni nanocząstek magnetycznych za

pomocą mieszaniny EDC/NHS. Następnie do zaktywowanej mieszaniny nanocząstek

dodawana była transferyna, a proces sprzęgania Tf z Fe@C-COOH Nps przebiegał

w obecności i nieobecności pola magnetycznego przez 1 h. W ostatnim etapie

syntezy nieprzereagowana transferyna odmywana była od koniugatu za pomocą

buforu fosforanowego w obecności magnesu. Schemat syntezy koniugatu

Fe@C-COOH/Tf ilustruje rysunek 78.

Kapsuły węglowe zawierające żelazo

sfunkcjonalizowane grupami –COOH

(Fe@C-COOH Nps)

AKTYWACJA

GRUP COOH (1 h)

TF

(1 h)

WYTRZĄSANIE

(1 h)

WIELOKROTNE

PRZEMYWANIE

MAGNES

Rysunek 78. Schemat syntezy koniugatu Fe@C-COOH/Tf.


167

12.3.2. Charakterystyka spektroskopowa koniugatu

Fe@C-COOH/Tf

Z uwagi na fakt, że białka wykazują silną tendencję do procesu adsorpcji,

pierwszy etap badań związany był z potwierdzeniem sposobu unieruchomienia Tf na

powierzchni nanocząstek magnetycznych. W tym celu zsyntezowano dwa koniugaty

Fe@C-COOH/Tf. W jednym z nich Tf unieruchomiona została na powierzchni

nanocząstki magnetycznej za pośrednictwem wiązania amidowego pomiędzy

grupami –NH2 obecnymi w jej otoczce białkowej i grupami –COOH nanokapsuł.

Drugi koniugat otrzymano w wyniku fizycznej adsorpcji Tf na powierzchni

Fe@C-COOH Nps (etap aktywacji grup karboksylowych przy użyciu mieszaniny

EDC/NHS został pominięty). Dodatkowo, syntezę koniugatów przeprowadzono

w nieobecności i obecności magnesu. Otrzymane koniugaty Fe@C-COOH/Tf

zostały scharakteryzowane przy użyciu spektroskopii w podczerwieni

z transformacją Fouriera (FTIR). Pomiary wykonano zarówno dla koniugatów, jak

i czystych składników, czyli kapsuł węglowych oraz transferyny. Uzyskane widma

FTIR przedstawione zostały na rysunku 79. Widmo FTIR czystych nanokapsuł

węglowych charakteryzuje się obecnością trzech głównych pasm położonych przy

następujących wartościach liczb falowych: (1) ok. 1700 cm-1

odpowiadających

drganiom rozciągającym –C=O grupy karboksylowej, (2) ok. 1580 i 1530 cm-1

związanych z drganiami rozciągającymi C=C w heksagonalnej sieci grafitu oraz

(3) ok. 1200 cm-1

odpowiadających drganiom wiązania CO. Z kolei widmo FTIR

transferyny, jak i każdego białka, posiada dwa dobrze widoczne, charakterystyczne

pasma przy ok. 1530 (amid II) i 1650 cm-1

(amid I) odpowiadające drganiom

rozciągającym pomiędzy atomami −N−H i −C=O [452]. Utworzenie trwałego

wiązania kowalencyjnego (wiązania amidowego) pomiędzy nanocząstką

magnetyczną a cząsteczką Tf skutkowało nie tylko spadkiem intensywności pasm

amid I i amid II, ale również przesunięciem pasma amid I w kierunku mniejszych

wartości liczb falowych o około 20 cm-1

. Położenie tego pasma w przypadku

koniugatu Fe@C-COOH/Tf otrzymanego w wyniku fizycznej adsorpcji białka nie

uległo zmianie. Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera

potwierdziła, że cząsteczki transferyny unieruchamiane są na powierzchni

nanocząstek magnetycznych głównie za pośrednictwem wiązań amidowych, pomimo


168

faktu, że grupy karboksylowe obecne na powierzchni nanokapsuł węglowych

pokrywają ją tylko w niewielkim stopniu [453].

liczba falowa / cm-1

800 1200 1600 2000 2400

tra

ns

mit

an

cja

/ a

.u.

Fe@C-COOH/Tf

Fe@C-COOH/Tf

Fe@C-COOH/Tfmagnes

wią

za

nie

n

ieko

wa

len

cyjn

ew

iąza

nie

k

ow

ale

nc

yjn

e

ludzka Tf

Fe@C-COOH Nps

amid II(-N-H)

amid I(-C=O)

Rysunek 79. Widma FTIR nanocząstek magnetycznych (Fe@C-COOH Nps), ludzkiej

transferyny (Tf) oraz koniugatów Fe@C-COOH/Tf utworzonych za pośrednictwem

niekowalencyjnych oraz kowalencyjnych wiązań, w nieobecności i obecności zewnętrznego źródła

pola magnetycznego (40 mT). Pomiary wykonane przez dr hab. Michała Bystrzejewskiego.

W celu potwierdzenia lub wykluczenia zjawiska niszczenia struktury

transferyny (uwolnienie żelaza z jej wnętrza) w wyniku jej kowalencyjnego

unieruchomienia na nanocząstkach magnetycznych w obecności pola

magnetycznego, zarejestrowane zostały widma UV-vis. Pomiary wykonano dla

roztworu koniugatu Fe@C-COOH Nps/Tf oraz roztworu transferyny przed etapem

jej związania z nanoczastką magnetyczną oraz po jej uwolnieniu z koniugatu.

Zarejestrowane widma UV-vis przedstawione zostały na rysunku 80. Z uwagi na

sposób związania cząsteczki transferyny z nanokapsułą Fe@C-COOH (wiązanie

amidowe) proces jej uwolnienia z koniugatu zachodzi w środowisku lekko kwaśnym

(pH 4÷5), w którym następuje hydroliza wiązania amidowego i w efekcie usunięcie

Tf z powierzchni nanokapsuły. Widmo UV-vis Tf posiada dwa charakterystyczne

pasma: (1) w zakresie ultrafioletu przy długości fali ok. 280 nm oraz (2) w zakresie

światła widzialnego przy długości fali ok. 465 nm. Zdolność Tf do pochłaniania

światła z zakresu UV wynika z obecności w jej strukturze aminokwasów

aromatycznych, takich jak: fenyloalanina, tryptofan oraz tyrozyna. Z kolei pasmo

przy około 465 nm związane jest z obecnością jonów Fe(III) w strukturze tego


169

białka. Widmo uzyskane dla koniugatu Fe@C-COOH/Tf (ciągła linia czerwona na

rysunku 80) jest bardzo zbliżone do widma UV-vis czystej Tf (ciągła linia czarna na

rysunku 80). Zatem etap unieruchamiania transferyny na powierzchni nanocząstek

magnetycznych w obecności magnesu nie powoduje uwolnienia jonów Fe(III) ze

struktury białka, co potwierdza wykres wewnętrzny na rysunku 80.


300 400 500 600

A

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0


400 500 600

A0.000

0.015

0.030

ludzka Tf

Fe@C-COOH/Tf

Fe@C-COOH Nps

Tf

Fe@C-COOH/Tf

Tf uwolniona z koniugatu

Fe@C-COOH Nps

Rysunek 80. Widma UV-vis nanokapsuł węglowych zawierających żelazo (Fe@C-COOH Nps),

ludzkiej transferyny (Tf) i koniugatu Fe@C-COOH/Tf utworzonego w obecności magnesu

(40 mT). Rysunek wewnętrzny: powiększenie obszaru z zakresu długości fali 400 ÷ 600 nm.

Warunki eksperymentalne: CTf = 200 mg·L-1

; 0.02 M bufor PB zawierający 150 mM K2SO4, pH

7.4.

Obecność ewentualnych zmian konformacyjnych transferyny wywołanych jej

oddziaływaniem z nanocząstkami magnetycznymi w obecności pola magnetycznego

została sprawdzona przy użyciu spektroskopii dichroizmu kołowego. Widma CD dla

czystej ludzkiej Tf, Fe@C-COOH Nps oraz koniugatu Fe@C-COOH/Tf przedstawia

rysunek 81.


170


190 200 210 220 230 240 250

m

deg

-5.0

0.0

5.0

10.0

ludzka Tf

Fe@C-COOH/Tf

Fe@C-COOH Nps długość fali / nm

200 220 240

m

deg

-2.0

0.0

2.0

Rysunek 81. Widma CD ludzkiej transferyny, nanokapsuł węglowych zawierających żelazo

(Fe@C-COOH Nps) i koniugatu Fe@C-COOH/Tf zsyntezowanego w obecności magnesu

(40 mT). Rysunek wewnętrzny: widma CD dla Tf przed (ciągła linia czerwona) i po uwolnieniu jej

z koniugatu (przerywana linia czerwona).

Widmo CD ludzkiej transferyny charakteryzuje się występowaniem dwóch pasm

negatywnych przy długości fali 210 i 217 nm oraz jednego pasma pozytywnego przy

długości fali ok. 192 nm, co wskazuje na wyższą zawartość struktur α-helikalnych

w cząsteczce Tf niż β-kartek. Analogicznie, jak w przypadku pomiarów UV-vis,

widmo CD transferyny uwolnionej z koniugatu jest praktycznie identyczne jak

widmo uzyskane dla roztworu czystego białka, co ilustruje wykres wewnętrzny na

rysunku 81. Zatem oddziaływanie Tf z nanocząstkami magnetycznymi w obecności

pola magnetycznego nie powoduje nieodwracalnych zmian jej konformacji.

12.3.3. Analiza termograwimetryczna koniugatu Fe@C-COOH/Tf

Informacji na temat ilości zwiazanej kowalencyjnie i niekowalencyjnie

transferyny z nanocząstką magnetyczną, jak również organizacji takiej warstwy

dostarczyły badania termograwimetryczne. Termiczny rozkład transferyny

rozpoczyna się przy temperaturze ok. 220-230 C i kończy przy 500 C, co ilustruje

wykres wewnętrzny na rysunku 82.


171

temperatura / oC

0 100 200 300 400 500

masa

(w

t. %

)

80

85

90

95

100

temperatura / oC

0 100 200 300 400 500

ma

sa (

wt.

%)

20

40

60

80

100ludzka Tf

Fe@C-COOH Nps

Fe@C-COOH/Tf

Fe@C-COOH/Tf magnes wią

za

nie

nie

ko

wale

ncyjn

ew

iąza

nie

ko

wale

ncyjn

e

Fe@C-COOH/Tf

Fe@C-COOH/Tf magnes

Rysunek 82. Krzywe termograwimetryczne dla nanocząstek magnetycznych Fe@C-COOH,

ludzkiej transferyny (Tf) i koniugatu Fe@C-COOH/Tf utworzonego w nieobecności i obecności

zewnętrznego pola magnetycznego (40 mT) za pomocą niekowalencyjnego i kowalencyjnego

wiązania. Pomiary wykonane przez dr hab. Michała Bystrzejewskiego.

Na krzywych TGA uzyskanych dla koniugatu Fe@C-COOH/Tf, bez względu na

sposób unieruchamiania białka, wyróżnić można dwa obszary. W pierwszym z nich

w zakresie temperatur 20 ÷ 100 C utrata masy nie przekraczała 3% i związana jest

z desorpcją wody oraz zaadsorbowanych gazów. Drugi obszar obejmuje z kolei

utratę masy związaną z procesem rozkładu pozostałych substancji zakotwiczonych

na powierzchni nanocząstek magnetycznych, w tym transferyny. Zarejestrowane

krzywe termograwimetryczne ewidentnie pokazują, że obecność pola

magnetycznego powoduje znaczne zwiększenie ilości unieruchamianej transferyny

na powierzchni nanokapsuł Fe@C-COOH. Dodatkowo, obecność magnesu na etapie

syntezy koniugatu Fe@C-COOH/Tf ma duży wpływ na morfologię uzyskiwanej

warstwy białka, a ściślej mówiąc na sposób ułożenia cząsteczek Tf w warstwie.

Kształt piku (280-290 C) na wykresie pierwszej pochodnej masy od temperatury,

przedstawionej na rysunku 83, jest inny dla koniugatu uzyskanego w nieobecności

i obecności pola magnetycznego.


172

temperatura / oC

100 200 300 400

dm

/dT

/ %

(oC

)-1

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

temperatura / oC

100 200 300 400 500d

m/d

T /

%(o

C)-1

0.00

0.02

0.04

Fe@C-COOH Nps

ludzka Tf

Fe@C-COOH/Tf

Fe@C-COOH/Tf magnes

Fe@C-COOH/Tf

Fe@C-COOH/Tf magnes

wią

za

nie

nie

ko

wa

len

cyjn

ew

iąza

nie

ko

wa

len

cyjn

e

Rysunek 83. Pochodne (dm/dT) dla nanocząstek Fe@C-COOH, ludzkiej transferyny (Tf)

i koniugatu Fe@C-COOH/Tf utworzonego w nieobecności i obecności zewnętrznego pola

magnetycznego (40 mT) za pomocą niekowalencyjnego i kowalencyjnego wiązania. Pomiary

wykonane przez dr hab. Michała Bystrzejewskiego.

12.3.4. Charakterystyka struktur białkowych na powierzchni

nanokapsuł węglowych przy użyciu mikrowagi kwarcowej

z dyssypacją energii

W celu uzyskania pełniejszych informacji na temat sposobu upakowania

transferyny w warstwie wykonane zostały eksperymenty z użyciem mikrowagi

kwarcowej z dyssypacją energii. Podczas pomiarów zmian częstotliwości drgań

kryształu kwarcu oraz zmian współczynnika rozproszenia energii (D) zastosowano

różne konfiguracje pola magnetycznego w stosunku do powierzchni elektrody, co

schematycznie przedstawia rysunek 84. W celu uzyskania stabilnej warstwy

nanocząstek magnetycznych powierzchnia złotego kryształu kwarcu została pokryta

monowarstwą cysteaminy. Następnie, w wyniku utworzenia wiązań amidowych

pomiędzy zaktywowanymi grupami karboksylowymi nanokapsuł węglowych

Fe@C-COOH a grupami aminowymi cysteaminy, monowarstwa CSH została

pokryta warstwą nanocząstek magnetycznych. W celu zwiększenia szybkości

opadania nanocząstek magnetycznych, ograniczenia ich aglomeracji na powierzchni

i utworzenia równomiernej warstwy pod elektrodą umieszczony został płaski

magnes. Tak zmodyfikowaną elektrodę (Au-CSH/Fe@C-COOH) umieszczano


173

w naczynku QCM-D. Pomiaru dokonano w nieobecności i obecności magnesu

w różnych jego konfiguracjach względem powierzchni elektrody.

1) CSH 3) UNIERUCHAMIANIE

TF

2) ZAKTYWOWANE FE@C-COOH

2a) Z MAGNESEM

2b) BEZ MAGNESU

Au

o0:AvsB

o90:AvsB

Rysunek 84. Schemat przygotowania elektrody do pomiarów z użyciem mikrowagi kwarcowej

z dyssypacją energii.

Otrzymane zależności zmian częstotliwości drgań kryształu kwarcu oraz zmian

współczynnika rozproszenia energii w funkcji czasu podczas etapu unieruchamiania

transferyny na powierzchni nanocząstek magnetycznych, w nieobecności i obecności

magnesu przedstawia rysunek 85. Po uzyskaniu stabilizacji częstotliwości drgań

kryształu kwarcu pokrytego monowarstwą cysteaminy oraz nanoczastkami

magnetycznymi (Au-CSH/Fe@C-COOH) w czystym 0.02 M buforze HEPES

z dodatkiem 150 mM Na2SO4, do układu wprowadzony został roztwór transferyny

o stężeniu 200 mg·L-1

. Wprowadzenie transferyny powodowało gwałtowny, znaczny

spadek częstotliwości drgań kryształu kwarcu. Obserwowany spadek był

konsekwencją utworzenia kowalencyjnego wiązania pomiędzy cząsteczkami

transferyny i grupami –COOH nanokapsuł węglowych. Po upływie około 20 minut

częstotliwość drgań kryształu kwarcu osiągnęła minimalną wartość i nie ulegała już

dalszym zmianom, co oznaczało, że maksymalna ilość cząsteczek Tf została

unieruchomiona na warstwie nanocząstek magnetycznych. Wprowadzenie magnesu

w trakcie wiązania Tf powodowało większe zmiany częstotliwości drgań kryształu

kwarcu, co bezpośrednio wiąże się z większą ilością cząsteczek Tf oddziałujących

z nanokapsułami. W celu usunięcia transferyny unieruchomionej na drodze fizycznej

adsorpcji z warstwy nanocząstek, do układu wprowadzony został czysty 0.02 M

bufor HEPES (bez dodatku Na2SO4). Na uzyskanych krzywych fn = f(t) praktycznie

nie obserwowano zmian częstotliwości drgań kryształu kwarcu, dzięki czemu można


174

stwierdzić, że Tf związała się z warstwą nanocząstek magnetycznych głównie na

drodze trwałego wiązania kowalencyjnego.

D

710

-6

0

2

4

6

8

10

12

14

t / min

40 50 60 70 80 90 100

f 7

/7 /

Hz

-100

-80

-60

-40

-20

0

Au-CSH/Fe@C-COOH/Tf

Au-CSH/Fe@C-COOHmagnes/Tf

Au-CSH/Fe@C-COOH/Tf magnes

Au-CSH/Fe@C-COOHmagnes/Tf magnes



o0:AvsB

o90:AvsB

dodatek Tf

dodatek0.02 M HEPES

Rysunek 85. Zależność zmian częstotliwości drgań kryształu kwarcu i współczynnika

rozpraszania energii w funkcji czasu oddziaływania Tf z Au-CSH/Fe@C-COOH Nps. Warunki

pomiarowe: CTf = 200 mg·L-1

; 0.02 M bufor HEPES z i bez dodatku 150 mM Na2SO4, pH 7.4.

Wykreślenie zależności D = f(f) pozwala na uzyskanie bardziej szczegółowych

informacji na temat morfologii tworzonej warstwy Tf na powierzchni nanocząstek

magnetycznych. W przypadku, gdy cząsteczeki transferyny unieruchamiane były na

powierzchni nanokapsuł Fe@C-COOH w obecności zewnętrznego źródła pola

magnetycznego, na wykresie D = f(f) widoczne są dwa odrębne zakresy

liniowości: dla niższych i wyższych wartości częstotliwości, co przedstawia rysunek

86.


175

f7/7 /Hz

-100 -80 -60 -40 -20 0

D

710

-6

0

2

4

6

8

10

12

14

Au-CSH/Fe@C-COOH/Tf

Au-CSH/Fe@C-COOHmagnes/Tf





o0:AvsB

o90:AvsB

Rysunek 86. Zależność zmian ΔD w funkcji Δf. Warunki pomiarowe: CTf = 200 mg·L-1

; 0.02 M

bufor HEPES z i bez dodatku 150 mM Na2SO4, pH 7.4.

Pierwszy obszar, poniżej -20 Hz, dotyczy etapu tworzenia monowarstwy Tf

i charakteryzuje się on małą wartością stosunku D/f wynoszącym ok.

8.3·10-9

Hz-1

. Tak mała wartość D/f wskazuje na dość ścisłe upakowanie

cząsteczek transferyny w warstwie. Jony Fe(III) obecne w strukturze białka posiadają

właściwości paramagnetyczne [454], zatem są przyciągane przez nanokapsuły

Fe@C-COOH – źródło pola magnetycznego na powierzchni kryształu kwarcu.

Z kolei reszty wodorowęglanowe i węglanowe, również obecne w strukturze Tf,

wykazują właściwości diamagnetyczne [455], są zatem wypychane na zewnątrz

przez pole magnetyczne. Skutkuje to utworzeniem na drodze oddziaływań

elektrostatycznych kolejnej warstwy, grubszej i zdecydowanie luźniejszej (D/f

~(3÷10)·10-6

Hz-1

). Zjawisko to występuje niezwykle rzadko w przypadku białek

oraz stałego pH. Podobne zachowanie się cząsteczek adsorbowanego białka na

powierzchni elektrody zaobserwował Höök i jego współpracownicy w trakcie

procesu adsorpcji hemoglobiny w funkcji pH [456].


176

12.3.5. Elektroaktywność transferyny kowalencyjnie związanej

z nanokapsułami Fe@C-COOH Nps

W badaniach sprawdzono również, czy transferyna unieruchomiona na

powierzchni nanocząstek magnetycznych wykazuje zdolność do bezpośredniej

wymiany elektronów z powierzchnią elektrody. W tym celu przeprowadzono

pomiary z użyciem techniki woltamperometrii cyklicznej. Z uwagi na położenie

jonów Fe(III) głęboko w otoczce białkowej Tf, kluczową kwestią w zachowaniu

elektroaktywności tego białka jest jego odpowiednia orientacja względem

powierzchni elektrody. W przypadku paramagnetycznej cząsteczki, jaką jest Tf, pole

magnetyczne pozwala uzyskać najbardziej korzystną orientację dla tego typu procesu

wymiany elektronów. Schemat przygotowania elektrody do pomiaru oraz orientację

pola magnetycznego względem powierzchni elektrody ilustruje rysunek 87.

1) CSH

Au

4) POMIAR

o0:AvsB

o60:AvsB

2) ZAKTYWOWANE FE@C-COOH

2a) Z MAGNESEM

2b) BEZ MAGNESU

3) UNIERUCHAMIANIE TF

3a) Z MAGNESEM

3b) BEZ MAGNESU

Rysunek 87. Schemat przygotowania elektrody do pomiarów woltamperometrycznych.

Przykładowe cykliczne krzywe woltamperometryczne uzyskane dla koniugatu

Fe@C-COOH/Tf w nieobecności i obecności pola magnetycznego zostały

przedstawione na rysunku 88. Dobrze ukształtowane sygnały elektroredukcji Fe(III)

do Fe(II) obserwowane były tylko w przypadku warstwy Tf utworzonej w obecności

pola magnetycznego. Dodatkowo, intensywność tych sygnałów prądowych zależała

od orientacji pola magnetycznego w stosunku do powierzchni elektrody. Wyższe

sygnały redukcji Tf obserwowano w sytuacji, gdy kąt pomiędzy powierzchnią

elektrody a polem magnetycznym wynosił 60. Wzrost inetnsywności sygnałów

prądowych wraz ze zmianą orientacji linii sił pola magnetycznego względem

powierzchni elektrody związany jest z wpływem sił generowanych przez pole

magnetyczne na stabilność warstwy białka na powierzchni nanocząstki

magnetycznej.


177


-0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

I /

A

-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0.0


Au-CSH/Fe@C-COOHmagnesTf magnes





E / V -0.6 -0.3 0.0

I /

A

-0.30

-0.15

0.00

pomiary

bez magnesu

po

mia

ry

z m

ag

ne

se

m

Au-CSH/Tfmagnes

pomiar z magnesem

pomiar bez magnesem

o0:AvsB

o60:AvsB

Rysunek 88. Cykliczne krzywe woltamperometryczne skorygowane o tło zarejestrowane dla

transferyny kowalencyjnie związanej z nanocząstkami magnetycznymi (Fe@C-COOH Nps)

w nieobecności oraz obecności zewnętrznego źródła pola magnetycznego. Warunki

eksperymentalne: 0.02 M bufor HEPES z dodatkiem 150 mM Na2SO4 o pH 7.4; v = 25 mV·s-1

.

Sygnał prądowy pojawiający się w zakresie anodowym (cyklu powrotnego) przy

wartości potencjału ok. 0.15 V pochodzi od utleniania wolnych jonów Fe(II).

W wyniku redukcji Fe(III) do Fe(II), jony żelaza(II) uwalniane są ze struktury białka,

dlatego i sygnały anodowe położone są na osi potencjałowej w zakresie

charakterystycznym dla wolnych jonów żelaza(II).

12.4. Podsumowanie

Wprowadzenie cząsteczek przeciwciała do warstwy receptorowej

immunosensora oraz zastosowanie zewnętrznego pola magnetycznego pozwoliło na

bezpośrednią woltamperometryczną detekcję transferny. Kombinacja pola

magnetycznego i ferromagnetycznego modyfikatora powierzchni elektrody

umożliwiła rejestrację dobrze ukształtowanych sygnałów prądowych elektroredukcji

transferyny związanej z przeciwciałem na drodze oddziaływań

antygenprzeciwciało, co jest nowym zjawiskiem, dotąd nieopisanym w literaturze.

Zaproponowany immunosensor pozwala również na oznaczenie transferyny we krwi

na niskim poziomie. Dodatkowo, prostota jego konstrukcji, wysoka stabilność

i selektywność sprawiają, że może on zostać wykorzystany jako alternatywa do


178

metod rutynowo stosowanych w analizie klinicznej do oznaczeń Tf w osoczu krwi.

Dużą zaletą immunosensora jest również możliwość jego kilkukrotnego użycia

w wyniku regeneracji warstwy sensorowej w roztworze chlorowodorku glicyny, co

znacznie obniża koszty analizy. Zaproponowany sensor otwiera nowe możliwości

w badaniach biologicznych białek i wykrywania ich na poziomie rzędu około

15 ngdL-1

.

Przeprowadzone badania udowodniły, że zarówno obecność

ferromagnetycznego modyfikatora elektrody (nanokapsuły węglowe zawierające

żelazo: Fe@C-COOH Nps), jak i zewnętrznego źródła pola magnetycznego jest

niezbędna do zapewnienia najwyższej aktywności elektrochemicznej transferyny

kowalencyjnie związanej z podłożem. Wprowadzenie zewnętrznego źródła pola

magnetycznego do układu elektrochemicznego prowadzi do powstania silnego

gradientu pola magnetycznego w pobliżu powierzchni elektrody zmodyfikowanej

ferromagnetykiem, co wpływa na strukturę transferyny. Paramagnetyczne centra Tf,

jony Fe(III), są wciągane przez pole magnetyczne i w konsekwencji zmieniają swoje

położenie, natomiast diamagnetyczne składniki otoczki białkowej Tf, głównie

wodorowęglany, są wypychane przez pole na zewnątrz. W związku z tym, w wyniku

oddziaływań elektrostatycznych, tworzy się kolejna warstwa Tf na powierzchni

nanocząstek. Jest to bardzo rzadkie zjawisko w przypadku białek w warunkach

stałego pH. Ponadto pomiary UV-vis wykazały, że związanie Tf z nanocząstkami nie

powoduje uwolnienia żelaza ze struktury białka.

Elektrochemiczna detekcja ferrytyny z wykorzystaniem…

179

13. Elektrochemiczna detekcja ferrytyny

z wykorzystaniem wysoce selektywnego

oddziaływania antygen–przeciwciało

Białka ostrej fazy stanowią grupę białek surowicy krwi syntezowanych przez

wątrobę, których stężenie we krwi zmienia się w wyniku odpowiedzi na stan zapalny

organizmu. Są one zatem niezwykle ważnym wskaźnikiem diagnostycznym

pozwalającym na wczesne rozpoznanie zmian zachodzących w organizmie. Na

podstawie ich poziomu w płynach ustrojowych, głównie we krwi, potwierdza lub

wyklucza się takie schorzenia, jak: choroby nowotworowe, procesy zapalne oraz

rozprzestrzeniające się infekcje. Podstawową funkcją tych białek jest przywrócenie

zaburzonej homeostazy organizmu poprzez hamowanie proteinaz, regulowanie

procesów krzepnięcia, wiązanie i neutralizację patogenów oraz transportowanie

metabolitów. Do tego typu białek zaliczana jest m.in. ferrytyna, która podobnie jak

hemoglobina i transferyna, zawiera w swojej strukturze jony żelaza odpowiedzialne

za jej aktywność elektrochemiczną. Fakt ten narzuca konieczność wykorzystania

wysoce selektywnego i specyficznego oddziaływania antygen–przeciwciało podczas

oznaczania poziomu tego białka w osoczu krwi. Ponadto żelazo obecne w strukturze

ferrytyny nadaje jej właściwości paramagnetyczne, umożliwiając tym samym

wykorzystanie pola magnetycznego podczas etapu jej detekcji.

Analogicznie, jak w przypadku hemoglobiny, transferyny, czy też

ceruloplazminy, głównym elementem warstwy receptorej czujnika były nanocząstki

magnetyczne, a ścisłej mówiąc nanokapsuły węglowe zawierające żelazo.

Najbardziej popularną metodą tworzenia warstwy nanocząstek magnetycznych na

powierzchni elektrody jest ich adsorpcja fizyczna. Zjawiskiem niepożądanym

w trakcie tworzenia takiej warstwy jest silna tendencja nanocząstek magnetycznych

do agregacji. Ponadto warstwa utworzona na drodze adsorpcji jest podatna na

działanie pola magnetycznego, nanocząstki w obecności magnesu zmieniają swoje

położenie, ustawiając się zgodnie z liniami sił pola magnetycznego [457].

W konsekwencji taka warstwa jest całkowicie niejednorodna, mało stabilna i podatna

na uszkodzenia mechaniczne. W celu utworzenia jednorodnej i stabilnej powłoki,


180

nanocząstki magnetyczne pokryte zostały warstwą fenylową uzyskaną na drodze

elektroredukcji odpowiedniej soli diazoniowej.

Zgodnie z literaturą, modyfikacja powierzchni elektrody warstwą fenylową

w wyniku jednoelektronowej elektroredukcji danej soli diazoniowej [458] zachodzi

z wytworzeniem formy przejściowej, którą jest rodnik [459]. Teoretycznie sól

diazoniowa może tworzyć dwie formy rodnikowe; wytworzenie rodnika może

nastąpić na atomie węgla pierścienia aromatycznego lub na atomie azotu grupy

diazoniowej. Forma rodnikowa tworzy z podłożem niezwykle trwałe i stabilne

wiązanie kowalencyjne, zgodnie z rysunkiem 89.

+

+e-

R

+

N+

N R

NN R

lub

NN R

R- N2

N

R

N

Rysunek 89. Schemat tworzenia warstwy fenylowej na powierzchni elektrody w wyniku

jednoelektronowej redukcji soli diazoniowej [460].

Proces elektroredukcji soli diazoniowej może być prowadzony na dwa sposoby:

w warunkach ex situ i in situ. W pierwszym przypadku w rozpuszczalniku

aprotycznym, np. acetonitrylu, elektroredukcji ulegają tylko wcześniej zsyntezowane

sole diazoniowe [461462]. Z kolei w drugim podejściu, warunki in situ, sól

diazoniowa syntezowana jest bezpośrednio w 0.5 M roztworze kwasu solnego,

zawierającym pierwszorzędową aminę aromatyczną i azotan(III) sodu [460,463,464],

w którym jednocześnie zachodzi proces elektroredukcji, co schematycznie ilustruje

rysunek 90.

R

R

NH2

NO2+0.5 M HCl

++ e-

Rysunek 90. Schemat tworzenia warstwy fenylowej na powierzchni elektrody w warunkach

in situ w wyniku jednoelektronowej redukcji soli diazoniowej, uzyskanej z pierwszorzędowej

aminy aromatycznej oraz azotanu(III) sodu [460].


181

Złożoność procesów, jakim mogą ulegać poszczególne składniki roztworów soli

diazoniowych wymusiły na badaczach optymalizację warunków tworzenia warstwy

fenylowej. Wiadomo, że rodniki powstające podczas procesu elektroredukcji mogą

ulegać reakcjom ubocznym (rysunek 91) zarówno w roztworze, jak i na powierzchni,

mogą m.in. oddziaływać z cząsteczkami rozpuszczalnika, przyłączać się do

pierścienia aromatycznego drugiej cząsteczki, czyli ulegać reakcji dimeryzacji,

a nawet oligomeryzacji, tworząc strukturę wielowarstwową [465,466].

RR

R

R

R

R

CH2CN+

CH3CN

dimeryzacja

tworzenie

wielowarstwy

tworzenie

monowarstwy

reakcja z

rozpuszczalnikiem

R

R

R

Rysunek 91. Możliwe reakcje rodnika arylowego zachodzące na powierzchni elektrody oraz

w roztworze acetonitrylu [466].

Badania przeprowadzone w grupie dr hab. Nowickiej wykazały, że przyłożenie do

elektrody potencjału o wartości woltamperometrycznego piku redukcji stosowanej

soli diazoniowej oraz zastosowanie równomolowego stosunku substratów pozwala

uzyskać warstwę najbardziej zbliżoną do monowarstwy, charakteryzującą się

największą jednorodnością rozmieszczenia grup fenylowych [467-469].

13.1. Procedura konstrukcji immunosensora

do elektrochemicznej detekcji ferrytyny

W przypadku czujników z elektrochemiczną detekcją ważne jest, aby

warstwa modyfikująca powierzchnię elektrody była odpowiednio cienka, jednorodna

i dobrze przewodząca. Powyższe parametry idealnie spełniają warstwy fenylowe

utworzone na drodze elektroredukcji odpowiednich soli diazonowych. W badaniach

zastosowano dwa typy soli diazoniowych różniących się między sobą grupami

funkcyjnymi: jedna sól posiadała grupę karboksylową (bezpośrednio związaną

z pierścieniem aromatycznym), druga zaś grupę aminową (połączoną z pierścieniem


182

za pomocą łącznika etylowego). Zróżnicowanie grup funkcyjnych na powierzchni

elektrody pozwoliło uzyskać różną orientację zastosowanego w warstwie

receptorowej przeciwciała. Z literatury wiadomo, że sposób ułożenia cząsteczek

przeciwciała w warstwie wpływa na wydajność oddziaływania antygenprzeciwciało

[437], co z kolei przekłada się na wydajność procesu elektrodowego ferrytyny

związanej z przeciwciałem.

Procedura konstrukcji immunosensora do elektrochemicznej detekcji

ferrytyny składała się z 5 etapów. W pierwszym, powierzchnię elektrody złotej

pokryto warstwą nanocząstek magnetycznych (Fe@C Nps). W tym celu na elektrodę

nałożono 6-µl kroplę zawiesiny nanocząstek i pozostawiono ją do wyschnięcia

w temperaturze pokojowej. Następnie tak uzyskaną warstwę nanocząstek

magnetycznych pokryto filmem fenylowym utworzonym w wyniku elektroredukcji

soli diazoniowej zawierającej odpowiednio grupę karboksylową i grupę aminową.

Elektroredukcja wybranej soli została przeprowadzona chronoamperometrycznie

przy stałej wartości potencjału, równej wartości woltamperometrycznego piku

redukcji odpowiedniej soli diazoniowej. W celu określenia wartości potencjałów

redukcji soli diazoniowych, w pierwszej kolejności zarejestrowano

woltamperogramy cykliczne zastosowanych soli, które przedstawione zostały na

rysunku 92. Proces elektroredukcji soli diazoniowej zawierającej grupę aminową

(+N2-C6H4(CH2)2NH2), zsyntezowanej przez dr Agatę Kowalczyk, prowadzono

w acetonitrylu. Zaś sól zawierająca grupę karboksylową (+N2-C6H4COOH)

zsyntezowana została w środowisku 0.5 M kwasu solnego. Na podstawie analizy

krzywych woltamperometrycznych, dla soli diazoniowej z grupą NH2 wybrano

wartość potencjału elektroredukcji -0.65 V, zaś w przypadku soli diazoniowej

z grupą COOH 0.22 V. Kolejny etap konstrukcji immunosensora związany był

z aktywacją grup –COOH oraz –NH2. W tym celu elektrody złote zmodyfikowane

nanocząstkami Fe@C i filmem karboksyfenylowym umieszczano na 1 godzinę

w wodnym roztworze zawierającym 40 mM EDC i 10 mM NHS, natomiast

elektrody pokryte filmem aminoetylofenylowym w roztworze 40 mM EDC na 0.5 h

[470].


183

E / V vs. Ag/AgCl/3 M KCl

-1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4

prą

d z

no

rma

lizo

wa

ny (

I /

I p)

-1.2

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

+N

2-C

6H

4(CH

2)2NH

2

+N

2-C

6H

4COOH

Rysunek 92. Znormalizowane względem wartości prądu piku cykliczne krzywe

woltamperometryczne uzyskane w wyniku jednoelektronowej elektroredukcji soli +N2-C6H4COOH w 0.5 M HCl (niebieska linia ciągła) oraz soli

+N2-C6H4(CH2)2NH2 (czarna linia

ciągła) w ACN z dodatkiem 0.1 M NBu4BF4. Warunki eksperymentalne: Csoli diaz. = 5 mM;

CNaNO2 = 5 mM (warunki in situ); szybkość przemiatania potencjałem 100 mV·s

-1.

Następnie na tak przygotowaną elektrodę nakładano 20-µl kroplę roztworu

przeciwciała (5 mgmL-1

) sporządzonego w 0.02 M buforze PB zawierającym

150 mM K2SO4 z dodatkiem 0.2% v/v Tween-20 na 2.5 h. Podczas etapu

modyfikacji podłoża cząsteczkami przeciwciała elektrody przechowywano

w lodówce, w temperaturze 4 C. Związanie przeciwciała z filmem fenylowym

następowało w wyniku utworzenia wiązania amidowego pomiędzy odpowiednimi

grupami funkcyjnymi pierścienia aromatycznego a grupami –COOH lub –NH2

przeciwciała. W przypadku filmu karboksyfenylowego proces kowalencyjnego

unieruchamiania cząsteczek przeciwciała odbywał się za pomocą grup aminowych

Ab, co prowadziło do pochylonego lub/i równoległego, a nawet pionowego

odwróconego ułożenia cząsteczek Ab względem danej powierzchni (rysunek 66).

Z kolei w przypadku filmu aminoetylofenylowego w procesie unieruchamiania

przeciwciała brały udział grupy karboksylowe obecne w domenie stałej przeciwciała,

prowadząc do pionowego ułożenia Ab względem powierzchni elektrody. Po

utworzeniu warstwy receptorowej (Au/Fe@C Nps/-C6H4R/Ab) elektrody delikatnie

i uważnie opłukiwano buforem PB, w celu usunięcia nadmiaru nieprzereagowanego

przeciwciała. Następnie zanurzano je do roztworu ferrytyny na czas 90 minut

w obecności zewnętrznego źródła pola magnetycznego (magnes neodymowy, 40


184

mT) w temperaturze pokojowej . Poszczególne etapy konstrukcji immunosensora do

detekcji ferrytyny ilustruje rysunek 93.

Magnes

Magnes

1ADSORPCJA

Fe@C Nps

5ZWIĄZANIE Ft Z Ab

(1.5 h)

Magnes

Rysunek 93. Schemat konstrukcji immunosensora do elektrochemicznej detekcji ferrytyny.

13.2. Określenie wpływu ułożenia Ab w warstwie

receptorowej na ilość unieruchamianej ferrytyny

przy użyciu technik LA-ICP-MS i QCM

Sposób ułożenia przeciwciała w warstwie receptorowej decyduje

o skuteczności oddziaływania antygen–przeciwciało. Zatem pierwszy etap badań

dotyczył sprawdzenia, czy wraz ze wzrostem stężenia ferrytyny w roztworze wzrasta

również ilość związanych cząsteczek tego białka z warstwą receptorową

immunosensora. W tym celu przeprowadzone zostały badania z wykorzystaniem

techniki LA-ICP-MS. Z uwagi na fakt, że zarówno nanocząstki magnetyczne, jak

i ferrytyna zawierają w swojej strukturze żelazo, w przypadku pomiarów

LA-ICP-MS elektrody zmodyfikowano tylko i wyłącznie odpowiednim filmem

fenylowym i ferrytyną o określonym stężeniu. Taka modyfikacja elektrody dawała

pewność, że rejestrowane sygnały izotpu 57

Fe pochodzą tylko i wyłącznie od żelaza

obecnego w strukturze ferrytyny. Uzyskane wyniki, przedstawione na wykresie

wewnętrznym rysunku 94, ewidentnie pokazują, że wprowadzenie cząsteczek Ab do

warstwy receptorowej za pośrednictwem grup karboksylowych Ab (HOOC-Ab)

prowadzi do ok. 3-krotnego wzrostu ilości ferrytyny związanej z immunosensorem

na drodze oddziaływań antygen–przeciwciało w porównaniu do wiązania Ft za

pośrednictem grup aminowych Ab (H2N-Ab), co jest zgodne z danymi opisanymi


185

w literaturze [437]. Zatem zmodyfikowanie powierzchni elektrody filmem

aminoetylofenylowym umożliwia unieruchomienie większej ilości cząsteczek

ferrytyny na powierzchni elektrody w porównaniu do warstwy karboksyfenylowej.

Zmiany intensywności sygnału dla izotopu żelaza w funkcji stężenia ferrytyny,

przedstawione na wykresie głównym rysunku 94, uzyskano dla Ft

o znanym stężeniu zaadsorbowanej bezpośrednio na elektrodzie złotej. Wykreślona

na tej podstawie krzywa kalibracyjna wykorzystana została do analizy Ft w próbkach

krwi.

CFt / gdL-1

0 10 20 30

inte

nsyw

no

ść s

yg

nału

dla

57F

e

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

int.

/ i

nt.

(H

2N

-Ab

)

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0H2N-Ab

HOOC-Ab

5.0 gdL-1

10.0 gdL-1

Rysunek 94. Zmiana intensywności sygnału izotopu 57

Fe w funkcji stężenia Ft. Rysunek

wewnętrzny: intensywność sygnału 57

Fe znormalizowana względem wartości tego sygnału dla

ferrytyny związanej z Ab, unieruchomionym na powierzchni elektrody za pomocą grup

aminowych, dla dwóch stężeń Ft. Badania wykonała dr hab. Barbara Wagner.

Wpływ sposobu unieruchamiania przeciwciała w warstwie receptorowej

immunosensora na wydajność reakcji antygen–przeciwciało sprawdzono również

przy użyciu mikrowagii kwarcowej. Rysunek 95 przedstawia zmiany częstotliwości

drgań kryształu kwarcu (proporcjonalne do zmiany masy) zarejestrowane w funkcji

czasu, dla etapów: tworzenia filmu fenylowego, przyłączania do niego przeciwciała

oraz tworzenia kompleksu antygen–przeciwciało. Zmiany częstotliwości drgań

kryształu kwarcu (odpowiadające 2.5 godzinnemu procesowi unieruchamiania Ab)

wynoszą 325 ± 10 oraz 175 ± 19 Hz, odpowiednio dla aminoetylofenylowego oraz

karboksyfenlowego filmu. Znając powierzchnię kryształu kwarcu (A = 0.49 cm-2

)

oraz jego stałą charakterystyczną (Cf = 4.3 ng) można wyznaczyć stężenie


186

powierzchniowe przeciwciała (Ab) związanego z powierzchnią elektrody za

pośrednictwem odpowiedniego filmu fenylowego. Uzyskane wartości stężenia

powierzchniowego Ab unieruchomionego na aminoetylofenylowym oraz

karboksyfenlowym filmie wynosiły odpowiednio 6.5 ± 0.8 oraz 3.5 ± 0.9 pmol·cm-2

.

Uzyskane wartości Ab są w dobrej zgodności z wartościami teoretycznymi Ab dla

przeciwciał typu IgG (7.30, 4.52 i 2.43 pmol·cm-2

odpowiednio dla pionowego,

pochylonego oraz równoległego ułożenia Ab względem powierzchni elektrody).

Praktycznie 100% wydajność procesu oddziaływania ferrytyny z cząsteczkami

przeciwciała obserwowano jedynie dla elektrody zmodyfikowanej filmem

aminoetylofenylowym. W przypadku elektrody zmodyfikowanej warstwą

karboksyfenylową stężenie powierzchniowe Ft związanej z Ab było mniejsze od

stężenia powierzchniowego Ab o ok. 24%. Świadczy to o tym, że nie każda

cząsteczka przeciwciała budująca warstwę receptorową immunosensora jest w stanie

związać ferrytynę. Najprawdopodobniej, wynika to z różnej orientacji przestrzennej

cząsteczek Ab; część z tych orientacji uniemożliwia utworzenie kompleksu antygen–

przeciwciało.

czas / h

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0

f

/ H

z

-800

-600

-400

-200

0Au/-C

6H

4R/Ab Au/-C

6H

4R/Ab/Ft

Au

/-C

6H

4R

-C6H

4(CH

2)2NH

2

-C6H

4COOH

Rysunek 95. Zmiany częstotliwości drgań kryształu kwarcu w funkcji czasu dla etapów:

tworzenia filmu fenylowego, przyłączania przeciwciała i tworzenia kompleksu antygen–

przeciwciało. Warunki eksperymentalne: CFt: 10 mg·dL-1

, CAb: 5 mg·mL-1

, 0.02 M bufor PB

zawierający 150 mM K2SO4 i 0.2% v/v Tween-20 o pH 7.4.


187

13.3. Elektrochemiczna charakterystyka etapów tworzenia

warstwy receptorowej immunosensora

Zmiany powierzchni elektrody związane z poszczególnymi etapami

konstrukcji immunosensora scharakteryzowano za pomocą elektrochemicznej

spektroskopii impedancyjnej. Typowe widma EIS zarejestrowane dla

poszczególnych etapów modyfikacji powierzchni elektrody ilustruje rysunek 96. Jak

wynika z uzyskanych zależności, największą oporność przeniesienia ładunku

wykazywała warstwa składająca się z Fe@C Nps i filmu karboksyfenylowego.

Wynika to z faktu, iż w pH 7.4 grupy –COOH są zdysocjowane, co prowadzi do

elektrostatycznego odpychania z ujemnie naładowanym próbnikiem redoks obecnym

w roztworze, a tym samym do zwiększenia półkola na wykresie Nyquist’a.

Natomiast grupy –NH2 w takich warunkach ulegają protonacji, co prowadzi do

elektrostatycznego przyciągania ujemnie naładowanego próbnika redoks.

Z' /

0 5000 10000 15000 20000 25000

-Z'' /

0

5000

10000

15000

20000Au

Au/Fe@C Nps

Au/Fe@C Nps/-C6H

4(CH

2)2NH

2

Au/Fe@C Nps/-C6H

4COOH

Rysunek 96. Wykresy Nyquist’a otrzymane dla niezmodyfikowanej chemicznie elektrody złotej,

elektrody zmodyfikowanej: warstwą M Nps (Au/Fe@C Nps), dodatkowo pokrytej filmem

karboksyfenylowym (Au/Fe@C Nps/-C6H4COOH) oraz filmem aminoetylofenylowym (Au/Fe@C

Nps/-C6H4(CH2)2NH2). Linie ciągłe – krzywe dopasowane teoretycznie; punkty – wyniki

eksperymentalne. Warunki eksperymentalne: 1 mM Fe(CN)63−/4−

w 0.02 M buforze PB

zawierającym 150 mM K2SO4 i 0.2% v/v Tween-20 o pH 7.4; Eapp. = 0.245 V; Au = 1.6 mm.

Wprowadzenie przeciwciała do warstwy receptorowej powodowało w obu

przypadkach dalszy wzrost półkola na wykresie Nyquist’a. Identyczny trend

obserwowano po etapie oddziaływania warstwy receptorowej z ferrytyną. Wzrost


188

wielkości półkola na wykresie Nyquist’a związany jest z coraz większą barierą

przeniesienia elektronu pomiędzy próbnikiem redoks obecnym w roztworze

a powierzchnią elektrody. Widma EIS uzyskane dla wybranych stężeń ferrytyny

ilustruje rysunek 97. Warto zauważyć, że uzyskane zależności już na etapie warstwy

receptorowej (Au/Fe@C Nps/-C6H4R/Ab) różnią się nieznacznie względem siebie.

Spowodowane było to tym, że immunosensory konstruowane były jednocześnie na

kilku elektrodach o tej samej średnicy, ale jak się okazało o różnej oporności.

Dlatego też do opisu ilościowego używano wartości Rct, będącej różnicą wartości

oporności przeniesienia elektronu uzyskanej po i przed procesem oddziaływania

z ferrytyną, ΔRct = Rct Au/Fe@C Nps/-C6H4R/Ab/Ft – Rct Au/Fe@C Nps/-C6H4R/Ab.

Z' /

0 10000 20000 30000

-Z'' /

0

5000

10000

15000

20000

25000 Au/Fe@C Nps/-C6H4COOH/Ab

Au/Fe@C Nps/-C6H4COOH/Ab/Ft (5.0 gdL-1

)

Z' /

0 10000 20000 30000 40000

-Z'' /

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000Au/Fe@C Nps/-C6H4COOH/Ab

Au/Fe@C Nps/-C6H4COOH/Ab/Ft (10.0 gdL-1

)

Z' /

0 10000 20000 30000 40000

-Z'' /

0

5000

10000

15000

20000

25000

Au/Fe@C Nps/-C6H4(CH2)2NH2/Ab

Au/Fe@C Nps/-C6H4(CH2)2NH2/Ab/Ft (5.0 gdL-1

)

Ab

Ft

Z' /

0 10000 20000 30000 40000

-Z'' /

0

5000

10000

15000

20000

25000Au/Fe@C Nps/-C6H4(CH2)2NH2/Ab

Au/Fe@C Nps/-C6H4(CH2)2NH2/Ab/Ft (10.0 gdL-1

)

A

B

Rysunek 97. Wykresy Nyquist’a otrzymane dla elektrod pokrytych nanocząstkami Fe@C

i filmem karboksyfenylowym (A) oraz aminoetylofenylowym (B) po unieruchomieniu

przeciwciała oraz po oddziaływaniu z ferrytyną. Linie ciągłe – krzywe dopasowane teoretycznie;

punkty – wyniki eksperymentalne. Warunki eksperymentalne: CFt: 5 oraz 10 mg·dL-1

, 1 mM

Fe(CN)63−/4−

w 0.02 M buforze PB zawierającym 150 mM K2SO4 i 0.2% v/v Tween-20 o pH 7.4;

Eapp. = 0.245 V; Au = 1.6 mm.

W celu uzyskania informacji ilościowych dotyczących poszczególnych

warstw immunosensora, do otrzymanych krzywych eksperymentalnych dopasowano

krzywe teoretyczne, zgodnie z obwodem zastępczym przedstawionym na rysunku

39. Wyznaczane w ten sposób wartości liczbowe uzyskanych parametrów

impedancyjnych zestawione zostały w tabeli 13.


189




niezmodyfikowanej i odpowiednio zmodyfikowanej elektrody złotej.

Tdl

[μFs(1-)

cm-2

]

dl Rct

[Ωcm2]

σ

[Ω rad1/2

s-1/2

cm2]

Cdl

[μFcm-2

]

Au 41.6 ± 1.4 0.93 ± 0.02 8.5 ± 0.4 282.1 ± 13.5 20.7 ± 0.8

Au- Fe@C Nps 27.2 ± 2.2 0.90 ± 0.04 33.4 ± 2.2 284.1 ± 10.1 11.0 ± 0.4

Au- Fe@C Nps/

-C6H4COOH 40.1 ± 1.2 0.81 ± 0.03 384.3 ± 4.3 304.2 ± 19.5 7.04 ± 0.5

Au- Fe@C Nps/

-C6H4COOH/Ab 12.5 ± 3.5 0.88 ± 0.04 400.2 ± 5.2 290.0 ± 27.3 5.90 ± 1.1

Au- Fe@C Nps/

-C6H4(CH2)2NH2 13.5 ± 2.5 0.91 ± 0.03 163.5 ± 3.2 290.6 ± 25.4 7.60 ± 1.0

Au- Fe@C Nps/

-C6H4(CH2)2NH2/Ab 86.2 ± 2.2 0.75 ± 0.03 616.4 ± 8.4 280.6 ± 19.3 8.28 ± 1.4

Au/Fe@C Nps/-C6H4COOH/Ab/Ft

Ft (0.1 mg·dL-1

) 13.3 ± 3.6 0.91 ± 0.01 504.5 ± 25.7 311.0 ± 25.7 5.68 ± 0.8

Ft (1 mg·dL-1

) 13.7 ± 2.3 0.91 ± 0.02 525.5 ± 13.2 308.0 ± 30.2 5.12 ± 0.6

Ft (2 mg·dL-1

) 10.7 ± 2.7 0.91 ± 0.01 574.3 ± 15.4 290.7 ± 23.1 4.75 ± 0.8

Ft (5 mg·dL-1

) 10.0 ± 5.3 0.91 ± 0.03 660.8 ± 23.6 246.3 ± 28.5 4.72 ± 0.4

Ft (10 mg·dL-1

) 14.6 ± 5.6 0.89 ± 0.02 834.8 ± 20.7 231.2 ± 22.6 4.54 ± 0.7

Ft (20 mg·dL-1

) 12.8 ± 5.3 0.89 ± 0.02 1199.2 ± 45.7 230.4 ± 21.2 4.09 ± 0.8

Ft (30 mg·dL-1

) 12.2 ± 3.8 0.91 ± 0.03 1463.2 ± 55.3 227.4 ± 23.2 4.09 ± 0.6

osocze 1 14.6 ± 2.8 0.89 ± 0.02 780.4 ± 26.3 242.4 ± 28.5 4.62 ± 0.5

osocze 2 12.2 ± 2.8 0.91 ± 0.02 580.2± 28.5 263.4 ± 31.5 4.69 ± 0.7

Au/Fe@C Nps/-C6H4(CH2)2NH2/Ab/Ft

Ft (0.1 mg·dL-1

) 13.9 ± 5.3 0.87 ± 0.04 636.2 ± 35.1 288.6 ± 27.4 7.64 ± 0.7

Ft (1 mg·dL-1

) 13.5 ± 4.3 0.84 ± 0.03 646.2 ± 45.3 287.5 ± 29.2 7.60 ± 0.8

Ft (2 mg·dL-1

) 12.2 ± 1.8 0.86 ± 0.04 669.7 ± 50.3 277.1 ± 24.3 7.06 ± 0.7

Ft (5 mg·dL-1

) 11.0 ± 2.1 0.87 ± 0.03 720.2 ± 29.6 276.5 ± 30.5 6.92 ± 0.9

Ft (10 mg·dL-1

) 10.1 ± 1.8 0.84 ± 0.04 787.3 ± 26.8 267.6 ± 29.6 6.77 ± 0.7

Ft (20 mg·dL-1

) 11.4 ± 2.3 0.83 ± 0.05 915.1 ± 35.8 264.8 ± 26.2 6.31 ± 0.6

osocze 1 11.9 ± 3.1 0.83 ± 0.04 748.5 ± 27.8 275.6 ± 28.3 6.34 ± 0.7

osocze 2 12.6 ± 4.5 0.82 ± 0.04 676.6 ± 28.3 276.9 ± 28.5 6.91 ± 0.8

osocze 1: krew szczura zdrowego; osocze 2: krew szczura chorego 100-krotnie rozcieńczona


190

Analizując uzyskane wartości parametrów EIS można zauważyć, że warstwy

tworzone podczas kolejnych etapów modyfikacji elektrody złotej charakteryzowały

się równomiernością i jednorodnością. Potwierdzają to niewielkie zmiany wartości

elementu stało-fazowego, które różnią się nie więcej niż 10% od wartości otrzymanej

dla chemicznie niezmodyfikowanej elektrody złotej. Znaczne zmiany,

w porównaniu do chemicznie niezmodyfikowanej powierzchni elektrody złotej,

obserwowano dla takich parametrów, jak: opór przeniesienia ładunku, parametr

Warburga oraz pojemność warstwy podwójnej. Wartości parametru Rct wzrastały

wraz z kolejnymi etapami modyfikacji powierzchni elektrody, bez względu na typ

użytej soli diazoniowej. Dodatkowo, parametr ten był bardzo czuły na ilość ferrytyny

oddziałującej z charakterystycznym dla niej przeciwciałem. Jeśli chodzi o pozostałe

parametry, takie jak parametr Warburga, czy też pojemność warstwy podwójnej,

intensywność zmian ich wartości była zdecydowanie mniejsza i mniej czuła na

zmiany stężenia ferrytyny. Na podstawie zmian parametru Warburga, ok. 20%

w odniesieniu do chemicznie niezmodyfikowanej elektrody złotej, można stwierdzić,

że transport próbnika redoks ulegał nieistotnym zmianom w wyniku modyfikacji

powierzchni elektrody. Porównując z kolei wartości pojemności warstwy podwójnej

wyraźnie widać, że wraz z kolejną modyfikacją wartość tego parametru zmniejszała

się, stabilizując się na poziomie 4÷5 mF·cm-2

. Taka wartość Cdl świadczy o znacznym

uwodnieniu tworzonych warstw.

Charakterystyki analitycznej zaproponowanego immunosensora dokonano na

podstawie kontroli zmian oporności przeniesienia ładunku w funkcji stężenia

ferrytyny. Uzyskane w ten sposób krzywe kalibracyjne ilustruje rysunek 98.

W przypadku modyfikacji elektrody filmem karboksyfenylowym liniową zależność

zmian wartości oporu przeniesienia ładunku w funkcji stężenia ferrytyny

obserwowano w zakresie 0.1 30 mg·dL-1

. Natomiast w sytuacji wykorzystania

filmu aminoetylofenylowego do stabilizacji warstwy nanocząstek magnetycznych,

liniowa zależność Rct = f(CFt) dotyczyła zakresu stężeń ferrytyny od 0.1 do

20 mg·dL-1

. Wyznaczona na podstawie uzyskanych zależności granica

wykrywalności ferrytyny wynosiła 0.40 0.04 oraz 0.20 0.02 µg·dL-1

,

odpowiednio dla filmu karboksyfenylowego i aminoetylofenylowego.


191

CFt / gdL-1

0 5 10 15 20 25 30 35

R

ct /

0

10000

20000

30000

40000

50000

CFt / gdL-1

0 5 10 15 20 25

R

ct /

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

A

B

Rysunek 98. Krzywe kalibracyjne ilustrujące zmianę wartości Rct w funkcji stężenia ferrytyny,

uzyskane dla elektrody zmodyfikowanej A: warstwą karboksyfenylową oraz B: warstwą

aminoetylofenylową. Czerwone symbole: osocze krwi szczura zdrowego; zielone symbole: osocze

krwi szczura. Rct = Rct(Au/Fe@C Nps/-C6H4R/Ab/Ft) - Rct(Au/Fe@C Nps/-C6H4R/Ab).

13.3.1. Wpływ pola magnetycznego na sygnał prądowy ferrytyny

Ze względu na fakt, że ferrytyna zawiera w swojej strukturze

paramagnetyczne jony żelaza(III), które jednocześnie odpowiadają za jej aktywność

elektrochemiczną, kolejny etap badań dotyczył sprawdzenia możliwości

wykorzystania woltamperometrii w detekcji ferrytyny. Obserwacja dobrze


192

wykształconych sygnałów prądowych metaloprotein możliwa jest tylko

w przypadku, gdy białko zostanie unieruchomione na powierzchni elektrody we

właściwym ułożeniu, umożliwiającym bezpośredni transport elektronu pomiędzy

centrum redoks białka a powierzchnią elektrody. Z uwagi na posiadane przez

ferrytynę właściwości magnetyczne, badania przeprowadzono w obecności oraz

nieobecności zewnętrznego źródła pola magnetycznego. Wpływ pola magnetycznego

na intensywność, położenie i kształt uzyskiwanych sygnałów prądowych redukcji

ferrytyny związanej z warstwą receptorową immunosensora na drodze oddziaływań

antygen–przeciwciało, sprawdzono dla wszystkich możliwych konfiguracji magnesu:

(i) pomiary, jak i etapy konstrukcji sensora z udziałem magnesu; (ii) magnes obecny

tylko podczas unieruchamiania ferrytyny, pomiar woltamperometryczny bez udziału

magnesu; (iii) brak magnesu podczas procesu unieruchamiania ferrytyny, pomiar

woltamperometryczny w obecności magnesu oraz (iv) magnes obecny na każdym

etapie prowadzonego eksperymentu. Dla wszystkich przebadanych konfiguracji

zastosowano stałe stężenie Ft, wynoszące 20 mg·dL-1

. Uzyskane sygnały prądowe

redukcji ferrytyny przy zastosowaniu różnych kombinacji zewnętrznego źródła pola

magnetycznego w przypadku modyfikacji elektrody filmem karboksyfenylowym



-0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1

I /

A

-1.2

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

wiązanie Ft bez magnesu i pomiar bez magnesu

wiązanie Ft bez magnesu i pomiar z magnesem

wiązanie Ft z magnesem i pomiar bez magnesu

wiązanie Ft z magnesem i pomiar z magnesem

Au/Fe@C Nps/-C6H

4COOH/Ab/Ft

Rysunek 99. Skorygowane o tło krzywe woltamperometryczne redukcji ferrytyny związanej

z warstwą receptorową immunosensora (Au/Fe@C Nps/-C6H4COOH/Ab), zarejestrowane metodą

DPV dla różnych konfiguracji pola magnetycznego (40 mT). Warunki eksperymentalne:

CFt = 20 µg·dL-1

, 0.02 M bufor PB (pH 7.4) zawierający 150 mM K2SO4 i 0.2% v/v Tween-20

o pH 7.4.


193

Uzyskane krzywe DPV pokazują, że pole magnetyczne ma bardzo duży wpływ

zarówno na kształt otrzymanych sygnałów prądowych, jak również na ich położenie.

W przypadku braku pola magnetycznego sygnał redukcji jonów żelaza(III) obecnych

w strukturze ferrytyny nie jest widoczny (linia czarna, rysunek 99). Wprowadzenie

pola magnetycznego na etapie pomiaru woltamperometrycznego skutkuje

pojawieniem się sygnału prądowego przy potencjale około -0.45 V (linie czerwona

i zielona, rysunek 99). Natomiast w przypadku, gdy pole magnetyczne obecne było

tylko na etapie oddziaływania ferrytyny z warstwą receptorową, na krzywej DPV

obserwowano dobrze wykształcony sygnał prądowy redukcji żelaza(III) przy

potencjale około -0.4 V. Największą intensywność sygnału prądowego

elektroredukcji ferrytyny można było zaobserwować w sytuacji wprowadzenia do

układu magnesu, zarówno na etapie wiązania białka z immunosensorem, jak również

podczas pomiaru woltamperometrycznego (linia zielona, rysunek 99). Przesunięcie

sygnału redukcji Fe(III) w stronę mniej ujemnych wartości potencjału świadczyło

o łatwiejszej redukcji jonów żelaza(III) w strukturze ferrytyny. W przypadku

warstwy receptorowej utworzonej z wykorzystaniem filmu aminoetylofenylowego,

pole magnetyczne wpływało jedynie na intensywność rejestrowanych krzywych

prądowych, natomiast ich położenie i kształt nie ulegały zmianie, rysunek 100.


-0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1

I /

A

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

wiązanie Ft bez magnesu i pomiar bez magnesu

wiązanie Ft bez magnesu i pomiar z magnesem

wiązanie Ft z magnesem i pomiar bez magnesu

wiązanie Ft z magnesem i pomiar z magnesem

Au/Fe@C Nps/-C6H

4(CH

2)2NH

2/Ab/Ft


z warstwą receptorową immunosensora (Au/Fe@C Nps/-C6H4(CH2)2NH2/Ab), zarejestrowane

metodą DPV dla różnych konfiguracji pola magnetycznego (40 mT). Warunki eksperymentalne:

CFt = 20 µg·dL-1

, 0.02 M bufor PB (pH 7.4) zawierający 150 mM K2SO4 i 0.2% v/v Tween-20

o pH 7.4.


194

Warstwa aminoetylofenylowa pozwala uzyskać pionowe ułożenie przeciwciała

w warstwie receptorowej. Zgodnie z doniesieniami literaturowymi, stężenie

powierzchniowe przeciwciał w warstwie, przy ich pionowym ustawieniu, jest

największe z możliwych. Co więcej, taka orientacja Ab sprawia, że wszystkie

cząsteczki przeciwciała są w stanie oddziaływać z antgenem, czyli z ferrytyną.

Niestety wraz ze wzrostem wydajności reakcji antygen–przeciwciało spada jej

użyteczność w stosunku do immunosensorów z woltamperometryczną detekcją.

Łańcuchy polipeptydowe są bardzo słabymi nośnikami ładunku. Przeprowadzone

pomiary wyraźnie pokazują, że intensywność sygnałów prądowych ferrytyny silnie

zależy od obecności pola magnetycznego. Najprawdopodobniej, podczas procesu

oddziaływania Ft z przeciwciałem, pole magnetyczne nie tylko wymusza na

cząsteczkach ferrytyny orientację zapewniającą ich maksymalną elektroaktywność,

ale również dodatkowo skraca odległość pomiędzy centrum elektroaktywnym białka

a powierzchnią elektrody. Ta zmiana odległości jest konsekwencją silnego

przyciągania pomiędzy paramagnetycznym białkiem i ferromagnetycznym

modyfikatorem powierzchni elektrody.

13.3.2. Woltamperometryczna charakterystyka immunosensora

do detekcji ferrytyny

Charakterystykę analityczną skonstruowanego immunosensora do

bezpośredniej woltamperometrycznej detekcji ferrytyny wykonano prowadząc

pomiary w obecności pola magnetycznego o wartości 40 mT, generowanego przez

magnes neodymowy (Fe14Nd2B) umieszczony w pobliżu elektrody. W tym celu

immunosensor zanurzano do roztworu Ft o odpowiednim stężeniu, z zakresu

0.1÷30 mg·dL-1

w obecności magnesu na czas 1.5 h. Następnie elektrodę

(Au/Fe@C Nps/-C6H4R/Ab/Ft), po opłukaniu wodą destylowaną, umieszczano

w czystym, odtlenionym 0.02 M buforze PB o pH 7.4 z dodatkiem 0.15 M K2SO4

i 0.2% v/v Tween-20 i wykonywano pomiar woltamperometryczny. Uzyskane

woltamperogramy redukcji ferrytyny związanej z warstwą receptorową, utworzoną

w wyniku modyfikacji elektrody filmem karboksyfenylowym, ilustruje rysunek 101.

Intensywność sygnału prądowego, pojawiającego się przy potencjale ok. -0.4 V

związanego z elektredukcją jonów Fe(III) obecnych w strukturze ferrytyny, była

wprost proporcjonalna do ilości ferrytyny związanej z warstwą receptorową

w zakresie stężeń Ft 0.1 ÷ 30 µg·dL-1

.


195


-0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1

I /

A

-1.4

-1.2

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.1 gdL-1

30.0 gdL-1

osocze krwi szczura zdrowego

Au/Fe@C Nps/-C6H

4COOH/Ab/Ft

osocze krwi szczura chorego

(100-krotnie rozcieńczone)


z warstwą receptorową immunosensora (Au/Fe@C Nps/-C6H4COOH/Ab), zarejestrowane metodą

DPV w odtlenionym za pomocą Ar buforze PB dla różnego stopnia wysycenia warstwy

receptorowej ferrytyną. Czerwona krzywa dotyczy analizy osocza krwi szczura zdrowego, zaś

krzywa zielona analizy 100-krotnie rozcieńczonego osocza krwi szczura chorego. Warunki

eksperymentalne: 0.02 M bufor PB, zawierający 150 mM K2SO4 i 0.2% v/v Tween-20 o pH 7.4;

szybkość przemiatania potencjałem: 25 mVs-1

.

Na podstawie wartości sygnałów prądowych w funkcji stężenia ferrytyny

sporządzono krzywą kalibracyjną, którą przedstawia rysunek 102.

CFt / gdL-1

0 5 10 15 20 25 30 35

I /

A

-1.4

-1.2

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

Au/Fe@C Nps/-C6H

4COOH/Ab/Ft

Rysunek 102. Krzywa kalibracyjna ilustrująca zmiany intensywności sygnału prądowego Ft

w funkcji jej stężenia. Czerwony symbol trójkątny odnosi się do analizy próbki osocza krwi

szczura zdrowego, zaś zielony 100-krotnie rozcieńczonego osocza krwi szczura chorego.


196

Najmniejsze stężenie ferrytyny rozpuszczonej w roztworze, możliwe do

precyzyjnego oznaczenia zaproponowaną metodą z wykorzystaniem filmu

karboksyfenylowego, wyznaczono z dolnego zakresu prostoliniowego krzywej

kalibracyjnej, zgodnie z równaniem 31. Uzyskana w ten sposób granica

wykrywalności wynosiła 0.13 0.04 µg·dL-1

. Ponadto dla wszystkich badanych

stężeń ferrytyny z zakresu liniowego krzywej kalibracyjnej powtarzalność wyników

była dobra, a względne odchylenie standardowe (n = 5) było mniejsze niż 10%.

Z kolei względne odchylenie standardowe wyników otrzymanych dla tego samego

stężenia ferrytyny przy użyciu sześciu różnych, oddzielnie zmodyfikowanych

elektrod wynosiło ok. 14%.

Unieruchomienie przeciwciała w warstwie receptorowej za pośrednictwem

filmu aminoetylofenylowego niestety nie sprzyjało dobrze wykształconym sygnałom

prądowym redukcji ferrytyny. Związanie przeciwciała z grupami aminowymi filmu

fenylowego następuje przy udziale grup karboksylowych zlokalizowanych

w części stałej Ab. Skutkuje to pionowym ułożeniem cząsteczek Ab względem

powierzchni elektrody. Takie ustawienie cząsteczek przeciwciała z jednej strony

zdecydowanie wzmacnia wydajność oddziaływania Ab z charakterystycznym dla

niego antygenem, z drugiej zaś drastycznie spowalnia transport elektronów

pomiędzy Ft a powierzchnią elektrody. Pomimo tych trudności, wraz ze wzrostem

stężenia ferrytyny w roztworze, do którego zanurzano immunosensor, wzrastała

intensywność rejestrowanego sygnału prądowego, co ilustrują krzywe

woltamperometryczne uzyskane metodą DPV, przedstawione na rysunku 103.

Zakres pracy immunosensora z wykorzystaniem filmu aminoetylofenylowego do

bezpośredniej elektrochemicznej detekcji ferrytyny wyznaczono na podstawie

liniowej odpowiedzi sygnału analitycznego (intensywność sygnału redukcji Ft)

względem stężenia tego białka w roztworze, do którego na 1.5 h zanurzano

immunosensor. W badaniach wykorzystano roztwory Ft o różnym stężeniu,

z zakresu 0.1 ÷ 30 mg·dL-1

. W zakresie stężeń 0.1 ÷ 20 mg·dL-1

obserwowano liniowy

wzrost wysokości sygnału elektroredukcji ferrytyny związanej z warstwą

receptorową immunosensora na drodze oddziaływania antygen–przeciwciało. Dla

stężeń Ft większych niż 20 mg·dL-1

nie obserwowano już dalszych zmian

intensywności piku redukcji. Z kolei w przypadku stężeń ferrytyny poniżej

0.1 mg·dL-1

uzyskiwane sygnały prądowe Ft były bardzo nieodtwarzalne.


197


-0.7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1

I /

A

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

osocze krwi szczura zdrowego

0.1 gdL-1

20.0 gdL-1

Au/Fe@C Nps/-C6H

4(CH

2)2NH

2/Ab/Ft

osocze krwi szczura chorego

(100-krotnie rozcieńczone)


z warstwą receptorową immunosensora (Au/Fe@C Nps/-C6H4(CH2)2NH2/Ab) zarejestrowane

metodą DPV w odtlenionym za pomocą Ar buforze PB dla różnego stopnia wysycenia warstwy

receptorowej Ft. Czerwona krzywa dotyczy analizy osocza krwi szczura zdrowego, zaś krzywa

zielona analizy 100-krotnie rozcieńczonego osocza krwi szczura chorego. Warunki

eksperymentalne: 0.02 M bufor PB, zawierający 150 mM K2SO4 i 0.2% v/v Tween-20 o pH 7.4;

szybkość przemiatania potencjałem: 25 mVs-1

.

Na podstawie uzyskanej krzywej kalibracyjnej, przedstawionej na rysunku 104,

wyznaczono granicę wykrywalności ferrytyny.

CFt / gdL-1

0 5 10 15 20 25

I /

A

-1.4

-1.2

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

Au/Fe@C Nps/-C6H

4(CH

2)2NH

2/Ab/Ft

Rysunek 104. Krzywa kalibracyjna ilustrująca zmiany intensywności sygnału prądowego Ft przy

potencjale 0.45 V w funkcji jej stężenia. Czerwony symbol trójkątny odnosi się do analizy próbki

osocza krwi szczura zdrowego, zaś zielony 100-krotnie rozcieńczonego osocza krwi szczura

chorego.


198

Wyznaczona, zgodnie z równaniem 31, granica wykrywalności ferrytyny związanej

z warstwą receptorową immunosensora, utworzonego na bazie nanocząstek

magnetycznych i filmu aminoetylofenylowego oraz monoklonalnego przeciwciała,

wynosiła 0.16 0.02 mg·dL-1

. Podobnie, jak w przypadku zastosowania filmu

karboksyfenylowego do utworzenia warstwy receptorowej immunosensora,

powtarzalność wyników dla badanych stężeń ferrytyny z zakresu liniowego krzywej

kalibracyjnej była bardzo dobra. Względne odchylenie (n = 5) było mniejsze niż

11%. Z kolei, względne odchylenie standardowe wyników uzyskanych dla tego

samego stężenia ferrytyny na sześciu różnych elektrodach wynosiło ok. 13%.

13.4. Selektywność immunosensora do detekcji ferrytyny

Selektywność zaproponowanego czujnika do bezpośredniej

woltamperometrycznej detekcji ferrytyny sprawdzono wobec innych

elektroaktywnych białek występujących w próbkach krwi, które zawierają w swojej

strukturze jony żelaza(III), czyli hemoglobiny oraz transferyny. Badania

przeprowadzono dla mieszaniny zawierającej ferrytynę i dany interferent

w równomolowym stosunku. Pomiary wykonano dla dwóch różnych stężeń

ferrytyny: 1 oraz 20 mg·dL-1

, dzięki czemu uzyskano różne wysycenie warstwy

receptorowej cząsteczkami białka. Podczas tego eksperymentu skonstruowane

immunosensory zanurzane były w roztworze zawierającym ferrytynę oraz badany

interferent o tym samym stężeniu, na czas 1.5 h w obecności zewnętrznego źródła

pola magnetycznego. Po upływie tego czasu, w celu usunięcia nieprzereagowanych

substancji, elektrodę opłukiwano buforem PB. Pomiaru woltamperometrycznego

dokonywano w czystym odtlenionym buforze PB z dodatkiem 0.15 M K2SO4 oraz

0.2% v/v Tween-20. Wpływ badanych interferentów na sygnał elektroredukcji

ferrytyny (IFt + interferent / IFt) ilustruje rysunek 105.


199

I Ft

+ in

terf

ere

nt /

I Ft

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

Ft: 20 gdL-1

Ft: 1 gdL-1

TfHb

I Ft

+ in

terf

ere

nt /

I Ft

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

Ft: 20 gdL-1

Ft: 1 gdL-1

TfHb

Au/Fe@C Nps/-C6H

4(CH

2)2NH

2/Ab/Ft

Au/Fe@C Nps/-C6H

4COOH/Ab/FtA

B

Rysunek 105. Wpływ obecności interferentów (Hb i Tf) na wartości prądu redukcji jonów

żelaza(III) obecnych w strukturze ferrytyny. Badania wykonane przy użyciu immunosensora

zawierającego A: film karboksyfenylowy oraz B: film aminoetylofenylowy.

Uzyskane wyniki pokazują, że obecność hemoglobiny i transferyny tylko

w nieznacznym stopniu wpływa na sygnał prądowy ferrytyny związanej z warstwą

receptorową immunosensora, bez względu na sposób unieruchomienia przeciwciała

w warstwie. Obecność hemoglobiny w roztworze powodowała niewielki spadek

sygnału prądowego ferrytyny, co świadczy o częściowym blokowaniu powierzchni

elektrody przez to białko, a z kolei transferyna powodowała nieznaczny wzrost

intensywności sygnału prądowego. Takie zmiany wynikały z różnego ułożenia

centrów redoks. Należy podkreślić, że zmiany te były na poziomie kilku procent,

czyli na granicy błędu statystycznego. Wykonane pomiary potwierdzają, że

zaproponowany immunosensor do bezpośredniej detekcji ferrytyny, utworzony


200

zarówno na bazie filmu karboksyfenylowego i aminoetylofenylowego,

charakteryzował się wysoką selektywnością.

13.5. Oznaczenie ferrytyny w próbkach krwi

Funkcjonalność skonstruowanego immunosensora do detekcji ferrytyny

sprawdzono wobec próbki naturalnej: krwi szczura zdrowego oraz krwi szczura

chorego o podniesionym poziomie ferrytyny. W pierwszym etapie krew szczurzą,

która zawierała antykoagulant w postaci cytrynianu sodu, poddano wirowaniu.

Proces wirowania pozwolił na oddzielenie elementów morfotycznych krwi od

osocza. W kolejnym etapie immunosensor zanurzany był do roztworu osocza na czas

1.5 h w obecności pola magnetycznego. Następnie elektrodę delikatnie opłukiwano

strumieniem wody destylowanej. Pomiary prowadzono w czystym odtlenionym

0.02 M buforze fosforanowym z dodatkiem 150 mM K2SO4 przy użyciu

elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej, woltamperometrii pulsowej

różnicowej oraz techniki LA-ICP-MS. Wyznaczone na podstawie krzywych

kalibracyjnych stężenia ferrytyny w badanych próbkach krwi szczurzej związanej

z karboksyfenylową oraz aminoetylofenylową warstwą sensorową przedstawia tabela

14.

Tabela 14. Porównanie zawartości ferrytyny we krwi szczura zdrowego i chorego.

EIS DPV LA-ICP-MS

Au/Fe@C Nps/-C6H4COOH/Ab/Ft

Osocze krwi szczura

zdrowego [mg·dL-1

] 8.1 ± 0.2 7.9 ± 0.2 8.4 ± 0.8

Osocze krwi szczura

chorego [mg·dL-1

] 220.8 ± 16.2 230.5 ± 21.5 223.0 ± 30.1

Au/Fe@C Nps/-C6H4(CH2)2NH2/Ab/Ft

Osocze krwi szczura

zdrowego [mg·dL-1

] 8.3 ± 0.2 8.4 ± 0.3 8.1 ± 0.7

Osocze krwi szczura

chorego [mg·dL-1

] 253.3 ± 19.5 248.5 ± 20.4 240.4 ± 45

Osocze krwi szczura chorego rozcieńczano 100-krotnie

Z literatury wiadomo, że zakres stężeniowy ferrytyny we krwi u zdrowej osoby

wynosi 1 40 µg·dL-1

[219]. Z kolei wysoka zawartość ferrytyny (41 390 µg·dL-1

)

[471] we krwi związana jest z nadmiarem żelaza w organizmie wywołanym


201

schorzeniami typu: stan zapalny, zakażenia, czy choroby nowotworowe. Analiza

krwi szczura zdrowego i chorego przy użyciu zaproponowanego narzędzia

analitycznego dowodzi, że może być ono z powodzeniem stosowane do oznaczenia

ilości tego białka we krwi.

13.6. Podsumowanie

Modyfikacja powierzchni elektrody odpowiednio sfunkcjonalizowanym

filmem fenylowym pozwoliła na kontrolę orientacji unieruchamianych za jego

pośrednictwem cząsteczek przeciwciała i w konsekwencji na efektywne oznaczanie

Ft. Dodatkowo, zastosowanie nanocząstek magnetycznych i wprowadzenie do

układu zewnętrznego źródła pola magnetycznego pozwoliło na osiągnięcie właściwej

orientacji ferrytyny, umożliwiającej jej bezpośrednią woltamperometryczną detekcję.

Wykorzystanie filmu karboksyfenylowego, jako składnika warstwy receptorowej

czujnika, umożliwiło wprowadzenie cząsteczek przeciwciała do warstwy sensorowej

poprzez jego grupy aminowe, co gwarantowało najkrótszy dystans pomiędzy

centrum redoks białka a powierzchnią elektrody, a tym samym obserwację dobrze

wykształconych sygnałów prądowych ferrytyny. Z kolei związanie przeciwciała za

pomocą grup karboksylowych obecnych w jego strukturze z grupami aminowymi

filmu aminoetylofenylowego sprawiało, że cząsteczki przeciwciała znajdowały się

wówczas w położeniu pionowym w stosunku do powierzchni elektrody [437]. Takie

ułożenie Ab powodowało, że sygnały prądowe ferrytyny nie były dobrze

wykształcone, ponieważ odległość pomiędzy centrum redoks białka a powierzchnią

elektrody była zbyt duża. Zatem w przypadku oznaczania ferrytyny bardziej

korzystne jest zastosowanie filmów karboksyfenylowych do unieruchamiania

przeciwciała specyficznie oddziałującego z oznaczanym białkiem. Zaproponowany

immunosensor pozwala na oznaczenia ferrytyny na poziomie około 0.1 mg·dL-1

.

Dodatkowo, za pomocą skonstruowanego czujnika możliwe jest selektywne

oznaczanie ferrytyny w próbce krwi. Czujnik ten może zatem stanowić alternatywę

do obecnych metod stosowanych w analizie klinicznej.

Streszczenie

203

14. Streszczenie

W ostatnich latach nastąpił duży wzrost zainteresowania wykorzystaniem

metaloprotein w różnych dziedzinach życia, takich jak: medycyna, biotechnologia,

czy przemysł. Jednak największe znaczenie białka te odgrywają w badaniu zmian

zachodzących w organizmie ludzkim. Oznaczenie zawartości metaloprotein we krwi

pozwala na szybkie rozpoznanie wielu schorzeń, jak również wczesne wykrycie

nowotworów. Z uwagi na coraz większą liczbę zachorowań na choroby

nowotworowe poszukuje się szybkich, tanich i skutecznych narzędzi analitycznych

umożliwiających diagnostykę tego typu chorób. Wykorzystanie elektrochemii do

oznaczania zawartości białek we krwi wydaje się być konkurencyjne w stosunku do

metod stosowanych w analizie klinicznej, ze względu na brak konieczności

stosowania toksycznych substancji, łatwość przygotowania próbek do pomiarów, jak

również relatywnie krótki czas wykonywania analizy. Dzięki zastosowaniu technik

elektrochemicznych możliwe jest również badanie wpływu oddziaływania różnych

substancji na właściwości metaloprotein i ich aktywność.

Niniejsza rozprawa doktorska dotyczy konstrukcji czujników do oznaczania

zawartości paramagnetycznych metaloprotein obecnych we krwi. Praca ma

klasyczny układ składający się z dwóch części: literaturowej i eksperymentalnej.

Część literaturowa obejmuje osiem rozdziałów. Dwa pierwsze rozdziały zawierają

uzasadnienie podjętej tematyki badawczej oraz sprecyzowane cele badawcze.

W części literaturowej scharakteryzowano płyny ustrojowe ze szczególnym

uwzględnieniem krwi oraz budowę i funkcje analizowanych metaloprotein:

hemoglobiny, ceruloplazminy, transferyny oraz ferrytyny. Z uwagi na fakt, że

niniejsza praca dotyczy elektrochemicznych czujników do oznaczania

paramagnetycznych metaloprotein we krwi, część literaturowa zawiera również

rozdział poświęcony ferromagnetycznym modyfikatorom powierzchni, sposbom

wymiany elektronów pomiędzy białkiem a powierzchnią elektrody oraz wpływowi

pola magnetycznego na transport depolaryzatora do powierzchni elektrody.

Teoretyczna część pracy zawiera także opis stosowanych w pomiarach technik

badawczych.

Badania opisane w niniejszej pracy doktorskiej dotyczą konstrukcji

elektrochemicznych czujników do detekcji paramagnetycznych metaloprotein we

krwi w oparciu o nanocząstki magnetyczne (nanokapsuły węglowe zawierające

Streszczenie

204

żelazo) i zewnętrzne źródło pola magnetycznego. Elektrochemiczna detekcja białek

jest wciąż dużym wyzwaniem dla badaczy, gdyż ich centra elektroaktywne są

głęboko osadzone w otoczce białkowej, co zdecydowanie utrudnia wymianę

elektronów pomiędzy tymi związkami a powierzchnią przewodnika. Ponadto białka

w kontakcie z powierzchnią elektrody, w szczególności z powierzchnią metaliczną,

ulegają denaturacji, a produkty tego procesu efektywnie blokują powierzchnię

przewodnika. Dlatego, ważnym czynnikiem ułatwiającym bezpośrednią wymianę

elektronów jest odpowiednia orientacja metaloproteiny względem powierzchni

elektrody. Odpowiednio modyfikując powierzchnię elektrody można „wymusić” na

cząsteczce takiego związku korzystną z elektrochemicznego punktu widzenia

orientację. W przypadku paramagnetycznych metaloprotein idealnymi kandydatami

są ferromagnetyczne nanokapsuły węglowe zawierające żelazo, które w połączeniu

z polem magnetycznym oddziałując z paramagnetycznymi- elektroaktywnymi

centrami umożliwiają wymianę elektronów pomiędzy białkiem a elektrodą.

Ważnym etapem konstrukcji czujników do detekcji wybranych metaloprotein

było opracowanie procedury tworzenia jednorodnej i stabilnej warstwy nanocząstek

magnetycznych na powierzchni elektrody. Przeprowadzone badania pokazały, że

utworzeniu warstwy o takich parametrach sprzyja zastosowanie homogenizatora

ultradźwiękowego podczas przygotowywania zawiesiny nanocząstek. Skuteczność

współdziałania nanocząstek Fe@C (modyfikatora powierzchni) i zewnętrznego

źródła pola magnetycznego w pierwszej kolejności sprawdzono wobec hemoglobiny,

białka o największej zawartości we krwi. Nanocząstki magnetyczne obecne na

powierzchni elektrody pełniły rolę nanomagnesów, które z jednej strony wzmacniały

transport paramagnetycznej Hb do powierzchni elektrody, z drugiej zaś zapewniały

korzystną dla bezpośredniej wymiany elektronów jej orientację. Dzięki czemu

rejestracja dobrze wykształconych sygnałów elektroredukcji Hb była możliwa. Dużą

zaletą zaproponowanej metody oznaczania hemoglobiny we krwi był brak

konieczności specjalnego przygotowania próbek. Hemoglobina obecna jest

w czerwonych krwinkach, dlatego też przed procesem jej oznaczania

przeprowadzono hemolizę krwi poprzez odpowiednie jej rozcieńczenie. Uzyskane

zdjęcia SEM pokazały, że czas hemolizy ma duży wpływ na proces uwolnienia Hb

z wnętrza czerwonych krwinek, a całkowite uwolnienie tego białka następuje po

ok. 20 minutach. Skonstruowany czujnik pozwolił na oznaczenie hemoglobiny

w próbce krwi ludzkiej oraz szczurzej z dużą dokładnością, dobrą powtarzalnością

Streszczenie

205

oraz niską granicą wykrywalności, rzędu pM. Badania dotyczące oznaczania

hemoglobiny w próbkach krwi przy wykorzystaniu czujnika z warstwą nanocząstek

magnetycznych zostały opisane w publikacji naukowej w czasopiśmie Biosensors

and Bioelectronics 64 (2015) 554.

Jednym ze sposobów ograniczenia kosztów analizy ilościowej białek jest

oznaczanie kilku białek podczas jednego pomiaru. Jednoczesna elektrochemiczna

detekcja kilku białek obecnych we krwi jest trudna do przeprowadzenia, gdyż

produkty zachodzących procesów elektrodowych mogą adsorbować się na

powierzchni elektrody, uniemożliwiając dalszą detekcję. W niniejszej rozprawie

doktorskiej wykazano, że jednoczesne oznaczanie białek jest możliwe przy użyciu

tego samego czujnika, wówczas gdy sygnały prądowe badanych białek pojawiają się

w innym zakresie na skali potencjałowej. Przeprowadzone badania udowodniły, że

możliwa jest bezpośrednia elektrochemiczna detekcja ceruloplazminy i hemoglobiny

w trakcie pojedynczego pomiaru, bez konieczności specjalnego przygotowania

analizowanej próbki krwi. Nanocząstki ferromagnetyka na powierzchni elektrody

pełniły rolę specyficznego i selektywnego filtru, który przyśpieszał oraz wzmacniał

transport tylko paramagnetycznych cząsteczek do powierzchni elektrody.

Dodatkowo, bezpośredni kontakt metaloproteiny z powierzchnią zastosowanego

ferromagnetyka nie prowadził do jej deaktywacji. Badania związane z bezpośrednią,

jednoczesną detekcją ceruloplazminy i hemoglobiny w próbce krwi szczurzej

opublikowane zostały w czasopiśmie Sensors and Actuators B: Chemical 221 (2015)

1461.

Ceruloplazmina jest niezwykle ważnym białkiem w osoczu krwi,

transportującym miedź, ale również katalizującym utlenianie żelaza Fe(II) do Fe(III),

co umożliwia wiązanie tego pierwiastka z transferyną i transport w osoczu krwi.

Właściwości katalityczne Cp są związane z jej unikalnym centrum aktywnym,

zwanym grupą prostetyczną, która złożona jest z 3 typów centrów miedziowych.

Właściwe unieruchomienie cząsteczek ceruloplazminy na powierzchni elektrody ma

niezwykle istotny wpływ na jej aktywność katalityczną. Przeprowadzone badania

z wykorzystaniem skaningowego mikroskopu elektrochemicznego udowodniły, że

zarówno obecność ferromagnetycznego modyfikatora elektrody, czyli nanokapsuł

węglowych zawierających żelazo, jak również zewnętrznego źródła pola

magnetycznego gwarantowały maksymalną aktywność katalityczną cerulolazminy

względem jonów Fe(II). Dodatkowo, wyniki uzyskane za pomocą metody

http://www.sciencedirect.com/science/journal/09254005

Streszczenie

206

LA-ICP-MS pokazały, że adsorpcja ceruloplazminy zachodziła przede wszystkim na

ferromagnetycznym modyfikatorze powierzchni elektrody. Uzyskane wyniki zostały

opisane w publikacji naukowej: Langmuir 31 (2015) 8176.

Kolejną ważną paramagnetyczną metaloproteiną obecną we krwi jest

transferyna. Z uwagi na fakt, że białko to zawiera w swojej strukturze, podobnie jak

Hb i Ft, jony żelaza oznaczanie tej metaloproteiny przy użyciu elektrody

zmodyfikowanej wyłącznie nanocząstkami magnetycznymi było niemożliwe. O ile

hemoglobinę można łatwo usunąć z oznaczanego roztworu poprzez odwirowanie

elementów morfotycznych krwi, o tyle ferrytyna wciąż pozostaje w roztworze i jest

głównym białkiem przeszkadzającym w analizie transferyny w osoczu krwi. Zatem

w celu dokonania oznaczenia transferyny niezbędne jest zmodyfikowanie

powierzchni elektrody przeciwciałem, które selektywnie wiąże oznaczane białko.

Głównym elementem budującym warstwę receptorową immunosensora było

przeciwciało monoklonalne typu IgG, które charakteryzuje się dużą zdolnością do

swoistego rozpoznawania antygenów. Wprowadzenie cząsteczek przeciwciała do

warstwy receptorowej immunosensora oraz zastosowanie zewnętrznego pola

magnetycznego pozwoliło na bezpośrednią woltamperometryczną detekcję

transferyny. Dzięki wykorzystaniu kombinacji pola magnetycznego

i ferromagnetycznego modyfikatora powierzchni elektrody możliwa była rejestracja

dobrze ukształtowanych sygnałów prądowych pochodzących od redukcji jonów

Fe(III) obecnych w strukturze transferyny. Wykonane badania pokazały również, że

skonstruowany immunosensor można zastosować do wykrywania dyskretnych zmian

ilości tego białka we krwi, co jest niezwykle istotne w diagnostyce wielu schorzeń.

Dużą zaletą zaproponowanego immunosensora jest prostota jego wykonania, duża

selektywność, jak również możliwość kilkukrotnego jego wykorzystania, co

znacznie obniża koszty przeprowadzenia analizy. Użyteczność skonstruowanego

immunosensora do detekcji transferyny w próbkach krwi została przedstawiona

w publikacji naukowej w czasopiśmie Sensors and Actuators B: Chemical 249

(2017) 105.

Transferyna, zaliczana do białek „miękkich” według klasyfikacji Norde, jest

podatna na zmiany konformacyjne w wyniku kontaktu z wybraną powierzchnią.

W organizmie ulega ona cyklicznym zmianom konformacyjnym podczas procesu

wiązania i uwalniania jonów Fe(III), umożliwiając tym samym rozpoznanie tego

białka przez receptory zlokalizowane na powierzchni błon plazmatycznych komórek.

http://www.sciencedirect.com/science/journal/09254005

Streszczenie

207

Dodatkowo, ilość receptorów Tf na powierzchni komórek nowotworowych jest

zdecydowanie większa w porównaniu do komórek zdrowych. Z tego względu

transferyna może pełnić funkcję nośnika leku w celowanej terapii

przeciwnowotworowej. Wykonane badania pokazały, że zastosowanie nanocząstek

magnetycznych (potencjalne nośniki leków przeciwnowotworowych) zawierających

na powierzchni grupy karboksylowe (Fe@C-COOH Nps) w obecności pola

magnetycznego prowadzi do kowalencyjnego unieruchomienia tego białka w jego

elektroaktywnej formie. Wprowadzenie zewnętrznego źródła pola magnetycznego

podczas procesu unieruchamiania Tf na powierzchni Fe@C-COOH Nps wpływało

na strukturę tworzonej warstwy transferyny. Paramagnetyczne centra Tf (jony

Fe(III)) były wciągane przez pole magnetyczne i w konsekwencji zmieniały swoje

położenie, natomiast diamagnetyczne składniki otoczki białkowej Tf (głównie

wodorowęglany) były wypychane przez pole na zewnątrz. W związku z tym,

w wyniku oddziaływań elektrostatycznych, tworzyła się kolejna warstwa Tf na

powierzchni nanocząstek, co potwierdziły badania z wykorzystaniem mikrowagi

kwarcowej z dyssypacją energii. Jest to bardzo rzadkie zjawisko w przypadku białek

w warunkach stałego pH. Ponadto pomiary z użyciem techniki UV-vis i CD

udowodniły, że zmiany konformacyjne cząsteczki transferyny zachodzące pod

wpływem pola magnetycznego nie uszkadzały jej struktury. Transferyna związana

z powierzchnią nanocząstki magnetycznej wciąż wykazywała wysoką aktywność

elektrochemiczną. Wyniki dotyczące wpływu sposobu związania transferyny

z nanocząstkami magnetycznymi na jej elektroaktywność oraz zmiany

konformacyjne opisane zostały w czasopiśmie Acta Biomaterialia 45 (2016) 367.

Ostatnią metaloproteiną poddaną analizie elektrochemicznej była ferrytyna

obecna, podobnie jak Cp i Tf, w osoczu krwi. Białko to, podobnie jak hemoglobina

i transferyna, zawiera jony żelaza, co uniemożliwia jego elektrochemiczne

oznaczanie we krwi w obecności tych białek. W celu zapewniania wysokiej

skuteczności działania zaproponowanego czujnika jego warstwę receptorową

wzbogacono o cząsteczki przeciwciała selektywnie oddziałującego tylko z Ft.

Konstrukcja immunosensora opierała się na wykorzystaniu warstwy nanocząstek

magnetycznych pokrytych filmem karboksyfenylowym lub aminoetylofenylowym

otrzymanym w wyniku elektroredukcji odpowiednej soli diazoniowej. Modyfikacja

powierzchni elektrody filmem fenylowym pozwoliła na kontrolę ułożenia

unieruchamianych cząsteczek przeciwciała, a w konsekwencji na efektywność ich

Streszczenie

208

oddziaływania z ferrytyną. Zastosowanie nanocząstek magnetycznych

i zewnętrznego źródła pola magnetycznego podczas reakcji antygenprzeciwciało

pozwoliło na osiągnięcie właściwej dla wymiany elektronu orientacji ferrytyny,

umożliwiającej jej bezpośrednią woltamperometryczną detekcję. Przeprowadzone

badania pokazały, że film karboksyfenylowy jest zdecydowanie korzystniejszy

w elektrochemicznej detekcji Ft w porównaniu do warstwy aminoetylofenylowej,

z uwagi na jakość uzyskiwanych sygnałów prądowych. Zaproponowany

immunosensor pozwala na selektywne oznaczanie ferrytyny w próbce krwi. Wyniki

uzyskane podczas tego etapu badań będą stanowiły podstawę publikacji naukowej.

Streszczenie w języku angielskim

209

15. Streszczenie w języku angielskim

In recent years there has been a great increase in interest of using

metalloproteins in various fields of life, such as medicine, biotechnology or industry.

However, the most important role of metalloproteins occurs in the study of changes

in the human body. The determination of the content of metalloproteins in blood

allows for a quick diagnosis of many diseases as well as early detection of cancer.

Due to the increasing number of cancer occurrences fast, cheap and effective

analytical tools for diagnosing such diseases are sought. The electrochemical

detection of these proteins seems to be competitive compared to clinical analysis due

to the low costs, no need to use the toxic substances, easiness of sample preparation

and short analysis time. The use of electrochemical techniques also allows to study

the effects of different substances on properties of metalloproteins and their activity.

This PhD thesis relates to the construction of sensors for determination of

paramagnetic metalloproteins present in the blood. Traditionally, this thesis consists

of two parts: literature and the experimental one. The literature section of this thesis

consists of eight chapters. The first two chapters describe the justification of the

research topic and the aim of this work. The next section describes the body fluids,

particularly blood. The structure and functions of the selected metalloproteins such

as hemoglobin, ceruloplasmin, transferrin and ferritin are also described. Due to the

fact that this thesis regards electrochemical sensors for determination of

paramagnetic metalloproteins in the blood, the literature part contains a chapter

devoted to ferromagnetic modifier of the surface, the way of electron exchange

between a protein and electrode surface as well as the influence of the magnetic field

on the transport of the substances to electrode surface. The theoretical part of this

thesis contains the description of the experimental techniques.

The research described in this thesis concerns the construction of

electrochemical sensors for detection of paramagnetic metalloproteins in the blood.

The sensors are based on magnetic nanoparticles (carbon encapsulated ion

nanoparticles) and the source of the external magnetic field. Detection of the

electrochemical protein is still a big challenge for researchers due to the fact that

protein redox centers are deeply embedded in the protein shell and, as a consequence,

the electron transfer rate is too slow. Moreover, the direct adsorption of large protein


210

onto the metallic electrode surface may lead to its denaturation, which in turn

efficiently blocks the electron communication between the redox centers and the

electrode. Therefore, an important factor allowing to direct electron exchange is the

appropriate orientation of the proteins on the electrode surface. The proper

modification of the electrode surface can lead to a favorable orientation of proteins

necessary for an electrochemical reaction. In the case of paramagnetic

metalloproteins, the ideal candidates for electrode modifier are ferromagnetic carbon

encapsulated iron nanoparticles (Fe@C Nps). The nanoparticles in combination with

the magnetic field, interact with the paramagnetic electroactive centers and allow for

an exchange of electrons between the protein and the electrode. An important step in

the construction of the sensors for the detection of selected metalloproteins was to

develop a procedure for creating a homogeneous and stable nanoparticle layer on the

electrode surface. The studies have shown that the formation of a layer with such

parameters is possible when using a homogenizer to prepare a nanoparticle

suspension.

The effectiveness of the interaction of Fe@C Nps (surface modifier) and the

external magnetic field was first tested on hemoglobin, a protein with the highest

content in blood. The magnetic nanoparticles have strengthened the transport of

paramagnetic Hb to the electrode surface causing the hemoglobin to be in a favorable

orientation for direct electron transfer. Due to the presence of nanoparticles on the

electrode surface the registration of well visible Hb signals was possible. The great

advantage of the proposed method for hemoglobin determination in the blood is the

lack of special preparation of the samples. Due to the fact that hemoglobin is present

in red blood cells, blood hemolysis was performed prior to Hb determination by

appropriate dilution. The obtained SEM images showed that hemolysis time has

a major impact on the release of Hb from the interior of red blood cells. The

complete release of Hb from red blood cells takes about 20 minutes. The constructed

sensor allowed the determination of hemoglobin in human and rat blood samples

with high accuracy, good repeatability and low detection limit in the pM range.

Studies on the determination of hemoglobin in blood samples using a sensor with

magnetic nanoparticles layer have been presented in the paper published in

Biosensors and Bioelectronics 64 (2015) 554.

The determination of several proteins in one measurement allows the

reduction the costs of analysis. The electrochemical detection of several proteins


211

present in the blood is difficult to perform because the products of the redox reaction

may adsorb on the electrode surface, preventing further detection. This thesis has

shown that the determination of proteins is possible using the same sensor when the

current signals of the investigated proteins appear in a different ranges on the

potential scale. The research has shown that direct electrochemical detection of

ceruloplasmin and hemoglobin is possible during a single measurement without any

special preparation of a blood sample. The construction of the proposed sensor was

based on the use of carbon nanocapsulated iron nanoparticles as electrode surface

modifier and on the presence of the source of external magnetic field. Ferromagnetic

nanoparticles on the electrode surface acted as a specific and selective filter that

stimulated and amplified the transport of only paramagnetic molecules to the

electrode surface. In addition, the direct contact of the metalloproteins with the

nanoparticles surface did not lead to its deactivation. The studies related to direct

detection of ceruloplasmin and hemoglobin in rat blood samples are presented in

Sensors and Actuators B: Chemical 221 (2015) 1461.

Ceruloplasmin is an extremely important protein in the blood plasma. The

ceruloplasmin transports copper and also catalyzes Fe(II) to Fe(III), which makes it

possible to bind Fe(III) with transferrin which transports it into the blood plasma.

Catalytic properties of Cp are associated with its unique active center called

a prosthetic group, which is composed of 3 types of copper centers. Proper

immobilization of ceruloplasmin molecules on the electrode surface is extremely

important for its catalytic activity. Studies conducted using a scanning

electrochemical microscopy (SECM) demonstrated that both the presence of

ferromagnetic nanoparticles (Fe@C Nps) as well as the source of external magnetic

field guarantee the maximum catalytic activity of ceruloplasmin towards Fe(II) ions.

In addition, the results obtained by LA-ICP-MS technique showed that adsorption of

ceruloplasmin occurred mainly on the surface of ferromagnetic electrode modifier.

The obtained results have been described in a scientific paper: Langmuir 31 (2015)

8176.

Another important paramagnetic metalloprotein present in the blood is

transferrin. Due to the fact that this protein contains in its structure the same iron ions

as Hb and Ft, the determination of this metalloprotein using an electrode modified

only with magnetic nanoparticles was impossible. Hemoglobin can be easily

removed from the solution by centrifugation of blood but this method does not


212

remove ferritin, which is the major protein that interfere with the transferrin analysis

in blood plasma. To determine the amount of transferrin it is necessary to modify the

electrode surface with an antibody that selectively binds the assayed protein. The

main component of building the receptor layer of immunosensor was the monoclonal

antibody type IgG which is characterized by its high ability to specifically recognize

the antigens. The introduction of antibody molecules onto the receptor layer and the

use of an external magnetic field allowed the direct electrochemical detection of

transferrin. Using a combination of a magnetic field and a ferromagnetic modifier of

electrode surface, it was possible to record well visible current signals derived from

the reduction of Fe(III) ions present in the transferrin structure. Studies have also

shown that a constructed immunosensor can be used to detect discrete changes in the

amount of this protein in the blood, which is extremely important in the diagnosis of

many diseases. The proposed immunosensor has many advantages such as its

simplicity, high selectivity, the ability to use it several times and also costs of

analysis. The utility of the constructed immunosensor for transferrin detection in

blood samples is presented in the scientific paper in Sensors and Actuators B:

Chemical 249 (2017) 105.

Transferrin, classified by Norde's as "soft" proteins, is susceptible to

conformational changes during a contact with a selected surface. In the human body

transferrin undergoes cyclic conformational changes during the binding and release

of Fe(III) ions. These changes thereby enable the recognition of this protein by

receptor localized on the surface of plasma membrane cells. In addition, the amount

of Tf receptors on the surface of tumor cells is considerably higher in comparison to

healthy cells. For this reason, transferrin may be used in targeted anti-cancer therapy.

The studies have shown that the use of magnetic nanoparticles (potential drug

carrier) with carboxylic groups (Fe@C-COOH Nps) in the presence of the magnetic

field leads to covalent immobilization of this protein in its electroactive form. The

introduction of the source of external magnetic field during the process of Tf

immobilization on F@C-COOH Nps affected the structure of a created transferrin

layer. The Tf undergoes conformation changes, in which the paramagnetic Fe(III)

ions (electroactive centers) are not deeply hidden in the protein shell in the presence

of the magnetic field, whilst the diamagnetic components of Tf molecule (mainly

carbohydrate) are pushed away towards the solution. Consequently, as a result of

electrostatic interactions the adlayer is formed. This is a very rare phenomenon in the


213

case of proteins in constant pH. In addition, the measurements using UV-vis and CD

techniques have proved that the conformational changes of the transferrin molecule

occurring under the influence of the magnetic field did not damage the structure of

transferrin. Transferrin linked to the surface of the magnetic nanoparticle still

exhibited electrochemical activity. The results on the effect of the method of binding

transferrin to magnetic nanoparticles on its electroactivity and conformational

changes have been described in the scientific paper in Acta Biomaterialia 45 (2016)

367.

The last metalloprotein submitted to electrochemical analysis was ferritin.

This protein, like hemoglobin and transferrin, also contains iron ions, what prevents

its electrochemical detection in the blood in the presence of Hb and Tf. In order to

ensure high performance of the proposed sensor, its receptor layer was enriched with

antibody molecules selectively interacting only with Ft. The construction of

immunosensor was based on the use of a magnetic layer coated with carboxyphenyl

or aminoethylphenyl film obtained by one-electron reduction of a diazonium salt.

Modification of the electrode surface with a phenyl film allowed the control of the

placement of immobilized antibody molecules and, consequently, their effectiveness

of interaction with ferritin. The use of magnetic nanoparticles and the source of

external magnetic field during the antigen-antibody interaction allowed to achieve

appropriate orientation of ferritin, enabling its direct voltammetric detection. Studies

have shown that the carboxyphenyl film is better at electrochemical Ft detection

compared to the aminoethylphenyl layer. The proposed immunosensor allows for

a selective detection of ferritin in a blood sample. The results obtained during this

stage of research will be the basis for a scientific publication.

Spis prac naukowych opublikowanych w trakcie studiów doktoranckich

215

16. Spis prac naukowych opublikowanych w trakcie

studiów doktoranckich

Publikacje i monografie bezpośrednio związane z tematem rozprawy doktorskiej:

1. E. Matysiak, M. Donten, A. Kowlaczyk, M. Bystrzejewski, I.P. Grudzinski,

A.M. Nowicka; „A novel type of electrochemical sensor based on

ferromagnetic carbon-encapsulated iron nanoparticles for direct determination

of hemoglobin in blood samples” Biosensors and Bioelectronics 64, 2015,

554-559.

2. E. Matysiak, B. Wagner, M. Bystrzejewski, I.P. Grudzinski, A.M. Nowicka;

„Direct voltammetric detection of ceruloplasmin in blood in presence of other

paramagnetic species” Sensors and Actuators, B: Chemical 221, 2015,

1461-1468.

3. E. Matysiak, A.J.R. Botz, J. Clausmeyer, B. Wagner, W. Schuhmann,

Z. Stojek, A.M. Nowicka; „Assembling paramagnetic ceruloplasmin at

electrode surfaces covered with ferromagnetic nanoparticles. Scanning

electrochemical microscopy in the presence of a magnetic field” Langmuir

31, 2015, 8176-8183.

4. A. Kowlaczyk, E. Matysiak-Brynda, M. Bystrzejewski, D.S. Sutherland,

Z Stojek, A.M. Nowicka; „Conformational control of human transferrin

covalently anchored to carbon-coated iron nanoparticles in presence of

a magnetic field” Acta Biomaterialia 45, 2016, 367-374.

5. E. Matysiak-Brynda, M. Bystrzejewski, A. Wieckowska, I.P. Grudzinski,

A.M. Nowicka; „Novel ultrasensitive immunosensor based on magnetic

particles for direct detection of transferrin in blood” Sensors and Actuators,

B: Chemical 249, 2017, 105-113.

6. E. Matysiak, A. Kowalczyk, M. Donten, A.M. Nowicka; „Aspekty

oddziaływań magnetycznych w elektrochemicznej charakterystyce substancji

istotnych biologicznie”, w: „Postępy Elektroanalizy”, B. Baś,

M. Jakubowska, W.W. Kubiak (Eds.), 2016, rodział 21, str. 235-249,

Wydawnictwo Naukowe AKAPIT, ISBN: 978-83-63663-78-0.

https://www.scopus.com/record/display.uri?eid=2-s2.0-84908020891&origin=resultslist&sort=plf-f&src=s&st1=Matysiak%2c+E.&st2=&sid=63448AABFD43A4A1FCB63264F4D3C54E.wsnAw8kcdt7IPYLO0V48gA%3a10&sot=b&sdt=b&sl=25&s=AUTHOR-NAME%28Matysiak%2c+E.%29&relpos=16&citeCnt=18&searchTerm=














Spis prac naukowych opublikowanych w trakcie studiów doktoranckich

216

7. E. Matysiak-Brynda, A. Kowalczyk, M. Bystrzejewski, D.S. Sutherland,

Z. Stojek, A.M. Nowicka; „Kontrolowane unieruchamianie transferyny na

powierzchni nanocząstki magnetycznej w obecności pola magnetycznego

sposobem na wzrost jej elektroaktywności”, w: „Nowe Strategie w Analizie

Elektrochemicznej”, B. Baś, M. Jakubowska, W.W. Kubiak (Eds.), 2017,

rodział 1, str. 15-28, Wydawnictwo Naukowe AKAPIT, ISBN: 978-83-

63663-90-2

Inne publikacje i rozdziały w książkach:

1. E. Matysiak, S. Sek, Z. Stojek, A.M. Nowicka; „Accuracy of determination

of mass of DNA films on gold electrodes” Sensors and Actuators, B:

Chemical 210, 2015, 624-632.

2. E. Matysiak, A.M. Nowicka, B. Wagner, M. Donten; „Space-oriented

immobilization of fully active laccase on PPy-ferromagnetic nanoparticles

composite layer” Electrochimica Acta 191, 2016, 586-593.

3. A.M. Nowicka, A. Kowalczyk, E. Matysiak, M. Hepel; „DNA damage by

highly oxidizing environmental pollutants”, w: „Oxidative Stress:

Diagnostics, Prevention, and Therapy Volume 2”, 2015, rozdział 12, str. 279-

299, ACS Symposium Series, ISBN: 9780841231009.

Publikacje wysłane do recenzji:

1. E. Matysiak-Brynda, P. Bujak, E. Augustin, A. Kowalczyk, Z. Mazerska,

A. Pron, A.M. Nowicka; „Stable nanoconjugate of transferrin with alloyed

quaternary nanocrystals Ag-In-Zn-S as biological entity for tumor

recognition”







http://pubs.acs.org/isbn/9780841231009



Bibliografia

217

17. Bibliografia

[1] A.A. Khan, M.A. Alzohairy; Res. J. Biol. Sci. 5, 2010, 565.

[2] P. Bajpai; Biotechnol. Prog. 15, 1999, 147.

[3] R.K. Murray, D.K. Granner, P.A. Mayes, V.W. Rodwell; „Biochemia Harpera”,

Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa, 2006.

[4] B.R. Waterhouse, A.D. Farmery; Anaesth. Intens. Care Med. 3, 2012, 603.

[5] G.B. Forbes; „Human Body Composition: Growth, Aging, Nutrition, and Activity”, Springer-

Verlag, New York, 1987.

[6] E. Ziółko; „Podstawy fizjologii człowieka”, Oficyna Wydawnicza PWSZ w Nysie,

Nysa, 2006.

[7] W.Z. Traczyk, A. Trzebski; „Fizjologia człowieka z elementami fizjologii stosowanej

i klinicznej”, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa, 2009.

[8] M. Tafil-Klawe, J.J. Klawe; „Wykłady z fizjologii człowieka”, Wydawnictwo Lekarskie PZWL,

Warszawa, 2009.

[9] A. Michajlik, W. Ramotowski; „Anatomia i fizjologia człowieka”, Wydawnictwo Lekarskie

PZWL, Warszawa, 2009.

[10] G. Zhao, M. Viehrig, M. Pumera; Lab Chip 13, 2013, 1930.

[11] W. Sawicki, J. Malejczuk; „Histologia”, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa, 2012.

[12] M. Kersaudy-Kerhoas, E. Sollier; Lab Chip 13, 2013, 3323.

[13] S.H.D.P. Lacerda, J.J. Park, C. Meuse, D. Pristinski, M.L. Becker, A. Karim, J.F. Douglas;

ACS Nano 4, 2010, 365.

[14] M.-J. Wang, W.-B. Tsai; „Biomaterials in Blood-contacting Devices: Complications and

Solutions”, Nova Science Publishers, New York, 2010.

[15] Kenry, K.P. Loh, Ch.T. Lim; Nanoscale 8, 2016, 9425.

[16] A.C. Frazer; Discussions Faraday Soc. 6, 1949, 81.

[17] C.D. Hillyer, L.E. Silberstein, P.M. Ness, K.C. Anderson, J.D. Roback; „Blood Banking and

Transfusion Medicine: Basic Principles & Practice”, Churchill Livingstone, Philadelphia,

2006.

[18] A. Blann; „Routine Blood Results Explained”, M&K Publishing, Bath, 2013.

[19] G. Lippi, M. Plebani, S. Di Somma, G. Cervellin; Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 48, 2011, 143.

[20] G. Lippi, G. Cervellin, E.J. Favaloro, M. Plebani; „In Vitro and In Vivo Hemolysis:

An Unresolved Dispute in Laboratory Medicin”, De Gruyter, Berlin, 2012.

[21] https://en.wikipedia.org/wiki/Tonicity

[22] N.W. Tietz; „Fundamentals of clinical chemistry”, Elsevier, St. Louis, 2008.

[23] X. Chen; „On-chip pretreatment of whole blood by using MEMS technology”, eBooks,

Bentham Science Publishers, 2012.

[24] Ch.H. Sloop, L. Dory, P.S. Poheim; J. Lipid Res. 28, 1987, 225.

[25] W. Ptak, M. Ptak, M. Szczepanik; „Podstawy immunologii”, Wydawnictwo Lekarskie PZWL,

Warszawa, 2008.

[26] R. Nezlin; „The immunoglobulins: Structure and Function”, Academic Press, San Diego, 1998.

[27] R. Toughiri, X. Wu, D. Ruiz, F. Huang, J.W. Crissman, M. Dickey, K. Froning, E.M. Conner,

T.P. Cujec, S.J. Demarest; MAbs 8, 2016, 1276.

[28] P.M. Lydyard, M.W. Fanger, A. Whelan; „Immunologia. Krótkie wykłady”, Wydawnictwo

Naukowe PWN, Warszawa, 2012.

[29] M. Zieliński; Biotechnologia 2, 2009, 113.

[30] Ł. Sędek, B. Mazur; Postępy Biologii Komórki 24, 2008, 17.

[31] T. Boenisch; Appl. Immunohistochem. 7, 1999, 300.

[32] M. Basu, S.S. Lenka, M. Paichha, B. Swain, B. Patel, R. Banerjee, P. Jayasankar, S. Das,

M. Samanta; Vet. Immunol. Immunopathol. 179, 2016, 77.

[33] T. Honjo, F.W. Alt; „Immunoglobulin Genes”, Academic Press, London, 1995.

[34] Y.H. Chow, Y.J. Yap, P.L. Show, J.Ch. Juan, M.S. Anuar, E.-P. Ng, Ch.-W. Ooi, T.Ch. Ling;

J. Biosci. Bioeng. 122, 2016, 613.

[35] A.H. Loo, A. Bonanni, A. Ambrosi, H.L. Poh, M. Pumera; Nanoscale 4, 2012, 921.

[36] S. Doonan; „Białka i peptydy”, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 2008.

Bibliografia

218

[37] A.V. Finkelstein, O. Ptitsyn; „Protein Physics: A course of Lectures”, Academic Press,

Amsterdam, 2002.

[38] R.T. Morrison, R.N. Boyd; „Chemia organiczna. T.2”, Wydawnictwo Naukowe PWN,

Warszawa, 2010.

[39] A. Kołodziejczyk; „Naturalne związki organiczne”, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa,

2004.

[40] J. Kączkowski; „Podstawy Biochemii”, Wydawnictwo WNT, Warszawa, 2012.

[41] D.B. Hames, N.M. Hooper; „Biochemia. Krótkie wykłady”, Wydawnictwo Naukowe PWN,

Warszawa, 2012.

[42] Y. Lu, N. Yeung, N. Sieracki, N.M. Marshall; Nature 460, 2009, 855.

[43] R.H. Holm, P. Kennepohl, E.I. Solomon; Chem. Rev. 96, 1996, 2239.

[44] M.M. Harding; Acta Cryst. D60, 2004, 849.

[45] R.W. Hay; „Chemia bionieorganiczna”, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 1990.

[46] R.F. Boyer, B.E. Schori; Biochem. Biophys. Res. Commun. 116, 1983, 244.

[47] A. Koj, A. Kurdowska, D. Magielska-Zero, H. Rokita, J.D. Sipe, J.M. Dayer, S. Demczuk,

J. Gauldie; Biochem. Int. 14, 1987, 553.

[48] B. Mariańska; Diagn. Lab. 38, 2002, 339.

[49] G. Winsauer, R. de Martin; Thromb. Haemost. 97, 2007, 364.

[50] M.M. Harding, M.W. Nowicki, M.D. Walkinshaw; Crystallogr. Rev. 16, 2010, 247.

[51] L. Stryer; „Biochemia”, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 2003.

[52] A.F. Wagner, K.A. Folkers; „Vitamins and coenzymes”, Interscience Publishers, New York,

1975.

[53] R.M. Roat-Malone; „Chemia bionieorganiczna”, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa,

2010.

[54] C.G. Fraga; Mol. Aspects Med. 26, 2005, 235.

[55] H. Sun, Z.-F. Chai; Annual. Rep. Prog. Chem., Sect. A 106, 2010, 20.

[56] A. Rodacka, J. Gerszon, M. Puchala, G. Bartosz; Radiat. Phys. Chem. 128, 2016, 112.

[57] K. Hemavathi, M. Kalaivani, A. Udayakumar, G. Sowmiya, J. Jeyakanthan, K. Sekar; J. Appl.

Cryst. 43, 2010, 196.

[58] M. Harding; Acta Cryst. D55, 1999, 1432.

[59] M.M. Harding; Acta Cryst. D56, 2000, 857.

[60] K. Hsin, Y. Sheng, M.H. Harding, P. Taylor, M.D. Walkinshaw; J. Appl. Cryst. 41, 2008, 963.

[61] Y. Yuan, V. Simplaceanu, J.A. Lukin, C. Ho; J. Mol. Biol. 321, 2002, 863.

[62] P. Norouzi, B. Larijani, F. Faridbod, M. R. Ganjali; Int. J. Electrochem. Sci. 5, 2010, 1550.

[63] E. Nagababu, J.M. Rifkind; Antioxid. Redox Signal 6, 2004, 967.

[64] T. Kanias, J.P. Acker; FEBS Journal 277, 2010, 343.

[65] X.Y. Bao, Z.W. Zhu, N.Q. Li, J.G. Chen; Talanta 54, 2001, 591.

[66] E.J. Parker-Williams; Medicine 37, 2009, 137.

[67] I.S. Anand; J. Am. Coll. Cardiol. 52, 2008, 501.

[68] P. Karlson; „Zarys biochemii”, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 1987.

[69] M. Weissbluth; „Molecular Biology: Biochemistry and Biophysics”, Springer, New York,

1974.

[70] F.W. Scheller, N. Bistolas, S. Liu, M. Jänchen, M. Katterle, U. Wollenberger; Adv. Colloid

Interface Sci. 116, 2005, 111.

[71] M.K. Chan; J. Porphyr. Phthaloc. 4, 2000, 358.

[72] T. Yonetani, M. Laberge; BBA – Proteins Proteom. 1784, 2008, 1146.

[73] https://www.google.pl/search?q=hemoglobina.com

[74] G.M. Tush, R.J. Kuhn; Ann. Pharmacother. 30, 1996, 1251.

[75] W.A. Eaton, E.R. Henry, J. Hofrichter, A. Mozzarelli; Nat. Struct. Biol. 6, 1999, 352.

[76] D.M. Harmening, V.C. Hughes, C. Del Toro; „Clinical Hematology and Fundamentals of

Hemostasis”, FA Davis, Philadelphia, 2002.

[77] D.L. Nelson, M.M. Cox; „Lehninger Principles of Biochemistry“, W.H. Freeman and

Company, New York, 2008.

[78] E. Nagababu, J.M. Rifkind; Biochemistry 39, 2000, 12503.

[79] J.W. Wallace, J.C. Maxwell; Biochem. Biophys. Res. Commun. 57, 1974, 1104.

[80] J. Umbreit; Am. J. Hematol. 82, 2007, 134.

[81] C. Giulivi, P. Hochstein, K.J. Davies; Free Radical Biol. Med. 16, 1994, 123.

[82] G.N. La Mar, J.S. de Ropp, L. Latos-Grazynski, A.L. Balch, R.B. Johnson, K.M. Smith,

D.W. Parish, R.J. Cheng; J. Am. Chem. Soc. 105, 1983, 782.

Bibliografia

219

[83] E. Zapora, I. Jarocka; Postepy Hig. Med. Dosw. 67, 2013, 214.

[84] Y. Jia, P.W. Buehler, R.A. Boykins, R.M. Venable, A.I. Alayash; J. Biol. Chem. 282, 2007,

4894.

[85] L. Pauling, C. Coryell; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 22, 1936, 159.

[86] L. Pauling, C. Coryell; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 22, 1936, 210.

[87] C. Coryell, F. Stitt, L. Pauling; J. Am. Chem. Soc. 59, 1937, 633.

[88] J.P. Savicky, G. Lang, M. Ikeda-Sato; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, 5417.

[89] V.L. Davidson, D.B. Sittmano; „Biochemia”, Urban & Partner, Wrocław, 2002.

[90] N. Masuoka, H. Kodama, T. Abe, D.H. Wang, T. Nakano; Biochim. Biophys. Acta 1637, 2003,

46.

[91] A. Kapralov, I.I. Vlasova, W. Feng, A. Maeda, K. Walson, V.A. Tyurin, Z. Huang,

R.K. Anjea, J. Carcillo, H. Bayir, V.E. Kagan; J. Biol. Chem. 284, 2009, 30395.

[92] W. Tao, Y. Liu, D. Pan, L. Nie, S. Yao; Bioelectrochemistry 65, 2004, 51.

[93] G. Vaschenko, T. Ross, A. MacGillivray; Nutrients 5, 2013, 2289.

[94] P. Hahn, G. Yong, J. Beard, J. Dunaief; NeuroReport 17, 2006, 1803.

[95] C.G. Holmberg; Acta Physiol. Scand. 8, 1944, 227.

[96] N.Takahashi, T.L. Ortel, F.W. Putnam; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, 390.

[97] S.A. Donley, B.J. Ilagan, H. Rim, M.C. Linder; Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 283, 2002,

E667.

[98] N.E. Hellman, J.D. Gitlin; Annu. Rev. Nutr. 22, 2002, 439.

[99] D. Wierzbicka, G. Gromadzka; Postepy Hig. Med. Dosw. 68, 2014, 912.

[100] P. Bielli, L. Calabrese; Cell. Mol. Life Sci. 59, 2002, 1413.

[101] H. Chen, Z.K. Attieh, B.A. Syed, Y.M. Kuo, V. Stevens, B.K. Fuqua, H.S. Andersen,

C.E. Naylor, W.R. Evans, L. Gambling, R. Danzeisen, M.B. Bacouri-Haidar, J. Usta,

C.D. Vulpe, H.J. McArdle; J. Nutr. 140, 2010, 1728.

[102] T.L. Ortel, N. Takahashi, F.W. Putnam; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, 4761.

[103] A. Messerschmidt, R. Ladenstein, R. Huber, M. Bolognesi, L. Avigliano, R. Petruzzelli,

A. Rossi, A. Finazzi-Agro; J. Mol. Biol. 224, 1992, 179.

[104] A. Messerschmidt, A. Rossi, R. Ladenstein, R. Huber, M. Bolognesi, G. Gatti, A. Marchesini,

R. Petruzzelli, A. Finazzi-Agro; J. Mol. Biol. 206, 1989, 513.

[105] S.M. Lee, Z.K. Attieh, H.S. Son, H. Chen, M.B. Bacouri-Haidar, C.D. Vulpe; Biochem.

Biophys. Res. Commun. 421, 2012, 449.

[106] T.E. Machonkin, H.H. Zhang, B. Hedman, K.O. Hodgson, E.I. Solomon; Biochemistry

37, 1998, 9570.

[107] I. Bento, C. Peixoto, V.N. Zaitsev, P.F. Lindley; Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr.

63, 2007, 240.

[108] E. Sedlak, P. Wittung-Stafshede; Biochemistry 46, 2007, 9638.

[109] T.E. Machonkin, E.I. Solomon; J. Am. Chem. Soc. 122, 2000, 12547.

[110] T. Kubiak, R. Krzyminiewski, B. Dobosz; Curr. Top. Biophys 36, 2013, 7.

[111] P. Dusek, J. Jankovic, W. Le; Neurobiol. Dis. 46, 2012, 1.

[112] X. He, P. Hahn, J. Iacovelli, R. Wong, C. King, R. Bhisitkul, M. Massro-Giordano,

J.L. Dunaief; Prog. Retin Eye Res. 26, 2007, 649.

[113] C. Eid, M. Hémadi, N.T. Ha-Duong, J.M. El Hage Chahine; Biochim. Biophys. Acta 1840,

2014, 1771.

[114] S. Osaki, D.A. Johnson; J. Biol. Chem. 244, 1969, 5757.

[115] D.M. De Silva, C.C. Askwith, J. Kaplan; Physiol. Rev. 76, 1996, 31.

[116] J. Healy, K. Tipton; J. Neural Transm. 114, 2007, 777.

[117] A. Michalak, J. Krzeszowiak, I. Markiewicz-Górka; Postepy Hig. Med. Dosw. 68, 2014, 1483.

[118] J.M. Gutteridge; Clin. Chem. 41, 1995, 1819.

[119] P. Bielli, L. Calabrese; Cell. Mol. Life Sci. 59, 2002, 1413.

[120] A. Augustyniak, E. Skrzydlewska; Postepy Hig. Med. Dosw. 58, 2004, 194.

[121] J.M. Gutteridge; Ann. Neurol. 32, 1992, S16.

[122] E. Frieden, H.S. Hsieh; Adv. Enzymol. Ramb. 44, 1976, 187.

[123] I. Kochanowska, E. Hampel-Osipowicz, P. Waloszczyk; Neurologia Dziecięca 17, 2008, 63.

[124] P.V. van den Berghe, L.W. Klomp; Nutr. Rev. 67, 2009, 658.

[125] I. Ojeda, M. Moreno-Guzmán, A. González-Cortés, P. Yáñez-Sedeño, J.M. Pingarrón;

Electroanal. 25, 2013, 2166.

[126] M.C. Linder; Metallomics 8, 2016, 887.

Bibliografia

220

[127] T.C. Larkin, T.A. Fingleton, M. Mccusker, M. Cassidy, G. Gunter, C.A. Lepp, E. Gamboa;

Clin. Lab. 50, 2004, 193.

[128] M. Nowak, T. Wielkoszyński, B. Marek, B. Kos-Kudła, E. Świętochowska, L. Siemińska,

J. Karpe, D. Kajdaniuk, J. Głogowska-Szeląg, K. Nowak; Clin. Exp. Med. 10, 2010, 185.

[129] M. Siotto, P. Pasqualetti, M. Marano, R. Squitti; J. Neural Transm. 121, 2014, 1281.

[130] R.N. Rosenberg, S.B. Prusiner, S. DiMauro, R. Barchi; „Kliniczne kompendium do

molekularnych i genetycznych podstaw chorób neurologicznych”, D.W. Publishing Co.,

Szczecin, 1999.

[131] T. Tonnesen, W.J. Kleijer, N. Horn; Hum. Genet. 86, 1991, 408.

[132] Y.H. Gu, H. Kodama, K. Shiga, S. Nakata, Y. Yanagawa, H. Ozawa; J. Inherit. Metab. Dis. 28,

2005, 473.

[133] I.H. Scheinberg, I. Sternlieb; Annu. Rev. Med. 16, 1965, 119.

[134] I.H. Scheimberg, D. Gitlin; Science 116, 1952, 484.

[135] G. Crisponi, V.M. Nurchi, D. Fanni, C. Gerosa, S. Nemolato, G. Faa; Coord. Chem. Rev. 254,

2010, 876.

[136] A. Ala, A.P. Walker, K. Ashkan, J.S. Dooley, M.L. Schilsky; Lancet. 369, 2007, 397.

[137] J.M. Walshe; Lancet. 270, 1956, 25.

[138] J.M. Zaucha; Hematologia 2, 2011, 15.

[139] P. Knekt, A. Aromaal, J. Maatelal, A. Rissanen, M. Hakama, R.-K. Aaran, T. Nikkari,

T. Hakulinen, R. Peto, L. Teppo; Br. J. Cancer 65, 1992, 292.

[140] T. Wróbel; Acta Haematologica Polonica 42, 2011, 375.

[141] T.M. Rose, G.D. Plowman, D.B. Teplow, W.J. Dreyer, K.E. Hellström, J.P. Brown; Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 83, 1986, 1261.

[142] R.P. Palmour, H.E. Sutton; Biochemistry 10, 1971, 4026.

[143] D. Łubgan, A. Marczak, L. Distel, Z. Jóźwiak; Postępy Biochemii 52, 2005, 72.

[144] E.N. Baker; Adv. Inorg. Chem. 41, 1994, 389.

[145] https://en.wikipedia.org/wiki/Transferrin

[146] G.V. Louie; Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 1993, 401.

[147] H. Sun, H. Li, P.J. Sadler; Chem. Rev. 99, 1999, 2817.

[148] C.L. Day, B.F. Anderson, J.W. Tweedie, E.N. Baker; J. Mol. Biol. 232, 1993, 1084.

[149] R.F. Fischetti, D.J. Rodi, D.B. Gore, L. Makowski; Chemistry & Biology 11, 2004, 1431.

[150] M.R. Schlabach, G.W. Bates; J. Biol. Chem. 250, 1975, 2182.

[151] R.T.A. MacGillivray, E. Mendez, S.K. Sinha, M.R. Sutton, J. Lineback-Zins, K. Brew; Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 79, 1982, 2504.

[152] O. Mazuryk, K. Kurpiewska, K. Lewiński, G. Stochel, M. Brindell; J. Inorg. Biochem.

116, 2012, 11.

[153] D. Furmanowicz, I. Pietrzak, K. Wiktorowicz; Przegląd Lekarski 64, 2007, 483.

[154] C.J. Parker Siburt, E.M. Lin, S.J. Brandt, A.D. Tinoco, A.M. Valentine, A.L. Crumbliss;

J. Inorg. Biochem. 104, 2010, 1006.

[155] A. Van Campenhout, C.M. Campenhout, A.R. Lagrou, B. Manuel-y-Keenoy; Free Radic. Res.

37, 2003, 1069.

[156] A. Hayashi, Y. Wada, T. Suzuki, A. Shimizu; Am. J. Hum. Genet. 53, 1993, 201.

[157] J. Artym, M. Zimecki; Kosmos 3, 2014, 345.

[158] P. Lipiński, Z. Jarząbek, S. Broniek, T. Zagulski; Int. J. Exp. Pathol. 72, 1991, 623.

[159] P. Aisen, C. Enns, M. Wessling-Resnick; Int. J. Biochem. Cell. Biol. 33, 2001, 940.

[160] J.L. Beard; J. Nutr. 131, 2001, 568S.

[161] T. Kubiak; Kosmos 62, 2013, 501.

[162] N.C. Andrews; N. Engl. J. Med. 341, 1999, 1986.

[163] M.D. Garrick, L.M. Garrick; Biochim. Biophys. Acta 1790, 2009, 309.

[164] B. Cylwik, L. Chrostek, M. Szmitkowski; Postepy Hig. Med. Dosw. 60, 2006, 101.

[165] H. Stibler, K.G. Kjellin; J. Neurol. Sci. 30, 1976, 269.

[166] H. Stibler; Clin. Chem. 37, 1991, 2029.

[167] P. Aisen, M. Wessling-Resnick, E.A. Leibold; Curr. Opin. Chem. Biol. 3, 1999, 200.

[168] M. Hémadi, P.H. Kahn, G. Miguel, J.M. El Hage Chahine; Biochemistry 43, 2004, 1736.

[169] Q.-Y. He, A.B. Mason, V. Nguyen, R.T.A. MacGillivray, R.C. Woodworth; Biochem. J. 350,

2000, 909.

[170] P.T. Gomme, K.B. McCann; Drug Discov. Today 10, 2005, 267.

[171] W.R. Harris; J. Inorg. Biochem. 27, 1986, 41.

[172] M. Shen, J. Wang, M. Yang, G. Li; Electrochem. Commun. 13, 2011, 114.

Bibliografia

221

[173] P. Aisen; Metal Ions Biol. Sys. 35, 1998, 585.

[174] R. Mariani, P. Trombini, M. Pozii, A. Piperno; Mediterr. J. Hematol. Infect. Dis. 1, 2009,

e2009006.

[175] M. Ching-Ming Chung; Biochemical Education 12, 1984, 146.

[176] H. Sun, H. Li, A.B. Mason, R.C. Woodworth, P.J. Sadler; J. Biol. Chem. 276, 2001, 8829.

[177] A. Ando, I. Ando, T. Hiraki, K. Hisada; Int. J. Rad. Appl. Instrum. B 15, 1988, 133.

[178] P. Domenica, J. Reich, W. Madonia, B.A. Cunha; J. Antimicrob. Chemother. 38, 1996, 1031.

[179] A. Ando, I. Ando, T. Hiraki, K. Hisada; Int. J. Rad. Appl. Instrum. B 15, 1988, 133.

[180] H. Li, Z.M. Qian; Med. Res. Rev. 22, 2002, 225.

[181] H. Li, H. Sun, Z.M. Qian; Trends Pharmacol. Sci. 23, 2002, 206.

[182] N.J. Hallab, A. Skipor, J.J. Jacobs; J. Biomed. Mater. Res. 65A, 2003, 311.

[183] J. Walley, P.J. Halbrooks, C. Vonrhein, M.A. Rould, S.J. Everse, A.B. Mason; J. Biol. Chem.

281, 2006, 24934.

[184] V. Thiruselvam, P. Sivaraman, T. Kumarevel, M.N. Ponnuswamy; Biochem. Biophys. Res.

Commun. 453, 2014, 636.

[185] P. Arosio, R. Ingrassia, P. Cavadini; Biochim. Biophys. Acta 1790, 2009, 589.

[186] E.C. Theil; Annu. Rev. Biochem. 56, 1987, 289.

[187] K. Orino, L. Lehman, Y. Tsuji, H. Ayaki, S.V. Torti, F.M. Torti; Biochem. J. 357, 2001, 241.

[188] G.J. Andreson, D.M. Frazer; Semin. Liver Dis. 25, 2005, 420.

[189] E.J. Lesnefsky; Adv. Exp. Med. Biol. 366, 1994, 129.

[190] C.W. Levenson, C.A. Fitch; Brain Res. Dev. Brain Res. 119, 2000, 105.

[191] S.V. Torti, E.L. Kwak, S.C. Miller, L.L. Miller, G.M. Ringold, K.B. Myambo, A.P. Young,

F.M. Torti; J. Biol. Chem. 263, 1988, 12638.

[192] K.B. Storey; J. Med. Biol. Res. 29, 1996, 1715.

[193] G. Beck, T.W. Ellis, G.S. Habicht, S.F. Schluter, J.J. Marchalonis; Dev. Comp. Immunol.

26, 2002, 11.

[194] P.M. Harrison, P. Arosio; Biochim. Biophys. Acta 1275, 1996, 161.

[195] F. Bou-Abdallah, G. Zhao, G. Biasiotto, M. Poli, P. Arosio, N.D. Chasteen; J. Am. Chem. Soc.

130, 2008, 17801.

[196] D.M. Lawson, P.J. Artymiuk, S.J. Yewdall, J.M. Smith, J.C. Livigstone, A. Treffry,

A. Luzzago, S. Levi, P. Arosio, G. Cesareni, C.D. Thomas, W.V. Shaw, P.M. Harrison; Nature

349, 1991, 541.

[197] R.R. Crixhton; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 12, 1973, 57.

[198] S.H. Banyard, D.K. Stammers, P.M. Harrison; Nature 271, 1978, 282.

[199] P. Rucker, F.M. Torti, S.V. Tprti; J. Biol. Chem. 271, 1996, 33352.

[200] N.D. Chasteen, P.M. Harrison; J. Struct. Biol. 126, 1999, 182.

[201] F.M. Michel, L. Ehm, S.M. Antao, P.L. Lee, P.J. Chupas, G. Liu, D.R. Strongin,

M.A.A. Schoonen, B.L. Phillips, J.B. Parise; Science 316, 2007, 1726.

[202] R.C. Hider, X. Kong; Dalton Trans. 42, 2013, 3220.

[203] E.C. Theil, R.K. Behera, T. Tosha; Coord. Chem. Rev. 257, 2013, 579.

[204] T. Douglas, D.R. Ripoll; Protein Sci. 7, 1998, 1083.

[205] X. Liu, E.C. Theil; Acc. Chem. Res. 38, 2005, 167.

[206] G. Jutz, P. van Rijn, B. Santos Miranda, A. Böker; Chem. Rev. 115, 2015, 1653.

[207] J.L. Johnson, M. Cannon, R.K. Watt, R.B. Frankel, G.D. Watt; Biochemistry 38, 1999, 6706.

[208] F. Carmona, Ò. Palacios, N. Gálvez, R. Cuesta, S. Atrian, M. Capdevila, J.M. Domínguez-

Vera; Coord. Chem. Rev. 257, 2013, 2752.

[209] N.E. Le Brun, A.M. Keech, M.R. Mauk, A.G. Mauk, S.C. Andrews, A.J. Thomson,

G.R. Moore; FEBS Lett. 397, 1996, 159.

[210] S.P. Martsev, A.P. Vlasov, P. Arosio, Protein Eng. 11, 1998, 377.

[211] M. Wagstaff, M. Worwood, A. Jacobs; Biochem. J. 173, 1978, 969.

[212] A. Friedman, P. Arrosio, D. Finazzi, D. Koziorowski, J. Galazka-Friedman; Park. Rel. Disord.

17, 2011, 423.

[213] K. Caban-Hernandez, J.F. Gaudier, A.M. Espino; Mol. Biochem. Parasitol. 182, 2012, 54.

[214] J. Zähringer, B.S. Baliga, H.N. Munro; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 1976, 857.

[215] K. Iwai, S.K. Drake, N.B. Wehr, A.M. Weissman, T. LaVaute, N. Minato, R.D. Klausner, R.L.

Levine, T.A. Rouault; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1998, 4924.

[216] P. Lipiński, R.R. Starzyński; Postepy Hig. Med. Dosw. 60, 2006, 322.

[217] D. Berg, G. Beceker, P. Riederer, O. Rieb; Neurotox. Res. 4, 2002, 637.

[218] A. Grzegorzewska; Pol. Arch. Med. Wewn. 117, 2007, 172.

Bibliografia

222

[219] A. Szczeklik; Choroby wewnętrzne, Tom II, Wydawnictwo Medycyna Praktyczna, Kraków,

2005.

[220] T. Podolecki, J. Wasilewski, L. Poloński; Choroby Serca i Naczyń 6, 2009, 180.

[221] J. McCord; Circulation 83, 1991, 1112.

[222] J.L. Sullivan; Lancet 1, 1981, 1293.

[223] J.L. Sullivan; Circulation 86, 1992, 1036.

[224] S. Kiechl, J. Willeit, G. Egger, W. Poewe, F. Oberhollenzer; Circulation 96, 1997, 3300.

[225] J.T. Salonen, K. Nyyssönen, H. Korpela, J. Tuomilehto, R. Seppänen, R. Salonen; Circulation

86, 1992, 803.

[226] M. Truffi, L. Fiandra, L. Sorrentino, M. Monieri, F. Corsi, S. Mazzucchelli; Pharmacol. Res.

107, 2016, 57.

[227] J.M. Dominguez-Vera; J. Inorg. Biochem. 75, 2004, 3145.

[228] G. ker; Chem. Rev. 115, 2015, 1653.

[229] I. Kętnik-Prastowska; „Immunochemia w biologii medycznej, metody laboratoryjne”,

Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 2009.

[230] J. Nowak, M. Boncler, C. Watała; Diagn. Lab. 50, 2014, 53.

[231] E. Turlej; Postepy Hig. Med. Dosw. 63, 2009, 213.

[232] T.W. Kragstrup, T. Vorup-Jensen, B. Deleuran, M. Hvid; SpringerPlus 2, 2013, 263.

[233] A.J. Crowle; „Immunodiffusion”, Academic Press, New York, 1973.

[234] B.H. Berne; Clin. Chem. 20, 1974, 61.

[235] G. Mancini, A.O. Carbonara, J.F. Heremans; Immunochemistry 2, 1965, 235.

[236] H.C.M. Clark, T. Freeman; Clin. Sci. 35, 1968, 403.

[237] G. Csako; Methods Mol. Biol. 869, 2012, 339.

[238] E.M. Southern; J. Mol. Biol. 98, 1975, 503.

[239] T. Mahmood, P. Yang; N. Am. J. Med. Sci. 4, 2002, 429.

[240] B.T. Kurien, R.H. Scofield; Methods 38, 2006, 283.

[241] J. Towbin, T. Staehlin, J. Gordon; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1979, 4350.

[242] J. Opiela; Wiadomości Zootechniczne 1, 2006, 11.

[243] http://metlab.pl/Western_blotting-_teoria_p41.html

[244] O. Warburg, W. Christian; Biochem. Z 310, 1941, 384.

[245] M.M. Bradford; Anal. Biochem. 72, 1976, 248.

[246] K. Takahata, S. Igarashi; Clin. Chim. Acta 283, 1999, 129.

[247] J. Wang; Electroanal. 13, 2001, 983.

[248] R.S. Freire, C.A. Pessoa, L.D. Mello, L.T. Kubota; J. Braz. Chem. Soc. 14, 2003, 230.

[249] J. Xu, W. Li, Q. Yin, H. Zhong, Y. Zhu, L. Jin; J. Colloid. Interf. Sci. 315, 2007, 170.

[250] T. Ruzgas, E. Csöregi, J. Emnéns, L. Gorton, G. Marko-Varga; Anal. Chim. Acta 330, 1996,

123.

[251] K. Habermüller, M. Mosbach, W. Schuhman; Fresenius J. Anal. Chem. 366, 2000, 560.

[252] X. Dominguez-Benetton, S. Srikanth, Y. Satyawali, K. Vanbroekhoven, D. Pant; J. Microbial.

Biochem. Technol. 5, 2013, S6.

[253] R.A. Marcus; Angew. Chem. Int. Ed. 32, 1993, 1111.

[254] J. Yang, F. Pang, R. Zhang, Y. Xu, P. He, Y. Fang; Electroanal. 20, 2008, 2134.

[255] E. Alvarezde Eulate, L. Serls, D.W.M. Arrigan; Anal. Bioanal. Chem. 405, 2013, 3801.

[256] Y. Sun, H. Du, Y. Lan, W. Wang, Y. Liang, C. Feng, M. Yang; Biosens. Bioelectron. 77, 2016,

894.

[257] H. Wang, D. Li, Z. Wu, G. Shen, R. Yu; Talanta 62, 2004, 199.

[258] I. Ojeda, M. Moreno-Guzmán, A. González-Cortés, P. Yáñez-Sedeño, J.M. Pingarrón;

Electroanal. 25, 2013, 2166.

[259] B. Garcinuño, I. Ojeda, M. Moreno-Guzmán, A. González-Cortés, P. Yáñez-Sedeño,

J.M. Pingarrón; Talanta 118, 2014, 61.

[260] S.-Q. Hi, Z.-Y. Wu, Y.-M. Zhou, Z.-X. Cao, G.-L. Shen, R.-Q. Yu; Anal. Chim. Acta 458,

2002, 297.

[261] M.S. Wilson, R.D. Rauh; Biosens. Bioelectron. 19, 2004, 693.

[262] L. Yang, W. Wei, X. Gao, J. Xia, H. Tao; Talanta 68, 2005, 40.

[263] X. Zhang, S. Wang, M. Hu, Y. Xiao; Biosens. Bioelectron. 21, 2006, 2180.

[264] S.-F. Wang, Y.-M. Tan; Anal. Bioanal. Chem. 387, 2007, 703.

[265] S. Patra, E. Roy, R. Madhuri, P.K. Sharma; Biosens. Bioelectron. 63, 2015, 301.

[266] A.L. Ghindilis, P. Atanasov, E. Wilkins; Electroanal. 9, 1997, 661.

[267] D. Leech, P. Kavanagh, W. Schuhmann; Electrochim. Acta 84, 2012, 223.

Bibliografia

223

[268] M. Zhao, Y. Gao, J. Sun, F. Gao; Anal. Chem. 87, 2015, 2615.

[269] J.A. Cracknell, K.A. Vincent, F.A. Armstrong; Chem. Rev. 108, 2008, 2439.

[270] J.-F. Rusling; Acc. Chem. Res. 31, 1998, 363.

[271] W.H. Scouten, J.H.T. Luong, R.S. Brown; Trends Biotechnol. 13, 1995, 178.

[272] E. Stellwagen; Nature 275, 1978, 73.

[273] T. Lötzbeyer, W. Schuhmann, E. Katz, J. Falter, H.-L. Schmidt; J. Electroanal. Chem. 377,

1994, 291.

[274] Z.Y. Wang, S.N. Liu, P. Wu, C.X. Cai; Anal. Chem. 81, 2009, 1638.

[275] D. Ivnitski, K. Artyushkova, R.A. Rincón, P. Atanassov, H.R. Luckarift, G.R. Johnson; Small

4, 2008, 357.

[276] S.X. Zhang, N. Wang, H.J. Yu, Y.M. Niu, C.Q. Sun; Bioelectrochemistry 67, 2005, 15.

[277] C.X. Cai, J. Chen; Anal. Biochem. 332, 2004, 75.

[278] E.E. Ferapontova, S. Shleev, T. Ruzgas, L. Stoica, A. Christenson, J. Tkac, A.I. Yaropolov,

L. Gorton; Prospectives in Bioanalysis 1, 2005, 517.

[279] Z.-Q. Zhai, J. Wu, W. Sun, K. Jiao; J. Chin. Chem. 56, 2009, 561.

[280] S. Shleev, J. Tkac, A. Christenson, T. Ruzgas, A.I. Yaropolov, J.W. Whittaker, L. Gorton;

Biosens. Bioelectron. 20, 2005, 2517.

[281] H. Bagheri, E. Ranjbari, M. Amiri-Aref, A. Hajian, Y. H. Ardakani, S. Amidi; Biosens.

Bioelectron. 85, 2016, 814.

[282] A. Chaubey, B.D. Malhotra; Biosens. Bioelectron. 17, 2002, 441.

[283] K. Karnicka, B. Kowalewska, K. Miecznikowski, P.J. Kulesza; Biotechnologia 4, 2007, 25.

[284] K. Markowska, A.M. Grudniak, K.I. Wolska; Post. Mikrobiol. 52, 2013, 29.

[285] M. Tominaga; Electrochem. Commun. 4, 2002, 968.

[286] X. Zhang, L. Chen, Q. Yang, Q. Li, X. Sun, H. Chen, G. Yang, Y. Tang; Luminescence 30,

2015, 1176.

[287] J. Polak, A. Jarosz-Wilkołazka; Biotechnologia 4, 2007, 82.

[288] J. Tatur, W.R. Hagen, H.A. Heering; Dalton Trans. 21, 2009, 2837.

[289] J. Ye, R.P. Baldwin; Anal. Chem. 60, 1988, 2263.

[290] S. Pakapongpana, R. Palangsuntikula, W. Surareungchai; Electrochim. Acta 56, 2011, 6831.

[291] C.F. Meunier, X.-Y. Yang, J.C. Rooke, B.-L. Su; ChemCatChem 3, 2011, 476.

[292] P. Jochems, Y. Statyawali, L. Diels, W. Dejonghe; Green Chem. 13, 2011, 1609.

[293] A.W.P. Vermeer, W. Norde; J. Colloid Interf. Sci. 225, 2000, 394.

[294] W. Norde, C.E. Giacomelli; J. Biotechnol. 79, 2000, 259.

[295] T.E. Benavidez, D. Torrente, M. Marucho, C.D. Garcia; Langmuir 31, 2015, 2455.

[296] D.G. Castner, B.D. Ratner; Surf. Sci. 500, 2002, 28.

[297] M. Malmsten; J. Colloid Interf. Sci. 207, 1998, 186.

[298] K. Nakanishi, T. Sakiyama, K. Imamura; J. Biosci. Bioeng. 91, 2001, 233.

[299] F. Secundo; Chem. Soc. Rev. 42, 2013, 6250.

[300] W.H. Scouten, J.H.T. Luong, R.S. Brown; Trends. Biotechnol. 13, 1995, 178.

[301] J. Wang; Electroanal. 3, 1991, 255.

[302] W. Norde, C.E. Giacomelli; J. Biotechnol. 79, 2000, 259.

[303] Y. Xiao, F. Patolsky, E. Katz, J.F. Hainfeld, I. Willner; Science 299, 2003, 1877.

[304] E. Katz, I. Willner; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43, 2004, 6042.

[305] S. Liu, Z. Dai, H. Chen, H, Ju; Biosens. Bioelectron. 19, 2004, 963.

[306] Z.S. Beiranvand, A.R. Abbasi, S. Dehdashtian, Z. Karimi, A. Azadbakht; Anal. Biochem. 518,

2017, 35.

[307] Z. Li, L. Sheng, A. Meng, C. Xie, K. Zhao; Microchim. Acta 183, 2016, 1625.

[308] A. Dyal, K. Loos, M. Noto, S.W. Chang, C. Spagnoli, K.V. Shafi, A.Ulman, M. Cowman, R.A.

Gross; J. Am. Chem. Soc. 125, 2003, 1684.

[309] S.A. Ansari, Q. Husain; Biotechnol. Adv. 30, 2012, 512.

[310] M. Opallo, A. Lesniewski; J. Electroanal. Chem. 656, 2011, 2.

[311] C.M. DiCarlo, D.L. Compton, K.O. Evans, J.A. Laszlo; Bioelectrochemistry 68, 2006, 134.

[312] S.J. Updike, G.P. Hicks; Nature 214, 1967, 986.

[313] X.Y. Yang, A. Léonard, A. Lemaire, G. Tian, B.L. Su; Chem. Commun. 47, 2011, 2763.

[314] N. Nassif, J. Livage; Chem. Soc. Rev. 40, 2011, 849.

[315] J. Kim, H. Jia, P. Wang; Biotechnol. Adv. 24, 2006, 296.

[316] J. Bryjak; Wiadomości chemiczne 58, 2004, 691.

[317] X.-P. Dai, Z.-F. Yang, R.G. Luo, K.K. Sirkan; J. Membr. Sci. 171, 2000, 183.

[318] L. Nobs, F. Buchegger, R. Gurny, E. Allémann; J. Pharm. Sci. 93, 2004, 1980.

Bibliografia

224

[319] J.B. Jia, B.Q. Wang, A.G. Wu, G.J. Cheng, Z. Li, S.J. Dong; Anal. Chem. 74, 2002, 2217.

[320] A. Ulman; Adv. Mater. 2, 1990, 573.

[321] D. Mandler, I. Turyan; Electroanal. 8, 1996, 207.

[322] S.F. D’Souza; Curr. Sci. 77, 1999, 69.

[323] I.Y. Galaev, B. Mattiasson; Enzyme Microb. Technol. 15, 1993, 354.

[324] J. Turkova; J. Chromotogr. B 722, 1999, 11.

[325] M. Saalemuddin; Adv. Biochem. Eng. 64, 1999, 203.

[326] S.K. Sahoo, V. Labhasetwar; Drugs Deliv. Today 8, 2003, 1112.

[327] E. Oberdörster; Environ. Health Prospect. 112, 2004, 1058.

[328] A.M. Świdwińska-Gajewska; Medycyna Pracy 58, 2007, 253.

[329] J. Rzeszutek, M. Matysiak, M. Czajka, K. Sawicki, P. Rachubik, M. Kruszewski, L. Kapka-

Skrzypczak; Hygeia Public Health 49, 2014, 449.

[330] I. Najarula; „Nanotechnology: Recent Trends, Emerging Issues and Future Directions”, Nova

Science Publishers, New York, 2014.

[331] D. Zhang, H. Li, H. Wang, L. Li; Int. J. Quantum Chem. 116, 2016, 1846.

[332] R.M. Allaf, I.V. Rivera, I.N. Ivanov; Int. J. Polym. Mater. Polym. Biomater. 66, 2017, 183.

[333] D. Han, X. Zhang, Z. Hua, S. Yang; App. Surf. Sci. 390, 2016, 760.

[334] J.S. Kim, E. Kuk, K.N. Yu, J.-H. Kim, S.J. Park, H.J. Lee, S.H. Kim, Y.K. Park, Y.H. Park,

C.-Y. Hwang, Y.-K. Kim, Y.-S. Lee, D.H. Jeong, M.-H. Cho; Nanomed. Nanotechnol. Biol.

Med. 3, 2007, 95.

[335] X. Huang, P.K. Jain, I.H. El-Sayed, M.A. El-Sayed; Lasers Med. Sci. 23, 2008, 217.

[336] L. Zhang, S.J. Xiao, L.L. Zheng, Y.F. Li, C.Z. Huang; J. Mater. Chem. B 2, 2014, 8558.

[337] S.E. McNeil; J. Leukoc. Biol. 78, 2005, 585.

[338] J. Aswathy, M. Suresh; ChemPlusChem 79, 2014, 1382.

[339] L. Cabrera, S. Gutierrez, N. Menendezb, M.P. Morales, P. Herrasti; Electrochim. Acta 53,

2008, 3436.

[340] O. Bomatı´-Miguel, L. Mazeina, A. Navrotsky, S. Veintemillas-Verdaguer; Chem. Mater.

20, 2008, 591.

[341] Y. Roh, H. Vali, T.J. Phelps, J.W. Moon; J. Nanosci. Nanotechnol. 11, 2006, 517.

[342] E.E. Carpenter, S. Calvin, R.H. Stroud, V. G. Harris; Chem. Mater. 15, 2003, 3245.

[343] J. Wang, S. Zheng, Y. Shao, J. Liu, Z. Xu, D. Zhu; J. Colloid Interface Sci. 349, 2010, 293.

[344] H. Hsu, Y.Y. Lin, S. Huang, K.W. Lem, D.H. Nguyen, D.S. Lee; Nanotechnology 24, 2013,

475102.

[345] R.A. Ramli, W.A. Laftah, S. Hashim; RSC Adv. 3, 2013, 15543.

[346] M. Zhu, G. Diao; Nanoscale 3, 2013, 2748.

[347] R.S. Ruoff, D.C. Lorents, B. Chan, R. Malhotra, S. Subramoney; Science 259, 1993, 346.

[348] M. Bystrzejewski, A. Huczko, H. Lange; Sens. Actuators, B 109, 2005, 81.

[349] J. Borysiuk, A. Grabias, J. Szczytko, M. Bystrzejewski, A. Twardowski, H. Lange; Carbon

46, 2008, 1693.

[350] M. Bystrzejewski; J. Solid State Chem. 184, 2011, 1492.

[351] M. Bystrzejewski, K. Pyrzyńska; Colloids Surf. A: Physicochem. Eng. Asp. 377, 2011, 402.

[352] M. Bystrzejewski, H. Lange, A. Huczko; Fuller. Nanotube. Car. N. 15, 2007, 167.

[353] M. Bystrzejewski, A. Huczko, M. Soszyński, H. Lange; Fuller. Nanotube. Car. N. 17, 2009,

600.

[354] N. Aguiló-Aguayo, L. Maurizi, S. Galmarini, M.G. Ollivier-Beuzelin, G. Coullerez, E. Bertran,

H. Hofmann; Dalton Trans. 43, 2014, 13764.

[355] K. Pyrzyńska, M. Bystrzejewski; Colloids Surf. A: Physicochem. Eng. Asp. 362, 2010, 102.

[356] A.M. Nowicka, A. Kowalczyk, M. Bystrzejewski, M. Donten, M.L. Donten, Z. Stojek,

Electrochim. Acta 126, 2014, 115.

[357] X.M. Lin, A.C.S. Samia; J. Magn. Magn. Mater. 305, 2006, 100.

[358] V. Panchal, M. Neergat, U. Bhandarkar; J. Nanopart. Res. 13, 2011, 3825.

[359] G. Reiss, A. Hutten; Nat. Mater. 10, 2005, 725.

[360] M. Bystrzejewski, K. Pyrzyńska; Mater. Chem. Phys. 141, 2013, 454.

[361] U. Laska, C.G. Frost, G.J. Price, P.K. Plucinski; J. Catal. 268, 2009, 318.

[362] J.S. Beveridge, J.R. Stephens, M.E. Williams; Annu. Rev. Anal. Chem. 4, 2011, 251.

[363] M. Bystrzejewski, S. Cudziło, A. Huczko, H. Lange, G. Soucy, G. Cota-Sanchez,

W. Kaszuwara; Biomol. Eng. 24, 2007, 555.

[364] H. Song, X. Chen; Chem. Phys. Lett. 374, 2003, 400.

[365] M. Bystrzejewski, K. Pyrzyńska, A. Huczko, H. Lange; Carbon 47, 2009, 1201.

Bibliografia

225

[366] A.M. Nowicka, A. Kowalczyk, M. Bystrzejewski, M. Donten, Z. Stojek; Electrochem.

Commun. 20, 2012, 4.

[367] M. Lundqvist, J. Stigler, G. Elia, I. Lynch, T. Cedervell, K.A. Dawson; Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 105, 2008, 14265.

[368] M.I. Setyawati, C.Y. Tay, D. Docter, R.H. Stauber, D.T. Leong; Chem. Soc. Rev. 44, 2015,

8174.

[369] A. Gessner, A. Lieske, B. Paulke, R. Müller; Eur. J. Pharm. Biopharm. 54, 2002, 165.

[370] M. Poplawska, M. Bystrzejewski, I.P. Grudziński, M.A. Cywińska, J. Ostapko,

A. Cieszanowski; Carbon 74, 2014, 180.

[371] K.K.L. Phua, H.F. Staats, K.W. Leong, S.K. Nair; Sci. Rep. 4, 2014, 5128.

[372] S. Aula, S. Lakkireddy, K. Jamil, A. Kapley, A.V.N. Swamy, H.R. Lakkireddy; RSC Adv.

5, 2015, 47830.

[373] A.M. Nowicka, A. Kowalczyk, A. Jarzebinska, M. Donten, P. Krysinski, Z. Stojek,

E. Augustin, Z. Mazerska; Biomacromol. 14, 2013, 828.

[374] Z. Galus; „Fundamentals of Electrochemical Analysis”, Wydawnictwo Naukowe PWN,

Warszawa, 1994.

[375] A. Lasia; „Advanced Electrochemistry. Interfaces, thermodynamics, and electrochemical

techniques”, Département de chimie, Université de Sherbrooke, 2014.

[376] A. Bund, S. Kohler, H.H. Kuhnlein, W. Plieth; Electrochim. Acta 49, 2003, 147.

[377] A. Bund, H. H. Kuehnlein; J. Pys. Chem. 109, 2005, 19845.

[378] N. Leventis, N. Chandrasekaran, A. Dass, X. Gao; ECS Trans. 13, 2008, 25.

[379] S.R. Ragsdale, K.M. Grant, H.S. White; J. Am. Chem. Soc. 120, 1998, 13461.

[380] K.M. Grant, J.W. Hemmert, H.S. White; Electrochem. Commun. 1, 1999, 319.

[381] A. Szewczyk, A. Wiśniewski, R. Puźniak, H. Szymczak; „Magnetyzm i nadprzewodnictwo”,

Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 2012.

[382] E. Katz, O. Lioubashevski, I. Willner; J. Am. Chem. Soc. 127, 2005, 3979.

[383] H. Stöcker; „Nowoczesne kompendium fizyki”, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa,

2012.

[384] M. Waskaas, Y.I. Kharkats; J. Electroanal. Chem. 502, 2001, 51.

[385] G. Mutschke, A. Bund; Electrochem. Commun. 10, 2008, 597.

[386] F. Scholtz; „Electroanalytical Methods”, Springer, Berlin, 2010.

[387] J. Wang; „Analytical Electrochemistry”, Wiley – VCH, New York, 2000. [388] V.M. Mecea; Sens. Actuators A 128, 2006, 270.

[389] V.M. Mecea; Anal. Lett. 38, 2005, 753.

[390] C.K. O'Sullivan, G.G. Guilbault; Biosens. Bioelectron. 14, 1999, 663.

[391] G. Sauerbrey; Z. Phys. 155, 1959, 206.

[392] M.V. Voinova, M. Jonson, B. Kasemo; Biosens. Bioelectron. 17, 2002, 835.

[393] K.A. Marx; Biomacromolecules 4, 2003, 1099.

[394] I. Reviakine, D. Johannsmann, R.P. Richter; Anal. Chem. 83, 2011, 8838.

[395] K.K. Kanazawa, J.G. Gordon; Anal. Chem. 57, 1985, 1770.

[396] R. Konradi, M. Textor, E. Reimhult; Biosensors 2, 2012, 341.

[397] F. Höök, A. Ray, B. Norden, B. Kasemo; Langmuir 17, 2001, 8305.

[398] J. Malmström, H. Agheli, P. Kingshott, D.S. Sutherland; Langmuir 23, 2007, 9760.

[399] S.H. Kristensen, G.A. Pedersen, L.N. Nejsum, D.S. Sutherland; J. Phys. Chem. B 117, 2013,

10376.

[400] C. Gabrielli; „Identification of electrochemical processes by frequency response analysis”,

Schlumberger Instrumentation Group, Farnborough, 1980.

[401] A. Królikowski; „Metody elektrochemiczne w badaniach korozyjnych”, Politechnika

Wrocławska, ZETiK, Karpacz, 1991.

[402] A. Lasia; „Electrochemical Impedance Spectroscopy and Its Applications, Modern Aspects of

Electrochemistry”, B.E. Conway, J. Bockris, R.E. White, Kluwer Academic/Plenum

Publishers, New York, 1999.

[403] H. Scholl, T. Błaszczyk, P. Knyczmonik; „Elektrochemia. Zarys teorii i praktyki”,

Wydawnictwo Uniwersytetu Łódzkiego, Łódź, 1998.

[404] R.N. Vyas, K. Li, B. Wang; J. Phys. Chem. B 114, 2010, 15818.

[405] A.J. Bard, F-R.F. Fan, J. Kwak, O. Lev; Anal. Chem. 61, 1989, 132.

[406] A.L. Barker, J.V. Macpherson, C.J. Slevin, P.R. Unwin; J. Phys. Chem. B 102, 1998, 1586.

[407] M.A. Edwards, S. Martin, A.L. Whitworth, J.V. Macpherson, P.R. Unwin; Physiol. Meas.

27, 2006, R63.

Bibliografia

226

[408] G. Wittstock, M. Burchardt, S.E. Pust,Y. Shen, C. Zhao; Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2007,

1584.

[409] F. Jaroszyk; „Biofizyka. Podręcznik dla studentów”, Wydawnictwo lekarskie PZWL,

Warszawa, 2013.

[410] L. Komorowski, A. Olszewski; „Chemia fizyczna. Tom 4”, Wydawnictwo Naukowe PWN,

Warszawa, 2013.

[411] K. Pigoń, Z. Ruziewicz; „Chemia fizyczna. Tom 2”, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa,

2007.

[412] H.O. Finklea, S. Avery, M. Lynch, T. Furtsch; Langmuir 3, 1987, 409.

[413] I.P. Grudzinski, M. Bystrzejewski, M.A. Cywinska, A. Cieszanowski, A. Ostrowska;

J. Nanopart. Res. 15, 2013, 1835.

[414] A. Zwart; Clin. Chem. 39, 1993, 1570.

[415] F. Darain, P. Yager, K.L. Gan, S.C. Tjin; Biosens. Bioelectron. 24, 2009, 1744.

[416] http://dl.cmuj.krakow.pl

[417] K. Takahata, S. Igarashi, Clin. Chim. Acta 283, 1999, 129.

[418] A. Paulus, S. Gijsbertus, H. Rossius, M. Dijk, S. de Vries; J. Biol. Chem. 287, 2012, 8830.

[419] D. Li, X. Zhang, Y. Long, X. Sun; Life Sci. J. 3, 2006, 52.

[420] C. Giulivi, K.J.A. Davies; J. Biol. Chem. 265, 1990, 19453.

[421] L. Gebicka, E. Banasiak; Acta Biochim. Pol. 56, 2009, 509.

[422] A.M. Nowicka, A. Kowalczyk, M. Bystrzejewski, M. Donten, Z. Stojek; Electrochem.

Commun. 20, 2012, 4.

[423] G.J. Brug, A.L.G. Van Den Eden, M. Sluyters-Rehbach, J.H. Sluyters; J. Electroanal. Chem.

176, 1984, 275.

[424] J. Deinum, T. Vänngård; Biochim. Biophys. Acta 310, 1973, 321.

[425] W. Norde, F. MacRitchie, G. Nowicka, J. Lyklema; J. Colloid Interface Sci. 112, 1986, 447.

[426] W. Norde; Colloids Surf. B 61, 2008, 1.

[427] W. Norde, J. Lyklema; Adv. Colloid Interface Sci. 179, 2012, 5.

[428] L.A. Currie; Anal. Chim. Acta 391, 1999, 127.

[429] A. Hubaux, G. Vos; Anal. Chem. 42, 1970, 849.

[430] K. Haberska, C. Vaz-Domínguez, A.L. De Lacey, M. Dagys, C.T. Reimann, S. Shleev;

Bioelectrochemistry 76, 2009, 34.

[431] A.M. Yates, S.J. Elvin, D.E. Williamson; J. Immunoass. Immunochem. 20, 1999, 31.

[432] R. Akter, B. Jeong, J.-S. Choi, Md.A. Rahman; Biosens. Bioelectron. 80, 2016, 123.

[433] D. Dan, X. Xiaoxing, W. Shengfu, Z. Aidong; Talanta 71, 2007, 1257. [434] S.Q. Hu, Z.Y. Wu, Y.M. Zhou, Z.X. Cao, G.L. Shen, R.Q. Yu; Anal. Chim. Acta 458, 2002,

297.

[435] T. Yin, W. Wei, L. Yang, X. Gao, Y. Gao; Sens. Actuators, B 117, 2006, 286.

[436] E. Arkan, R. Saber, Z. Karimi, M. Shamsipur; Anal. Chim. Acta 874, 2015, 66.

[437] M. Stobiecka, A. Chalupa, B. Dworakowska; Biosens. Bioelectron. 84, 2016, 37.

[438] M.C. Garnett; Adv. Drug Deliv. Rev. 53, 2001, 171.

[439] E. Brynda; „Methods for attachment of antibodies onto optical biosensors”, w: „Optical

Chemical Sensors”, F. Baldini (Eds), Springer, New York, 2006.

[440] P. Aisen, A. Leibman, J. Zweier; J. Biol. Chem. 253, 1978, 1930.

[441] J. Zhang, Y. Sun, B. Xu, H. Zhang, Y. Gao, H. Zhang, D. Song; Biosens. Bioelectron. 45,

2013, 230.

[442] E. Prusak-Sochaczewski, J.H.T. Luong; J. Anal. Chem. 23, 1990, 183.

[443] X. Le Guevel, N. Daum, M. Schneider; Nanotechnology 22, 2011, 275103.

[444] T. Yin, W. Wei, L. Yang, X. Gao, Y. Gao; Sens. Actuators, B 117, 2006, 286.

[445] C.-X. Lei, J. Wu, H. Wang, G.-L. Shen, R.-Q. Yu; Talanta 63, 2004, 469.

[446] Z. Liu, S. Huang, D.C. Jiang, B.H. Liu, J.L. Kong; Anal. Lett. 37, 2004, 2283.

[447] M.C. Powanda, F.B. Abeles, K.A. Bostian, J.P. Fowler, E.C. Hauer; Biochem. J. 178, 1979,

633.

[448] Y. Cheng, O. Zak, P. Aisen, S.C. Harrison, T. Walz; Cell 116, 2004, 565.

[449] J. Wall, P.J. Halbrooks, C. Vonrhein, M.A. Rould, S.J. Everse, A.B. Mason, S.K. Buchanan;

J. Biol. Chem. 281, 2006, 24934.

[450] A. Bhattacharya, S. Chatterjee, V. Khorwal, T.K. Mukherjee; Phys. Chem. Chem. Phys. 18,

2016, 5148.

[451] M. Mahmoudi, M.A. Shokrgozar, S. Sardari, M.K. Moghadam, H. Vali, S. Laurent, P. Stroeve;

Nanoscale 3, 2011, 1127.

Bibliografia

227

[452] J. Banker; Biochim. Biophys. Acta 1120, 1992, 123.

[453] I.P. Grudzinski, M. Bystrzejewski, M.A. Cywinska, A. Kosmider, M. Poplawska,

A. Cieszanowski, A. Ostrowska; J. Nanopart. Res. 15, 2013, 1835.

[454] J. Dubach, B.J. Gaffney, K. More, G.R. Eaton, S.S. Eaton; Biophys. J. 59, 1991, 1091.

[455] O.P. Ivakhnenko, D.K. Potter; Phys. Chem. Earth 29, 2004, 899D.

[456] F. Höök, M. Rodahl, P. Brzezinski, B. Kasemo; Langmuir 14, 1998, 729.

[457] E. Matysiak, A.M. Nowicka, B. Wagner, M. Donten; Electrochim. Acta 191, 2016, 586.

[458] A.J. Kariuki-Downard; Electroanal. 12, 2000, 1085.

[459] M. Damar, R. Hitami, J. Pison, J.M. Saveant; J. Am. Chem. Soc. 114, 1992, 5883.

[460] J. Lyskawa, D. Belanger; Chem. Mater. 18, 2006, 4755.

[461] J. Pinson, F. Podvorica; Chem. Soc. Rev. 34, 2005, 249.

[462] H. Uetsuka, D. Shin, N. Tokuda, K. Saeki, C.E. Nobel; Langmuir 23, 2007, 3466.

[463] A. Adenier, E. Cabet-Deliry, A. Chausse, S. Griveau, F. Mercier, J. Pinson, C. Vautrin-Ul;

Chem. Mater. 17, 2005, 491.

[464] J. Agullo, S. Canesi, F. Schaper, M. Morin, D. Belanger; Langmuir 28, 2012, 4889.

[465] P. Allongue, M. Delawar, B. Debat, O. Fageboume, R. Hitmi, J. Pinson, J.M. Saveat; J. Am.

Chem. Soc. 119, 1997, 201.

[466] A. Berisha, C. Combellas, F. Kanoufi, J. Pinson, S. Ustaze, F.J. Podvorica; Chem. Mater. 22,

2010, 2962.

[467] A.M. Nowicka, M. Fau, A. Kowalczyk, M. Strawski, Z. Stojek; Electrochim. Acta 126, 2014,

11.

[468] M. Fau, A. Kowalczyk, P. Olejnik, A.M. Nowicka; Anal. Chem. 83, 2011, 9281.

[469] A. Kowalczyk, M. Fau, A.M. Nowicka, Z. Stojek; Electroanal. 24, 2012, 2053.

[470] G.T. Hermanson; „Bioconjugate Techniques”, Academic Press is an imprint of Elsevier,

Amsterdam, 2013.

[471] D.H. Parry, M. Worwood, A. Jacobs; Br. Med. J. 1, 1975, 245.

Elektrograwimetryczna detekcja wybranych metaloprotein w ...

Documents