1 Alexandra Benachi, Jean-Marc Costa Hôpital Antoine Béclère. Clamart-France Laboratoire CERBA-France Diagnostic Prénatal Non Invasif sur sang maternel Diagnostic prénatal • Quels prélèvements? – Biopsie de trophoblaste (11SA) – Amniocentèse (15SA) – Sang fœtal • Quels risques? – Fausse-couche – Prématurité – Hémorragie – Infection 1% Fausse-couche Diagnostic prénatal • Comment diminuer le nombre de pertes fœtales – Réduire le risque du geste • Expérience de l’opérateur – Diminuer le nombre de gestes invasifs • Améliorer le dépistage – Développer des approches non invasives • Imagerie fœtale • Analyse du fœtus à partir d’un prélèvement maternel Diagnostic prénatal à partir du sang maternel Un « nouveau » concept L’ADN fœtal sérique ou plasmatique (ADN et ARN fœtal libres circulants) Cellules fœtales circulantes Cellules fœtales circulantes • Existence connue depuis 1893… • 1 à 2 /ml de sang maternel • Certaines persistent dans le sang ou les tissus maternels • Pas de culture possible • Analyse unicellulaire délicate • Isolement et enrichissement complexes Saker, Prenat Diagn 2009 NIPD Workflow : Circulating Fetal TrophoblaticCells isolated by ISET Advantages :reliable, versatile . 1 to 3 CFTC per mL in all mother tested so far (over 135 mothers) . 100 % sensitivity, 100 % specificity : blind analysis of more than 1000 single cells microdissectedfrom ISET filters in the SMA/CF clinical validation (Mouawia et al, submitted) . CFTC present as early as 5 weeks of gestation (Mouawiaet al, submitted) . Pure fetal DNA to test for different genetic or chromosomal conditions Filtration Mother blood collection lysis filter staining microdissection WGA Partner blood or saliva collection DNA extraction and quantification (OD) Genotyping STR, SNP Identification of fetal cells Recessive diseases spinal motor atrophy cystic fibrosis PCR and Sequencing (Béroud et al 2003, Saker 2006) Trisomy 21, 18, 13 CGH Multiallelic, digital PCR Paternity tests Gender Genotyping PCR 6 Pr Patricia Paterlini, 2012
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1
Alexandra Benachi, Jean-Marc Costa
Hôpital Antoine Béclère. Clamart-France
Laboratoire CERBA-France
Diagnostic Prénatal Non Invasif
sur sang maternel
Diagnostic prénatal
• Quels prélèvements?
– Biopsie de trophoblaste (11SA)
– Amniocentèse (15SA)
– Sang fœtal
• Quels risques?
– Fausse-couche
– Prématurité
– Hémorragie
– Infection
1% Fausse-couche
Diagnostic prénatal
• Comment diminuer le nombre de pertes fœtales
– Réduire le risque du geste
• Expérience de l’opérateur
– Diminuer le nombre de gestes invasifs
• Améliorer le dépistage
– Développer des approches non invasives
• Imagerie fœtale
• Analyse du fœtus à partir d’un prélèvement maternel
Diagnostic prénatal à partir du sang
maternel
Un « nouveau » concept
L’ADN fœtal sérique ou plasmatique
(ADN et ARN fœtal libres circulants)
Cellules fœtales circulantes
Cellules fœtales circulantes
• Existence connue depuis 1893…
• 1 à 2 /ml de sang maternel
• Certaines persistent dans le sang ou
les tissus maternels
• Pas de culture possible
• Analyse unicellulaire délicate
• Isolement et enrichissement complexes
Saker, Prenat Diagn 2009
NIPD Workflow : Circulating Fetal Trophoblatic Cells isolated by ISET
Advantages :reliable, versatile
. 1 to 3 CFTC per mL in all mother tested so far (over 135 mothers)
. 100 % sensitivity, 100 % specificity : blind analysis of more than 1000 single cells microdissected from ISET filters in the SMA/CF clinical
validation (Mouawia et al, submitted)
. CFTC present as early as 5 weeks of gestation (Mouawia et al, submitted)
. Pure fetal DNA to test for different genetic or chromosomal conditions
Filtration
Mother blood
collection
lysisfilter staining microdissection
WGA
Partner blood or saliva collection
DNA extraction and
quantification (OD)
Genotyping
STR, SNPIdentification of fetal cells
Recessive diseases
spinal motor atrophy
cystic fibrosis
PCR and Sequencing
(Béroud et al 2003, Saker
2006)
Trisomy 21, 18, 13
CGH
Multiallelic, digital PCR
Paternity tests
Gender
Genotyping
PCR
6 Pr Patricia Paterlini, 2012
2
Diagnostic prénatal non invasif
ADN fœtal libre circulant
Lancet 1997;350:485-7.
Détection de séquences ADN dérivées du
chromosome Y : 80 % (24/30)
ADN circulant
• Source– Cellules fœtales circulantes (1/ml)
– ADN circulant (16 Geq/ml au 1er T) provenant des villosités choriales
• Plus de 99% des molécules circulent sous forme de fragment < 313bp
• Représente 5% de l’ADN libre dans la circulation maternelle
ADN circulant
• Détectable dès la 5e semaine de grossesse
• Concentration augmente au cours de la grossesse
• Disparition rapide (< 24h) après l’accouchement
• Ne persiste pas dans l’organisme maternel
ADN fœtal circulant et grossesse
ADN circulant-Indications
• Analyses restreintes aux séquences ADN absentes ou différentes du génome maternel
– Sexe fœtal
– Génotypage Rhésus D du fœtus
• Pathologies dominantes de novo
– Achondroplasie
• Trisomie 21 et autres anomalies chromosomiques
Détermination du sexe fœtal
• Maladies génétiques liées à l’X– Evite un geste invasif (BT) chez les patientes
conductrices qui portent un fœtus de sexe féminin (ne présentant aucun risque)
• Hyperplasie congénitales des surrénales (Déficit en 21-hydroxylase)
– Eviter le recours à un traitement corticoïde chez les patientes qui portent un foetus de sexe masculin (traitement inutile)
Taux >1/250: 4% (mais environ 15% de ces patientes décline le
prélèvement)
Prélèvements effectués: 28199
3,8 % de faux positifs
Fausse-couche théoriques: 140-280
VPP du dépistage 1/20
Trisomie 21: 711 (2,5%)
Autres anomalies que T 21, 13 et 18: 208 (0,7%)
27418 (97%) gestes invasifs évités
Dépistage de la T21
Rapport ABM, 2011
Dépistage ou Diagnostic Non Invasif ?
Dépistage
Test offert à une
population sans risque
connu
Diagnostic
Test offert à une
population avec des
symptômes ou à risque
Ce n’est pas la précision (sensibilité et spécificité) du
test qui en fait un test de dépistage ou de diagnostic
En dépistage on privilégie la sensibilité (identifier
correctement ceux qui ont la maladie) et en diagnostic la
spécificité (identifier ceux qui n’ont pas la maladie)
Dépistage ou Diagnostic?
Tout dépend
-Du risque accepté
-De la prévalence de l’anomalie dans la population
étudiée
-De la nécessité d’un test de contrôle
Une
spécificité à
99% = 1 faux
positif /100
Prévalence de la
T21 dans les
populations
générales=1/400
et à risque 1/40
Actuellement une
amniocentèse est
indispensable
DPNI et T21
– Test supplémentaire améliorant l’évaluation du risque
– En remplacement de l’actuel test de dépistage
– En remplacement de l’actuel test diagnostic
– En remplacement des deux
– Test intermédiaire entre évaluation du risque et diagnostic invasif pour les patientes à haut risque
Avec une sensibilité de 100%, spécificité à 99,7%, et une
prévalence à 1/500, la VPP d’un test sera environ de 40%
Echographie ou DPNI?
+Echographie + DPNI
L’échographie T1 est indispensable
Echographie
- Datation
- Multiples
- Morphologie - Col
- Placenta
- Doppler
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La CGH permet d’identifier
1,6 % d’anomalies chez des
fœtus avec caryotypes et
échographie normaux
Ne seront pas détectées
• Les anomalies
chromosomiques sans
manifestation
échographiques
– 0,7 % d’anomalies autres
que T21,18,13
• Les triploïdies
• Certaines mosaïques
• Microdélétions et
duplications?
• Les patientes à risque de PE
Seront détectées
• Les anomalies confinées
au placenta
• Les mosaïques
maternelles
Wapner R, AJOG, 2012
Risque > 1/250 et CN< 95eP
BT ou Amnio
Résultat
Suivi
DPNI
Pas de
résultat
Négatif
Suivi
Résultat
positif
Anomalies
échographiques
Population des 2-4
%: quel risque?
2-4%
As a result of the initial experience with NIPT,
Obstetrics and Gynecology of Atlanta now offers
NIPT as a first-line screening test to patients with
singleton pregnancies of at least 10weeks
gestational age. Patients are scheduled for a
follow-up visit 2weeks after their NIPT to review
their results and receive counseling. If at the 2-
week follow-up visit an NIPT result is not available,
patients are advised to undergo conventional FTS.
Prenat Diagn 2013
Paris, le 29 janvier 2013Paris, le 29 janvier 2013Paris, le 29 janvier 2013Paris, le 29 janvier 2013
Evaluation des coûts
Song K, J Mater Fetal Neonat Med, 2013
-99%
-95%
8
Projet SEHDA*
*SEquençage à Haut Débit et Aneuploïdies (projet SE HDA)
Titre long : Diagnostic non invasif des aneuploïdies fœtales chez les patientes à haut risque par analyse de l’ADN fœtal circulant dans le plasma maternel au cours de la grossesse
• 2 fœtus porteur du Syndrome de
Di Georges
Jensen J, Clin Chem, 2012
DPNI et del 22q11.2
• Déterminer si le fœtus a hérité
de la mutation maternelle sur le
chromosome X
• Relative mutation dosage
approach: Concentration de
l’allèle mutante est sur-exprimée
dans le plasma des patientes
hétérozygotes
– 7 patientes
Chiu RWK, Blood, 2011
DPNI et HémophilieGénome fœtal
• Reconstruction de tout le génome fœtal
• En 2 ans amélioration majeure de la technique
Lo YD , Sc Transl Med, 2010,
Kitzmann, , Sc Transl Med, 2012
• Tant qu’un prélèvement de contrôle est nécessaire ne sera
pas un test diagnostic
• Non Invasive Prenatal Testing (NIPT)
• Pour les patientes à risque (1/250 ou 1/1000 ?)
• Pourrait remplacer les marqueurs sériques
– En détectant plus de T21
– Si possible avant 13SA
– En générant 90% en moins de prélèvements inutiles car moins de
faux positif
– Mais au prix d’une perte d’information et d’un coût élevé
– Facile à expliquer (pas certain…)
• Difficultés financières
– Dépistage T1 détecte 86% des T21, on va passer à 99,5% mais le
coût de chaque cas dépisté en plus risque d’excèder le budget de la
plupart des systèmes de santé
• Difficultés logistiques
• Etudes cliniques prospectives nécessaires
• Nécessité de mettre en place ce test en France afin d’éviter