1 Université Ferhat Abbas Sétif -1 Année Universitaire : 2019-2020 Faculté des sciences de la nature et de la vie Module : Méthodes d’Analyses Département de Biologie et Ecologie végétales Biotechnologie et Valorisation des Plantes - Master 1 (Deuxième partie )Techniques Chromatographiques Généralités 1. Définition - La chromatographie est une méthode qui permet de séparer les composants d'un mélange à ana- lyser grâce à leur migration différentielle le long d'un dispositif séparateur. - Dispositif séparateur a une forme géométrique qui peut varier suivant les conditions de mise en œuvre du procédé analytique. - Ce dispositif séparateur est constitué de deux phase, l'une granulaire est la phase fixe, l'autre (li- quide ou gazeuse) est la phase mobile, dans laquelle baignent les granules de la phase fixe. 2. Principe physico-chimique général de séparation - La chromatographie utilise toutes les formes possibles d'interactions réver- sibles entre les molécules de la phase fixe et celles du soluté. - La séparation des constituants d'un mélange basée sur les interactions entre trois produits lors d'un processus dynamique : le composant (analytes), la phase mobile (le solvant) et la phase sta- tionnaire (cellulose, silice, alumine, etc...).
14
Embed
(Deuxième partie )Techniques Chromatographiques Généralités
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
1
Université Ferhat Abbas Sétif -1 Année Universitaire : 2019-2020
Faculté des sciences de la nature et de la vie Module : Méthodes d’Analyses
Département de Biologie et Ecologie végétales Biotechnologie et Valorisation des Plantes - Master 1
(Deuxième partie )Techniques Chromatographiques
Généralités
1. Définition
- La chromatographie est une méthode qui permet de séparer les composants d'un mélange à ana-
lyser grâce à leur migration différentielle le long d'un dispositif séparateur.
- Dispositif séparateur a une forme géométrique qui peut varier suivant les conditions de mise en
œuvre du procédé analytique.
- Ce dispositif séparateur est constitué de deux phase, l'une granulaire est la phase fixe, l'autre (li-
quide ou gazeuse) est la phase mobile, dans laquelle baignent les granules de la phase fixe.
2. Principe physico-chimique général de séparation
- La chromatographie utilise toutes les
formes possibles d'interactions réver-
sibles entre les molécules de la phase
fixe et celles du soluté.
- La séparation des constituants d'un mélange basée sur les interactions entre trois produits lors
d'un processus dynamique : le composant (analytes), la phase mobile (le solvant) et la phase sta-
tionnaire (cellulose, silice, alumine, etc...).
2
- L’analyte en présence d'une phase liquide, va avoir tendance à se dissoudre partiellement ou
totalement (dissolution) et en présence d'une phase solide à s'adsorber.
3. Paramètres d’une analyse chromatographique
3.1. Phase stationnaire ou fixe
La phase stationnaire est soit un solide, soit un liquide (fixé sur un support solide).
(Peut-être un solide finement pulvérisé, ou un liquide immobilisé sur un support solide poreux inerte le
support n’intervient pas dans le phénomène de séparation).
3.1.1. Propriétés de la phase stationnaire (classification)
La phase fixe est douée de propriétés qui détermine le mécanisme de séparation :
Adsorption chromatographie d'adsorption la phase stationnaire est un solide.
Partage chromatographie de partage la phase stationnaire est un liquide non miscible avec la
phase mobile.
Echange d’ions chromatographie d'échange d'ions la phase stationnaire porte des groupes fonc-
tionnels acides ou basiques, destinée à séparer des composés ionisés.
Exclusion stérique la chromatographie d'exclusion la phase stationnaire (poreuse) se comporte
comme un tamis et sépare les composés en fonction de leur taille.
Affinité chromatographie d’affinité cas particulier de la chromatographie d’adsorption.
3.1.2. Géométrie de la phase stationnaire (classification)
La phase stationnaire immobilisée de 2 manières différentes :
Soit étendue sur une surface plane chromatographie de surface ou planaire :
3
La chromatographie sur papier.
La chromatographie sur couche mince (CCM)
Soit à l'intérieur d'une colonne chromatographie sur colonne.
La phase stationnaire en suspension dans un solvant (tampon) maintenue dans une colonne.
Introduction en tête de colonne de l'échantillon à analyser (au moyen d'un injecteur).
Détection des solutés (grâce à un détecteur).
Collection de fractions (collecteur de fractions).
« La chromatographie sur colonne peut être à basse pression (chromatographie classique sur colonne)
ou haute pression (H.P.L.C) »
3.2. Phase mobile
La phase mobile est un fluide (liquide ou gaz) qui se déplace en contact de la phase fixe, soit encore un
fluide supercritique elle entraîne les divers analytes fixés par la phase fixe.
La combinaison de ces possibilités conduit à diverses possibilités :
Chromatographie liquide—solide (LSC)
Chromatographie liquide—liquide (LLC)
Chromatographie gaz—solide (GSC ou GC)
Chromatographie gaz—liquide (GLC ou GC)
Chromatographie supercritique (SFC)
4
Chromatographie classique sur colonne
1. Introduction
La chromatographie sur colonne est une méthode préparative qui permet de séparer et d'isoler les
constituants d'un mélange. Cette technique est fondée principalement sur des phénomènes d'adsorption et
permet de séparer pratiquement tous les mélanges possibles.
2. Description et principe
La phase solide (alumine , gel de silice, polyamide etc…) est déposée dans une colonne de longueur et de
section variables; l'échantillon est déposé en haut de la colonne et la séparation des composants résulte de
l'écoulement continu d'un éluant, traversant la colonne par gravité ou sous l'effet d'une faible pression. On
peut utiliser comme éluant un solvant unique ou un gradient croissant de polarité.
Les molécules sont éluées vers le bas à des vitesses variables selon leur affinité pour l'adsorbant et leur
solubilité dans l'éluant.
3. Facteurs dont dépend la séparation
Quatre facteurs interviennent:
l'adsorbant
l'éluant
la dimension de la colonne
la vitesse d'élution
Adsorbant
Une grande surface spécifique de l’adsorbant est naturellement souhaitable car elle permet d’obtenir de
meilleures séparations tout en diminuant la longueur des colonnes .
L’adsorbant doit être pratiquement insoluble dans les solvants utilisés et inerte vis-à-vis des solutés.
l'alumine et le gel de silice sont les adsorbants les plus utilisées .
5
La quantité d'adsorbant dépend de la difficulté de la séparation et de la masse d'échantillon.On peut
considérer que pour chaque gramme d'échantillon, il faut 30 à 50 g d'adsorbant si la polarité des composants
à séparer est très différente et jusqu'à 200 g si la séparation est difficile.
Eluant
L'éluant est en général un mélange de deux solvants. Au début de l'élution, on commence par le solvant le
moins polaire qui entraîne les substances les moins retenues par l'adsorbant (les moins polaires). Ensuite on
fait varier la composition de l'éluant en additionnant graduellement le solvant le plus polaire. Ainsi les
composés les plus polaires, retenus sur l'adsorbant, ne migreront que graduellement vers le bas de la
colonne.
Dimension de la colonne
Les colonnes classiques ont à leur base une plaque de verre fritté ou de porcelaine qui permet l'écoulement
libre de l'éluant tout en empêchant le passage de l'adsorbant. On peut aussi utiliser une burette, au fond de
laquelle on place du coton et du sable.
La quantité d'adsorbant est telle qu'il occupe une hauteur égale à environ 10 fois le diamètre de la colonne. Il
faut également prévoir un espace de 10 cm environ au-dessus de l'adsorbant pour placer le solvant.
Vitesse d'élution
Elle doit être la plus constante possible. Il faut qu'elle soit suffisamment lente pour que le soluté soit au plus
près de l'équilibre entre les phases liquide et adsorbée. Elle ne doit pas être trop lente car sinon les
substances diffusent dans le solvant et on obtient des bandes de plus en plus larges et une séparation
médiocre , il faut travavailler sous faible pression dans ce cas.
4. Remplissage de la colonne
le remplissage doit être le plus homogène possible sans bulles d'air. Les surfaces inférieure et supérieure de
l'adsorbant doivent être parfaitement horizontales. La colonne étant verticale, le remplissage peut être réalisé
selon deux méthodes au choix :
6
Remplissage par voie humide
Dans un bécher, on mélange l'adsorbant avec le moins polaire des solvants utilisés jusqu’à obtenir une
bouillie suffisamment fluide pour couler facilement.
A l'aide d'un entonnoir, on verse suffisamment de bouillie pour que l'adsorbant qui se dépose
progressivement forme une couche d'environ 2 cm. on fait couler lentement le solvant et on poursuit
l'addition de la bouillie homogénéisée par portions successives. Quand tout l'adsorbant est introduit, on
laisse décanter jusqu'à ce que le liquide qui surnage soit limpide.
Pendant l'opération,on doit veiller à ce que le niveau de solvant soit toujours supérieur à celui de l'adsorbant.
on continue à faire couler le solvant le moins polaire afin de bien tasser la colonne.
Remplissage par voie sèche
La colonne est remplie au deux tiers par le moins polaire des deux solvants et l'adsorbant en poudre est
ajouté en portions successives dans la colonne à l'aide d'un entonnoir; pendant l'addition, on frappe
continuellement sur les parois pour obtenir un tassement maximal. Quand la première portion forme une
couche d'environ 2 cm, on fait couler lentement le solvant afin de bien tasser la colonne.
5. Dépôt des produits à analyser
Ils doivent former une zone cylindrique étroite dans le haut de la colonne.
Un solide sera dissous dans le minimum du moins polaire des deux solvants .
On ajuste d'abord le niveau de solvant pour qu'il soit juste au-dessus de celui de l'adsorbant puis , à l'aide
d'une pipette, on fait couler l'échantillon au sommet de la colonne de façon uniforme sur toute la surface de
la colonne sans la déformer. Si nécessaire, on ajuste à nouveau, comme précédemment, le niveau de liquide
de la colonne : l'échantillon est ainsi adsorbé uniformément au sommet de la colonne. On peut placer un
verre fritté ou une rondelle de papier filtre au-dessus de l'adsorbant pour prévenir une remise en suspension
de l'adsorbant.
7
6. Elution
l'élution doit être continue, on peut alimenter la colonne en continu à l'aide d'une ampoule de coulée ou bien
ajouter manuellement l'éluant. Veiller à ce que la surface de l'adsorbant ne doit jamais être au contact de l'air
car une colonne laissée à sec se détériore: la séparation sera vouée à l'échec à cause des fissures .
Echantillon
Colonne remplie d’adsorbant
Verre frité
Schéma d’une colonne classique chromatographique
La chromatographie sur colonne présente plusieurs inconvénients :
Elle nécessite une grande quantité d'éluant.
La durée de l'élution est en général très grande.
La détection des composés exige une attention constante.
Il est indispensable de coupler cette chromatographie avec d'autres méthodes de façon à pouvoir
détecter les constituants du mélange.
Les paramètres influençant la séparation sont :
Le diamètre et la hauteur de la colonne.
La quantité de la phase stationnaire et sa granulométrie.
Le débit de l’éluant et sa polarité.
8
Chromatographie liquide haute performance CLHP (HPLC en anglais)
1. Introduction
La chromatographie liquide haute performance est une technique instrumentale qui permet de séparer les
composants d’un mélange non volatile, de polarité élevée afin de les identifier et les quantifier. Elle met en
œuvre, selon la nature de la phase stationnaire, des phénomènes de partage, d’adsorption, d’échange d’ions
ou d’exclusion.
2. Appareillage
Un appareil CLHP (Fig.1 ) comporte différents modules: un réservoir contenant la phase mobile, un système
de pompage, un injecteur, une colonne, un détecteur à travers lesquels un liquide entraîne les substances
d’un mélange à séparer .
Fig.1 Les composants d’un chromatographe liquide à haute performance
Réservoirs de solvant
9
Réservoir de solvants
Pour l’éluant on emploi un vase clos pour éviter l’évaporation. Le solvant utilisé doit nécessaire-
ment :
• Maintenir la stabilité de la colonne
• Etre compatible avec le détecteur
• Solubiliser suffisamment l’échantillon et ne pas gêner sa récupération.
Il est recommandé de toujours employer des solvants traités spécifiquement pour CLHP. Ils doivent
être dégazé et filtré avant usage.
Dispositif de dégazage
Tout solvant en contact avec l’atmosphère va dissoudre des gaz (dont l’oxygène) jusqu’à atteindre le point
d’équilibre entre les deux phases. Les gaz, ainsi dissous, sont susceptibles de perturber le mélange de deux
solvants en générant, à haute pression, des microbulles qui peuvent perturber l’analyse (rétention et/ou
détection). En outre, la présence d’oxygène peut entrainer une oxydation des capillaires métalliques et de la
phase stationnaire de la colonne.
Il est donc important en chromatographie de s’assurer que les solvants ne contiennent plus (ou peu) de gaz
dissous au moment de leur mélange pour éviter l’apparition de microbulles. Pour cela deux solutions :
• l’appareil est équipé d’un dégazeur en ligne sous vide. Le dégazeur est généralement placé
entre les bouteilles de solvants et les pompes.
• Par barbotage ou bain à ultrasons. Le barbotage sert à remplacer les gaz dissous par un gaz
inerte pour éviter l’oxydation, tandis que le bain à ultrasons permet la volatilisation des gaz
dissous.
Pompe
lle est muni d'un système de gradient permettant d'effectuer une programmation de la nature du solvant. Elle
permet de travailler:
• en mode isocratique, c'est-à-dire avec 100% d'un même éluant tout au long de l'analyse.