i CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -SENACYT- FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -FONACYT- FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA-USAC- INFORME FINAL EVALUACIÓN DE DAÑO PRIMARIO AL ADN, POR ENSAYO COMETA EN CÉLULAS SANGUÍNEAS DE RATAS EXPUESTAS A PIRETROIDES CON DIESEL COMO DISOLVENTE, QUE SE UTILIZAN PARA CONTROL DE VECTORES EN GUATEMALA. PROYECTO FODECYT No. 21-2010 AMARILLIS SARAVIA GÓMEZ Ph.D. Investigador Principal GUATEMALA, ABRIL DE 2014
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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -CONCYT-
SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -SENACYT-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -FONACYT-
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA
UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA-USAC-
INFORME FINAL
EVALUACIÓN DE DAÑO PRIMARIO AL ADN, POR ENSAYO COMETA EN
CÉLULAS SANGUÍNEAS DE RATAS EXPUESTAS A PIRETROIDES CON
DIESEL COMO DISOLVENTE, QUE SE UTILIZAN PARA CONTROL DE
VECTORES EN GUATEMALA.
PROYECTO FODECYT No. 21-2010
AMARILLIS SARAVIA GÓMEZ Ph.D.
Investigador Principal
GUATEMALA, ABRIL DE 2014
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AGRADECIMIENTOS:
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo
Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por la Secretaría Nacional de
Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -
CONCYT-
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OTROS AGRADECIMIENTOS:
Adicionalmente se agradece a la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la
Universidad de San Carlos de Guatemala.
Biografía académica de los autores:
Amarillis Saravia Gómez Ph.D.
Química Farmacéutica, Doctorado en Farmacia con énfasis en Farmacología de la
Universidad de Clermont-Ferrad, Francia, Internado de Farmacia Hospitalaria en Hospital
de Vichy. Francia. Catedrática y Jefa de departamento de Farmacología y Fisiología y
Directora del Bioterio desde 1980 a la fecha, cuenta con más de 60 publicaciones nacionales
e internacionales, es miembro activa en más de 20 instancias académicas y científicas
nacionales e internacionales, asesora y revisora de más de 60 tesis ad gradum, expositora en
diversos foros, congresos y ponencias internacionales. Medalla de investigadora
internacional Toledo España.
Lic. Rodrigo Vargas
Químico Farmacéutico graduado de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la
Universidad de San Carlos de Guatemala, con estudios de maestría en Biotecnología,
especialización en Nanotecnología en el 2009 y Biología Molecular y Genética en el 2013,
así como capacitaciones en procedimientos experimentales en ratas y ratones, por la
asociación chilena de animales de laboratorio en 2012, cuenta con más de ocho
investigaciones realizadas con fondos concursables, participando como investigador
principal y asociado, recibiendo en 2010 el reconocimiento a la investigación relevante
como investigador principal por la Dirección General de Investigación, USAC. Catedrático
en la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad Mariano Gálvez, cuenta con dos
publicaciones internacionales y varias nacionales.
Licda. Dulce Saldaña
Química Farmacéutica graduada de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la
Universidad de San Carlos de Guatemala en 2007, Tiene una especialización en
Toxicología Experimental y Manejo de Animales de Laboratorio en la Universidad de la
Habana, 2009. Investigadora del Centro de Información y Asesoría Toxicológica (CIAT) en
2007, y del Herbario de la Universidad de San Carlos de Guatemala (USCG-CECON) en
2007, Becaria de la Facultad Latinoamericana de Ciencias Sociales (FLACSO) en 2008.
Catedrática Titular en la Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud de la Universidad
Mariano Gálvez desde 2010. Ha participado como investigadora principal y asociada en
proyectos de cofinanciamiento. Cuenta con publicaciones nacionales e internacionales, entre
las que destaca “Plantas Tóxicas de Guatemala” publicada por el Instituto Nacional de
Biodiversidad de Costa Rica (INBio) 2010.
El equipo de investigación agradece muy especialmente la participación y apoyo
incondicional del Br. Cristian López, quien funge como técnico de bioterio y auxiliar de
investigación en el Bioterio de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, USAC.
También agradece al M.Sc. Gerardo Arroyo Del Departamento de Citohistología de la
escuela de Química Biológica. Y al Departamento de Patología de la Facultad de
Veterinaria y Zootecnia, por su apoyo durante la fase experimental del presente trabajo de
Selección de especie: Al comienzo del estudio la variación de pesos entre los animales no
excedió del ± 20 % de la media.
Número y sexo: 5 animales (machos) para cada grupo de prueba haciendo un total de 20
animales. Se utilizó un grupo satélite de 4 animales (machos) con una alta concentración, no se
observó reversibilidad, y una persistencia de los efectos.
Acondicionamiento y alimentación (antes y después de la exposición): la temperatura de
la habitación en la que se encontraron los animales fue de 22º C (±3º C) y la humedad relativa
fue del 50 al 60%. La luz es artificial la secuencia de 12 horas luz, 12 horas oscuridad. Para la
alimentación, la dieta convencional se utilizó con agua y comida ilimitada. Los animales se
encontraban en grupos por sexo; no interfiriendo con la observación clara de cada animal.
Equipamiento: los animales fueron sometidos en un equipo de inhalación diseñado con
flujo dinámico de aire de 12 a 15 cambios por hora y se aseguró el contenido de oxígeno
adecuado y una exposición distribuida adecuadamente en la atmósfera. La cámara mantuvo una
ligera presión negativa interna que previno que la sustancia se libere en el área circundante. Se
utilizó un sistema de inhalación dinámico con un control analítico de concentración.
Procedimiento: ambos grupos fueron expuestos a la sustancia prueba a una concentración
de 1:65, 3:65, 0.5:65 de deltametrina: diesel y 1:65 de deltametrina: aceite mineral durante 28
días por 6 horas diarias. Se observaron continuamente los efectos presentados por los animales:
comportamiento, peso, ingesta de la dieta, efectos (persistencia, disminución o aumento de los
mismos), posteriormente se realizó la necropsia y el análisis histopatológico.
I.4.5.3. Daño primario al DNA por Ensayo Cometa Mediante la técnica descrita por
Collins, A.R., et al en 1997 (Dhawan, 2006)
Se obtuvo la muestra de sangre. Se preparó el microgel: los linfocitos son colocados en un
portaobjetos con una solución de agarosa 0.5-1%. Se produce una lisis celular con Tritón X-
100, y NaCl 2.5M.
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El desenrrollamiento del DNA se realiza por incubación alcalina al supercoloide de DNA
con 0.3 M NaOH, 10 mM EDTA y posteriormente se realiza una electroforesis a 0.8V/cm por
30 minutos. Se neutralizaron todas las muestras y se tiñeron con Bromuro de Etidio EtBr.
Observándose en el microscópico y realizando el conteo individual de las células.
Registrándose fotográficamente como constancia de realización del análisis.
I.4.6. Tratamiento estadístico:
Los resultados observados de los ensayos de toxicidad inhalatoria aguda y subaguda
fueron registrados en el programa Epidat versión 4.6
Los resultados obtenidos del ensayo cometa fueron sometidos a un análisis mediante el
software Casp 1.2.2
Se utilizó estadística descriptiva, chi-cuadrado para determinar la asociación entre los
efectos genotóxicos y la concentración del plaguicida.
Se realizaron correlaciones tanto crudas como parciales.
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PARTE II
II.1. Marco Teórico
Control de enfermedades transmitidas por vectores: uso de plaguicidas en ambientes
domiciliares
Los agentes patógenos transmitidos por vectores o que tienen huéspedes intermediarios se
encuentran entre las principales causas de enfermedad y muerte en muchos países tropicales y
subtropicales. Esas enfermedades, entre las que se incluyen la enfermedad de Chagas, el
dengue, la leishmaniasis, la filariasis linfática y la malaria, son un importante obstáculo al
desarrollo económico y social (WHOPES, 2001).
La lucha contra vectores desempeña un papel fundamental en la prevención y el control
de las principales enfermedades transmitidas por vectores, como la enfermedad de Chagas, el
dengue y la malaria, y a menudo constituye la primera línea de defensa ante las epidemias de
estas enfermedades (WHOPES, 2001).
El control de vectores es un componente importante en los programas de control de
diversas enfermedades ocasionadas por vectores. Esta implementación incluye objetivos,
métodos disponibles de sitios específicos, predicción en viabilidad técnica y operacional,
recursos e infraestructura. Estos deben ser aplicados de acuerdo con los principios integrados
del contexto local, racionalizando el uso de los métodos y de los recursos de control del vector
y acentúa la implicación de las comunidades (WHO, 2006).
Los plaguicidas utilizados para fines de salud pública son inocuos, costo eficaces y
operacionalmente aceptables. Los plaguicidas con los que se cuenta en el mercado de hoy,
deben de seguir una serie de requisitos para ser aceptados y utilizados para el programa de
control de vectores. Éstos requieren la selección adecuada; tanto el uso de ciertos principios
activos como las formulaciones, deben ser las más apropiados para la plaga (en cuanto a
resistencia del vector) y la modalidad de aplicación a las que estén destinados, garantizando la
seguridad de la población (WHOPES, 2002; WHO, 2010).
El control de vectores en Guatemala es importante ya que forma parte de las estrategias
de la salud preventiva. Para este programa se utilizan distintos plaguicidas, siendo el más
importante la deltametrina, un piretroide que se utiliza para el rociamiento de interiores, ya que
es un insecticida de acción residual (Vargas, 2009).
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Piretroides:
Los piretroides son un grupo de pesticidas artificiales desarrollados para controlar
preponderantemente las poblaciones de insectos plaga. La obtención de piretrinas sintéticas
(denominadas piretroides, es decir, “semejantes a piretrinas”), se remonta a la fabricación de la
Aletrina en 1949. Desde ese entonces su uso se ha ido ampliando en la medida en que los
demás pesticidas eran acusados de alta residualidad, bioacumulación y carcinogénesis
(organoclorados) y por otra parte el alto efecto tóxico en organismos no plaga y en mamíferos
(carbamatos y organofosforados) (INCAP, Hayes, 1995).
Los piretroides, en cambio, no poseen estas desventajas y debido a las bajas cantidades
de producto necesarias para combatir las plagas su costo operativo es más que conveniente.
Debido a las ventajas antes señaladas, los piretroides son actualmente el plan con mayor
ventaja en el combate y control de vectores. Sus cualidades en este último campo, son su alto
poder de volteo y su baja acción en el hombre. Su acción, como casi todos los insecticidas, es a
nivel sistema nervioso, generando una alteración de la transmisión del impulso nervioso
(INCAP, Hayes, 1995).
Al contrario de los organoclorados, los carbamatos y los organofosforados, no existen
muchos casos de resistencia de insectos a piretroides. Sin embargo, como con todos los
insecticidas, recomiendan el uso moderado de los mismos alternando los distintos tipos de
insecticidas y usando las cantidades mínimas necesarias (INCAP, Hayes, 1995).
Los signos y síntomas de la toxicidad de los piretroides están divididos en dos grupos:
tipo I (conducta agresiva, hipersensibilidad por estímulos externos, temblores del cuerpo
completo, postración) que corresponden para piretroides como la aletrina, bioaletrina,
resmetrina, fenotrina. El grupo tipo II (patadas, salivación profusa, temblores fuertes,
coreoatetosis1, convulsiones clónicas) para piretroides como la deltametrina, fenvalerato,
cipermetrina, cihalotrina. Siendo el mismo mecanismo de acción en mamíferos como en
insectos, provocando una disrupción en el voltaje de los canales de sodio; los piretroides se
enlazan a la subunidad alfa de los canales de sodio y enlentecen la activación (apertura), como
también la tasa de inactivación (cierre) de los canales de sodio, dejando un estado
hiperexcitable de forma estable. Los canales de sodio se abren y son potencialmente
hiperpolarizados, y se mantienen abiertos durante más tiempo, permitiendo que más iones sodio
crucen y despolaricen la membrana neuronal (Curtis, 2008).
1Síndrome que se caracteriza por la presencia de movimientos incontrolados e involuntarios en
varias zonas corporales, con carácter de atetosis (posturas retorcidas, proximales y frecuentemente alternantes) y de corea (movimientos involuntarios, breves y finalidad aparente, especialmente de la cara y las extremidades distales). Está provocado por un trastorno de las vías motoras extrapiramidales.
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Deltametrina
De acuerdo a la ficha técnica la deltametrina corresponde el nombre químico (IUPAC)
de: S-alpha-ciano-3-fenoxibenzil (1R)-cis-3-(2,2-dibromovinil)-2,2-dimetilciclopropanocarboxi
lato. Su fórmula química es C22H19Br2NO3 de masa molecular de 505.2g. N° CAS 52918-
63-5. En caso de incendio se desprende humos (o gases) tóxicos e irritantes. Deltametrina
es un piretroide compuesta de un isómero individual de 8 estereoisómeros preparados
selectivamente por la esterificación de ácido 2,2-dimetil-3-ciclopropanocarboxílico con -
alcohol o -alfa-ciano-3-fenoxibencil o por recristalización selectiva de los ésteres racémicos
obtenidos por esterificación del ácido con el racémico o-alcohol.
Es uno de los insecticidas más populares y ampliamente utilizados en el mundo y se han
convertido en muy popular con los operadores de control de plagas y de los individuos en los
Estados Unidos. Este material es un miembro de una de las clases más seguras de plaguicidas:
los piretroides sintéticos. Este pesticida es altamente tóxico para los organismos acuáticos,
especialmente el pescado, y por lo tanto se debe utilizar con extrema precaución en torno al
agua. Aunque generalmente se considera seguro para usar alrededor de los humanos, todavía es
neurotóxico para los seres humanos. Este es capaz de pasar de la piel de una mujer a través de
su sangre y en la leche materna.
Hay muchos usos para deltametrina, que van desde los usos agrícolas para el control de
plagas en casa. Ha sido fundamental en la prevención de la propagación de enfermedades
transmitidas por los perros de los sitios infestados con garrapatas, roedores y otros animales de
madriguera. Es útil en la eliminación y prevención de una amplia variedad de plagas
domésticas, especialmente arañas, pulgas, garrapatas, hormigas carpinteras, abejas de
carpintero, cucarachas y chinches. Es también uno de los ingredientes principales en tiza
hormiga.
Como se mencionó anteriormente, este pesticida, juega un papel clave en el control de
vectores, y se utiliza en la fabricación de mosquiteros insecticidas de larga duración. Se utiliza
como uno de una batería de insecticidas piretroides en el control de los vectores de la malaria,
en particular Anopheles gambiae, y siendo a la vez el insecticida piretroide más empleado, se
puede utilizar en conjunto con, o como una alternativa a permetrina, cipermetrina y otros
organofosforados basado insecticidas, como el malatión. La resistencia a la deltametrina es
ahora muy extendida y amenaza el éxito de los programas de control de vectores en todo el
mundo. La resistencia se ha caracterizado en varios insectos, entre ellos importantes vectores de
la malaria como el mosquito Anopheles gambiae, así como plagas no conductoras de
enfermedades como los chinches de cama.
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Un determinante en el uso de la deltametrina, como control de vectores, fue que mostró
un mayor efecto en la disminución de índices de picadura intra y peridomiciliares y en los
índices de reposo en superficies rociadas en comparación con los otros dos insecticidas
(malatión y DDT). El análisis de costos indicó que la aplicación en bajo volumen de
deltametrina y malatión fue 2.56 veces mayor y 0.89 veces menor, respectivamente, que el
costo de la aplicación de DDT en forma adicional. El ahorro en costos, anudado a la eficacia y
utilidad práctica de esta técnica de rociado, la convierten en una alternativa viable para el
control de vectores (Vaca-Marín MA y col., 1991).
En el transcurso del uso de la deltametrina se han estudiado mecanismos de resistencia
ante su uso. Los métodos de resistencia incluyen el engrosamiento de la cutícula del insecto
para limitar la penetración del insecticida, la resistencia metabólica a través de la
sobreexpresión de metabolizar P450 glutatión-S-transferasa mono-y oxigenasas, y la resistencia
desmontables mutaciones del canal de sodio que hacen que la acción de los insecticidas
ineficaces, incluso cuando se administran conjuntamente con butóxido de piperonilo. La
caracterización de las diferentes formas de resistencia de los mosquitos se ha convertido en una
prioridad en los grupos de estudio de la medicina tropical, debido a la alta mortalidad de los que
residen en las zonas endémicas.
La deltametrina posee efectos nocivos a la salud tanto humana como al ecosistema, los
síntomas por exposición de acuerdo con la ficha técnica de seguridad, por inhalación provoca
una sensación de quemazón, tos, vértigo, dolor de cabeza, náuseas. Por contacto en piel,
presenta enrojecimiento, sensación de quemazón, picor. Por contacto en ojos, presenta
enrojecimiento, dolor. Si llegase a ingerirse pueden presentar dolor abdominal, vómitos.
Los efectos de exposición de corta duración: irrita los ojos, la piel y el tracto
respiratorio. Puede causar efectos en sistema nervioso, dando lugar a sensaciones faciales tales
como, picores, quemazón, punzadas.
Mientras que la deltametrina es fácil de usar y en algunos casos muy eficaz, siempre debe
ser tratado con precaución. Se debe aplicar de acuerdo a las instrucciones que vienen con el
insecticida. Cuando no se tiene cuidado, se puede producir intoxicación deltametrina. Debido a
que es una neurotóxica, ataca temporalmente el sistema nervioso de cualquier animal con el que
entra en contacto. Al tener contacto con la piel puede causar hormigueo o enrojecimiento de la
piel local a la aplicación. Si se toma a través de los ojos o la boca, un síntoma común es la
parestesia facial, que puede sentirse como diferentes sensaciones anormales, incluyendo,
entumecimiento parcial, "alfileres y agujas" quema la piel, gatear, etc. No hay informes que
indican que la intoxicación crónica de insecticidas piretroides causa daño neuronal motora o
enfermedad de la motoneurona. Sin embargo, en 2011, un caso fue publicado que demostró
patológicamente probado la muerte de las neuronas motoras en una mujer japonesa después de
la ingestión aguda masiva de pesticidas que contienen piretroides y organoclorados.
Recientemente, en Sudáfrica, se encontraron residuos de deltametrina en la leche materna, así
como el DDT, en un área que utiliza el tratamiento DDT para el control de la malaria, así como
los piretroides en la agricultura a pequeña escala. No existen antídotos y el tratamiento debe ser
sintomático, tal como fue aprobado por un médico. Con el tiempo, deltametrina es
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metabolizado, con una rápida pérdida de toxicidad, y se hace pasar desde el cuerpo. Un centro
de control de envenenamiento se debe contactar en caso de un envenenamiento accidental.
Los casos de toxicidad han sido observados en el ganado, tras el uso de la preparación
de deltametrina agrícola en aplicación externa en el control de garrapatas. Los síntomas
aparecen 36 horas después de la aplicación, y se incluyen temblores musculares que conducen a
decúbito 12 horas después. Después de 12 horas, se produjo una recuperación espontánea y el
animal podría levantarse de nuevo, a pesar de los temblores musculares persistieron. La
temperatura de su cuerpo era entonces 38.3C.
Experimentación en animales de laboratorio
Como animal de laboratorio se entiende por cualquier animal vertebrado (ej., animales de
laboratorios tradicionales, animales de granja, animales silvestres y acuáticos) utilizado en
investigación científica, enseñanza o pruebas de laboratorio. Cuando es oportuno se hacen
excepciones o énfasis específicos sobre los animales de granja. Generalmente, cuando se utiliza este
término no incluyen específicamente los animales de granja empleados en investigación científica
agrícola o enseñanza superior, los animales silvestres o acuáticos estudiados en sus ámbitos
naturales ni tampoco a los animales invertebrados utilizados en investigación científica
(ILARCLSNRC, 1999).
La experimentación en los animales de laboratorio comienza en el momento en que se
inicia la preparación de un animal para su utilización y termina cuando ya no se va a hacer
ninguna observación ulterior. El uso de animales conducen a despejar incertidumbres y
desarrollar la ciencia, muy encaminada al mejoramiento de la salud humana (Saravia, 2005).
La manipulación de los animales que se utilizan en investigación se rige por normas
éticas las cuales están encaminadas al principio de Las Tres Erres: reemplazo, refinamiento y
reducción. Motivo por el cual, para el científico no es un requerimiento tener una muestra
estadísticamente significativa, sin dejar de lado el respeto al animal con que se trabaja,
reduciendo al mínimo el estrés o dolor causado, administrando un sacrificio menos doloroso
(OECD, 1996).
El uso de animales requiere de la constante observación de parámetros dentro del bioterio,
como puede ser el alojamiento, el espacio destinado para cada animal dentro de las jaulas, la
frecuencia de limpieza y el tipo de material del alojamiento. Deben de ser controladas las
fluctuaciones de luz, aire, ruido que pueden interferir en los resultados de las investigaciones.
Además de cumplir con el control de ingesta de alimentos y agua.
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Los principios éticos internacionales que guían la investigación biomédica con
animales aplicados:
1. El avance del conocimiento biológico y el desarrollo de mejores medios para la
protección de la salud y el bienestar, tanto del hombre como del animal, requieren
recurrir a experimentación en animales vivos intactos de una gran variedad de especies.
2. Siempre que sean apropiados, deben usarse métodos tales como modelos matemáticos,
simulación en computador y sistemas biológicos in vitro.
3. La experimentación en animales solamente se debe realizar después de estudiar su
importancia para la salud humana o animal y para el avance del conocimiento biológico.
4. Los animales seleccionados para la experimentación deben ser de una especie y calidad
apropiada, y utilizar el mínimo número requerido para obtener resultados
científicamente válidos.
5. Los investigadores y demás personal nunca deben dejar de tratar a los animales como
seres sensibles y deben considerar como un imperativo ético el cuidado y uso apropiado
y el evitar o minimizar el desconfort, la angustia y el dolor.
6. Los investigadores deben presumir que procedimientos que causarían dolor en seres
humanos también causan dolor en otras especies de vertebrados, aún cuando todavía
falta mucho por saber sobre la percepción del dolor en los animales.
7. Todo procedimiento que pueda causar en los animales más que un dolor o una angustia
momentánea o mínima, debe ser realizado con sedación, analgesia o anestesia apropiada
y conforme con la práctica veterinaria aceptada. No se deben realizar procedimientos
quirúrgicos o dolorosos en animales no anestesiados paralizados por agentes químicos.
8. Cuando se requiera apartarse de lo establecido, la decisión no debe ser tomada
solamente por el investigador directamente involucrado, sino que debe ser tomada por
un cuerpo revisor convenientemente constituido. Estas excepciones no deben hacerse
solamente con fines de demostración o de enseñanza.
9. Al final del experimento, o cuando sea apropiado durante el mismo, los animales que
puedan sufrir dolor crónico o severo, angustia, desconfort, o invalidez que no pueda ser
mitigada, deben ser sacrificados sin dolor.
10. Los animales mantenidos con propósitos biomédicos deben tenerse en las mejores
condiciones de vida posibles. Normalmente el cuidado de los animales debería estar
bajo la supervisión de veterinarios con experiencia en la Ciencia de Animales de
Laboratorio. En todo caso se debe disponer de cuidado veterinario cuando sea
requerido.
11. El director del instituto o del departamento donde se usen animales es el responsable de
asegurar que los investigadores y demás personal tengan calificación apropiada o
experiencia para realizar procedimientos en animales. Debe proporcionar oportunidades
adecuadas de entrenamiento en servicio que incluyan la preocupación por un trato
humano y apropiado para con los animales que están bajo su cuidado.
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Organizaciones Internacionales que rigen el uso con animales de laboratorio
Existen diversas instituciones a nivel internacional que dictan lineamientos a cumplir para
el trabajo con animales de experimentación, entre ellas podemos mencionar:
Se puede encontrar la “Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio,
auspiciada por el National Institutes of Health (NIH), USA, en sus diferentes versiones (la
última edición fue publicada por The National Academy Press, USA, 1996).
La “Directiva 86/609/CEE relativa a la Aproximación de las Disposiciones Legales,
Reglamentarias y Administrativas de los Estados Miembros de la Comunidad Económica
Europea respecto a la Protección de los Animales Utilizados para Experimentación y otros fines
Científicos”
La convención ETS 123 para la protección de animales vertebrados usados para
experimentación y otros propósitos científicos, adoptada por el Consejo de Europa, el cual tiene
fuerza de recomendación.
La UNESCO en París se proclamó en 1978 la “Declaración Universal de los Derechos de
los Animales”, cuyo texto fue revisado en 1989 por la Liga Internacional de los Derechos del
Animal.
Existen Recomendaciones Internacionales relacionadas específicamente con la Seguridad
en Trabajos con Animales como por ejemplo las descriptas en las publicaciones: ILAR/NRC,
USA, “Occupational Health and Safety in the Care and Use of Research Animals”, National
Academy Press, Washington, D.C., 1997 y CDC/NIH, USA, “Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories” 4th
Ed., US Government Printing Office, Washington, D.C., 1999.
Existen sobre categorización y educación y entrenamiento mínimo requerido por todas
las personas relacionadas con el cuidado y uso de animales de laboratorio, como por ejemplo
las elaboradas por la Federación Europea de Asociaciones de Ciencia de Animales de
Laboratorio (FELASA).
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Guías de la OECD
En este proyecto se aplicaron las normas y pautas que regula la OECD a través de las
Guidelines for Testing of Chemical (OECD, 1996) además de respetar los principios éticos para
el uso de animales.
Por sus siglas en inglés Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico
OCDE, es una organización intergubernamental en la que los representantes de los 30 países
industrializados de América del Norte, Europa y la región de Asia y el Pacífico, así como la
Comisión Europea, se reúnen para coordinar y armonizar las políticas, discutir temas de interés
común, y trabajar juntos para responder a los problemas internacionales. La mayor parte del
trabajo de la OCDE se lleva a cabo en más de 200 comités especializados y grupos de trabajo
compuestos por delegados de los países miembros. Los observadores de varios países con
estatuto especial en la OCDE, y de las organizaciones internacionales interesadas, asistir a
muchos de los talleres y otras reuniones de la OCDE. Comités y grupos de trabajo son
atendidas por la Secretaría de la OCDE, con sede en París, Francia, que se organiza en
Direcciones y divisiones. En Medio Ambiente, División de Salud y Seguridad Pública
documentos libres de cargo de cada diez series diferentes : Pruebas y Evaluación; buenas
prácticas de laboratorio y verificación de su conformidad; Plaguicidas y Biocidas; Gestión de
Riesgos; Armonización de la vigilancia reglamentaria en biotecnología; Seguridad de Nuevos
Alimentos y Piensos; Accidentes Químicos; Contaminantes y Registros de Transferencia;
Documentos de escenarios de emisiones y la seguridad de los nanomateriales fabricados.
Las directrices de la OCDE son revisados periódicamente a la luz de las consideraciones
de los avances científicos y de bienestar animal. El desarrollo de un método de inhalación
aguda de clase tóxica (ATC) para la inhalación, se consideró apropiado tras la adopción del
método ATC bucal revisado previamente. En diciembre de 2001 y la posterior supresión de la
pauta oral aguda tradicional prueba 401. La alternativa TG N º 436 sobre "Toxicidad aguda por
inhalación Agudo Clase Método-ATC Toxico" ofrece refinamiento y reducción mediante la
aplicación de medidas de serie y las concentraciones objetivo fijo para clasificar la toxicidad
artículo de prueba para la clasificación y el etiquetado, de acuerdo con el Sistema de las
Naciones Unidas Globalmente Armonizado (SGA) de clasificación y etiquetado de productos
químicos.
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OECD Toxicidad Inhalatoria Aguda
Los estudios de toxicidad aguda por inhalación son los medios ideales para la
caracterización de los peligros agudos de inhalación, pero hay circunstancias en las que
requieren un estudio de toxicidad por inhalación no se justifica por razones humanitarias,
científicas o prácticas. Pruebas en GHS categoría 5 es generalmente desalentada y sólo debe
considerarse cuando hay una fuerte probabilidad de que los resultados de una prueba de este
tipo tendría una relevancia directa para la protección de la salud humana. Por regla general, las
pruebas deben hacerse a menos que existan razones de peso para no probar. La decisión de
probar o no probar debe considerarse sobre una base caso por caso, utilizando un enfoque de
ponderación de la evidencia. Pruebas agudas por inhalación no es necesario si la forma física
de un artículo de prueba, como se comercializa o se utiliza, se opone a cualquier exposición a la
inhalación humana (por ejemplo, el bloque sólido de metal, gránulos no friables, materiales
elásticos compuestos). Sin embargo, la toxicidad asociada con los efluentes de la termólisis o la
combustión de los productos de otro modo no inhalable puede estar sujeto a prueba.
Consideraciones Éticas en Animales de laboratorio: Ensayos de Toxicidad Aguda
Las consideraciones éticas deben de velar por que el diseño y realización de los procedimientos
además de tener relevancia para la salud humana y animal, proveer un avance en el
conocimiento y dar un bien de la sociedad (ILARCLSNRC, 1999), se debe garantizar que:
1. El uso de las especies, calidad y número apropiados de animales.
2. El evitar o reducir al mínimo la incomodidad, diestrés y dolor, siempre y cuando sea
compatible con una buena ciencia.
3. El uso apropiado de sedación, analgesia y anestesia
4. El establecimiento de metas y objetivos en el experimento
5. Brindar un manejo apropiado a los animales, dirigido y realizado por personas
calificadas
6. La conducción de experimentos en animales vivos sólo por, o bajo la, estricta
supervisión de personas calificadas y con experiencia
Existe la preocupación ética por el bienestar de los animales de laboratorio, que incluye el
alivio de la tensión y el sufrimiento. Además de permitir que para la clasificación de los
estudios de toxicidad aguda por inhalación que pueden proporcionar información importante
acerca de los peligros potenciales que pueden estar asociados con el uso de los productos de
consumo (por ejemplo, los biocidas de interior, latas de spray multiusos, productos de limpieza
en aerosol, incienso repelente de insectos, entre otros). Para este fin, los puntos finales no
letales en el extremo inferior de la curva de concentración - respuesta pueden ser tan útiles
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como puntos finales letales. Siempre que este objetivo se puede lograr mediante el uso de
métodos de ensayo alternativos, que utilizan menos animales, dentro de lo posible debe
mantenerse y optar por este enfoque.
La guía revisada 403 utiliza menos animales que la versión de la 403 de 1981 y todos
ellos contienen un requisito para seguir la guía N º 19 de la OECD sobre puntos finales, lo que
debería reducir el sufrimiento total de animales utilizados en aguda pruebas de toxicidad por
inhalación. La guía 403 utiliza un estudio preliminar para reducir al mínimo el número de
animales necesarios.
En la utilización de animales de experimentación estos que muestren signos graves y
duraderos de angustia o dolor deberán ser sacrificados humanitariamente como se describe en la
Guía de la OCDE Documento No. 19. Al exponer los animales a un artículo de la prueba con
propiedades irritantes o corrosivos fuertes donde las concentraciones buscadas no deben inducir
irritación / efectos corrosivos severos, sin embargo, suficientes para extender la curva de
concentración - respuesta a los niveles que alcanzan el objetivo normativo y científico de la
prueba. Artículos de prueba que son irritantes para los ojos / de la piel también pueden ser
irritantes de las vías respiratorias a concentraciones de exposición altos. Debido a
marcadamente diferentes enfoques metodológicos, los resultados de las pruebas de
corrosividad para los ojos / de la piel no se pueden traducir fácilmente a concentraciones de
exposición por inhalación reales entregados en un período de tiempo especificado. Por lo tanto,
los artículos de prueba corrosivos deben ser evaluados y probados siguiendo la opinión de
expertos en un términos comparables en caso por caso.
Exposición de animales de laboratorio en técnicas de toxicidad inhalatoria
Los animales que sean utilizados en estas técnicas se seleccionan al azar, marcados para
su identificación individual y se mantienen en sus jaulas durante al menos 5 días antes del
comienzo de la prueba para permitir que se aclimaten a las condiciones de laboratorio. Aunque
varias especies de mamíferos de prueba se pueden usar, la especie preferida es la rata.
Se recomienda uso de cepas comunes de laboratorio. Si se utiliza otra especie de
mamíferos, el experimentador usualmente debe proporcionar una justificación de su selección.
Al comienzo de un estudio, ratas adultas jóvenes - deben utilizarse (aproximadamente 8 12
semanas de edad)
El intervalo de tiempo entre los grupos de tratamiento se determina por la aparición,
duración y gravedad de los signos tóxicos. Inicio de una exposición debe retrasarse hasta que
uno es razonablemente seguro del resultado de los animales tratados con anterioridad. La
exposición de los animales en la próxima baja o más alta concentración se debe basar en la
experiencia previa y el juicio científico.
22
Los animales deben ser observados con frecuencia durante el período de exposición. Tras
la exposición, las observaciones clínicas cuidadosas deben hacerse por lo menos dos veces en
el día de la exposición, o con mayor frecuencia si así lo indica la respuesta de los animales para
el tratamiento, y por lo menos una vez al día a partir de entonces durante el período posterior a
la exposición. Observaciones adicionales si los animales siguen presentando signos de
toxicidad. Las observaciones incluyen cambios en la piel y el pelo, los ojos y las membranas
mucosas, del aparato respiratorio, circulatorio, los sistemas nerviosos autónomo y central, la
actividad somato -motriz y patrones de comportamiento. La atención debe ser dirigida a la
observación de temblores, convulsiones, salivación, diarrea, letargo, sueño y coma.
El principio del ensayo de Toxicidad Inhalatoria a dosis repetida que dictamina la OECD
No. 403 y No.412 consisten en exponer diversos grupos de animales de experimentación
diariamente en un periodo definido para probar la sustancia en concentraciones graduales, una
concentración por grupo, por un período de 14 o 28 días respectivamente. Donde un vehículo es
usado para ayudar a generar una concentración apropiada de la sustancia en la atmosfera, se
utilizan un grupo control del vehículo. Durante el periodo de administración los animales son
observados diariamente para detectar signos de toxicidad.
Abordaje a la toxicología general
La toxicidad aguda se debe a la presencia de los efectos inmediatos o mediatos por dosis
altas o dosis repetidas en un breve lapso de tiempo, pueden desembocar en la muerte o en una
incapacidad grave. No obstante, en algunos casos la intervención puede producir efectos
transitorios y totalmente reversibles. El resultado estará determinado por la dosis o por la
gravedad de la exposición (Curtis, 2008).
Cuando se administra una dosis única y elevada, algunas sustancias químicas no
presentan el mismo mecanismo de toxicidad que cuando se administran repetidamente en dosis
bajas pero tóxicas, comprendiendo como una toxicidad crónica. Cuando se administra una dosis
única y elevada cabe siempre la posibilidad de que se supere la capacidad de la persona para
destoxificar o excretar la sustancia, y ello puede provocar una respuesta tóxica distinta de la que
se produce cuando se administran repetidamente dosis más bajas. Un buen ejemplo a este
respecto es el alcohol, a dosis altas de alcohol producen efectos primarios en el sistema
nervioso central, mientras que la repetición de dosis más bajas (crónico) produce lesión
hepática (DeMarini & Huff, 2001).
Los plaguicidas organofosforados, por ejemplo, tienen en su mayoría escasa toxicidad
para los mamíferos hasta que son activados metabólicamente, sobre todo en el hígado. El
principal mecanismo de acción de los organofosforados es la inhibición de la acetilcolinesterasa
(AChE) en el cerebro y el sistema nervioso periférico. La AChE es la enzima que normalmente
pone fin a la estimulación provocada por el neurotransmisor acetilcolina. La inhibición leve de
la AChE a lo largo de un período prolongado no se ha asociado con efectos adversos. A niveles
23
de exposición altos, la incapacidad de poner fin a esa estimulación neuronal produce una
sobreestimulación del sistema nervioso colinérgico, lo que en última instancia provoca toda una
serie de síntomas, como parada respiratoria a la que sigue la muerte si no se trata (Watanabe,
2001).
La DL (dosis letal) es la dosis que produce una mortalidad del 50 % en una población
animal. La DL50solía considerarse en la bibliografía más antigua como una medida de la
toxicidad aguda de las sustancias químicas. A mayor DL50, menor toxicidad aguda. De una
sustancia química muy tóxica (con una DL50baja) se dice que es potente. No hay una
correlación necesaria entre la toxicidad aguda y la toxicidad crónica. La DE (dosis efectiva) es
la dosis que produce en el 50 % de los animales un efecto específico no letal.
Nociones de genética toxicológica:
La genética toxicológica o genotoxicología, es una rama de la toxicología que evalúa los
efectos de diversos agentes químicos y físicos en el material hereditario AND y en los procesos
genéticos de células vivas. Existen diversas metodologías que evalúan directamente la
interacción de los agentes con el ADN e indirectamente como pueden ser mutaciones genéticas
o alteraciones cromosómicas. Todos los cambios sufridos en el ADN tienen impactos directos
en la salud que se evidencian en la salud humana como alteraciones o desordenes genéticos que
pueden ser desde defectos al nacer y cáncer (Curtis, 2008).
La toxicología genética es, por definición, el estudio de la forma en que agentes químicos
o físicos afectan al complejo proceso de la herencia. Las sustancias químicas genotóxicas son
compuestos capaces de modificar el material hereditario de las células vivas. La probabilidad
de que una determinada sustancia cause un daño genético depende inevitablemente de diversas
variables, como el nivel de exposición del organismo a la sustancia, la distribución y retención
de ésta una vez que ha penetrado en el cuerpo, la eficiencia de los sistemas de activación
metabólica y/o destoxificación en los tejidos diana y la reactividad de la sustancia o de sus
metabolitos con macromoléculas críticas de las células. La probabilidad de que el daño genético
produzca una enfermedad depende en última instancia de la naturaleza del daño, la capacidad
que posee la célula de reparar o amplificar el daño genético, la oportunidad de expresar
cualquier alteración que se haya inducido y la capacidad del cuerpo de reconocer y suprimir la
multiplicación de células aberrantes (Misra & Walkees, 2001).
24
Mecanismos de inducción de alteraciones genéticas:
Los mecanismos que inducen alteraciones genéticas pueden darse por daño directo al
ADN por radiaciones ionizantes y no ionizantes, luz ultravioleta agentes químicos y endógenos,
que pueden llegar a producir roturas de una o las dos hebras, cruce entre las bases del ADN o
entre las bases y las proteínas, adiciones de elementos químicos en las bases del ADN
(aductos), producción de especies de oxígeno reactivo (superóxido, radicales libres de
hidróxido y peróxido de hidrógeno). Pueden presentarse daños en el momento de la reparación
del ADN dañado, durante la reparación si el daño al ADN es extensivo la célula muerte por
apoptosis. Si el daño es menos severo puede ser reparado por una serie de procesos que forman
parte de una respuesta al daño al ADN
que lleva al ADN a un estado sin daño,
llevado a cabo por familias de
polimerasas. Pero que al fallar esta
respuesta puede generar la formación
de mutaciones genéticas que pueden
ser en células somáticas (aberraciones
cromosómicas estructurales, cambios
en el número de cromosomas, cambios
en las cromátidas hermanas), o en
células germinales, que presentan
cambios similares a las células
somáticas. (Curtis, 2008).
Las primeras teorías sobre la
forma en que las sustancias químicas
interactúan con el ADN se remontan a
los estudios que se realizaron durante
el desarrollo del gas mostaza con fines
bélicos. Se amplió después el
conocimiento de estos procesos
cuando se trató de identificar agentes
anticarcinógenos que detuvieran
selectivamente la replicación de
células tumorales en rápida división.
La mayor preocupación de la opinión
pública por los peligros ambientales ha
impulsado nuevas investigaciones sobre los mecanismos y consecuencias de la interacción de
sustancias químicas y material genético (Misra & Walkees, 2001).
25
Existen diversos ensayos para detectar las alteraciones genéticas que van desde la
caracterización de las mutaciones genéticas hasta las ensayos que evalúan un punto final único
(por ejemplo existen ensayos donde se evalúa la reserción del triptófano WP2 de la E. coli
(Curtis, 2008).
Medición del daño primario al ADN:
Se trata de evaluar la capacidad que tienen los agentes de inducir cualquiera de los tres
tipos generales de cambios (o mutaciones) que puede sufrir el material genético (ADN):
cambios génicos, cromosómicos y genómicos. En organismos como los humanos, los genes se
componen de ADN, que consta de una serie de unidades llamadas bases de nucleótidos. Los
genes están organizados en estructuras físicas discretas que se denominan cromosomas. La
genotoxicidad puede producir efectos importantes e irreversibles sobre la salud humana. El
daño genotóxico es un paso crítico en la inducción del cáncer y puede intervenir también en la
inducción de defectos de nacimiento y muerte fetal. Las tres clases de mutaciones que se han
mencionado pueden producirse en cualquiera de los dos tipos de tejidos que poseen los
organismos como el ser humano: los espermatozoides y óvulos (células germinales) y el tejido
restante (células somáticas).
Los ensayos que miden la mutación génica son los que detectan la sustitución, adición o
supresión de nucleótidos en un gen. Los ensayos que miden la mutación cromosómica son los
que detectan rupturas o reordenaciones cromosómicas en las que intervienen uno o varios
cromosomas. Los ensayos que miden la mutación genómica son los que detectan cambios en el
número de cromosomas, fenómeno que se denomina aneuploidía. La evaluación de la toxicidad
genética ha cambiado mucho desde que Herman Müller desarrolló en 1927 el primer ensayo de
detección de agentes genotóxicos (mutágenos). Desde entonces se han desarrollado más de 200
ensayos que miden las mutaciones del ADN; no obstante, no llegan a diez los que normalmente
se utilizan hoy para evaluar la toxicidad genética.
Existen tres razones fundamentales que justifican la preocupación por la exposición del
hombre a los agentes mutagénicos.
Primero, el incremento en el grado de mutación de las células germinales (óvulos,
espermatozoides y sus precursores) lo cual puede provocar un aumento de la incidencia de las
enfermedades genéticas en futuras generaciones. Segundo, la existencia de una estrecha
relación entre la inestabilidad genómica de células somáticas con el cáncer y las enfermedades
degenerativas crónicas. Tercero, el origen ambiental del cáncer. Ello orienta a la utilización de
ensayos a corto plazo los cuales, informan en poco tiempo acerca de la actividad mutagénica de
dichas sustancias y en algunos casos brindan información suficiente para establecer los niveles
de seguridad para el hombre (Arencibia, 2003).
26
Fundamento del ensayo cometa
Ostling y Johanson en el año 1984, fueron los primeros en desarrollar una técnica de
electroforesis en microgeles para detectar el daño al ADN a nivel de células individuales. En
esta técnica las células son embebidas en agarosa y son añadidas en láminas de microscopio
para ser sometidas a una electroforesis neutral, tras la lisis en presencia de sales y detergentes.
Las células que tienen una elevada frecuencia de rupturas de doble cadena se movían
significativamente hacia el ánodo. En general el principio básico del ensayo, es la migración del
ADN en una matriz de agarosa bajo condiciones de electroforesis. Luego, al ser observada la
célula al microscopio (por fluorescencia, en el caso de este experimento), presenta la apariencia
de un cometa, con una cabeza (región nuclear) y cola (formada por fragmentos nucleares que
han migrado en dirección del ánodo) por lo que este ensayo es también conocido como ensayo
Cometa, debido al patrón de migración del ADN que se produce en las células dañadas. La
detección de la migración del ADN alterado depende de varios parámetros, tales como: la
concentración de la matriz de agarosa, el pH, la temperatura y duración del desenrollamiento,
voltaje, amperaje y duración de la electroforesis. El protocolo de este ensayo ha sufrido
diversas modificaciones a través del tiempo, y su objetivo establecido es para detectar daño al
ADN, específicamente aquellos producidos por las rupturas de cadena, la formación de sitios
lábiles al álcali, los entrecruzamientos ADN-ADN y ADN-proteínas y más recientemente para
la evaluación de los mecanismos de reparación de daño oxidativo en el ADN en células
eucariotas obtenidas tanto de estudios in vivo como in vitro.
Comparado con otros ensayos de genotoxicidad, el ensayo Cometa se distingue por su
(Arencibia, 2003):
1. Demostrada sensibilidad para detectar bajos niveles de daño al ADN (0.01 Gy),
2. Rápida realización (resultados en pocos días),
3. Análisis de los datos a nivel de células individuales,
4. Requiere un pequeño tamaño de muestra (pocas células),
5. Flexibilidad y bajo costo,
6. Aplicable a cualquier población de células eucariotas.
Este ensayo cometa, se utiliza la electroforesis comúnmente utilizada para el estudio de
proteínas y ácidos nucleicos, técnica que ayuda en el estudio del movimiento de biomoléculas
con una carga neta a través de un campo eléctrico. En la electroforesis la migración depende de
la forma, tamaño, carga y composición química; es utilizada para analizar y determinar el peso
molecular de diferentes tipos de biomoléculas. Existen diversos tipos de electroforesis cuya
diferencia radica en los distintos tipos de medios de soporte: lso geles de celulosa son usados
para moléculas de bajo peso molecular como los aminoácidos y los carbohidratos, los geles de
poliacrilamida y agarosa se utilizan para moléculas de mayor peso molecular (ADN, ARN y
proteínas). Los geles de electroforesis pueden ser horizontales, verticales o cilíndricos. Son
27
útiles para lograr la separación de componentes de mezclas complejas. Se aplican pequeñas
cantidades de la disolución de proteínas a un soporte sólido, que se impregna con una solución
de tampón. Los soportes son en general polímeros y forman un gel poroso que restringe el
movimiento de las moléculas a través del medio durante la electroforesis y disminuyen los
flujos de convección del solvente. Como soportes han sido utilizados papel (celulosa), almidón,
poliacrilamida, agarosa, acetato de celulosa, etcétera (Morales & Gallo, 2006).
Este método tiene gran poder resolutivo (técnica electroforética) porque se aplica una
cantidad pequeña de proteína a una zona estrecha, mientras que la longitud del trayecto es
mucho mayor que la zona de aplicación. El equipamiento requerido es simple (fuente de poder
y cubeta vertical u horizontal donde se coloca el soporte y 2 electrodos). Con el desarrollo de la
ciencia se han diseñado y existen diversos equipos automatizados de electroforesis. Además
existen diversos factores que deben de tomarse en cuenta para realizar la técnica de
electroforesis, siendo algunos parámetros: Diferencia de potencial (V): este potencial se mide
en voltios y es lo que define el campo eléctrico, cuanto mayor sea, mayor será la velocidad de
migración; las electroforesis se consideran de bajo voltaje si se realizan entre 10-500 voltios (la
mayoría) y de alto voltaje si se realizan entre 500-10,000 voltios. La intensidad (I) que se mide
en amperios y cuantifica el flujo de carga eléctrica, está relacionada con la diferencia de
potencial por la Ley de Ohm: V=IR y para una diferencia de potencial dada, su valor
(normalmente entre 5-50mA) viene determinado por la resistencia del soporte, por lo que, en
última instancia, da cuenta de la distancia recorrida por las moléculas. La resistencia (R) que se
mide en ohmios y cuanto mayor sea la resistencia del soporte, menor será la movilidad
electroforética (ya que la intensidad ha de ser menor para que se cumpla la Ley de Ohm),
depende de la naturaleza del soporte, sus dimensiones (anchura, longitud y sección) y de la
concentración del tampón de electroforesis. La temperatura, por el efecto Joule, el paso de una
corriente eléctrica produce calor, y este efecto será tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia
de potencial y la resistencia del sistema; este debe controlarse de forma estricta, puesto que
puede afectar a la muestra (desnaturalizándola), al soporte e incluso al equipo electroforético
(Morales & Gallo, 2006).
El ensayo del cometa ha demostrado ser una técnica muy sensible a la hora de evaluar
daño en el DNA en una amplia variedad de células, dañadas por distintos agentes tanto físicos
como químicos, detectando entre 50 y 15000 rupturas por células. Este permite establecer
relaciones dosis-respuesta a bajas dosis, es capaz de detectar daño genético y su reparación en
moléculas de ADN altamente compactadas con eficacia y exactitud. Este ensayo se puede
medir en un gran número de células y en diferentes tejidos, los datos son obtenidos a nivel
individual donde pueden generar información sobre la heterogeneidad de una muestra (Zúñiga,
2009).
El ensayo cometa es una prueba que permite evaluar el daño primario al ADN,
evaluando la ruptura de las cadenas de ADN por exposición a contaminantes ambientales, este
ensayo permite evaluar si existe un daño primario al ADN por exposición a piretroides que
28
utilizan diesel como disolvente y enseguida comparar el daño producido entre los piretroides
utilizados con diesel versus el daño provocado utilizando un solvente adecuado según la
etiqueta. El ensayo cometa es un ensayo que mide la alteración al ADN visiblemente como una
cola de cometa en el microscopio de fluorescencia en campo oscuro, la ruptura de cadenas
como lo es el daño primario al ADN es el punto de partida para un daño clastogénico expresado
a nivel celular como aberraciones cromosómicas. (Dhawan, 2008; Valverde, 2009)
Es ampliamente utilizado para evaluar el daño genotóxico inducido por distintos
agentes, y su atención en mutagénesis y biomonitoreo ambiental parece incrementarse con el
desarrollo de las continuas mejoras que se van implementando. No obstante, uno de los puntos
críticos es la no uniformidad de la electroforesis que aporta variabilidad a los resultados y
también por la preparación de los microgeles respectivos (Crespo, 2011).
29
PARTE III
III.1. Resultados
TABLA No.1
Distribución de Grupos Experimentales
Ensayo Grupo Concentración
403
Macho 1 parte deltametrina: 1 parte de diesel
Hembra 1 parte deltametrina: 1 parte de diesel
412
Alta 3 partes de deltametrina: 65 partes
del diesel
Media 1 partes de deltametrina: 65 partes
del diesel
Baja 0.5 partes de deltametrina: 65 partes
del diesel
Control 1 partes de deltametrina: 65 partes de
aceite mineral
Fuente: Fodecyt 21-2010
GRÁFICA No. 1
Comportamiento del peso según sexo durante Ensayo 403
Fuente: Fodecyt 21-2010
30
TABLA No. 2
Efectos predominantes de la Toxicidad Inhalatoria No. 403