CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT- FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT- FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA -USAC- INFORME FINAL “Caracterización de microorganismos cromatografía de gases acoplada a masas” Proyecto FODECYT No. 19-2007 EDUARDO ROBLES AGUIRRE Investigador Principal GUATEMALA, JUNIO DE 2010
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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT-
SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT-
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA
UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA -USAC-
INFORME FINAL
“Caracterización de microorganismos cromatografía de gases
acoplada a masas”
Proyecto FODECYT No. 19-2007
EDUARDO ROBLES AGUIRRE
Investigador Principal
GUATEMALA, JUNIO DE 2010
AGRADECIMIENTOS
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de
Ciencia y Tecnología, -FONACYT- otorgado por la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología –SENACYT-
y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -CONCYT-.
PARTE I .......................................................................................................................................................... 3
1.4.2. LAS VARIABLES ................................................................................................................................. 9
1.4.4.1. Población y muestra ............................................................................................................... 10
1.4.5. EL MÉTODO ..................................................................................................................................... 10
1.4.6. LA TÉCNICA ESTADÍSTICA ............................................................................................................... 11
1.4.7. LOS INSTRUMENTOS A UTILIZAR ................................................................................................... 12
PARTE II ....................................................................................................................................................... 14
II. MARCO TEÓRICO ............................................................................................................................ 14
II.1 Descripción de microorganismos seleccionados ........................................................................... 14
II.2 Métodos actuales para la identificación de microorganismos ..................................................... 17
II.3 La cromatografía como técnica analítica ....................................................................................... 19
II.4 La cromatografía de gases ............................................................................................................. 20
II.5 La espectrometría de masas como método de detección en cromatografía ............................... 26
II.6 La identificación de microorganismos por técnicas cromatográficas .......................................... 27
PARTE III ...................................................................................................................................................... 30
III. RESULTADOS ................................................................................................................................... 30
III.1 DISCUSIÓN DE RESULTADOS .......................................................................................................... 33
PARTE IV ..................................................................................................................................................... 35
IV.4. 1 Cromatogramas y espectros de masas seleccionados .................................................................. 41
IV.4.2 Fotografías del proyecto ................................................................................................................ 78
PARTE V ...................................................................................................................................................... 81
Escherichia coli and Cryptococcus neoformans it was developed a methodology for the lipids analysis
of these bacteria by gas chromatography coupled to mass spectrometry. A hexanic extract was prepared
and analyzed after cellular lysis and derivatization of fresh bacterial mass with 8% sodium metoxide in
methanol. This hexanic extract was analyzed following the developed methodology using gas
chromatography coupled to mass spectrometry.
There were found three chemical biomarkers characteristic of Bacillus subtillis, one characteristic of
Salmonella typhi as well as other tow biomarkers occasionally observed in this last bacterium, but not in
the other studied microorganisms.
There were not found constant biomarkers for Staphylococcus aureus, but three biomarkers that
occasionally showed exclusively for this bacterium were observed. It was the same for Mycobacterium
smegmatis, that it showed five occasional biomarkers that appeared only for this specie.
There were not found biomarkers that can be considered constant for Cryptococcus neoformans, even
though it was observed two characteristic biomarkers of this specie compared to the other ones under
study. However, these could not be considered definitive because of the weakness of the signal
produced.
It could not be found constant or occasional biomarkers for Escherichia coli either. But this specie can
still be differentiated of the other microorganisms studied by the presence of an uncommon biomarker
and the absence of the characteristic peaks of Salmonella typhi, that is the only other bacterium
showing that biomarker.
There were not found any constant or occasional biomarkers for Pseudomonas aeuruginosa and there
were not observed other biomarkers that could be used to indirectly identify it from the other
microorganisms under study, so a definitive identification strategy could not be applied.
Comparing consumed resources by the developed microorganisms characterization methodology by gas
chromatography coupled to mass spectrometry to de conventional characterization method, it was
obtained an analysis time reduction of about 94 % and a direct cost decrease of about 2.5 %.
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PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN
En la actualidad el diagnóstico de microorganismos y hongos patógenos se realiza a través de cultivos
que pueden llegar a tardar entre tres días a varias semanas dependiendo de cada organismo y en
especial para aquellos de crecimiento lento. En ese transcurso el médico tratante deberá utilizar su
intuición para adelantarse a darle un posible tratamiento a su paciente; ya que si espera demasiado
tiempo, para cuando se haya identificado el organismo causante de la afección del paciente, esté se
encontrara en una situación empeorada.
El presente proyecto buscaba como objetivo desarrollar una metodología que permita caracterizar
microorganismos, por medio del análisis de marcadores químicos, especialmente lípidos que forman
parte de las paredes bacterianas por medio de cromatografía de gases acoplada a masas, disminuyendo
así los tiempos de diagnóstico. Consecuentemente, al contar con un diagnóstico más rápido y objetivo,
el médico podrá tomar decisiones más oportunas y apropiadas a fin de salvar más vidas. Si bien la
inversión en equipo es considerable, rápidamente se recupera al ahorrar reactivos, medios de cultivo
incubadoras y tiempo.
En adición se obtuvo valiosa información con aplicación en bacteriología clínica e industrial ya que se
identificaron marcadores químicos que permiten determinar la presencia de las especies de
microorganismos estudiadas. Debe hacerse énfasis en que la información obtenida en el proyecto no
queda restringida al diagnóstico clínico, sino a la bacteriología industrial, el control de calidad
microbiológico en alimentos, cosméticos, agua y fármacos.
Los microorganismos seleccionados para el presente proyecto son Staphylococcus aureus, Salmonella
typhi, Mycobacterium smegmatis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Cryptococcus
neoformans, debido a que estas son las bacterias de referencia con las que cuenta la facultad de ciencias
químicas y farmacia y nuestros colaboradores en este momento.
El método a seguir para identificar los marcadores químicos a utilizar para la caracterización y posterior
identificación de las bacterias mencionadas consistió en el cultivo de dichas bacterias en agar Müller-
Hilton, tras lo cual se recolectó la masa bacteriana y se realizó en un solo paso la lisis celular y
derivatización de los lípidos, utilizando metóxido de sodio en metanol para el efecto.
Los extractos hexánicos obtenidos a partir de la anterior mezcla de reacción fueron analizados por
cromatografía de gases acoplada a masas, con un método analítico optimizado a partir de pruebas
preliminares con algunas de las bacterias a utilizar en la investigación.
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Los resultados presentados a continuación se enfocan en la diferenciación de las especies de
microorganismos basándose en la presencia y/o ausencia de picos característicos en sus
cromatogramas, especialmente de picos exclusivos para cada especie.
De esta manera, la investigación aporta en el campo de la caracterización de microorganismos,
principalmente bacterias y agentes patógenos más comunes, haciendo uso de técnicas analíticas, cuya
aplicación en este campo es novedosa, lo es la cromatografía de gases acoplada a masas (GC-MS), a
través de la identificación de metabolitos propios de las especies en cuestión, principalmente los lípidos
de la pared celular, que se utilizaron como marcadores químicos.
Así se contribuye al proceso de desarrollo de nuevas formas de diagnóstico más rápidas y baratas que
las técnicas convencionales, que a largo plazo mejorarán la capacidad de respuesta en microbiología
clínica. Además se contribuye al conocimiento general de os microorganismo en cuestión, con
información que puede ser aplicada a otros campos.
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I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
1.2.1. ANTECEDENTES EN GUATEMALA
1.2.1.1. Métodos actuales para la identificación de microorganismos
Las últimas décadas han producido una explosión de nuevos métodos en el laboratorio
microbiológico. Aún en la década de los 70 los diagnósticos de laboratorio definitivos para
enfermedades infecciosas eran mayoritariamente alcanzados únicamente por medio del uso de
técnicas engorrosas, costosas, lentas y usualmente subjetivas, que requerían personal altamente
capacitado y experimentado. (Murray, 1995)
Los microorganismos se visualizaban directamente por microscopía de material clínico teñido.
Alternativamente o en adición, se realizaban cultivos usando métodos de un siglo de antigüedad
en medios sólidos o líquidos. Los organismos recuperados en el cultivo eran identificados por
métodos convencionales laboriosos basados en el crecimiento y, cuando era necesario, se realizaban
pruebas de susceptibilidad antimicrobiana por el procedimiento manual de difusión de discos. (Murray,
1995)
Este tipo de pruebas se continúan realizando en el país, aunque por lo general, no son las técnicas
rutinarias de diagnóstico. Varias áreas específicas han tenido un gran cambio en el laboratorio clínico
microbiológico actual. En el campo de la identificación de bacterias, ésta se logra ahora en gran
parte a través de sistemas de utilización de sustrato miniaturizados, muchos de los cuales so n
automatizados. (Murray, 1995)
Por otro lado, las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana son comúnmente realizadas con
procedimientos de microdilución de caldos de cultivo comerciales o por alguna forma instrumental.
La bacteremia y fungemia son usualmente detectadas por sistemas comerciales instrumentales de
cultivo en sangre. Existen nuevos métodos de inmunodiagnóstico para detección de antígenos y
anticuerpos, que son ampliamente utilizados. (Murray, 1995)
La identificación de bacterias y levaduras por medio de sistemas de utilización de sustratos se basa en
las siguientes características: reacciones que producen cambios de pH; perfiles enzimáticos, detectados
visual o automáticamente por liberación de cromógenos o fluorógenos; utilización de fuentes de
carbono, midiendo actividad metabólica visual o automáticamente con cambios de color; detección de
productos metabólicos, por cromatografía; y, detección visual de crecimiento, variando el sustrato. Solo
algunos de estos métodos son actualmente aplicados en Guatemala (Murray, 1995)
1.2.1.2. La identificación de microorganismos por técnicas cromatográficas
El uso de métodos cromatográficos con fines de identificación y como herramienta de
caracterización fenotípica ha cobrado importancia en la microbiología recientemente. Cuando se
utilizan apropiadamente estas técnicas son extremadamente útiles para identificar microorganismos
de interés clínico, permitiendo la automatización y rapidez en la identificación de los mismos. (David et
al, 2008; Murray, 1995; Piñeiro-Vidal et al, 2008; Stenerson, 2004; Termonia et al, 1989)
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El uso de la cromatografía de gases para la identificación de microorganismos a través del análisis de los
ésteres metílicos de ácidos grasos celulares comienza a generalizarse en otras partes del mundo,
existiendo métodos comerciales y diversidad de técnicas de preparación de muestra y de análisis
cromatográficos reportados. (Analysis, 2008; Bryan and Gardner, 1967; David et al, 2008; Kunitsky et al
2006; Wayne et al, 1974; Vannieuwenhuyze, 1987)
Sin embargo, en Guatemala, no se ha encontrado reportes del uso de técnicas cromatográficas, para la
identificación de microorganismos. Este campo aún no ha sido apropiadamente investigado en el país, a
pesar de que existen múltiples reportes de su uso en investigación científica, como por ejemplo los
anteriormente mencionados.
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1.2.2. JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
En Guatemala actualmente la identificación de microorganismos para el diagnóstico de
enfermedades se realiza a través de métodos convencionales. Estos generalmente incluyen cultivos, que
pueden tardar de días a semanas, con lo cual el tiempo necesario para el diagnóstico adecuado se
extiende mientras empeora la salud de los pacientes. Esta situación se agrava al considerar la
elevada capacidad de mutación de los patógenos, su rápida difusión a través de los medios de
transporte modernos y el contacto humano con nuevos vectores al ampliar su hábitat. Es
necesario, por lo tanto, implementar nuevos métodos para la identificación de microorganismos
que permitan resultados más rápidos, conservando la exactitud en el diagnóstico.
En este trabajo de investigación se desarrolló metodología que permite caracterizar
microorganismos, por medio de la identificación de marcadores químicos, utilizando técnicas
cromatográficas. Esta metodología mejorará el diagnóstico clínico al reducir el tiempo de análisis de
muestras a pocas horas. Además, a largo plazo disminuye los costos de análisis, ya que ahorra el
gasto en enzimas, medios de cultivo, incubadoras, y tiempo de trabajo.
La metodología desarrollada servirá además de base para futuras investigación es en este campo, ya que
puede ampliarse para otros microorganismos no incluidos en esta investigación, e incluso servir
de referencia para el desarrollo de métodos de diferenciación celular en otros campos. Adicionalmente,
se obtuvo información bacteriológica acerca de marcadores químicos para cada una de las
especies incluidas, que puede aplicarse a otras ramas además de la microbiología clínica, como la
bacteriología industrial, el control de calidad microbiológico en alimentos, agua, fármacos, entre otras.
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I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS
1.3.1. OBJETIVOS
1.3.1.1. Objetivo General
• Contribuir a la investigación química de microorganismos.
1.3.1.2. Objetivos Específicos
• Encontrar marcadores biológicos que permitan diagnosticar la presencia de microorganismos por medio de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas.
• Desarrollar una metodología analítica que permita caracterizar los lípidos presentes en las paredes de Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Mycobacterium smegmatis, Bacillus
subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Cryptococcus neoformans.
• Reducir los costos de las metodologías de caracterización de microorganismos por cromatogafía de gases acoplada a espectrometría de masas.
• Desarrollar una metodología que permita extraer de manera reproducible los lípidos de las paredes de bacterias.
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I.4 METODOLOGÍA
1.4.1. LOCALIZACIÓN
La investigación se llevó a cabo en las instalaciones del Departamento de Fisicoquímica, de la
Escuela de Química de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San
Carlos de Guatemala, con el apoyo del Departamento de Citohistología de la Escuela de
Química Biológica de la misma facultad.
Ambos sitios de desarrollo de la investigación se encuentran dentro de la Ciudad Universitaria,
zona 12, para la cual se tienen los siguientes datos:
Coordenadas
Latitud: N 14° 35.101’
Longitud: W 90° 33.284’
Altitud: 1522 msnm
Precipitación pluvial (promedio anual): 1100 - 1200 mm
Temperatura máxima: 24.5 °C
Temperatura mínima: 14.0 °C
Humedad relativa (promedio): 78 %
(INSIVUMEH, 2010 y OLIVA, 2009)
1.4.2. LAS VARIABLES
1.4.2.1. Variables dependientes
Para el trabajo de investigación se consideró como variable dependiente la composición del
extracto hexánico, de la mezcla de lisis celular/derivatización de lípidos, determinada por medio
de cromatografía de gases acoplada a masas.
1.4.2.2. Variables independientes
Entre las variables independientes se tomó como variable de prueba la especie de
microorganismo, manteniendo constantes las demás variables independientes como medio de
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cultivo, madurez de los cultivos, procedimientos de derivatización y extracción de analitos y
metodología analítica.
1.4.3. INDICADORES
Se tomó como indicadores, para la evaluación de la correlación entre la variable dependiente y
la variable independiente de trabajo, la presencia/ausencia de picos en los cromatogramas
obtenidos para los microorganismos bajo estudio.
1.4.4. ESTRATEGIA METODOLÓGICA
1.4.4.1. Población y muestra
El universo de trabajo lo constituyen las bacterias Staphylococcus aureus, Salmonella typhi,
Mycobacterium smegmatis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Cryptococcus
neoformans. La muestra consiste en porciones de masa bacteriana proveniente de cultivos
sobre agar Mûller-Hilton de cepas de estas bacterias.
1.4.5. EL MÉTODO
Preparación de muestras:
1. Se lavó cuantitativamente toda la cristalería a utilizar, esterilizando con etanol al final.
2. Se identificó una serie de frascos de 4 y 10 ml para cada microorganismo y solución a contener.
3. Se realizaron pruebas preliminares con dos de las bacterias utilizando diferentes
concentraciones de metóxido en metanol, solventes para extracción y técnicas de tratamiento
de las muestras, hasta encontrar una metodología apropiada.
4. Se preparó 50 ml de solución de metóxido de sodio en metanol 8 % (p/v).
5. Se agregó a cada tubo rotulado 1.500 ml de solución de metóxido.
6. Se agregó una asada llena de masa bacteriana a cada tubo correspondiente, recolectándola con
un asa de nicromo y agitándola para liberarla en el vial.
7. Se agitó y dejó reaccionar por 1 minuto.
8. Se agregó 0.900 ml de hexano.
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9. Se agitó por 1 minuto y se centrifugó por 3 minutos para separar las fases.
10. Se recolectó la fase orgánica y se trasvasó a un vial de 4 ml identificado.
Análisis por Cromatografía de Gases Acoplada a Espectrometría de Masas:
1. Se realizaron pruebas preliminares con dos de los extractos utilizando diferentes condiciones de
análisis en una columna DB-5, variando la temperatura del inyector, temperatura inicial
del horno, temperatura final, rampa de temperatura, modo de inyección y volumen de inyección
2. Se grabó en el equipo de CG/EM un método para los extractos, tomando en cuenta las pruebas
preliminares, con la siguiente descripción: Inyección: 1 µL splitless por 30 segundos;
temperatura de inyección 280 ºC; temperatura inicial del horno 150 ºC por 5 minutos, gradiente
de 3 ºC/min hasta 180 ºC, gradiente de 2 ºC/min hasta 220 ºC y temperatura final de 220 ºC por
70 minutos; temperatura de interface 280 ºC; detector de espectrometría de masas en modo de
barrido desde m/z 40 hasta m/z 550, con 15 minutos de tiempo muerto.
3. Se inyectaron las muestras y se recolectó los espectros y cromatogramas correspondientes.
Análisis de cromatogramas:
1. Se identificaron picos persistentes en los diferentes cromatogramas de las mismas
bacterias analizadas.
2. Se identificaron picos iguales y diferentes en los cromatogramas de las distintas bacterias
analizadas obtenidos en las mismas condiciones.
3. Se numeró los picos de todos los cromatogramas para su fácil identificación.
4. Se buscó la diferenciación de las especies de estudio basándose en la presencia y/o ausencia de
picos característicos en sus cromatogramas, especialmente de picos exclusivos de cada
especie.
5. Se realizó la elucidación estructural de los compuestos correspondientes a los picos
exclusivos y principales de cada especie, para su asignación como marcadores químicos.
1.4.6. LA TÉCNICA ESTADÍSTICA
Para el análisis de la composición del extracto hexánico de los microorganismos bajo estudio se
repitió el procedimiento completo desde el cultivo de la cepa hasta el análisis cromatográfico,
buscando obtener tres cromatogramas para cada especie, a manera de obtener un resultado
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más representativo en términos estadísticos. Sin embargo, la elección del número de replicados
estuvo limitada por la disposición de recursos, siendo éste el número máximo posible de
muestras a trabajar, independientemente de los criterios estadísticos aplicables.
Debido a que se utilizó indicadores cualitativos, no se aplicó un análisis estadístico a los
resultados.
1.4.7. LOS INSTRUMENTOS A UTILIZAR
� Cromatógrafo de gases Hewlett-Packard 5890 II plus con detector de espectrometría de masas
HP 5970, equipado con columna Restek Rtx-5 de 30m, 0.25 mm DI y recubrimiento 0.50 µm.
� Refrigerador
� Microcentrífuga
� Agitador vórtex
� Probetas de 25 y 100 ml
� Pipetas volumétricas de 5, 10 y 25 ml
� Pipetas Pasteur
� Micropipetas automáticas de 1000 y 200 µl
� Bureta de 50 ml con llave de teflón
� Beakers de 25, 50, 250 y 500 ml
� Tubos de ensayo de 10 ml
� Tubos de cultivo de 10 ml
� Frascos ámbar de 4 ml
� Frascos ámbar de 10 ml
� Varilla de agitación
� Asas de nicromo
� Pipeteadores
� Bulbos para pipetas Pasteur
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� Puntas para micropipetas automáticas
� Jeringas para inyección en CG
� Gradilla para tubos de ensayo
� Espátulas metálicas
� Metanol grado CLAR
� Hexano grado CLAR
� Etanol
� Sodio metálico
� Helio 99.999 %
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PARTE II
II. MARCO TEÓRICO
II.1 Descripción de microorganismos seleccionados
Para la investigación se usaron los siguientes microorganismos: Staphylococcus aureus, Salmonella typhi,
Mycobacterium smegmatis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Cryptococcus neoformas.
Staphylococcus aureus es una bacteria de forma esférica de 0.8 a 1.0 micrones. Ocurre aislada,
en parejas, en cadenas cortas y en agregados irregulares. No tiene motilidad. Es un coco gram
positivo, aeróbico facultativo. (Breed, 1948)
Da negativa la prueba del indol. Reduce los nitratos a nitritos. Forma ácido a partir de glucosa, lactosa,
sacarosa, manitol y glicerol, pero no de rafinosa, salicina o inulina. Fermenta el manitol. Forma
ácido láctico inactivo o levorrotatorio. Produce ligera formación de HS. No hidroliza el almidón.
No utiliza NH4H2PO4 como fuente de nitrógeno. Produce amoniaco de peptonas. (Breed, 1948)
Su temperatura óptima de incubación es de 37 º C. Licúa la gelatina, con una película amarillenta y un
sedimento amarillo a naranja. Las colonias en agar son circulares, suaves, amarillentas a
anaranjadas, brillantes, intactas. En agar inclinado las colonias son abundantes, opacas, suaves, planas,
amarillentas a anaranjadas. En caldo el medio es turbio con un anillo amarillento y sedimento,
volviéndose transparente. (Breed, 1948)
Es patogénico. Las cepas varían en su habilidad para producir hemolisina, coagulasa y otros productos
metabólicos. Algunas cepas, bajo las condiciones adecuadas no sólo producen exotoxinas
(hematoxina, dermatoxina, toxina letal, etc.) sino también una potente enterotoxina que es una causa
significante de intoxicación alimentaria. (Breed, 1948)
Se recomienda examinar su presencia en comidas con ingredientes altos en proteínas, como
queso,carne, panadería rellena de crema, embutidos, ensaladas, etc. (Murray, 1995)
Se puede aislar del pus de las heridas. Su hábitat natural son la piel y las membranas mucosas.
Es causante de furúnculos, abscesos, supuración en las heridas, etc. (Breed, 1948)
Salmonella typhi es un bacilo de 0.6 a 0.7 por 2.0 a 3.0 micrones, ocurre aislado, en parejas y
ocasionalmente en cadenas cortas. Es móvil con flagelos peritricos. Es una bacteria gram negativa.
Es aeróbico facultativo. (Breed, 1948)
Produce ácido pero no gas de la glucosa, fructosa, galactosa, xilosa, maltosa, rafinosa, dextrina, glicerol,
manitol y sorbitol. No actúa en la lactosa, sacarosa, inulina, ramnosa, inositol, salicina y
usualmente arabinosa y dulcitol. Reduce el óxido de trimetilamina. No forma indol. Produce
nitritos a partir de nitratos. Produce sulfuro de hidrógeno. (Breed, 1948)
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Su temperatura óptima de incubación es de 37º C . Las colonias en gelatina son grisáceas, de
transparentes a opacas, con superficie de hojuela. No licúa la gelatina. Las colonias en agar son
grisáceas, de transparentes a opacas. En agar inclinado el crecimiento es blanquecino a gris,
brillante, completo u ondulado. En caldo el medio se vuelve turbio con sedimento moderado y
una película delicada en cultivos viejos. No tiene un olor característico. (Breed, 1948)
Se encuentra en el intestino humano. Es causante de la fiebre tifoidea. Es patogénico para animales
de laboratorio. (Breed, 1948)
Mycobacterium smegmatis forma células elongadas que tienen una tendencia definida a ramificarse. Es
un bacilo gram positivo; no excede los 1.5 micrones y tiene mayoritariamente alrededor de 1 micrón de
diámetro. En ocasiones forma estructuras ramificadas que se asemejan al micelio de los hongos;
no forma esporas. (Azna, 2008)
Es una micobacteria de crecimiento rápido. Da positiva la prueba de alcohol ácido resistente para
el ácido pero no para el alcohol. Da negativa la prueba de la arilsulfatasa y la de catalasa. Crece en
agar MacC onckey sin cristal violeta. Reduce los nitratos. (Azna, 2008)
Su temperatura óptima de crecimiento es de 28º C. La mitad de las cepas clínicas producen una
pigmentación amarillo anaranjada en cultivos viejos. Las colonias en agar son habitualmente elevadas,
rugosas y de bordes festoneados, aunque algunas cepas forman colonias lisas. (Azna, 2008)
Se encuentra naturalmente en suelo y agua. Su potencial patógeno es escaso ya que es poco frecuente
en la patología humana. En esos casos, se ha asociado a infecciones en pacientes con
enfermedad pulmonar obstructiva, infecciones de la piel y partes blandas tras traumatismos y
cirugía, infecciones articulares, bacteriemia relacionada con catéteres, endocardiatitis, linfadenitis e
infección diseminada en pacientes inmunodeprimidos. (Azna, 2008)
Pseudomonas aeruginosa es un bacillo recto de 0.5 a 0.6 por 1.5 micrones, ocurre aislado, en parejas o
en cadenas cortas. Presenta motilidad ya que posee de uno a tres flagelos polares monotricos. Es
una bacteria gram negativa, aeróbica facultativa. (Breed, 1948)
Usualmente da negativa la prueba de formación del indol. Reduce los nitratos a nitritos y nitrógeno. No