BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE AA 2011-12 LEZIONE 17 Acidi nucleici e nuovi farmaci II CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Valeria Benedusi
BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHEAA 2011-12
LEZIONE 17
Acidi nucleici e nuovi farmaci II
CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO
Valeria Benedusi
Gli acidi nucleici, oltre a riconoscere
e ibridare con altre molecole di DNA
sono
in grado di assumere una struttura
tridimensionale che permette loro di
interagire con specificità anche con
altre macromolecole quali, ad es., le
proteine.
FLESSIBILITA’ DEL DNAFLESSIBILITA’ DEL DNA
Struttura del complesso CAP-DNA.
La struttura del DNA consente una forte interazione con proteine dell’apparato trascrizionale, per esempio.
MOTIVI STRUTTURALI CHE PERMETTONO LEGAME AD ALTA AFFINITA’ TRA PROTEINE E DNA
APTAMERI
Sono ORN o ODN capaci di riconoscere una specifica
sequenza amminoacidica o un epitopo appartenente
ad una proteina
Sono stati scoperti per caso osservando l’alterazione
del processo di coagulazione, dovuto ad un aumento
del tempo di protrombina in seguito alla
somministrazione di ODN antisenso.
In queste molecole e’ presente un “G quartet” che
conferisce al DNA la capacità di legare la trombina
inattivandola
APTAMERO PER L’a-TROMBINA
Organizzazione strutturale dell’aptamero per l’a-trombina e disposizione dei quartetti di guanina che ne stabilizzano la conformazione
STRUTTURA DI ALCUNI APTAMERI
Riconoscimento di ligandi aromatici piatti:A: strutture B: teofillina-RNA C: FMN-RNAD: AMP-DNA E: AMP-RNA
Riconoscimento di aminoacidi basici:A: strutture B,C: arginina-DNA D: arginina-RNAE: citrullina-RNA
Riconoscimento dell’antibiotico aminoglicoside tobramicina:A: struttura B: aptamero tobramicina-RNA C: la tasca che accoglie il ligando
Riconoscimento di peptidi e proteine:A:peptide derivante dalla proteina Rev del virus umano HIV-1 B,C: diversi aptameri RNA Rev D, E: aptamero proteina di rivestimento del batteriofago MS2-RNA
FMN=flavin mononucleotide
APTAMERI CON STRUTTURA 3D DETERMINATA
Ligando Affinita’ Kd (mM)Acido nucleico
Teofillina
FMN
AMP
Arginina
Citrullina
Tobramicina
Neomicina B
HIV-1 Rev peptide
HTLV-1 Rex peptide
MS2 coat protein
Trombina
RNA
RNA
DNA/RNA
DNA/RNA
RNA
RNA
RNA
RNA
RNA
RNA
DNA
0,3
0,5
6/10
125/60
65
0,009
0,115
0,004
0,025
ND
0,025
A tutt’oggi è impossibile indicare a priori se esistano e quali siano le sequenze di DNA in grado di riconoscere una definita struttura enzimatica
L’analisi basata sui metodi computazionali richiede tempi di elaborazione esageratamente prolungati per stabilire la conformazione spaziale di macromolecole
L’isolamento di aptameri ad attività biologica richiede lo sviluppo di metodologie sperimentali specifiche
IDENTIFICAZIONE DI APTAMERI IN GRADO DI LEGARE PROTEINE AD ALTA AFFINITA’
SELEX ( Selection of functional nucleic acids)
UNA METODOLOGIA CHE NASCE:
1. dalla evoluzione delle tecniche di sintesi in vitro di acidi nucleici che permette la generazione di innumerevoli sequenze “degenerate” di nucleotidi
2. Dalla disponibilità della PCR che permette di amplificare all’infinito sequenze specifiche di DNA
SELEX ( Selection of functional nucleic acids)
Random or doped DNA pool
Trascribed RNA pool
cDNA
Regenerated DNA pool1. Generazione di una
diversità di sequenza (sintesi chimica, manipolazione enzimatica, PCR)
2. Selezione di forme funzionali attraverso il legame con il bersaglio e l’eliminazione di molecole non affini
3. Amplificazione della popolazione selezionata con metodiche di PCR
4. Step successivi di selezione e riamplificazione per isolare le molecole più efficienti
DNA SELEX ( Selection of functional nucleic acids)
• la libreria di oligo contiene 1013 -1015 molecole
• ciascuna molecola è di 20-100 nt
• ciascuna molecola contiene sequenze di fiancheggiamento che permettono l’appaiamento dei primers necessari per la reazione di PCR
• per la reazione di SELEX le molecole di DNA sono a singolo filamento (ottenute per separazione di prodotti di PCR)
RNA SELEX ( Selection of functional nucleic acids)
La libreria di oligo contengono 1013 -1015
molecole di RNA a singolo filamento
ottenute tramite la trascrizione in vitro
di templati a doppio filamento di DNA
mediante polimerasi T7
METODI ALTERNATIVI PER L’IDENTIFICAZIONE DI APTAMERI
Il gruppo di Clary alla Duke University ha identificato oligonuceotidi che si legavano a un tumore indotto in topo.
Gli oligo sono stati iniettati in vivo, poi estratti dalla massa tumorale e amplificati. Due degli oligo selezionati legavano un biomarcatore tumorale (P68) molto espresso nel tumore indotto nei topi.
POTENZIALE TERAPEUTICO DEGLI APTAMERI 1.
• Possono essere utilizzati come gli anticorpi, ma hanno il vantaggio di essere prodotti di sintesi (quindi sono scevri da contaminazioni virali/batteriche)
• Non sono immunogenici
• Possono essere funzionalizzati o legati a molecole di riconoscimento
• A differenza di aODN possono agire su target extracellulari: generalmente bloccano interazioni ligando- recettore e quindi hanno funzioni di “antagonisti” per recettori di membrana
• Molecole dotate di capacità traslazionale (dal laboratorio all’ospedale)
POTENZIALE TERAPEUTICO DEGLI APTAMERI 2.
Limitazioni nell’uso di aptameri in terapia
• Difficolta’ di predizione delle caratteristiche farmacocinetiche
• Breve emi-vita dovuta a filtrazione renale (dovuta alle loro ridotte dimensioni)
• Degradazione rapida nel circolo (fino a 2 min per oligo naturali, ma prolungabile fino a 24h nell’uomo mediante PEGilazione es. Macugen Pfizer/Eyetech)
• Problemi brevettuali (il brevetto per la tecnologia SELEX –systematic evolution of ligands by exponential enrichment) è in scadenza (US PATENT 5271163 del 14/12/1993)
• Difficoltà di penetrazione di membrane biologiche
MODIFICAZIONI CHIMICHE PER AUMENTARE LA POTENZA TERAPEUTICA DEGLI APTAMERI
Aumento emivita
• Tutte le modificazioni chimiche descritte per aODN
• Coniugazione al 5’ con polietilenglicole (PEG)
• Uso di Spigelmers in cui lo zucchero è un enantiomero del ribosio (L-ribonucleotidi sono pessimi substrati per le nucleasi, ma anche per la polimerasi)
• ”capping” dei nucleotidi a livello 3’
L’unico aptamero in commercio (pegaptanib) è peghilato
TOSSICOLOGIA DEGLI APTAMERI
Possono agire quali anticoagulanti/attivatori del complemento e stimolatori della immunità innata
L’azione anticoagulante forse associata al fatto che il DNA è un polianione come l’eparina
L’azione di attivazione del complemento pare essere legata alla possibilità degli oligonucleotidi di legarsi al fattore H del complemento
BLOCCO DELLA ATTIVITA’ ANTICOAGULANTE DI
APTAMERI
L’INIEZIONE DI OLIGONUCLEOTIDI “ANTISENSO”
NEI CONFRONTI DI QUELLO TERAPEUTICO HA
FUNZIONATO COME “ANTIDOTO”
APTAMERI IN CLINICA
APTAMERI IN CLINICA
Pegaptanib (Pfizer/Eyetech) – approvato dalla USFDA nel 2004 e sul mercato per la terapia della degenerazione maculare. Si tratta di un aptamero che lega il VEGFA con una affinità pari a 49pM. Originariamente identificato in una libreria SELEX, una volta selezionato è stato ridotto a 27 nt con sostituzione di 12 delle 14 ribopurine con 2’-o-metil-purine per limitare la sensibilità alle nucleasi. Inoltre il nucleotide è stato peghilato per aumentarne la stabilità e limitare la sua capacità di distribuirsi nei tessuti.
Viene somministrato tramite iniezione intravitrea (0.3 mg/occhio) una volta ogni 6 settimane per limitare la angiogenesi aberrante causata dalla maculopatia.
In competizione con i frammenti di anticorpo Ranimizumab (Genetech, Lucentis) che lega tutte le forme di VEGFA.
AS1411
Oligo di 26 nucleotidi (solo G e T) che pare esercitare effetti antiproliferativi legando la nucleolina (una proteina coinvolta nella sintesi e maturazione dei ribosomi).
L’aptamero inoltre pare destabilizzare la proteina Bcl2 in B-linfomi,
e NFkB.
AS1411 è in fase clinica II per la cura della leucemia mieloide acuta e per il tumore del rene
REG1 (Regado Biosciences)
Un aptamero specifico per il fattore di coagulazione IX per il quale ha una affinità pari a 2.8 nM in studio per operazioni di intervento percutaneo sulle coronarie.
Contiene 34 nucleotidi e proviene da uno screening SELEX di una libreria di molecole 2’-ribo purine/2’-fluoropirimidine.
ARC1779 (Archemix)
Un aptamero che lega il dominio A1 del fattore di vonWillebrand (Kd=2nM) e ha effetto antitrombotico senza attività anticoagulante.
E’ stato identificato nello screening di una library di oligodegenerati ed è stato troncato a 39 nucleotidi. La sequenza è stata prodotto come fosfotioato con un cap al 3’, l’oligo è peghilato.
In fase II per microangiopatie trombotiche in pazienti con patologie della carotide che subiscono chirurgia della carotide.
NOX-A12 (NOXXON Pharma)
Lega il ligando della chemochine 12, una chemochina ritenuta rilevante nella metastatizzazione tumorale e nella angiogensi.
E’ un L-RNA (Spiegelmer) sviluppato per trapianto autologo di cellule emopoietiche in pazienti con linfoma non-Hodgkin (attualmente in fase I)
APTAMERI IN DIAGNOSTICA
Aptamero legante della tenascina per imaging di neoplasie in sviluppo da parte della Schering AG
SVANTAGGI DEGLI APTAMERI COME FARMACI
1. Come gli aODN sono molecole relativamente poco stabili
2. Problemi nella distribuzione e nella biodisponibilità
3. Costo di produzione
NB. Possono però essere modificati chimicamente per aumentarne la stabilità e si possono utilizzare le metodologie di veicolazione già viste per gli ODN
VANTAGGI DEGLI APTAMERI COME FARMACI
1. Interagiscono specificatamente con i loro target
2. La grande area superficiale degli acidi nucleici permette la formazione di più interazioni con il bersaglio rispetto ai farmaci classici, ciò determina un legame molto stretto (Kd nel range nanomolare e picomolare)
3. Sono in grado di inibire la funzione del loro bersaglio ma anche di modificare il metabolismo associato a quel bersaglio es. aptameri anti-trombina bloccano anche la coagulazione del sangue
UTILIZZO DEGLI APTAMERI
L’UTILIZZO TERAPEUTICO è ancora incerto
Sono utili MEZZI DIAGNOSTICI grazie alla loro alta affinità e specificità per il bersaglio.
Come gli anticorpi possono essere legati a molecole radioattive o ad enzimi la cui attività può essere facilmente valutata. Sono però più piccoli e maneggevoli degli anticorpi
Referenze bibliografiche:
Aptamers as therapeuticsAD Keefe, S Pai and A EllingtonNature Review on Drug Discovery 9:537, 2010
DECOY
Sono brevi sequenze di DNA omologhe ad
una sequenza consenso per una proteina
transattivante. Il decoy inibisce la funzione
della proteina legandosi in modo
competitivo al sito di riconoscimento della
proteina con la sequenza consenso
MECCANISMO D’AZIONE DI DECOY CHE INIBISCONO LA PROLIFERAZIONE CELLULARE
TTTCGCGC
TTTCGCGC
TTTCGCGC
TTTCGCGC
TTTCGCGC
TTTCGCGC
TTTCGCGC
E2F
E2F
E2F
cdk
cdk
cdk
P
P
P
RB
RB
RB
Ciclina A
Ciclina A
Ciclina ASilente
Silente
Transattivante
C-mycC-mybCdc2KinasePCNA
oligonucleotide mimicking a negative regulatory sequence of promoter C of estrogen receptor alpha (ER alpha) gene is sufficient for its re-expression in ER-negative human cancer cell lines
NFκB decoy oligo therapy for IBD (Inflammatory Bowel Disease)
E2F Decoy Transfection by HVJ-AVE–Liposome Method Cardiac Allograft Arteriopathy
DECOYS IN THERAPY
NUOVI TARGET TERAPEUTICI
DIFFERENZE APTAMERI/DECOY
APTAMERI• RNA o DNA singolo o doppio
filamento
• Omologhi di consensus dell’RNA
• legano proteine citoplasmatiche
DECOY• ODN a doppia elica
• Omologhi di consensus del DNA
• legano proteine nucleari
GLI OLIGONUCLEOTIDI ANTI-GENE (TRIPLEX)
L’oligonucleotide si lega in modo specifico al DNA, intercalandosi nella struttura a doppia elica, formando un tratto di catena tripla che determina l’inattivazione della replicazione del DNA e della trascrizione dell’mRNA
VANTAGGI DELLA TERAPIA ANTIGENE RISPETTO AGLI ODN
Tale modalità di impiego mostra prospettive alquanto interessanti poiché l’azione diretta sul gene implica l’uso di quantità inferiori di ODN essendo in questo caso solo due i targets (le due copie del gene) rispetto ai numerosissimi targets della strategia ODN (le copie dell’mRNA). Si garantisce inoltre una più durevole attività terapeutica contando sulla maggiore durata dell’emivita del gene rispetto a quella del messaggero.
Questa strategia comporta la formazione di un breve tratto a tripla elica (mediante legami di Hoogsteen) nelle regioni di controllo della trascrizione presenti nel DNA.
TRIPLEX
Le prime indicazioni, indirette circa la possibilità di formazione di un tratto di DNA a tripla elica risale a studi sulla densità ottica con miscele di poli U e poli A condotti da B. Felsenfeld nel 1957.
Hoogsteen chiarisce la natura dei legami che consentono la formazione della tripla elica in tratti omopurinici e omopirimidinici (AG o TC). In questo contesto la C non presenta atomi disponibili per un ponte idrogeno con la G prospiciente e deve essere quindi protonata. Tale reazione può avvenire a un pH leggermente acido (6,6) e in presenza di ioni bivalenti. In queste condizioni l’ODN ibridizza con la sequenza omopurinica complementare mediante legami di Hoogsteen, formando così le due triplette T-AT e C-GC. L’ODN si colloca nel solco maggiore del duplex preesistente con una orientazione parallela alla sequenza omopurinica del DNA bersaglio.
LEGAMI DI HOOGSTEEN
PROBLEMATICHE DELLA TERAPIA ANTI-GENE
1. Il bersaglio deve essere costituito da sequenze omopuriniche/pirimidiniche
2. La lunghezza della sequenza bersaglio deve essere minimo di 15 nucleotidi consecutivi
3. Il rapporto A/G non deve essere inferiore a 4
molte sequenze 5’ rispetto ai DNA codificanti hanno tratti omopurinici
4. Tutte le C devono essere protonate e quindi occorre agire a pH più bassi di quello fisiologico.
Questo problema può essere superato con alcuni stratagemmi
METODICHE PER SUPERARE L’OSTACOLO DELLA PROTONAZIONE
1. utilizzo nella sintesi dell’ODN di 5-metilcitosina che consente l’ibridizzazione al duplex anche a pH neutri
2. Utilizzare ODN costituiti da PNA che hanno una migliore capacità di ibridizzare
3. Utilizzo di molecole intercalanti legate all’ODN, capaci di legare una base sul duplex conferendo una maggiore stabilità alla tripla elica
4. Sostituire la base citosina con l’eterociclo 2-aminopiridina, il cui pKa è maggiore di quello della citosina e ciò favorisce il legame a pH neutro
Watson-Crick PNA Strand
HoogsteenPNA Strand
DNA Strand
N
N
N
N
N
Watson - Crick
HH
Hoogsteen
N
NO H
O
CH3
N N
CH3
O
O
H
T
A
T
NH3+ C T C T T C T T C
'3 G A G A A G A A G 5'
COO- C T C T T C T T C
PNA Strand invasion
COO-
NH3+
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
CHIMICA DEL LEGAME PNA-DNA
I PNA possono legarsi al DNA sia attraverso legami idrogeno sia di Hoogsteen
I RIBOZIMI
RIBOZIMI NATURALI
Producono nel taglio di un RNA substrato estremità 3’OH e 5’ fosfato.Sono raggruppabili in classi in base alla loro struttura ed alle reazioni in cui sono coinvolti
RNAsi P: Ubiquitaria, è responsabile della maturazione dei tRNA nel loro estremo 5’
RNAsi HRP: Replicazione DNA mitocondriale tagliando RNA primer
INTRONI tipo I: Tetrahymena pre RNA mitocondriale di lievito
geni di cloroplasti
INTRONI tipo II: con meccanismo di splicing conservato (precursori di mRNA in organelli
di funghi e piante)
CARATTERISTICHE COMUNI AI RIBOZIMI
Reazione di formazione e rottura di legami covalenti in molecole substrato a RNA
I ribozimi sono catalizzatori di reazioni che li vedono altresì implicati come substrato
La struttura tridimensionale dell’enzima determina la sua specificità di legami con il substrato a creare il sito catalitico
Le reazioni catalizzate sono basate sullo scambio di protoni (con conseguente idrolisi o transesterificazione risultanti nel taglio di legami fosfodiesterici)
I ribozimi sono metallo-enzimi
MECCANISMO D’AZIONE DEGLI INTRONI DI TIPO I
1. Attacco nucleofilo della guanina presente nell’ambiente
2. Generazione di un terminale OH
3. Seconda transesterificazione per attacco nucleofilo del terminale libero sul primo nucleotide dell’esone in 3’
SITI ATTIVI NEGLI INTRONI DI TIPO I
GGGAGG
GGGAGG 5'
G
GGGAGG5'
3'GOH
GGGAGG
G
+
G414
G-OH
3'
CUCUCU5'
G-binding site
Substrate binding site
IGS
ex1
ex2
414
3'1st transfer
CUCUCU5'
ex1
G
OH
ex2
ex1
ex2+
414
2nd transfer
UUUACCUG
3rd transfer
414
5'G UUUACCU
MECCANISMO D’AZIONE DEGLI INTRONI DI TIPO II
• Usano il 2’ OH di una adenina interna all’introne
• Attacca il 5’ fosfato sul primo nucleotide dell’introne
• L’introne assume una struttura circolare tipica detta “lariat”
• Gli esoni sono uniti e l’introne è exciso mantenendo la struttura “lariat”
• Un enzima appositamente deputato taglia il “lariat” e origina un introne lineare
• L’introne lineare viene degradato
2’
AHO
2’
Exon 1 Exon 2
OH
A
Exon 1+22’ A
+
STRUTTURA DEI RIBOZIMI HAMMERHEAD
Lo schema rappresenta il cambiamento di struttura in due fasi, indotto dal legame di ioni Mg2+.La prima fase consiste nella formazione di un dominio coassiale tra due eliche la seconda genera il core catalitico.Il ribozima con la struttura finale è in grado di auto-tagliarsi nel punto indicato dalla freccia rossa
STRUTTURA CRISTALLOGRAFICA DEI RIBOZIMI HAMMERHEAD
La struttura cristallina evidenzia 5 siti di legame per il Mg2+
STRUTTURA SECONDARIA E TERZIARIA DEI RIBOZIMI HAMMERHEAD
La sequenza CUGA adiacente allo stem loop I è sufficiente per il taglio
Struttura terziaria
RIBOZIMI MECCANISMO D’AZIONE -1
RNA è una molecola meno stabile del DNA perché l’O in 2’ può attaccare il legame fosfodiesterico adiacente (attacco nucleofilo) e romperlo, lasciando un fosfato 2’-3’ ciclico e un ossidrile in 5’.
MODALITA’ DI TAGLIO DI RNA:
RNAsi P e introni di tipo I e II catalizzano l’idrolisi del legame fosfodiesterico, lasciando un fosfato in 5’ e un ossidrile in 3’
Le reazioni di taglio che dipendono dall’O in 2’ possono essere attivate in due modi:1) Ambiente alcalino: l’O in 2’ si attiva per ionizzazione
2) Ribonucleasi A catalizza la reazione di taglio usando un residuo basico di istidina per spostare il protone dell’O al 2’ e un residuo acido di aspartato per trasferirlo al 5’
La carica positiva di un residuo di lisina adiacente interagisce con il fosfato e lo stabilizza durante lo stato di transizione.
Il fosforo tende ad assumere una conformazione a bipiramide trigonale durante lo stato di transizione e questo può spiegare perché il taglio mediato dall’O al 2’ è più rapido in presenza di nucleotidi (pirimidina, adenosina) specifici perché le interazioni tra basi possono influenzare la conformazione del legame fosfodiestere
RIBOZIMI MECCANISMO D’AZIONE -2
APPLICAZIONI TERAPEUTICHE DEI RIBOZIMI-1
Ribozima con mRNA corretto
Sono attivi in “CIS” cioè intramolecolarmente. Studi in
corso prevedono manipolazioni per indurli a lavorare in
“TRANS” ad esempio per il riparo di RNA mutati o
danneggiati.
Esempio: ripristino del controllo della proliferazione cellulare agendo su p53
mRNA mutato
+
mRNA corretto mRNA scartato ribozima
+ +
ANGIOZYME TM
HEPTAZYME TM
Ribozima disegnato per inibire il VEGF (Vascular EndothelialGrowth Factor).
ANGIOGENESIS
Ribozima che lega sequenze altamente conservate del virus dell’epatite C
HCV DRUG RESISTANCE
RIBOZIMI IN CLINICAL TRIALS-1