BASI MOLECOLARI DELL’AZIONE DEL FARMACO BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 8 Ingegneria cellulare CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi
BASI MOLECOLARI DELL’AZIONE DEL FARMACO
BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE
LEZIONE 8Ingegneria cellulare
CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO
Adriana Maggi
Ingegneria Cellulare
Modificazione del genoma di cellule in coltura mediante mutazioni del genoma stesso o mediante l’inserimento di DNA
esogeno
Finalità dell’ingegneria cellulare applicate alla farmacologia
•Identificazione di bersagli di farmaci
•Screening di farmaci
•Produzione di proteine terapeutiche
•Terapia cellulare
Ingegneria cellulare considerazioni preliminari
1. Gene/processo di interesse
2. Tipo di cellula da transfettare
3. Scelta del vettore
4. Modalità di transfezione/infezione
5. Applicazioni
La scelta del sistema cellulare 1.
• coltura primaria
• cellula immortalizzata
• linea tumorale
Scelta del sistema cellulare 2.
2. Efficienza di transfezione
3. Modificazioni post-traduzionali
4. Espressione di fattori di regolazione dell’espressione genica
5. Facilità di analisi immunologica o di purificazione della proteina (espressione di proteine omologhe)
1. Facilità di coltura e stabilità
Scelta del vettore per ingegneria cellulare
1. La scelta del vettore
Determinata dal tipo di sistema che si vuole generare:
1. iperespressione proteica
2. espressione regolata per studio della funzione del gene, per produzione limitata nel tempo
3. studio della regolazione della espressione di un gene
Vettori per ingegneria cellulare
sequenze per la replicazione in procariote
Cassetta di espressione
Polylinker Promotore (virale, tess. specifico,inducibile ,
ecc.)
Modificazioni posttrascrizionali (Siti di: terminazione della trascrizione; poliadenilazione;
segnali di splicing )
Marcatori di selezione
Vettori di espressione: il vettore pCI-neo Promotore virale
Introne chimerico
Polylinker
Poliadenilazione
Promotore T7 pol
Promotore T3 pol
Origine di replicazione del fago f1
Neo resistenzaPromotore virale
Poliadenilazione
Amp resistenza
E.Coli ori
Arrivata fino a qui 26 novembre
T-antigen e cellule COS.
L’uso di cellule COS consente di ottenere alti livelli di
espressione di proteine esogene senza l’utilizzo di promotori
virali forti. Il gene è clonato in un plasmide che include l’origine di replicazione virale di SV40. Le cellule Cos contengono, nel loro
genoma, il gene codificante per il T-antigen, una proteina che
riconosce l’origine di replicazione di SV40 e stimola una massiccia replicazione del
plasmide.
Promotori inducibili: il repressore LacIq
Promotori inducibili: il sistema Tet-on/Tet-off
Utilizzando il sistema di regolazione trascrizionale dell’operone responsabile della tetraciclina-resistenza di E. Coli è possibile regolare l’espressione di un transgene.
Il sistema è composto da un transattivatore chimerico che lega tet-responsive-element TRE espresso in modo costitutivo (promotore virale o tessuto-specifico)
Il gene la cui trascrizione deve venire regolata è sotto il controllo di un promotore contenente TRE
E’ necessario cotransfettare un plasmide contenente il fattore di regolazione ed un plasmide contenente il
transgene sotto il controllo trascrizionale di un promotore responsivo alla tetraciclina.
Il sistema Tet-on/Tet-off
pCMV tetR VP16 Tet-OFF
pCMV rtetR VP16 Tet-ON
TRE Pmin CV Gene of interest
Transcription
Plasmidi codificanti
per l’elemento di regolazione
Plasmide contenente il transgene
Il sistema Tet-off basato sulla produzione della proteina transattivante tTA
è represso in presenza di tetraciclina o dell’analogo doxiciclina
Il sistema Tet-On basato sulla produzione della proteina transattivante rtTA
è indotto in presenza di tetraciclina o dell’analogo doxiciclina
Ricombinazione omologa e gene targeting
Es. di gene targeting
GENE knock-out; GENE Knock-in
Integrazione random
Integrazione sito specifica
3. Modalità di trasfezione
Transfezione transiente o stabile
Tecnologia per la transfezione
Transfezioni stabili o transienti
Transfezioni transienti: il gene esogeno entra nel nucleo e viene trascritto dalla RNA pol II ma non si
integra nel genoma della cellula transfettata. Viene perduto dopo pochi cicli replicativi
Transfezioni stabili: il gene esogeno viene integrato nel genoma della cellula ed in presenza
di una adeguata pressione selettiva viene mantenuto per numerosi passaggi in coltura.
La probabilità di integrazione stabile è dell’ordine di 10-4, 10-6 sul totale delle
cellule transfettate
Transfezione stabile
Durante le prime 48 ore dopo la transfezione, fino al 50% delle
cellule contengono il DNA esogeno. In seguito, a causa della degradazione e della diluizione, le
cellule che non hanno integrato tale DNA nel loro genoma lo
perdono. Per isolare le cellule transfettate stabilmente occorre applicare una pressione selettiva, utilizzando un apposito marker di
selezione.
Marcatori di selezione per cellule di mammifero
Tk fosforila la timidina
Aminopterina (Inibisce sintesi
timidina-P)
Timidina chinasi (Tk)
XGPRT sintetizza GMPAcido micofenolico(Inibisce sintesi GMP)
Xantina-guanina fosforibosil
transferasi (XGPRT)
Inattiva Xyl-A9--D-furanosil (Xyl-A) (danneggia
DNA)
Adenosina deaminasi (ADA)
HPH inattiva igromicina
Igromicina B (Inibitore sintesi proteica)
Igromicina fosfotransferasi (HPH)
Variante resistente DHFR
Metotrexate (Inibisce DHFR)
Diidrofolato reduttasi (DHFR)
APH inattiva G418G418 (Inibitore sintesi proteica)
Aminoglicoside fosfotransferasi (APH)
MECCANISMOFARMACOENZIMA
Transfezione stabile - applicazioni
Generazione di linee cellulari con caratteristiche specifiche per la produzione di
biofarmaci o lo screening di molecole farmacologicamente attive.
Servono markers specifici per poter selezionare le cellule transfettate
Transfezione transiente - applicazione
Studio della regolazione dell’espressione genica con sistemi reporter
Studio dei meccanismi di trasduzione del segnale
Identificazione di molecole attive su enzimi o recettori
Studi di correlazione struttura attività di mutanti
Il problema della espressione del transgene continuata nel tempo
fine lezione 7