BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE 2008/09 LEZIONE 1 CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi
Jan 11, 2016
BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE2008/09
LEZIONE 1
CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO
Adriana Maggi
Adriana Maggi
Via Balzaretti 9
Telefono 02-50318375
ORARIO RICEVIMENTO STUDENTI: venerdì
mattina (9:00-12:00)
…IL MEDICO ADOPRERA’ BENE
LE MEDICINE QUANDO LUI CONOSCERA’
CHE COSA E’ OMO,
CHE COSA E’ VITA E COMPLESSIONE,
CHE COSA E’ SANITA’…
LA FARMACOLOGIA STUDIA I FARMACI ELE INTERAZIONI CHE HANNO LUOGO TRA QUESTI
E GLI ESSERI VIVENTI
PER FARMACO SI INTENDE OGNI SOSTANZA DI PROVOCARE IN UN ORGANISMO MODIFICAZIONI
FUNZIONALI MEDIANTE UNA AZIONE CHIMICA O FISICA
IL FARMACOLOGO DEVE POSSEDERE CONOSCENZE:
SUI PRINCIPI ATTIVI
SULLA PATO-FISIOLOGIA GLI ORGANISMI SUI QUALI I FARMACI AGISCONO
Biotecnologie Farmacologiche
proteine umane proteine modificate anticorpi umanizzati acidi nucleici cellule
applicazione delle conoscenze di biologia/biologia molecolare nel disegno di nuovi farmaci
Farmaci biotecnologici
La rilevanza dei processi di regolazione della espressione genica
nel disegno di nuovi farmaci
MECCANISMI DI REGOLAZIONE DELLA ESPRESSIONE GENICA
ESPRESSIONE GENICA IN PROCARIOTE
Nei procarioti lo stesso enzima (RNAP) catalizza la sintesi di tutti e tre gli RNAa RNA polimerasi di procariote è un enzima di relativamente grandi dimensioni ed è formata da 5 subunità (~400 kDa): α2:le due subunità αalfa assemblano l’enzima e riconoscono i fattori di regolazione.
β: catalizza la sintesi di RNA β': lega il DNA in modo non specifico. ω: funzione non ben descrittaPer legare sequenze specifiche di DNA nel promotore dei geni bersaglio, l’enzima necessita del fattore σ . La struttura della RNAP ha una cavità di 55 Å di lunghezza e 25 Å di diametro dove si adatta con precisione il DNA a doppio filamento (20 Å ): la lunghezza della cavità è sufficiente per riconoscere un numero di circa 16 nucleotidi.
RNA POLYMERASE IN EUKARIOTE
RNA polimerasi I per la sintesi di pre-rRNA 45S, che matura a 28 S, 18S and 5,8S rRNA
RNA polymerase II per la sintesi dei precursori di RNAm e la gran parte degli snRNA. Richiede i fattori di trascrizione per legare con specificità il DNA bersaglio RNA polymerase III per lasintesi dei tRNA, rRNA 5S e altri piccoli RNA che
si trovano nel nucleo e citoplasma.
Cloroplasti e mitocodri hanno altri tipo di RNA polimerasi.
La trascrizione in eucariota
Le dimensioni dei nucleosomi sono di circa 260 kDLa polimerasi di eucariota è un enzima con diverse subunità che raggiunge le dimensioni di circa 500 kD
La polimerasi determina una alterazione della struttura nucleosomi che non è permanente
Il promotore di geni di eucariota
Caratterizzato da alta variabilità
Promotori riconosciuti dalla Polimerasi II in genere si trovano a monte del gene, hanno struttura modulare e si contraddistinguono per variabilità e si estendono percirca 200 pb (ad eccezione degli enhancers)
La polimerasi II riconosce i siti di “attacco” tramite interazioni con altri “fattori” proteici
- fattori generali di trascrizione (ubiquitari)- fattori di trascrizione inducibili
Roger Kornberg Nobel Price for chemistry 2006
In the figure: the transcriptional process depicted in 2001. Pol II in white;DNA helix in blue and the growing RNA strand in red
L’inizio della trascrizione in eucariota richiede un considerevole numero di proteine che riconoscono elementi in cis: si intende per promotore tutta la regione che contiene questi moduli di riconoscimento dei attori di trascrizione indispensabili per consentire la trascrizione efficiente e propriamente controllata in termini di inizio
Generalmente la regolazione in eucariote è in positivo, esistono tuttavia repressori anche in eucariote
Generalmente una unità trascrizionale di eucariota è costituita da un singolo gene
Le polimerasi di eucariota sono enzimi composti da diverse subunità (8-14) e raggiungono le dimensioni di circa 500kD. La Pol II si caratterizza per un dominio carbossi-terminale con sequenze amminoacidiche ripetitive ricche di treonine e serine
Differenze significative tra promotore procariota e eucariota
TBP + 12 TAFs (TBP ass. factors)
TFIID recognizes TATA (Inr)
TFIIA; TFIIB; TFIIF
TFIIE; TFIIH
TFIIF pol II bindingTFII H helicase and kinase
commitment
Pol II entry
Promoter clearence
Bob RoederLasker Award 2003
TBP lega il solco minore del DNA
Poiché nei nucleosomi le sequenze ATnel solco minore si affacciano all’interno della molecola, la presenzadi nucleosomi è incompatibile conil legame di questo complessoproteico
COMPLESSITA’ DEI PROMOTORI DI EUCARIOTA
COMPLESSITA’ DEI PROMOTORI DI EUCARIOTA
Si tratta di una sequenza di DNA in cui sono presenti diversi moduli:
TATA box a circa -30 pb dal sito di inizio della trascrizone importantePer il corretto inizio della trascrizione
CAT box a circa –80 pb che determina l’efficienza del promotore(CAAT). Lega: proteine della famiglia CTF, CP1 eCP2 , C/EBP, ACF.
GC box a circa –90 pb (GGGcGG) anche presente in multiple copieE’ riconosciuto dal fattore SP1
Ottamero traget di proteine Oct
Enhancers es. SV40 due sequenze in tandem di 72 pb
Moduli specifici per fattori di trascrizione inducibili
UN ESEMPIO DI PROMOTORE DI EUCARIOTA COMPLESSO
Enhancer: - sequenza di DNA dove sono presenti diversi motivi strutturali riconosciuti da fattori che attivano la trascrizione che stimolano la trascrizione- funzionano anche a distanza dal gene trascritto- funzionano in ambedue gli orientamenti
Il meccanismo con cui agiscono rimane non ben chiarito:
Ipotesi iniziali cambiano l’intera struttura del templatopongono il promotore in una posizione conveniente (es. matrice nuclearefacilitano l’entrata dellla polimerasi
Aumentano la disponibilità di fattori di trascrizione nellavicinanza del promotore di cui influenzano la trascrizione
Meccanismi di metilazione del DNA e eredità epigenetica
Meccanismi di metilazione del DNA e eredità epigenetica
Circa il 2-7% delle citosine nel DNA animale subisce metilazione ad opera di
specifici enzimi che agiscono su sequenze palindromi:
5’ mCpG 3’3’ GpCm 5’
ESPRESSIONE GENICA E’ GENERALMENTE
ASSOCIATA CON DEMETILAZIONE
I GENI “HOUSEKEEPING” SONO ESPRESSI INMODO COSTITUTIVO E CONTENGONONEL LORO PROMOTORE MOLTE “ISOLE” CpGNON METILATE
CpG islands are genomic regions that contain a high frequency of CG nucleotides. In mammalian genomes, CpG islands are typically 300-3,000 base pairs in length. They are in and near approximately 40% of promoters of mammalian genes (about 70% in human promoters).
The "p" in CpG notation refers to the phosphodiester bond between the cytosine and the guanine.
The usual formal definition of a CpG island is a region with at least 200 bp and with a GC percentage that is greater than 50% and with an observed/expected CpG ratio that is greater than 60%.
Another recent study revised the rules of CpG island prediction in order to exclude other GC-rich genomic sequences such as Alu repeats. Based on an extensive search on the complete sequences of human chromosomes 21 and 22, DNA regions >500 bp with a GC content >55% and observed CpG/expected CpG of 0.65 were more likely to be the true CpG islands associated with the 5' regions of genes.
PROCESSI DI ACETILAZIONE E DEACETILAZIONE SONO IMPORTANTINELLA REGOLAZIONE DELLA ATTIVITA’ DELLA CROMATINA
ESPRESSIONE GENICA E’ GENERALMENTE
ASSOCIATA CON ACETILAZIONE
Acetylation of the lysine residues at the N terminus of histone proteins removes positive charges, thereby reducing the affinity between histones and DNA. This makes RNA polymerase and transcription factors easier to access the promoter region. Therefore, in most cases, histone acetylation enhances transcription while histone deacetylation represses trancription .
Acetylation and deacetylation of the lysine residue.
Histone acetylation is catalyzed by histone acetyltransferases (HATs) and histone deacetylation is catalyzed by histone deacetylases (denoted by HDs or HDACs). Several different forms of HATs and HDs have been identified. Among them, CBP/p300 is probably the most important, since it can interact with numerous transcription regulators
Acetilasi e deacetilasi sono associate a co-regolatori della espressione genica (attivatori e repressori, rispettivamente
(es. - p300/CBP che interagisce con diversi fattori di trascrizione Myo D e AP1 è una acetilasi che acetila N-terminus di H4: questo enzima è bersaglio di proteine virali - PCAF acetila H3, ecc
- Sin3, fa da proteina ponte tra SMART e HDAC per inibire recettori intracellulari, quali RAR)
I PROCESSI DI METILAZIONE GIOCANO UN RUOLONELLA PATOGENESI UMANA