UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO Centro de Ciências Biológicas Doutorado em Ciências Biológicas CLÁUDIO GALVÃO DE SOUZA JÚNIOR Tese de Doutorado APLICAÇÃO DE CÉLULAS RECOMBINANTES DA LEVEDURA Kluyveromyces marxianus EM SORO DE QUEIJO RECIFE 2004
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
Centro de Ciências Biológicas
Doutorado em Ciências Biológicas
CLÁUDIO GALVÃO DE SOUZA JÚNIOR
Tese de Doutorado
APLICAÇÃO DE CÉLULAS RECOMBINANTES DA LEVEDURA
Kluyveromyces marxianus EM SORO DE QUEIJO
RECIFE 2004
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
Centro de Ciências Biológicas
Doutorado em Ciências Biológicas
CLÁUDIO GALVÃO DE SOUZA JÚNIOR
Tese de Doutorado
APLICAÇÃO DE CÉLULAS RECOMBINANTES DA LEVEDURA
Kluyveromyces marxianus EM SORO DE QUEIJO
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Pernambuco como
parte dos requisitos para obtenção do grau de
Doutor na área de concentração em Genética.
Orientador: Dr. Marcos Antônio Morais Júnior
Recife 2004
APLICAÇÃO DE CÉLULAS RECOMBINANTES DA LEVEDURA
Kluyveromyces marxianus EM SORO DE QUEIJO
CLÁUDIO GALVÃO DE SOUZA JÚNIOR
BANCA EXAMINADORA
Prof. Marcos Antônio de Morais Júnior (Orientador) Doutor em Biologia Molecular pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Profª. Elza Áurea de Luna Alves Lima
Doutora em Ciências Biológicas pela Universidade Federal do Rio de Janeiro
Prof. Diogo Ardaillon Simões
Doutor em Microbiologia e Biotecnologia pelo Instituto Nacional de Ciências Aplicadas de
Toulouse, França.
Profª. Alexandra Amorim Salgueiro
Ph.D. em Microbiologia Aplicada pela Universidade de St. Andrews, Escócia.
Prof. Marco Antonio Zachia Ayub
Ph.D. em Biotecnologia pela Universidade de Manchester, Inglaterra.
Tese defendida no Auditório Professor Marcionilo de Barros Lins do Departamento de Bioquímica – UFPE, em 18 de junho de 2004
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes de K. marxianus... ii
SUMÁRIO
Pág
LISTA DE FIGURAS iii
LISTA DE TABELAS iv
RESUMO 05
ABSTRACT 06
1- INTRODUÇÃO 07
2- REVISÃO DA LITERATURA 10
2.1. Potencial biotecnológico das leveduras 11
2.2. Genética de leveduras 12
2.3. Expressão heteróloga em leveduras 14
2.4. A levedura Kluyveromyces marxianus 17
2.5. Vetores plasmidiais 20
2.5.1- K. marxianus transformada com o vetor plasmidial pDblet 24
2.6. K. marxianus em lactose 26
2.7. Soro-de-queijo 28
3- MATERIAL E MÉTODOS 31
4- ARTIGOS 42
4.1- Método simples e rápido de transformação por acetato de lítio de células da
levedura Kluyveromyces marxianus
43
4.2- Utilização do soro de queijo como meio de crescimento alternativo para linhagens
recombinantes de Kluyveromyces marxianus
47
4.3- Diminuição da atividade da enzima β-galactosidase em Kluyveromyces marxianus
CBS 6556 por altas concentrações de galactose
53
5- OUTROS RESULTADOS 59
5.1- Parâmetros fermentativos das células recombinantes 60
6 - CONCLUSÕES 67
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 69
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes de K. marxianus... iii
LISTA DE FIGURAS
Figura 12. Estabilidade plasmidial dos vetores pDblet e pDαAmy em células de K. marxianus
cultivadas em soro de queijo...........................................................................................
65
Figura 13. Atividade β-gal nos cultivos em soro de queijo das linhagens selvagem CBS 6556 (■)
e recombinantes KMDB-1 (•) e KαAMY (▲) da levedura K. marxianus......................
66
Pág
Figura 1. Desenho esquemático do mapa físico do vetor pDblet..................................................... 26
Figura 2. Hidrólise da molécula de lactose resultando em uma molécula de galactose e outra de
Glicose...............................................................................................................................
27
Figura 3. Desenho esquemático da construção do vetor pDαAmy pela inserção do gene STA 1 no
vetor pDblet.......................................................................................................................
36
Figura 4. Gel de agarose contendo os vetores estudados e seus fragmentos inseridos.................... 37
Figura 5. Desenho esquemático da construção do vetor pDKan pela substituição do inserto URA4
pelo fragmento Kanr (2,6 Kb) + URA3 (1,1 Kb)..............................................................
38
Figura 6. Desenho esquemático da construção do vetor pDHLZ pela substituição do inserto Kanr
do vetor pDKan pelo fragmento HLZ de 1,8 Kb..............................................................
39
Figura 7. Biomassa produzida pelo cultivo em soro de queijo das linhagens selvagem CBS 6556
( ) e recombinantes KMDB-1 (•) e KαAMY (▲) da levedura K. marxianus.................
63
Figura 8. Curva de crescimento das linhagens selvagem CBS6556 ( ) e recombinantes KMDB-1
(▲) e KαAMY (•) da levedura K. marxianus em soro de queijo.....................................
63
Figura 9. Consumo de proteína extracelular do soro de queijo entre as linhagens selvagem CBS
6556 ( ) e recombinantes KMDB-1 (•) e KαAMY (∆) da levedura K. marxianus.Os
resultados representam valores médios de experimentos em triplicata sob condições de
cultivo descritas no tópico 6.2.1.......................................................................................
64
Figura 10. Consumo de lactose do soro de queijo entre as linhagens selvagem CBS 6556 (■) e das
linhagens recombinantes KMDB-1 (•) e KαAMY (▲) da levedura K. marxianus.........
64
Figura 11. Variação do pH do soro de queijo durante o cultivo das linhagens selvagem CBS 6556
(∆)e recombinantes KMDB-1 (●) e KαAMY (□) da levedura K. marxianus ................
65
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes de K. marxianus... iv
Figura 14. Atividade proteásica extracelular nos cultivos em soro de queijo em linhagens
selvagem CBS6556 (◊) e recombinantes KMDB-1 (▲) e KαAMY ( ) da levedura K.
marxianus. Os resultados representam valores médios de experimentos em triplicata
sob condições de cultivo descritas no tópico 6.2.1 ........................................................
66
LISTA DE TABELAS
Pág
Tabela 1. Quadro comparativo da capacidade de utilização de diferentes de fontes carbono entre
duas espécies de Kluyveromyces e Saccharomyces ........................................................
17
Tabela 2. Estudo comparativo entre recombinantes das leveduras Saccharomyces cerevisiae
(MM10-2a) e Kluyveromyces marxianus (KMS2) portadores dos vetores epissomais
pE1 e pDblet em células ..................................................................................................
25
Tabela 3. Composição padrão do soro de queijo fresco................................................................... 29
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 5
RESUMO
A levedura Kluyveromyces marxianus Hansen tem sido apontada como
sistema biológico para estudos genéticos e biotecnológicos baseado nas suas
vantagens fisiológicas e bioquímicas. Contudo, a ausência de plasmídios
naturais e o pouco conhecimento sobre sua genética e comportamento têm sido
os principais entraves para estudos mais aplicados. Sua capacidade de utilizar
lactose como fonte de carbono possibilita o uso do soro de queijo, atualmente
um importante poluente da indústria de laticínios, como matéria-prima para
outros processos industriais. Buscou-se, portanto, construir vetores plasmidiais
eficientes e compatíveis com a levedura K. marxianus para avaliar a
capacidade de linhagens recombinantes utilizarem o soro de queijo como meio
de crescimento de baixo custo no processo de expressão de genes de interesse
industrial, tais como enzimas extracelulares ou peptídeos antimicrobianos. Este
trabalho permitiu verificar que: um método simples e rápido de transformação
mediado por acetato de lítio permitiu um aumento da eficiência de
transformação de células de K. marxianus em 2,5 vezes em relação ao método
convencional; o crescimento de células de leveduras recombinantes
transformadas com pDblet ou seus derivados não foi afetado pela alta
concentração de lactose no soro de queijo, apresentando perfil de crescimento
similar ao de células parentais. Esses dados sugerem a possibilidade do uso de
linhagens recombinantes de Kluyveromyces marxianus portadoras de
plasmídios baseados no pDblet para processos biotecnológicos a partir do soro
de queijo advindo das indústrias de laticínios.
Palavras chave: Kluyveromyces marxianus; soro de queijo; vetores
plasmidiais, leveduras recombinantes; parâmetros fermentativos.
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 6
ABSTRACT
The yeast Kluyveromyces marxianus Hansen has been pointed as a biological
system tool for biotechnological and genetic purposes, due its physiologic and
biochemical features. However, the absence of natural plasmids and the little
knowledge about its physiological behavior has been the main constrains for
advanced studies. K. marxianus ability to utilize lactose as carbon source
allows it to use cheese whey, an important by-product of the cheese making
industry, for potential value-added product formation. Therefore, compatible
and efficient cloning vectors were constructed for K. marxianus aiming to
evaluate the recombinant strains ability for cheese whey utilization, as an
alternative inexpensive growth substrate. It should be used for the expression
of gene of industrial interest, such as extra cellular enzymes or anti-microbial
peptides. The main results of this study show a rapid and simple LiAc-
mediated transformation procedure to produce K. marxianus transformants
with an efficiency of 2.5-folds higher than basic method. Growth of
recombinant yeast cells transformed with pDblet or its derivatives was not
affected by high lactose concentration in the cheese whey, presenting
fermentative profile similar to parental cells. These data suggest the use of
recombinant plasmid bearing strains of Kluyveromyces marxianus to further
process cheese whey from cheese making industry.
Key-words: Kluyveromyces marxianus; cheese whey; plasmidial vector,
recombinant yeast; fermentation parameters.
Endereço eletrônico do autor:
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 7
_______________________________________________1. INTRODUÇÃO
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 8
Entre os seres eucariontes, as leveduras têm sido os organismos mais
utilizados em genética molecular por aliar características vantajosas similares
às dos seres procariontes (unicelulares, com genomas pequenos e alta taxa de
crescimento) e de seres eucariontes (apresentam todo um sistema genético,
bioquímico e fisiológico deste grupo), o que possibilita estudar as funções
celulares de eucariontes, como expressão gênica e excreção protéica.
Saccharomyces cerevisiae é a levedura melhor estudada, devido à
aplicação e ao conhecimento acumulado na preparação de vinhos e cerveja e
na fabricação do pão, atividades conhecidamente milenares da civilização. A
aplicação desta levedura se estendeu para a moderna biotecnologia como
resultado do advento da tecnologia do DNA recombinante. Porém, existe um
grande número de espécies de leveduras, que, em sua maioria, são pouco ou
nada estudadas, mas que podem reunir melhores condições de uso específico
para determinados objetivos da biotecnologia.
A levedura Kluyveromyces marxianus é uma espécie industrialmente
mais atrativa quando comparada à S. cerevisiae e demais leveduras, devido às
suas características fisiológicas. Os conhecimentos adquiridos na utilização
industrial desta espécie de levedura na produção de biomassa alimentar,
inulinase e pectinase, bem como a sua maior capacidade de excreção protéica
em relação a Saccharomyces, fazem dela uma excelente candidata à produção
de proteínas heterólogas de interesse industrial. Notavelmente, a capacidade
desta levedura de consumir lactose possibilita a utilização de substratos como
o soro de queijo, um resíduo da industria de laticínios, responsável por
problemas de poluição de mananciais hídricos em todo o planeta pelo seu
descarte descontrolado.
Apesar de se tratar de um organismo não patogênico de uso seguro e alto
potencial industrial, K. marxianus não tem sido utilizada como hospedeira em
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 9
experimentos de clonagem gênica devido ao pouco conhecimento de seus
mecanismos genéticos e à falta de plasmídios endógenos que possibilitem a
construção de vetores de expressão. Portanto, o estabelecimento de um sistema
genético baseado em uma linhagem de K. marxianus portadora de um vetor
plasmidial de alta estabilidade e capaz de utilizar o soro de queijo como
substrato para a produção de biomassa alimentar e proteínas de interesse será
uma importante contribuição para o progresso da utilização industrial desta
levedura e um passo no avanço da biotecnologia microbiana.
OBJETIVOS:
• Geral:
Avaliar a capacidade do soro de queijo de ser usado como meio de crescimento de
baixo custo para linhagens recombinantes da levedura Kluyveromyces marxianus para
permitir a utilização deste importante dejeto industrial no processo de clonagem e expressão
de genes homólogos e heterólogos.
• Específicos:
1. Avaliar a influência da alta concentração de lactose do soro sobre o crescimento
celular e produção enzimática das linhagens estudadas;
2. Construir as linhagens recombinantes das células de K. marxianus com plasmídios
pDblet (linhagem KMDB-1) e pDαAmy (linhagem KMDα);
3. Avaliar o perfil de crescimento das linhagens recipiente e transformadas de
Kluyveromyces marxianus utilizando o soro de queijo como substrato para o cultivo;
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 10
__________________________________2. REVISÃO DA LITERATURA
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 11
2.1. Potencial Biotecnológico das Leveduras
As leveduras são microrganismos eucariontes, sapróbios ou parasitas,
dependentes de carbono orgânico como fonte de energia. São naturalmente
encontradas associadas a vegetais, insetos, húmus ou qualquer outro substrato
fornecedor de açúcar (Phaff, 1990). Seus diferentes habitats e características
diferenciadas de crescimento como baixo pH, onde apenas poucos
microrganismos podem se desenvolver, facilitam seu isolamento e manutenção
em laboratório (Phaff e Stamer, 1987).
Dentre as diferentes áreas de aplicação da biotecnologia de leveduras
pode-se citar a indústria de fermentação (vinhos, cerveja, pão e bioetanol), a
indústria química (enzimas, pigmentos, acidulantes de alimentos e redutores
químicos), a indústria farmacêutica (vacinas, probióticos, hormônios e fatores
sangüíneos), pesquisas biomédicas (metabolismo de drogas, doenças genéticas
humanas, câncer e AIDS), tecnologia ambiental (biorremediação, utilização de
subprodutos industriais, controle biológico e bioabsorção de metais) e as
pesquisas fundamentais (biologia celular e molecular, bioquímica e genética)
(Walker, 1998).
Com o advento da tecnologia do DNA recombinante novas aplicações
têm surgido para as leveduras além da tradicional importância na fermentação
de alimentos e bebidas. As leveduras geneticamente manipuladas têm sido
estudadas visando a produção de diversos agentes biofarmacêuticos para
prevenção e tratamento de doenças humanas (Walker, 1998). Particularmente,
os estudos de leveduras têm contribuído para a bioquímica, atuando na
elucidação da glicólise e natureza e função de enzimas (respiração, proteólise,
etc.), para a citologia, no que diz respeito ao mecanismo de mitose e meiose, a
biogênese de organelas e elucidação de rotas secretoras de proteínas, e para a
genética e biologia molecular, nos estudos de acasalamento celular, estrutura
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 12
de genomas e ácidos nucléicos, mecanismos de recombinação e reparação de
DNA, controle da expressão gênica, mapeamento e sequenciamento gênico,
controle do ciclo celular e funções dos oncogenes (Castilho-Valavicius et al.,
1992; Walker, 1998).
2.2. Genética de leveduras
As leveduras possuem genoma pequeno, não maior do que 15.000 kb e
com poucos íntrons e seqüências repetidas. Possuem cromossomos lineares e
de diferentes tamanhos, formados por cadeias de dupla fita de DNA associadas
às histonas H2, H3 e H4. Em função de não apresentarem a histona H1,
provavelmente formam nucleossomos com empacotamento menos denso do
que os de eucariontes superiores. Todo material genético se encontra
compartimentalizado em um núcleo bem definido, e dessa forma todo o
mecanismo transcricional e traducional, assim como a regulação da expressão
gênica é própria de organismos eucariontes (Perez-Ortin et al., 1989).
Dentre os eucariontes, as leveduras são os organismos melhor
caracterizados geneticamente. Saccharomyces cerevisiae, espécie mais
estudada, possui todo o seu genoma seqüenciado (Goffeau et al.,1996) e mais
de seis mil genes identificados, sendo mais da metade com função conhecida
(Oliver, 1996; Walker, 1998; Brachat et al., 2003). O número de cromossomos
de isolados de K. marxianus varia entre seis a doze, porém em sua maioria são
encontrados em número de oito cromossomos por célula. Após recentes
estudos baseados na construção de uma biblioteca genômica parcial (17% do
genoma total) de K. marxianus constatou-se uma grande proximidade
evolutiva entre esta espécie e a S. cerevisiae quanto à classificação funcional
dos genes seqüenciados (Llorente et al., 2000).
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 13
Assim como em todos os outros campos de estudo sobre leveduras, as
características reprodutivas desses organismos baseiam-se no estudo do ciclo
de vida da levedura de brotamento S. cerevisiae. As células desta levedura
podem existir principalmente em duas formas na natureza, haplóide ou
diplóide. Em células diplóides, o ciclo de vida mantém-se vegetativo até a
escassez dos nutrientes ou que outras condições de estresse ocorram, quando
então o ciclo meiótico passa a ser adotado. Na reprodução vegetativa
(assexuada), que ocorre por mitose, novas células são formadas a partir do
brotamento da célula mãe.
A exemplo do ciclo de vida mitótico de outros eucariontes, a interfase se
caracteriza por três sub-fases: a G1, que precede a síntese de DNA
cromossômico, a fase S, quando ocorre a replicação cromossômica e a fase
G2, que precede a mitose (Castilho-Valavicius et al., 1992). Em leveduras de
brotamento, na sub-fase G2 ocorre um crescimento lateral do protoplasma da
célula, o broto, que dará origem à formação da célula filha. Em geral o
tamanho do broto é um indicativo do estágio celular ao longo do ciclo
mitótico. Células sem broto estão na fase G1, com a presença de um pequeno
broto indicam já haver sido iniciada a mitose e, células portadoras de brotos
grandes (com, no mínimo, metade do tamanho da célula mãe) indicam a
ocorrência de segregação cromossômica, divisão nuclear e migração (Castilho-
Valavicius et al., 1992).
O ciclo meiótico em leveduras Ascomycetes é caracterizado pela
geração de quatro células haplóides (esporos) agrupadas em ascos. Nestes
ascos são encontradas duas células com o sinal de acasalamento a e outras
duas com o sinal de acasalamento α. As conjugações ocorrem unicamente
entre células de diferentes sinais de acasalamento. Em cepas selvagens, estes
dois tipos de células haplóides podem se interconverter para promover a
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 14
conjugação, isto é, uma célula a se tornar α ou vice-versa. Desta forma, a fase
haplóide das leveduras Ascomycetes selvagens se reduz apenas a um pequeno
período do ascósporo (Phaff, 1990). Os fatores que determinam os dois tipos
de sinais de acasalamento se localizam no lócus MAT (Mating type)
(Castilho-Valavicius et al., 1992; Walker, 1998). Estes fatores regulam uma
série de genes que determinam a capacidade das células se conjugarem e assim
formarem diplóides.
As cepas de leveduras preferencialmente usadas em laboratório para
estudos genéticos são heterotálicas, não portadoras da propriedade de
interconversão; desta forma, as células haplóides expressam sempre o mesmo
sinal de acasalamento (ou a ou α), o que impede o acasalamento e a
conseqüente recombinação, garantindo a estabilidade das informações
genéticas em estudo (Castilho-Valavicius et al., 1992).
2.3. Expressão heteróloga em leveduras
O estudo de genes heterólogos em leveduras tem início pela introdução
de fragmentos de DNA portando o gene de interesse. Fatores tais como alta
eficiência de transformação (introdução do DNA exógeno na célula) e boa
estabilidade (permanência por gerações) são essenciais para esse processo.
Os plasmídios, moléculas de DNA extracromossomal presentes
naturalmente em alguns microrganismos, têm sido utilizados como vetores de
inserção de fragmentos de DNA de interesse para estudos moleculares. Para
tanto, uma grande variedade de plasmídios originais de leveduras e
principalmente de bactérias tem sido geneticamente modificados para poderem
ser inseridos e mantidos nas células alvo (células hospedeiras). A molécula de
DNA inserida pode ser mantida na levedura integrada ao genoma ou como
plasmídio, a partir de dois tipos de vetores desenvolvidos para este fim: os
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 15
integrativos e os epissomais, respectivamente. Os vetores plasmidiais
desenvolvidos para estudo genético em leveduras apresentam propriedades
úteis para sua manutenção, propagação e expressão gênica, tanto em leveduras
como em bactérias. Isto porque toda a manipulação genética precedente à
expressão em células de leveduras é feita em células de Escherichia coli. Estas
características são próprias de vetores chamados bifuncionais (Ausubel et al.,
1989; Johnston, 1994).
As marcas de seleção de plasmídios para bactérias são geralmente genes
que codificam resistência a antibióticos, enquanto que as marcas de seleção
para leveduras geralmente são genes envolvidos na rota biossintética de
aminoácidos ou bases nitrogenada, que, por mutação, foram silenciados no
genoma da levedura. Assim, a seleção das células de leveduras portadoras de
plasmídio (transformadas) é monitorada pelo semeio das células em meio de
cultura desprovido do nutriente em questão, chamado meio seletivo. Desta
forma, apenas se desenvolvem neste meio aquelas células que possuem o
plasmídio (Ausubel et al., 1989; Guthier e Fink, 1991).
Deve-se ter cuidado especial na escolha de uma espécie hospedeira para
o vetor plasmidial para se obter rendimentos e prevenir problemas em etapas
posteriores como a instabilidade plasmidial e com a purificação do produto
desejado, assim como se faz importante o hospedeiro ter um conjunto de
técnicas moleculares bem estabelecidas (Ausubel et al., 1989).
A levedura S. cerevisiae, por ser considerada como um modelo de
organismo eucarionte, tem sido alvo de numerosos estudos nos mais diversos
campos da ciência. Nos últimos quinze anos, um grande número de técnicas
foi desenvolvido para estudos nessa espécie de problemas e funções comuns a
todas as células de seres eucariontes (Gellissen e Hollenberg, 1997). Em
função disso, essa levedura vem sendo utilizada como hospedeira nos
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 16
processos de clonagem e expressão gênica. S. cerevisiae tem muitas aplicações
industriais na produção de cerveja, vinho, álcool, fermento e proteínas
heterólogas. Seu uso data de milhares de anos e apesar de várias linhagens
terem sido selecionadas para vários fins, como boa produtividade em etanol e
tolerância a altos teores de etanol, existe algumas características que tornam S.
cerevisiae ainda imperfeita do ponto de vista industrial (Antunes, 2003). Três
problemas podem ser observados: 1) a glicose reprime a utilização de outras
fontes de carbono que estejam presentes no meio; 2) formação de glicerol sob
condições anaeróbicas; e 3) efeito “Crabtree” (produção de etanol sob
condições aeróbicas) (Olson e Nielsen, 2000).
Segundo Romanos et al., (1992), apesar de possuir um sistema genético
já bem estudado, a levedura S. cerevisiae apresenta inconveniências para a
produção em larga escala de algumas proteínas heterólogas, devido a certos
obstáculos, tais como a necessidade de fermentação alimentada para alcançar
altas densidades celulares, além da hiperglicosilação de algumas proteínas
heterólogas. Sistemas alternativos têm sido desenvolvidos com base em outras
leveduras, devido às suas propriedades metabólicas. Estudos de sistemas de
expressão utilizando as leveduras Kluyveromyces lactis Dombrowski e Picchia
pastoris Guilliermond estão bem adiantados e algumas linhagens e vetores de
expressão desta última já estão sendo comercializados. Contudo, o menor
tempo de geração, a maior diversidade de substratos e a capacidade de crescer
em temperaturas mais elevadas do que estas espécies indicam ser a K.
marxianus uma boa candidata a sistemas alternativos de expressão (Bergkamp
et al. 1993) (Tabelas 1 e 2).
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 17
Uma vez que as principais técnicas moleculares adotadas na
manipulação de Kluyveromyces são provenientes de estudos com linhagens de
S. cerevisiae (Bergkamp et al., 1993; Iborra, 1993), adaptações e
melhoramentos têm sido alvo de pesquisas visando aumentar eficiência de
transformação em K. marxianus.
2.4. A levedura Kluyveromyces marxianus
K. marxianus é um fungo pertencente ao filo Ascomycota, à
ordem Saccharomycetales e à família Saccharomycetaceae. Esta família inclui
leveduras que são predominantemente unicelulares e podem produzir
pseudomicélio, têm reprodução assexuada primariamente por brotamento
Fontes de carbono assimiladas (fonte: Kreger-van Rij, 1984). Legenda: (+) assimila, (-) não assimila, (v) depende da linhagem, (nd) não determinado.
Tabela 1: Quadro comparativo da capacidade de utilização de diferentes de fontes carbono
entre duas espécies de Kluyveromyces e Saccharomyces cerevisiae.
Fonte de Carbono K. marxianus K. lactis S. cerevisiae
Lactose V + -
Inulina + - nd
Maltose - v v
Rafinose + v v
Sacarose + v v
Celobiose + + -
D-Ribose + - -
D-Xilose + v -
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 18
multilateral e que produzem ascosporos que se originam tanto de um zigoto
como partenogeneticamente (Alexopoulos et al., 1996).
K. marxianus apresenta características ideais para utilização
industrial, tais como altas taxas de crescimento, capacidade de ser cultivada a
temperaturas elevadas (40 a 45oC) e em ampla faixa de pH (2,6 a 6), e a
utilização de uma grande variedade de açúcares como fonte de carbono, como
por exemplo lactose e frutanos, mediante a produção de lactase e inulinase
(Grootwassing e Fleming, 1980). Essa levedura é considerada como organismo
GRAS (Generally Recognized as Safe) pelo FDA (Food and Drug
Administration) dos EUA, e sua capacidade de utilizar lactose como fonte de
carbono poderá possibilitar o uso do soro de queijo, atualmente um importante
poluente da indústria de laticínios, como matéria-prima para outros processos
industriais (de Mercado, 1995). A lactase (β-Galactosidase) produzida por esta
levedura é utilizada para reduzir os níveis de lactose do leite, possibilitando o
consumo do leite hidrolisado e seus derivados por indivíduos com intolerância
à lactose, os quais compreendem aproximadamente 70% dos brasileiros, e
também para resolver os problemas de cristalização do doce-de-leite, que
ocorrem durante a estocagem, devido à baixa solubilidade da lactose (Furlan et
al., 2000).
Dois outros campos têm sido explorados pela fermentação por K.
marxianus: a produção de biomassa e a produção enzimática. Esta levedura
pode ser utilizada como complemento alimentar, atuando como probiótico em
ração para aves, bovinos e suínos. A biomassa celular pode suprir estas rações
com “fatores de crescimento” reduzindo os custos com a suplementação
vitamínica (de Mercado, 1995; Furlan et al., 2000). Outrossim, a K. marxianus
possui uma alta produtividade enzimática que, se aliada a eficientes sistemas
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 19
de expressão e secreção de proteínas, pode ser explorada para a produção de
proteínas heterólogas (Van den Berg et al., 1990; Laloux et al., 1991).
Comparativamente, os conhecimentos acumulados pela utilização
industrial de K. marxianus na produção de biomassa alimentar, inulinase e
pectinases, bem como na expressão e secreção de proquimosina bovina (Van
den Berg et al., 1990), confirmam que essa espécie tem uma capacidade de
produção maior que a de S. cerevisiae, o que a torna uma excelente candidata à
produção de proteínas heterólogas de interesse industrial (Laloux et al., 1991).
Tal como S. cerevisiae, a levedura K. marxianus possui os sinais sexuais
a e α, os quais podem ser segregados após esporulação para a propagação das
linhagens haplóides ou para cruzamentos planejados, possibilitando a
introdução de marcas genéticas para seleção (Walker, 1998). Entretanto, a
genética de K. marxianus ainda é pouco conhecida devido à falta de cepas
mutantes auxotróficas e do desenvolvimento de cepas heterotálicas e haplóides
estáveis (Bergkamp et al. 1993).
Estudos de transformação com plasmídios replicativos demonstraram
que esta levedura apresenta uma boa capacidade de transformação com
plasmídios de outras leveduras, entretanto esses transformantes mostraram-se
muito instáveis (Iborra, 1993;; Basabe et al., 1996; Souza Jr, 1999),
provavelmente devido à incompatibilidade das origens de replicação entre a
célula e o plasmídio. Assim, para que se possa estabelecer K. marxianus como
um sistema genético, fez-se necessário a identificação de vetores de expressão
replicativos de alta estabilidade nesta levedura que permitam a clonagem e
expressão gênica (Souza Jr, 1999).
As origens de replicação autônoma cromossomais KARS1 e KARS2 de
K. lactis e a origem de replicação do plasmídio natural pKD1 de K.
drosophilarum Shehata foram utilizadas na transformação e estabilização de
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 20
plasmídios epissomais em células de K. marxianus (Iborra, 1993; Bergkamp et
al., 1993; Basabe et al., 1996). Destes, a maior estabilidade foi encontrada em
plasmídios contendo a origem de replicação de pKD1, como o vetor pE1
inicialmente desenvolvido para K. lactis. Recentemente, Souza Jr. e Morais Jr.,
(2000) demonstraram uma maior estabilidade do plasmídio pDblet, o qual
contém a origem de replicação ars3002 e o gene URA4 da levedura
Schizosaccharomyces pombe e também a possibilidade de utilização deste
plasmídio como vetor de expressão gênica em K. marxianus (Tabela 2).
Em relação às novas tecnologias, estudos recentes têm mostrado que a
levedura K. marxianus é bastante eficiente na expressão de algumas proteínas
heterólogas, ou seja, proteínas produzidas naturalmente por outros organismos.
Como exemplo, foram obtidas a produção e a secreção de proquimosina
bovina (Van den Berg et al., 1990) e da α-galactosidase de Cyamopsis
tetragonoloba L. (Bergkamp et al., 1993). Contudo, um campo promissor deve
se consolidar com o estabelecimento de um sistema de clonagem eficiente e
estável formado entre linhagens de K. marxianus e vetores plasmidiais
multifuncionais de expressão.
2.5. Vetores Plasmidiais
Dado que o sucesso de fermentações baseadas em tecnologia de DNA
recombinante é uma combinação das interações entre o ambiente fermentativo,
o organismo hospedeiro e os elementos genéticos recombinantes, como os
vetores plasmidiais, o estudo do comportamento das células transformadas
com vetores tanto em meio líquido como em meio sólido é de suma
importância para linhagens de leveduras usadas em fermentação industrial;
afinal, estas células podem sofrer vários estresses físicos e químicos que
podem vir a impedir o crescimento e o metabolismo (O’Kennedy et al.2000).
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 21
A instabilidade é a tendência das células transformadas perderem suas
propriedades de engenharia molecular por casa de mudanças ou perdas do
plasmídio ao longo de gerações.Portanto, após o plasmídio recombinante ser
introduzido dentro de células hospedeiras, as interações dentre plasmídio e o
hospedeiro são de suma importância uma vez que determinam a instabilidade
plasmidial e o grau de expressão dos genes clonados (Zhang et al., 1996;
Moreira, 2003).
Existem dois tipos de instabilidade plasmidial: a estrutural e a
segregacional. A primeira é causada usualmente por deleção, inserção,
recombinação ou outros eventos ao nível de DNA, enquanto que a
segregacional é causada pela partição desigual de plasmídios durante a divisão
celular (Zhang et al., 1996).
Os plasmídios centroméricos, caracterizados por possuírem origem de
replicação cromossomal, comportam-se como minicromossomos durante a
divisão celular, e apresentam uma alta estabilidade, aliada a um baixo número
de cópias. Estas características os limitam a funções específicas, como o uso
para construção de bibliotecas genômicas. Os plasmídios integrativos
apresentam a maior estabilidade dentre os vetores adotados para sistemas
recombinantes de transformação. Este tipo de vetor caracteriza-se pela
ausência de uma origem de replicação de levedura e pelo fato de se integrar ao
cromossomo da célula alvo pela complementaridade de seqüências homólogas
de DNA. Todavia, apresentam baixa eficiência de transformação (Hinnen et
al., 1978), e, a menos que possuam sítio de integração ribossomal, seu baixo
número de cópias não satisfaz a quantidade mínima necessária para expressão
ótima e alta estabilidade de proteínas recombinantes (Van der Aar et al.,
1990).
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 22
Os plasmídios epissomais baseados no plasmídio natural 2µm de S.
cerevisiae têm sido bastante adotados para estudos biotecnológicos em
leveduras, em função do alto número de cópias e da alta estabilidade.
Entretanto, esses vetores necessitam da presença do 2µm nativo para promover
a complementação in trans das funções envolvidas com a amplificação e
estabilidade (Futcher e Cox, 1984; Macreadie et al., 1991; Hosford et al.,
1992; Hottiger et al., 1995). Além do mais, plasmídios tipo 2µm como o pKD1
de Kluyveromyces drosophilarum, têm se mostrado pouco estáveis em
Saccharomyces ou em outras espécies de Kluyveromyces (Bianchi et al. 1991;
Chen, 1996; Hsieh e da Silva, 1998).
O pE1, vetor portador da seqüência completa do plasmídio pKD1 em
fusão com o plasmídio integrativo YIp5 de S. cerevisiae, foi desenvolvido para
a levedura K. lactis e tem sido usado para estudo da expressão de genes tanto
em K. lactis como em K. marxianus pela relativa estabilidade apresentada
(Bianchi et al., 1991; Chen, 1996; Basabe et al., 1996). Contudo os estudos
com a levedura K. marxianus ainda não têm apresentado resultados
satisfatórios para sua adoção como vetor definitivo de sistema de clonagem,
assim como a eficiência de transformação para esta espécie (6,0 x 102
transformantes µg-1 DNA) está bem aquém das que são observadas quando se
transforma S. cerevisiae e K. lactis (6,0 x 104 e 3,0 x 105 transformantes µg-1
DNA, respectivamente) (Souza Jr e Morais Jr, 2000), o que justifica o a
aprimoramento de técnicas.
Iborra (1993) construiu um vetor para K. marxianus usando uma ARS
de K. lactis (KARS2) que, embora apresentasse uma alta eficiência de
transformação, demonstrou uma baixíssima estabilidade plasmidial (15% após
crescimento em meio seletivo e 3,3% após dez gerações em meio rico).
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 23
Estudos utilizando plasmídios replicativos em K. marxianus têm reforçado a
necessidade de identificação de vetores replicativos mais estáveis. Basabe et
al. (1996) relatam uma estabilidade de 77% ao usar um plasmídio replicativo
com origem ARS de K. lactis em células de K. marxianus após 16 horas de
cultivo em meio seletivo. Iborra e Ball (1994) clonaram dois fragmentos do
DNA de K. marxianus que apresentaram seqüências ARS e ARS-CEN, de
aproximadamente 600 e 1200 pares de bases, respectivamente. A taxa de perda
plasmidial de 2 e 4,6% por geração celular (20 a 46% por cultivo de 16 horas)
dos plasmídios contendo apenas a ARS foram maiores do que as taxas
observadas para os plasmídios centroméricos (ARS-CEN), tanto para K.
marxianus como K. lactis. Entretanto, o mesmo não foi evidenciado para S.
cerevisiae, que apresentou taxas de perda plasmidial de 18 e 20%,
respectivamente.
De toda forma, fica evidente a necessidade da identificação entre o
sistema de replicação celular e de replicação plasmidial para o estabelecimento
de um eficiente sistema de clonagem (Fournier et al., 1993; Clyne e Kelly,
1995; Dubey et al., 1996; Okuno et al., 1997). Este fato pode ser bem
representado pelos estudos comparativos com plasmídios desenvolvidos para a
levedura de fissão Sz. pombe. O vetor replicativo pFL20 apresentou uma
estabilidade mitótica de 95%±5 após vinte e quatro horas e um número de
cópias de até 80 por célula quando estudado por Heyer et al. (1986) e de
apenas 62% portando 8 (oito) cópias plasmidiais quando estudado por Brun et
al. (1995), durante o mesmo tempo. Tais diferenças devem estar relacionadas
com a constituição genética das linhagens celulares utilizadas nos dois
trabalhos (Brun et al., 1995).
Com o objetivo de ampliar a capacidade de permanência de plasmídios
replicativos em leveduras, estratégias genéticas como combinação de marcas e
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 24
pressão seletiva, implantação de condição de autoseleção e amplificação de
seqüências de replicação têm sido adotadas (Chen, 1996). Hsieh e da Silva
(1998) estabeleceram um sistema de auto-seleção para a levedura K. lactis
baseado na presença da dupla mutação ura3 fur1 e aumentaram a estabilidade
de um plasmídio contendo a origem de replicação pKD1 em relação ao simples
mutante ura3. O mesmo fundamento pode ser aplicado quando se somam as
pressões seletivas de marcadores auxotróficos e de resistência a antibióticos,
que provocam uma maior necessidade do vetor de se replicar para garantir sua
sobrevivência (Reiser et al., 1990; Romanos et al., 1992; Steensma et al.,
2001). Entretanto, esta estratégia é apenas indicada para estudos laboratoriais,
uma vez que sistemas de vetores de clonagem baseados em marcas de
resistência a antibióticos são de alto custo, além de restritos pela legislação
vigente para uso industrial.
2.5.1. K. marxianus transformada com o vetor plasmidial pDblet
Trabalhos recentes avaliaram o desempenho da linhagem KMS2
(CBS6556, ura3-) da levedura K. marxianus transformada com o vetor
plasmidial pDblet, originalmente desenvolvido para a levedura de fissão
Schizosaccharomyces pombe. (Souza Jr e Morais Jr, 2000) (Tabela 2). Nestes
estudos, os autores observaram que, em comparação com vetores comumente
adotados para estudos moleculares em K. marxianus como o pE1, o plasmídio
replicativo pDblet (Figura 1) representa um vetor melhor indicado para
construção de bibliotecas genômicas e expressão de genes provindos de outras
leveduras em células de K. marxianus. Baseado nestes resultados, este
plasmídio replicativo foi utilizado neste trabalho como vetor plasmidial.
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 25
O vetor plasmidial pDblet possui características vantajosas para os
trabalhos de clonagem e expressão gênica em células de leveduras. Este
plasmídio possui uma dupla seqüência do fragmento ars3002 de Sz. pombe
dispostos in tandem e o gene URA4, o qual pode complementar a mutação
ura3 de S. cerevisiae. Além disso, possui um sítio múltiplo de clonagem para a
introdução de fragmentos digeridos com uma grande variedade de enzimas de
restrição, a capacidade de seleção das moléculas recombinantes em bactérias
pelo sistema “white-blue”, indicado pela ausência de cor azul nas colônias
contendo o plasmídio recombinante crescidas em meio contendo IPTG/X-Gal,
e é capaz de produzir DNA em fita simples por portar a origem de replicação
do fago f1, além de sintetizar RNAm in vitro pelo uso de promotores de fago
T3/T7 (Brun et al., 1995).
Tabela 2. Estudo comparativo entre recombinantes das leveduras Saccharomyces cerevisiae (MM10-
2a) e Kluyveromyces marxianus (KMS2) portadores dos vetores epissomais pE1 e pDblet em células.
Linhagem MM10-2a KMS2
Plasmídios pE1 pDblet pE1 pDblet
Transformantes/µg plasmidio 6,1 x 104 2,2 x 105 7,0 x 102 1,1 x 104
Estabilidade Plasmidial 24 h 55 27 78 75
Taxa de segregação Plasmidial (%) 3,4 6,1 1,03 1,19
Taxa de crescimento especifico (h-1) 0,47 0,51 0,68 0,68
Tempo de duplicação Celular (min) 87 80 60 60
Fonte: Souza Jr. e Morais Jr., 2000.
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 26
2.6. K. marxianus em Lactose
A lactose, 4-O-β-D-galactopiranosil-D-glicose (C12H22O11), é um
dissacarídeo formado por uma molécula de glicose e uma molécula de
galactose encontrada no leite e seus derivados. Sua utilização pela levedura
depende da ativação de uma proteína transportadora de lactose e da produção
da enzima lactase (β-galactosidase, EC 3.2.1.23), que catalisa a hidrólise da
lactose em glicose e galactose (Fiedurek e Szczodrak, 1994; Hensing et al.,
1994; Furlan et al., 2000) (Figura 2).
Figura 1. Desenho esquemático do mapa físico do vetor
plasmidial pDblet. (Fonte: Brun et al., 1995)
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 27
A lactose dos derivados de laticínios é pouco solúvel, o que potencializa
seu efeito poluente em mananciais hídricos, contribuindo para o
comprometimento da demanda de água potável mundial (Hetzner e Richarts,
1996) e propicia efeitos tóxicos em peixes e laxativos em humanos quando
consumidos em quantidade excessiva (Fiedurek e Szczodrak, 1994).
As espécies do gênero Kluyveromyces têm sido adotadas para uso
industrial pela capacidade de produzir a β-D-galactosidase, e K. marxianus
tem sido considerada um dos mais adequados organismos para a bioconversão
da lactose do soro de queijo, diminuindo o seu potencial poluente (Berruga et
al., 1997; Rech et al.,1999). Neste processo, a lactose é hidrolisada pela lactase
à glicose e galactose que são convertidas à glicose 6-fosfato para ser
assimiladas como fonte de carbono (Silva e Martins, 1990).
Figura 2. Hidrólise de uma molécula de lactose resultando em uma molécula de galactose e outra de glicose.
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 28
2.7. Soro de Queijo
O soro de queijo é um resíduo da indústria de laticínios decorrente da
precipitação da caseína que consiste na parte líquida composta por 5% de
lactose, 1% de proteínas, 0,8% de sais e 0,5% de ácido láctico, com pH em
torno de 5,5 (ver tabela 3). Sua demanda biológica de oxigênio fica em torno
de 40.000 mg/l, o que o torna um dos mais potentes poluentes orgânicos no
mundo (Hetzner e Richarts, 1996). O reprocessamento e a estocagem tem
incidência expressiva sobre os custos da indústria.
Mundialmente, para cada quilo de queijo produzido nove quilos de soro
são obtidos, o que o torna o maior problema da indústria de laticínios. Hetzner
e Richarts (1996) registraram que só nos países da União Européia, Estados
Unidos, Canadá, Japão, somam-se mais de 15 milhões de toneladas de soro
produzidos anualmente. Estes autores enfatizaram que embora exista um
esforço nestes países desenvolvidos para reduzir o descarte do soro de queijo
desde 1990, o mesmo não ocorre entre os países chamados “em
desenvolvimento”, onde a produção de queijo vem crescendo ano a ano. Para
se ter uma idéia do que isso representa em termos de poluição, basta tomar-se
como exemplo o Canadá. Berruga et al. (1997) relataram que dos 1,7 milhões
de toneladas de soro produzido naquele país, cerca de 17% eram despejados no
saneamento e 26% diretamente no solo, comprometendo sua estrutura física e
química, diminuindo o rendimento da agricultura.
No Brasil, cerca de metade do volume de soro de queijo produzido é
descartado in natura, comprometendo as fontes de água potável (Rech et al.,
1999). O aproveitamento deste sub-produto ainda não é satisfatório e a
utilização de tecnologias de ponta, como o uso da biotecnologia, pode permitir
a reutilização deste sub-produto na produção de produtos de alto valor
agregado (Rech et al., 1999).
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 29
Na região Nordeste do Brasil a chamada indústria de laticínios é secular,
porém, em sua grande maioria, assim como em todos os países em
desenvolvimento, é administrada de forma artesanal, com pouca tecnologia e
nenhuma preocupação em biossegurança e impacto ambiental. Nesse contexto,
o soro de queijo é considerado um dejeto a ser descartado nos rios ou solo, ou
quando muito, nas cooperativas de queijo ou indústrias de médio porte, é
reutilizado para dar cheiro e sabor à ração do gado, o que significa um
Tabela 3: Composição padrão do soro de queijo fresco (Jenness e Koops, 1962; Franco, 1986).
Componente Concentração
Lactose 50,0 g/L
Proteínas 7,5 g/L
Lipídios 5,0 g/L
Fosfato de potássio 1,58 g/L
Citrato de potássio 0,98 g/L
Sulfato de potássio 0,18 g/L
Citrato de sódio 1,79 g/L
Cloreto de cálcio 1,30 g/L
Citrato de magnésio 0,38 g/L
Carbonato de potássio 0,30 g/L
Cloreto de potássio 1,00 g/L
Ferro 0,1 g/L
pH 5,6
Cinzas 1%
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 30
desperdício e um prejuízo altíssimo a se considerar o alto teor protéico e de
lactose.
Apesar do crescente número de publicações com linhagens de K.
marxianus na área de fisiologia do processo fermentativo em soro de queijo
(Rech et al.,1999; Revillion et al., 2003; Longhi et al., 2004) e na área da
expressão de genes heterólogos (Van der Berg et al., 1990; Bergkamp et al.,
1993; Hsieh e da Silva, 1998), nenhum trabalho tem sido encontrado com a
utilização deste substrato por células recombinantes de K. marxianus,
justificando este trabalho de Doutorado.
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 31
__________________________________3. MATERIAL E MÉTODOS
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 32
3.1. Local de trabalho:
O presente trabalho foi realizado no Setor de Biologia Molecular
do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami – LIKA, na
Universidade Federal de Pernambuco.
3.2. Linhagens de bactéria e leveduras:
Foi utilizada a linhagem de E. coli DH5α (amp-) para a
manutenção e amplificação dos plasmídios a serem utilizados. O meio
Luria Broth (LB) foi adotado para crescimento bacteriano, sendo
adicionado ampicilina a uma concentração final de 100 µg/mL para
seleção de transformantes.
A linhagem selvagem de K. marxianus var. marxianus CBS6556
(Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Delft, Holanda) e seu
mutante auxotrófico KMS2 (CBS6556 ura-; Bergkamp et al., 1993)
foram utilizados como as linhagens padrão e recipiente para a
introdução dos plasmídios, respectivamente. As linhagens
recombinantes construídas para este estudo foram: KMDB-1 (KMS2
portadora do vetor pDblet), KMDamy (KMS2 portadora do vetor
pDαAmy), KMDkan (KMS2 portadora do vetor pDkan) e KDHLZ
(KMS2 portadora do vetor pDHLZ).
3.3. Tipos plasmidiais e transformação celular:
O plasmídio pDBlet (Brun et al., 1995) contem o gene ura4 e a
origem de replicação ars3002 de Sz. pombe. O plasmídio pDαAmy
contem o gene da α-Amilase inserido no plasmídio pDBlet. O plasmídio
pDkan contem o gene da G-418 inserido no plasmídio pDBlet. O
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 33
plasmídio pDHLZ possui o gene da lisozima humana (HLZ). As células
de bactéria foram transformadas com o DNA plasmidial pelo método do
cloreto de cálcio (Sambrook et al., 1989) e as células de levedura foram
transformadas pelo método rápido mediado por acetato de lítio (Antunes
et al., 2000).
3.4. Construções dos Vetores
Para alcançar os objetivos almejados quanto ao estudo do
crescimento fermentativo em batelada das linhagens recombinantes de
K. marxianus em soro de queijo, vetores plasmidiais baseados no
pDblet, apresentando insertos de DNA heterólogo ao material genético
da K. marxianus foram construídos.
3.4.1. Construção do plasmídio pDαAmy
Com o objetivo de avaliar a estabilidade de vetores com eficiência
de produção enzimática um segundo recombinante de K. marxianus foi
construído adicionando-se um fragmento portador do gene STA-1 que
codifica a enzima α-amilase de Aspergillus ao vetor plasmidial pDblet
(Figura 3).
A presença deste vetor plasmidial, denominado pDαAmy, nas
células cultivadas no soro de queijo foi monitorada: a partir do
crescimento de colônias em placa contendo como fonte de carbono o
amido 1% e através de constatação em gel de agarose 0,8 % de
fragmento relativo ao gene (banda de 2,2 Kb) dentro dos plasmídios
extraídos da cultura em pontos aleatórios ao longo do cultivo (Figura 4).
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 34
3.4.2. Construção do plasmídio pDKan
O plasmídio pDKan foi construído a partir da substitição do gene
URA 4 (1.8 Kb) do pDblet pelo fragmento de 3.7 Kb contendo os genes
URA 3 de S. cerevisiae (1.1 Kb) e Kanr de E. coli (2,6 Kb), o qual é
capaz de conferir às células de levedura resistência ao antibiótico
geneticina, ambos extraídos do vetor pNF2. As células transformadas
com este plasmídio são capazes de crescer em meio seletivo contendo
geneticina (Figura 5).
Esta estratégia tem relevância no fato de que vetores portadores de
marcas de seleção por pressão seletiva dominante, como os vetores que
contém o gene bacteriano codificador de resistência à kanamicina (kanr),
podem ter o seu número de cópias aumentado e, conseqüentemente,
aumentar sua estabilidade plasmidial, além de serem úteis para estudos
de genes que precisam ser superexpressos (Chen, 1996).
A obtenção de uma linhagem de K. marxianus portadora do vetor
pDKan permitiu a monitoração, através de um ensaio simples
qualitativo em meio sólido, da permanência do plasmídio nas células de
K. marxianus crescidas durante os ensaios fermentativos em soro de
queijo e ao mesmo tempo a constatação da capacidade de expressão do
gene heterólogo ao longo do crescimento. A presença do vetor
construído pode ser monitorada pela presença das bandas relacionadas
ao vetor (4,5 Kb) e ao fragmento onde está inserido o gene (3,7 Kb) em
gel de agarose 0,8%, após extração ao longo do cultivo (ver figura 4).
Em adição, esta estratégia pode contribuir para estudos posteriores
de análise comparativa de perfil fermentativo entre as linhagens KMS2
(CBS 6556, ura 3-) e ATCC 36907 em meios contendo lactose como
substrato, uma vez que esta última não possui linhagem auxotrófica
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 35
disponível. Este estudo pode ser muito informativo, dado que a
avaliação da produção de biomasssa e atividade enzimática entre as
linhagens CBS 6556 e ATCC 36907, demonstrou que a segunda
apresentou um melhor perfil destes parâmetros quando crescidas em
meio contendo sacarose (Souza et al., 2003).
3.4.3. Construção do plasmídio pDHLZ
O plasmídio pDHLZ foi construído para se estudar a produção da
proteína lisozima humana, codificada pelo gene HLZ, em células
recombinantes de K. marxianus. Para tal, o fragmento de 1,8 Kb
contendo o promotor do gene Gal-7 de K. lactis e o gene HLZ foi
extraído do vetor plasmidial YIpRD2-Lys com a enzima de restrição
Hind III e utilizado para substituir um fragmento Hind III de
aproximadamente 2,0Kb do plasmídio pDKan que compreende o gene
Kanr (Figura 6).
A presença do vetor construído pode ser monitorada pela presença das
bandas relacionadas ao vetor (8,1 Kb) e ao fragmento onde está inserido
o gene (1,8 Kb) em gel de agarose 0,8%, após extração ao longo do
cultivo (Figura 4).
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 36
Figura 3. Desenho esquemático da construção do pDαAmy pela inserção do
gene STA 1 no vetor pDblet.
Sta 1 (2,6 Kb)
YepSta 1
Xba I Sac I Sta 1 (2,6 Kb)
Xba I
PDblet 6,2 Kb
∧
Sac I
pDα amy 8,8 Kb
Xba I Sac I
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 37
4,34 Kb
23,130 Kb 9,416 Kb
6,78 Kb
2,25 Kb
1,98 Kb
λ - H ind III (48,377 Kb)
L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7
Figura 4. Gel de agarose contendo os vetores estudados e seus fragmentos
inseridos:
L1 – Marcador de Peso Molecular λ-Hind III;
L2 – pDblet linearizado com Hind III (6,2 Kb);
L3 - pDαamy digerido com Xba I e Sac I (6,2 Kb + 2,2 Kb);
L4 - pDαamy linearizado com Hind III (8,4 Kb);
L5 – pDkan digerido com Xho I e Xba I (4,5 Kb + 3,7 Kb);
L6 – Gene HLZ (~1,8 Kb) extraído do vetor YipRD2-Lys com Hind III;
L7 – pDHLZ linearizado com Xba I (8,1 Kb) .
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 38
Xba IXho I
Kanr (2,6 Kb) + URA 3 (1,1 Kb)
pNF2 10,3 Kb
Xho I Xba I
pDblet
URA 4 (1,8 Kb)
Kanr + URA 3)(3,7 Kb)
pDKan 8,2 Kb
Xho I Xba I
Figura 5. Desenho esquemático da construção do pDKan pela substituição do
inserto URA 4 pelo fragmento Kanr (2,6 Kb) + URA 3 (1,1 Kb).
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 39
YipRD2-Lys 1
Hind IIIHind IIIHLZ (1,8 Kb)
pDKan
Hind IIIHind IIIKanr (2,0 Kb)
HLZ (1,8 Kb)
pDHLZ 8,1 Kb
Hind III Hind III
Figura 6. Desenho esquemático da construção do pDHLZ pela substituição do inserto Kanr do vetor pDKan pelo fragmento HLZ de 1,8 Kb.
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 40
3.5. Cultivo celular e processamento das amostras:
As células de bactéria foram cultivadas em meio LB
suplementado com ampicilina para os transformantes. As células de
levedura foram cultivadas nos meios ricos YPD e YPL, em meio
mínimo contendo glicose ou lactose e em soro de leite. A produção de
biomassa foi avaliada pelo peso seco celular e o crescimento celular foi
avaliado por absorbância a 660 nm, segundo descrito em Dewes and
Southeland (1992). As amostras retiradas ao longo dos cultivos foram
centrifugadas e o sobrenadante da cultura foi avaliado para o consumo
de substratos e atividade das enzimas extracelulares. Todos os
experimentos foram repetidos em triplicata e a média dos resultados foi
adotada.
3.6. Consumo de substratos:
Os consumos de proteína e lactose do meio de cultura ao longo do
cultivo foram avaliados respectivamente pelos métodos do Folin-
Ciocalteau (Lowry et al., 1951) e de.DNSA (Miller, 1959).
3.7. Fermentação em batelada:
As fermentações em batelada foram feitas em frascos de 1 litro
em volume de 300 mL. As culturas foram incubadas após inoculo inicial
de 0,3gL-1 em Shaker orbital com agitação de 200 rpm e temperatura de
30°C ou 37ºC, ambos constantes, por até 36 horas.
3.8. Produção de biomassa:
A produção de biomassa foi avaliada pelo peso seco celular e pelo
crescimento celular:
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 41
Crescimento celular durante o cultivo – 1mL do cultivo foi retirado a
cada ponto de coleta para leitura de sua densidade em espectrofotômetro
( avaliada por absovância a 600nm, segundo descrito por Dewes and
Southerland, 1992). Sendo usado como “branco”, 1mL de meio não
contaminado, fazendo-se diluições para leitura a partir da densidade
ótica de 0,700.
Peso seco – 2 mL do cultivo aliquotado foi centrifugado em tubo estéril
pré-pesado e o tubo contendo o sedimento resultante foi levado para
estufa (80ºC por 2 horas). Após repesagem do tubo, a diferença de peso
foi anotada e dividida pelo volume utilizado. (g de células / L de
cultura).
3.9. Atividades enzimáticas:
As atividades enzimáticas foram avaliadas de acordo com as
metodologias correntes: β-galactosidase (Ausubel et al., 1989) e
protease (Bergmeyer, 1974).
A atividade enzimática da β-galactosidase foi avaliada a 30ºC em
um espectrofotômetro Hitachi a 340 nm de comprimento de onda (λ)
segundo o método de Ausoubel et al. (1972), utilizando o ONPG
(o-nitrophenol-β-D-galactopyranoside) como substrato cromogênico:
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 42
_________________________________________________4. ARTIGOS
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 43
____________________________________ARTIGO CIENTÍFICO 1
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 44
MÉTODO SIMPLES E RÁPIDO DE TRANSFORMAÇÃO POR
ACETATO DE LÍTIO DE CÉLULAS DA LEVEDURA
Kluyveromyces marxianus.
Artigo publicado na revista World Journal of
Microbiology & Biotechnology (ISSN 0959-3993).
A simple and rapid method for lithium acetate-mediated transformationof Kluyveromyces marxianus cells
Daiane Felberg Antunes, Cla udio GalvaÄ o de Souza Junior and Marcos Antonio de Morais Junior*Setor de Biologia Molecular/LIKA and Departamento de GeneÂtica, Universidade Federal de Pernambuco,Recife, PE, Brasil*Author for correspondence: Setor de Biologia Molecular/LIKA, Universidade Federal de Pernambuco.Av. Moraes Rego, s/n, Cidade UniversitaÂria, 50670-901, Recife, PE, BrasilFax: +55 81 271 8485, E-mail: [email protected], URL: www.lika.ufpe.br/setores/biomol.html
Received 30 May 2000; accepted 19 September 2000
Keywords: Dithiothreitol, lithium acetate, Kluyveromyces marxianus, yeast transformation
Summary
E�cient plasmid transformation of Kluyveromyces marxianus cells of 1.9 ´ 103 transformant lg)1 DNA with anepisomal plasmid was achieved by the use of a simple lithium acetate method with the addition of 10 mM DTT andan increased heat shock temperature of 47 °C. This method is shown to be also e�cient for replicative plasmids.Therefore, we suggest its use as a routine method to transform K. marxianus cells.
Introduction
Kluyveromyces marxianus is a budding yeast with in-creasing applications in the production of food biomass,several hydrolytic enzymes and useful products, speciallyused in the food and pharmaceutical industries (reviewedby Bele m & Lee 1998). Some papers have reported theuse of K. marxianus as an e�cient host for geneheterologous expression and protein production (Berg-kamp et al. 1993). However, only a few reports can befound in the literature on the construction of e�cientcloning vectors and speci®c transformation methodol-ogy. The episomal vectors based on the K. drosophilarum2-lm-like endogenous plasmid pKD1, like the pE1plasmid (Bergkamp et al. 1993), and replicative vectorsbased on the K. lactis replication origins have been used(Iborra 1993). Recently, we reported that the Schizosac-charomyces pombe plasmid pDblet was e�ciently intro-duced and stable in K. marxianus cells (Souza Jr &Morais Jr 2000). Moreover, the lithium acetate (LiAc)procedure described for S. cerevisiae or the laborious andexpensive electroporation method have been used forK. marxianus cell transformation (Meilhoc et al. 1990;Bergkamp et al. 1993; Iborra 1993). In this context, wedescribe a rapid and simple LiAc-mediated transforma-tion procedure to produce K. marxianus transformants.
Results and Discussion
We have used the procedure described by Soni et al.(1993) for S. cerevisiae to transform stationary
K. marxianus cells with the episomal plasmid pE1. Afterapproximately 16 h of incubation, the cultures reachedaround 2 ´ 108 cell ml)1 and the transformatione�ciency was 7 ´ 102 transformant lg)1 pE1 plasmidusing the basic procedure. This last value was the sameas described by Souza Jr & Morais Jr (2000) forexponentially growing K. marxianus cells. Therefore, wetested the e�ect of dithiothreitol (DTT) or dimethylsulphoxide (DMSO) added to Polyethyleneglycol(PEG)/LiAc solution and ethanol (EtOH) added duringthe heat shock on the transformation e�ciency of yeastcells.The incubation of the cells in PEG/LiAc solution in
the presence of DMSO decreased cell transformation forvalues below the basic procedure, and at a concentrationof 10% (v/v) practically no transformants could beobserved (Figure 1). The use of DMSO was based onthe ®nding that this compound can stimulate lithiumacetate-mediated whole-cell transformation in S. cerevi-siae, although it decreased cell viability (Hill et al. 1991;Soni et al. 1993). In this context, it could be suggestedthat if DMSO is e�ective in increasing cell wall porosityit may be very toxic to K. marxianus cells. On the otherhand, the presence of 10 mM DTT during lithiumacetate incubation period promoted a 2.5-fold increasein the transformation e�ciency over the basic protocolto 1.9 ´ 103 transformant lg)1 DNA, while someinhibitory e�ect was observed at a higher DTT concen-tration of 15 mM (Figure 1). It has been reported thatDTT increases yeast competence and transformation(Meilhoc et al. 1990; Chen et al. 1992; Iborra 1993) andthat an inhibitory e�ect was also observed for
World Journal of Microbiology & Biotechnology 16: 653±654, 2000. 653Ó 2001 Kluwer Academic Publishers. Printed in the Netherlands.
K. marxianus cells using electroporation procedure byboth higher DTT concentration or prolongated periodof incubation (Iborra 1993).Post-incubation with ethanol during heat-shock treat-
ment also increased the transformation e�ciency in therange of 2-fold over the basic procedure and practicallyno di�erence was found whether 5 or 10% (v/v) ethanolwas used (Figure 1). Ethanol at a concentration of 10%(v/v) was also found to increase cell transformation in S.cerevisiae (Lauermann 1991; Soni et al. 1993), probablyby increasing yeast cell membrane ¯uidity (Jones 1987).Combined addition of pre-incubation agents and ethanolhad a synergistic e�ect on cell toxicity that resulted in adecrease of the transformation e�ciency (Figure 1). Thesame e�ect was also observed in S. cerevisiae cells by thecombination of DMSO and ethanol (Soni et al. 1993).The results presented here suggest for use of 10 mM
DTT during the incubation in LiAc solution as the bestcondition for e�cient transformation of K. marxianus inthe stationary phase of growth. Additionally, prepara-tion of LiAc/PEG solution in Tris-bu�ered solution andthe increase of heat shock temperature from 42 to 47 °Cpromoted a 2-fold increase in the e�ciency of transfor-mation (data not shown). We used another plasmid, thereplicative vector pDBlet and its recombinant formspDBKan and pDBaAM, to transform K. marxianuscells with our improved protocol. The transformatione�ciency was around 1.3 ´ 103 transformant lg)1 DNAfor the three plasmids, which was 10 times lower thanthat described for pDBlet (Souza Jr & Morais Jr 2000)but double that obtained for the replicative plasmidpKL2 (Iborra 1993), both using LiAc-mediated trans-formation of exponential K. marxianus cells.
Recommended Procedure
The optimized procedure described here is as follows:cells from 1.5 ml overnight culture were washed withsterile water and resuspended by vortexing in 20 ll(200 lg) of carrier DNA, transforming DNA at mini-mum volume, 0.4 ml of PEG solution (40% PEG 4000,0.1 M LiAc, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA)and DTT to 10 mM at ®nal concentration. The mixturewas incubated for 15 min at room temperature andsubmitted to heat shock at 47 °C for 15 min. The cellswere centrifuged and resuspended in 1 ml sterile waterbefore plating 200 ll on selective plates.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the ConselhoNacional de Desenvolvimento Cienti®co e Tecnologico(CNPq) and Fundacao de Amparo a Ciencia e Tecno-logia do Estado de Pernambuco (Facepe). The authorsthank Dr W.M. Ledingham, St Andrews University,UK, for his critical review of the manuscript.
References
Bele m, M.A. & Lee, B.H. 1998 Production of bioingredients from
Kluyveromyces marxianus grown on whey: an alternative. Critical
Reviews in Food Science and Nutrition 38, 565±598.
Bergkamp, R.J.M., Bootsman, T.C., Tschka, H.Y., Mooren, A.T.A.,
Kox, L., Verbakel, J.M.A., Geerse, R.H. & Planta, R.J. 1993
Expression of an a-galactosidase gene under control of the
homologous inulinase promoter in Kluyveromyces marxianus.
Applied Microbiology and Biotechnology 40, 309±317.
Chen, D.C., Yang, B.C. & Kuo, T.T. 1992 One-step transformation of
yeast in stationary phase. Current Genetics 21, 83±84.
Hill, J., Donald, K.A., Gri�ths, D.E., Donald, G. & Donald, K.A.
1991 DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic
Acids Research 19, 5791.
Iborra, F. 1993 High e�ciency transformation of Kluyveromy-
ces marxianus by a replicative plasmid. Current Genetics 24, 181±
183.
Jones, R.P. 1987 Factors in¯uencing deactivation of yeast cells
exposed to ethanol. Journal of Applied Bacteriology 63, 153±164.
Lauermann, V. 1991 Ethanol improves the transformation e�ciency of
intact yeast cells. Current Genetics 20, 1±3.
Meilhoc, E., Masson, J.M. & Teissie , J. 1990 High e�ciency
transformation of intact yeast cells by electric ®eld pulses.
Biotechnology 8, 223±227.
Soni, R., Carmichael, J.P. & Murray, J.A.H. 1993 Parameters a�ecting
lithium acetate-mediated transformation of Saccharomyces cerevi-
siae and development of a rapid and simpli®ed procedure. Current
Genetics 24, 455±459.
Souza Jr, C.G. & Morais Jr, M.A. 2000 The use of the replicating
pDblet plasmid as a cloning vector with enhanced stability in
Kluyveromyces marxianus. Biotechnology Letters 22, 43±45.
Figure 1. Transformation e�ciency of the K. marxianus KMS2 strain
by the plasmid pE1 using modi®ed LiAc-mediated procedure with the
permeabilization agents at indicated concentrations. Details of the
procedure are described in the text and the values represent the mean
of triplicates.
654 D.F. Antunes et al.
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 47
______________________________________ARTIGO CIENTÍFICO 2
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 48
UTILIZAÇÃO DO SORO DE QUEIJO COMO MEIO DE
CRESCIMENTO ALTERNATIVO PARA LINHAGENS
RECOMBINANTES DE Kluyveromyces marxianus.
Artigo publicado na revista
Biotechnology Letters (ISSN 0141-5492).
Biotechnology Letters 23: 1413–1416, 2001.© 2001 Kluwer Academic Publishers. Printed in the Netherlands.
1413
Utilisation of cheese whey as an alternative growth medium forrecombinant strains of Kluyveromyces marxianus
Claudio Galvão de Souza Junior1, William MacDonald Ledingham3 & Marcos Antônio deMorais Junior1,2,∗1Setor de Biologia Molecular-LIKA and 2Departamento de Genetica, Universidade Federal de Pernambuco,Recife, PE, Brasil3School of Biology, University of St. Andrews, St. Andrews, UK∗Author for correspondence (Fax: +55 81 3271 8485; E-mail: [email protected])
Received 2 January 2001; Revisions requested 12 January 2001/10 April 2001; Revisions received 6 April 2001/25 June 2001; Accepted 2 July2001
Key words: cheese whey, fermentative parameters, Kluyveromyces marxianus, recombinant physiology
Abstract
Kluyveromyces marxianus KMDB-1, a plasmid-bearing recombinant, not carrying any particular gene of relevance,derived from auxotrophic strain KMS-2 (ura−), grew in cheese whey with a maximum specific growth rate of0.34 h−1. This recombinant strain showed the same lactose uptake and extracellular protease production kineticsas the wild type CBS6556 with no evidence of catabolite repression. The plasmid was retained in 50% of cellsafter 36 h of batch culture. The presence of this vector in Kluyveromyces marxianus, which possesses no naturalplasmids, together with the absence of any metabolic loading effect, creates a suitable microbial system for cheesewhey processing for potential value-added product formation.
Introduction
Cheese whey is an important by-product of the cheesemaking industry. Some 83% by volume of totalmilk utilised is discarded thereby imposing a highBOD loading on municipal sewage and natural watercourses. The budding yeast Kluyveromyces marxi-anus can be used to decrease pollution by utilisationof lactose within the whey (Ghaly & Singh 1989).Considered as a GRAS (Generally Recognized AsSafe) organism, K. marxianus has been used for in-dustrial purposes due to its physiological character-istics and bioproducts yield, in particular hydrolyticenzymes and food biomass (Walker 1998), ribonu-clotides, oligosaccharides and oligopeptides (Belém& Lee 1998). In addition this yeast is highly efficientin the expression of heterologous proteins (Bergkampet al. 1993). The possibility of using an inexpen-sive growth substrate for production of added valueproducts has gained increased attention. Maullu et al.(1999) reported the production of lysozyme enriched-
biomass by recombinant K. lactis cells during cottagecheese whey fermentation. However, there has beenno report on the cheese whey fermentation by recom-binant K. marxianus cells. Recently, we have reportedthe possibility of using the plasmid, pDblet, as acloning vector with enhanced stability in K. marxi-anus (Souza & Morais 2000). This replicative plas-mid transformed yeast cells with high efficiency andit did not impose any physiological loading on theyeast cells under batch fermentation using laboratorymedium (Souza & Morais 2000). In the present report,we further investigated the physiological behaviourof K. marxianus recombinant cells during the fer-mentation of sweet cheese whey and its feasibility asa cheap biotechnological tool for heterologous geneexpression.
1414
Materials and methods
Strains and plasmids
Kluyveromyces marxianus KMS2 is a ura3− aux-otrophic derivative of CBS6556 strain. KMDB-1is a KMS2 strain bearing (transformed with) thereplicative pDblet vector. Plasmid pDblet is pBlue-script II SK+-based that contains the URA4 gene andtwo copies in tandem of the Autonomous Replica-tion Sequence (ARS) ars3002 from the fission yeastSchizosaccharomyces pombe (Brun et al. 1995).
Miscellaneous molecular techniques
Plasmid extraction and digestion, agarose gel elec-trophoresis and bacterial transformation were per-formed according to Sambrook et al. (1989). Im-proved lithium acetate-mediated procedure describedby Antunes et al. (2000) was adopted for yeast trans-formations. Mitotic plasmid stability was measured bya duplicate plate method described by Futcher & Cox(1984). The value of 100% indicates that all the cellsmaintained the plasmid under cultivation in uracil-freemedium (lactose minimal medium – see below).
Cell cultivation and procedures
All experiments were carried out in an orbital shakerat 37 ◦C/200 rpm. YPD medium consists of 20 g pep-tone l−1, 10 g yeast l−1 extract and 20 g glucose l−1.Pre-inocula in lactose minimal media (1.6 g yeast ni-trogen l−1 base, 5 g (NH4)2SO4 l−1, 20 g lactosel−1) were used to inoculate 2 l flasks with 500 mlfresh media (minimal medium or sterile cheese whey)for an initial cell concentration of 0.3 g l−1. Thecultures were incubated for 36 h at the same condi-tions described above and samples were withdrawnat indicated intervals and harvested by centrifuga-tion. Biomass was analysed for cellular dry weightand plasmid stability and the supernatant was usedto measure external pH, substrate consumption andextracellular proteolytic activity.
Enzymatic activities and substrate consumption
Protein was measured by the Lowry method and lac-tose by the dinitrosalicylic acid (DNSA) method. Asno free glucose was observed in the whey by using theglucose oxidase kit (BioClin, Brazil), it was assumedthat DNSA measured the total lactose in the substrate.
Fig. 1. Shake flask fermentation of CBS6556 (closed symbols) andKMDB-1 (open symbols) strains in minimal medium containinginitial lactose concentrations of 10 g l−1 (O), 30 g l−1 (�) and60 g l−1 (�). Cultivation condition is described in Materials andmethods. The results represent the mean value of two experimentsfor each strain.
Extracellular acidic protease was measured accordingto Bergmeyer (1974) using azocasein as substrate.
Results and discussion
Batch growth of yeast cells in defined medium withdifferent lactose concentrations
Varying the initial lactose concentration (10 g l−1,30 g l−1, 60 g l−1) in minimal media had no effect onthe maximum specific growth rate for either the wildstrain or the recombinant KMDB-1 strain (Figure 1).As we used cheese whey with 36 g lactose l−1, thiswill have no significant catabolic repressive effect tothe cells.
Growth rate and biomass production in cheese whey
Wild type CBS6556 and the plasmid-bearing KMDB-1 strains grew at the same rate (Figure 2), suggestingthat the additional genetic load of the plasmid didnot affect cell physiology. The specific growth ratewas 0.34 h−1 with a yield of 5.5 g dry cell l−1 forboth strains (Figure 2). However, the maximum spe-cific growth rate of 0.34 h−1 for KMDB-1 strain washalf that of the same strain grown in glucose medium(Souza & Morais 2000). However, it was twice that re-ported of another K. marxianus strain grown in cheesewhey (Ben-Hassan et al. 1992).
No additional nitrogen source was required formaximum yeast growth, as supplementation of whey
1415
Fig. 2. Shake flask cultivation of the strains CBS6556 (O) andKMDB-1 (�) in cheese whey containing 36 g lactose l−1. Themedium was inoculated with 0.3 g cell l−1 and incubated at 30 ◦Cand 200 rpm. At defined times, samples were withdrawn and har-vested cells were used for dry weight (closed symbols) while thesupernatant was used for lactose consumption (open symbols) andpH variation (dashed lines). The results represent the mean value ofthree experiments for each strain.
Fig. 3. Fermentation profile of the strains CBS6556 (©,�) andKMDB-1 (�,�) for protein consumption (open symbols) and ex-tracellular protease activity (closed symbols). Conditions for cheesewhey fermentation and the reproducibility were as described inFigure 2.
with 5 g (NH4)2SO4 l−1 had no effect as growth (datanot shown). Biomass production of 5.5 g l−1 and a bio-mass yield (YX/S) of 1.6 g cells g−1 lactose shown heresuggests a good system for production of biomass-dependent bioproduct without any further additionalfermentation media costs.
Fig. 4. Plasmid stability of KMDB-1 recombinant strain (O) grownunder conditions mentioned in Figure 2. Plasmid stability in mini-mal (�) and YPD (�) media are shown as control. Mitotic stabilitywas evaluated by duplicate plate method using 300 to 500 cells perplate. The results represent the mean value of three experiments intriplicate plates for each transformant.
Protein consumption and protease activity in cheesewhey
Initial protein concentration in cheese whey was about3 g l−1, as measured by the Folin–Ciocalteau method.Whey protein consumption was observed during theexponential growth phase (up to 20 h of cultivation)and the same kinetics were observed for both wildtype and recombinant cells (Figure 3). Acidic proteaseactivity in the medium started to increase after 14 h ofincubation, at the same time whey protein was below1 g l−1 (Figure 3) and the pH value dropped to 4.6(Figure 1).
Plasmid stability
Plasmid mitotic stability was evaluated for K. marxi-anus recombinant strain since cheese whey does notimpose any selective pressure on these cells. Figure 4demonstrates that all KMDB-1 cells maintained theirplasmids during the first 12 h of cultivation. Plasmidpresence decreased to 75% (24 h) and 50% at the endof fermentation (still a high mitotic stability value con-sidering pDblet is a replicative plasmid). This result issimilar for KMDB-1 cells in YPD fermentation wherebatch cultures retained plasmids during cell growthbut started to lose them upon entry into the stationaryphase (Souza & Morais 2000).
Growth rate is one of the major determinants inselecting yeast strains for industrial, commercial orresearch use, especially if the products of interest are
1416
biomass-associated (Mason 1991). The presence ofchimeric plasmids may impose a metabolic burden onyeast cells, with an influence on the host cell growthas well as on substrate consumption. They promotea direct influence on the segregation rate, therebyaffecting plasmid stability (Romanos et al. 1992). Dif-ferent Kluyveromyces strains have been transformedwith chimeric vectors bearing the replication originand cis-stabilization of the natural episomal plasmidpKD1 from K. drosophilarum (Bergkamp et al. 1993).Although well established, this 2 µm-like vector needsa complementary endogenous fragment for long-term(e.g., fed-batch or continuous) fermentation (Hsieh& Da Silva 1998). Several strategies for stabiliz-ing pKD1-derivative vectors in yeast cells by usingresistance to geneticin (Chen 1996) or by inducing in-tegrated copies of the recombinase gene for plasmidamplification (Morlino et al. 1999) have been pro-posed. However, problems of stability of decreasedyields have arisen. We have previously shown thatpDblet was successfully maintained in batch fermen-tation compared to other replicative vectors reported(Souza & Morais 2000).
Our data suggest that the use of recombinantplasmid-bearing strains of Kluyveromyces marxianusto further process cheese whey has industrial poten-tial considering the absence in this system of negativeeffects (specific growth rate, plasmid stability, etc.)
Acknowledgements
This work was supported with grants from the Brazil-ian agencies CNPq ,CAPES (WML as Visiting Profes-sor) and FACEPE.
References
Antunes DF, Souza Jr CG, Morais Jr MA (2000) A simple andrapid method for lithium acetate-mediated transformation ofKluyveromyces marxianus cells. World J. Microbiol. Biotechnol.16: 653–654.
Belém MAF, Lee BH (1998) Production of bioingredients fromKluyveromyces marxianus grown on whey: an alternative. Crit.Rev. Food Sci. Nutr. 38: 565–598.
Ben-Hassan RM, Ghaly AE, Ben-Abdallah N (1992) Metabolismof cheese whey lactose by Kluyveromyces fragilis for energy andgrowth under batch condition. Appl. Biochem. Biotechnol. 33:97–116.
Bergkamp RJM, Bootsman TC, Tschka HY, Mooren ATA, KoxL, Verbakel JMA, Geerse RH, Planta RJ (1993) Expression ofan α-galactosidase gene under control of the homologous in-ulinase promoter in Kluyveromyces marxianus. Appl. Microbiol.Biotechnol. 40: 309–317.
Bergmeyer HU (1974) Methods of Enzymatic Analysis, Vol. 3.Berlin: Weinheim-Verlag Chemie.
Brun C, Dubey DD, Huberman JA (1995) pDblet, a stable au-tonomously replicating shuttle vector for the Schizosaccha-romyces pombe. Gene 164: 173–177.
Chen XJ (1996) Low- and high-copy-number shuttle vectors forreplication in the budding yeast Kluyveromyces lactis. Gene 172:131–136.
Futcher AB, Cox BS (1984) Copy number and the stability of 2 µmcircle-based artificial plasmids of Saccharomyces cerevisiae. J.Bacteriol. 157: 283–290.
Ghaly AE, Singh RK (1989) Pollution potential reduction of cheesewhey through yeast fermentation. Appl. Biochem. Biotechnol. 22:181–203.
Hsieh HP, da Silva NA (1998) Partial-pKD1 plasmids pro-vide enhanced structural stability for heterologous protein inKluyveromyces lactis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 411–416.
Mason CA (1991) Physiological aspects of growth and recombi-nant DNA stability in Saccharomyces cerevisiae. Antonie vanLeeuwenhoek 59: 269–283.
Maullu C, Lampis G, Basile T, Ingianni A, Rossolini GM, PompeiR (1999) Production of lysozyme-enriched biomass from cheeseindustry by-products. J. Appl. Microbiol. 86: 182–186.
Morlino GB, Tizzani L, Fleer R, Frontali L, Bianchi MM (1999) In-ducible amplification of gene copy number and heterologous pro-tein production in the yeast Kluyveromyces lactis. Appl. Environ.Microbiol. 65: 4808–4813.
Romanos MA, Scorer CA, Clare JJ (1992) Foreign gene expressionin yeast: a review. Yeast 8: 423–488.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular Cloning. ALaboratory Manual, 2nd. edn. New York: Cold Spring HaborLaboratory Press.
Souza Jr CG, Morais Jr MA (2000). The use of the replicatingpDblet plasmid as a cloning vector with enhanced stability inKluyveromyces marxianus. Biotechnol. Lett. 22: 43–45.
Walker GM (1998) Yeast Physiology and Biotechnology. London:John Wiley and Sons.
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 53
_______________________________________ARTIGO CIENTÍFICO 3
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 54
DIMINUIÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA
β-GALACTOSIDASE EM Kluyveromyces marxianus CBS6556
POR ALTAS CONCENTRAÇÕES DE GALACTOSE
Artigo publicado na revista
Current Microbiology (ISSN 1432-0991).
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 59
___________________________________5 OUTROS RESULTADOS
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 60
5.1. Parâmetros fermentativos das células recombinantes
5.1.1. Biomassa celular e taxa específica de crescimento
Parâmetros como biomassa celular e taxa específica de crescimento são
indicativos da adaptabilidade do microrganismo ao meio de crescimento
adotado, além de representar um dos fatores mais visados na escolha de cepas
produtivas em escala industrial.
Em tempos definidos, amostras das células das linhagens estudadas
foram coletadas e centrifugadas, sendo o precipitado usado para da
estabilidade plasmidial e determinação da biomassa por peso seco, enquanto o
sobrenadante fora utilizado para determinação da concentração de proteína e
carboidrato, variação de pH e atividade proteásica.
A biomassa acumulada durante o crescimento das linhagens
recombinantes (KMDB-1 e KαAMY) no soro de queijo denotou não haver
diferença significativa quando comparada a biomassa obtida com a linhagem
selvagem CBS6556 sob mesmas condições (Figura. 7 e Figura 8). Este
resultado é um forte indicativo que as células da K. marxianus transformadas
pelos vetores construídos não apresentaram redução do seu tempo de
duplicação e capacidade de crescimento celular.
5.1.2. Consumo da lactose e proteína total
O consumo da lactose e proteína total das células recombinantes
cultivadas em soro de queijo foram monitorados visando avaliar se a
sobrecarga genética imposta pela presença do DNA dos vetores inseridos
comprometeria o perfil fermentativo das células transformadas. Os resultados
observados ao longo dos experimentos ratificaram que todos dos vetores
plasmidiais projetados não modificaram estes parâmetros quando as células
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 61
recombinantes foram comparadas à linhagem parental de K. marxianus (Figura
9 e Figura 10).
5.1.3. pH do meio de cultura
O pH inicial de 5.6 apresentado pelo soro de queijo utilizado enquadra-
se na faixa de crescimento da levedura K. marxianus, que pode variar de 2.6 a
6.0. A curva observada na figura 11 revela que, ao longo do cultivo, o pH do
meio atinge um patamar mínimo estável em 4.6 após as primeiras 12 horas de
crescimento. Este difere da variação de pH de culturas de K. marxianus em
glicose que atinge um valor em torno de 2,0 ao final da fermentação (Souza Jr.
e Morais Jr, 2000). Entretanto, este está em concordância com a variação em
meio rico com lactose. A presença de DNA plasmidial não influenciou nesta
variação de pH do soro de queijo durante a fermentação.
5.1.4. Estabilidade plasmidial
O estudo da estabilidade plasmidial nas linhagens recombinantes
permitiu averiguar a presença dos vetores plasmidiais ao longo das gerações
das células de KMDB-1 e KαAMY submetidas ao crescimento em soro de
queijo como substrato (Figura 12). Os resultados indicam que os dois
plasmídios adotados mostraram-se altamente estáveis nas primeiras 12h de
crescimento (100% de estabilidade). Estes perfis foram semelhantes ao
observado para o vetor pDblet em células de K. marxianus crescidas em meio
rico YPD (Souza Jr e Morais Jr, 2000).
5.1.5. Atividade enzimática intra e extra celular
O perfil enzimático intra e extra celular ao longo do crescimento das
linhagens estudadas no soro de queijo estéril foram obtidos através da
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 62
avaliação da atividade β-galactosidásica (β-gal) e pela atividade da protease
ácida, respectivamente. Os resultados sobre a atividade específica intracelular
entre as células selvagem e recombinantes (Figura 13) demonstraram um
aumento nas primeiras 4 horas de crescimento e outro após as 16 horas de
atividade, intercalados por um decréscimo, provavelmente relacionado com
uma ação inibitória do aumento de galactose intracelular causado pelo
metabolismo da lactose (Martins et al., 2002). Esse resultado é importante para
a determinação do período para a produção da β-galactosidase por fermentação
de soro de queijo.
Os resultados apresentados na Figura 14 demonstram uma baixa
atividade proteásica extracelular nas primeiras 12 horas de cultivo, seguida de
um aumento de cerca de 4 vezes. Isso sugere ser esse um período ótimo de
produção de proteínas secretadas no soro de queijo, sem haver hidrólise do
produto dos recombinantes pela protease extracelular. É importante mencionar
que durante as primeiras 12h de cultivo a estabilidade plasmidial é máxima
(Figura 12), permitindo maior produção de proteína heteróloga.
Fica claro, contudo, que estes parâmetros e considerações são apenas
válidos quando se leva em conta cultivos experimentais em batelada e em
bancada, fazendo-se primordial para avaliação de um processo em escala
industrial, condições onde altas concentrações celulares possam se obtidas e
uma conseqüência da atividade proteásica possa ser monitorada.
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 63
0,01
0,1
1
10
100
0 2 4 6 8 10 12 14 16 20 24 28 32 36
Tempo (h)
DO
600
Figura 8. Curva de crescimento das linhagens selvagem CBS6556 ( )
e recombinantes KMDB-1 (▲) e KαAMY (•) da levedura K.
marxianus em soro de queijo.
0,0
0,1
1,0
10,0
0h 4h 8h 12h
16h
20h
24h
32h
36h
Tempo(h)
Bio
mas
sa (g
/L)
Figura 7. Biomassa produzida pelo cultivo em soro de queijo das linhagens selvagem CBS 6556 ( ) e recombinantes KMDB-1 (•) e KαAMY (▲) da levedura K. marxianus.
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 64
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0h 2h 4h 6h 8h 12h 16h 20h 24h 36h
Tempo (h)
Pro
teín
a ex
trace
lar (
mg/
mL)
Figura 9. Consumo de proteína extracelular do soro de queijo entre as
linhagens selvagem CBS 6556 ( ) e recombinantes KMDB-1 (•) e KαAMY
(∆) da levedura K. marxianus.Os resultados representam valores médios de
experimentos em triplicata sob condições de cultivo descritas no tópico 6.2.1.
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0h 4h 8h 14h 18h 22h 28h 36h
Tempo(h)
Con
cent
raçã
o de
Lac
tose
(mM
)
Figura 10. Consumo de lactose do soro de queijo entre as linhagens selvagem CBS
6556 (■) e das linhagens recombinantes KMDB-1 (•) e KαAMY (▲) da levedura
K. marxianus.
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 65
0
1
2
3
4
5
6
7
0 6 12 24 36
Tempo (h)
pH
Figura 11. Variação do pH do soro de queijo durante o cultivo das linhagens
selvagem CBS 6556 (∆)e recombinantes KMDB-1 (●) e KαAMY (□) da
levedura K. marxianus.
Figura 12. Estabilidade plasmidial dos vetores pDblet e pDαAmy em células de K. marxianus cultivadas em soro de queijo.
0
20
40
60
80
100
120
0 12 24 36
Tempo (h)
% p
lasm
ídio
+ cé
lula
s
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 66
0
4000
8000
12000
16000
0 2 4 6 8 12 16 20 24 28 32
Tempo (h)
Uni
dade
s β-
Gal
Figura 13. Atividade β-gal nos cultivos em soro de queijo das linhagens selvagem
CBS 6556 (■) e recombinantes KMDB-1 (•) e KαAMY (▲) da levedura K.
marxianus.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 2 4 6 8 12 16 20 24 36
Tempo (h)
Ativ
. Esp
ecífi
ca (U
/440
nm)
Figura 14. Atividade proteásica extracelular nos cultivos em soro de queijo
em linhagens selvagem CBS6556 (◊) e recombinantes KMDB-1 (▲) e
KαAMY ( ) da levedura K. marxianus. Os resultados representam valores
médios de experimentos em triplicata sob condições de cultivo descritas no
tópico 6.2.1.
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 67
________________________________________6. CONCLUSÕES
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 68
• Através de adaptações de métodos desenvolvidos para a levedura
Saccharomyces cerevisiae, melhores resultados de eficiência de
transformação em células de Kluyveromyces marxianus foram obtidos;
• Os altos níveis de lactose presentes no soro de queijo, assim como
variações entre níveis de lactose em soros de diferentes produtores não
mostraram influência significativa no desempenho da linhagem CBS 6556
e suas derivadas (mutantes e recombinantes) quanto ao rendimento em
biomassa;
• Células recombinantes da levedura Kluyveromyces marxianus portadoras
de vetores com genes heterólogos apresentaram comportamento em soro
de queijo idêntico ao de células recipientes com e sem vetores inseridos
revelando serem adequadas para processos laboratoriais;
• Os vetores plasmidiais quiméricos pDαamy e pDkan desenvolvidos neste
estudo não influenciaram negativamente sobre o crescimento das células
de K. marxianus, sobre o consumo do substrato e nem demonstraram ter
influência direta na estabilidade plasmidial pela presença dos genes
inseridos.
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 69
____________________________7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
De acordo com a revista Genetics and
Molecular Biology (ISSN 1415-4757)
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 70
Alexopoulos, CJ; Mims, CW; Blackwell, M (1996) Introductory mycology, 4th
ed, John Wiley & Sons, Inc, Canada.
Antunes DF (2003) Uso da engenharia metabólica em Saccharomyces
cerevisiae para otimização da produção de álcool. Dissertação de
Mestrado, UFPE, Recife, Brasil.
Araújo RFF (2001) Cinética de crescimento de Kluyveromyces marxianus
CBS 6556 em lactose e galactose: um estudo quimiostático.
Dissertação de Mestrado, UFPE, Recife, Brasil.
Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD and Smith JA (1989) Current
protocols in molecular biology. Vols. 1 and 2. Jonh Willey & Sons,
Inc, New York, USA.
Basabe L, Cabrera N, Yong V, Menéndez J, Delgado JM and Rodriguez L
(1996) Isolation and characterization of mutants as an approach to a
transformation system in Kluyveromyces marxianus. Current Genetics
30: 89-92.
Bergkamp RJM, Bootsman TC, Tschka HY, Mooren ATA, Kox L, Verbakel
JMA, Geerse RH and Planta RJ (1993) Expression of an α-
galactosidase gene under control of the homologous inulinase promoter
in Kluyveromyces marxianus. Applied Microbial Biotechnology 40:
309-317.
Bergmeyer HU (1974) Methods of enzymatic analysis. Vol. 3. Weinheim-
Verlag Chemie, Berlin, Germany.
Berruga MI, Jaspe A and San Jose C (1997) Selection of yeast strains for
lactose hydrolyses in dairy effluents. International Biodeterioration and
Biodegradation 40: 2-4.
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 71
Bianchi MM, Santarelli R and Frontali L (1991) Plasmid functions involved in
the stable propagation of the pKD1 circular plasmid in Kluyveromyces
lactis. Current Genetics 19: 155-161.
Brachat S, Dietrich FS, Voegeli S, Zhang Z, Stuart L, Lerch A, Gates K,
Gaffney T and Philippsen P (2003) Reinvestigation of the
Saccharomyces cerevisiae genome annotation by comparison to the
genome of a related fungus: Ashbya gossypii. Genome Biology 4(7): 45-
47.
Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quatification of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye
binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254.
Brun C, Dubey DD e Huberman JA (1995) pDblet, a stable autonomously
replicating shuttle vector for the Schizosaccharomyces pombe. Gene
164: 173-177.
Castilho-Valavicius BA, Takita MA, Thompson GM and Piestun VS (1992)
The Molecular genetics of Saccharomyces cerevisiae. Ciência e
Cultura 44: 301-309.
Chen XJ (1996) Low- and high-copy-number shuttle vectors for replication in
the budding Yeast Kluyveromyces lactis. Gene 172: 131-136.
Clyne RK and Kelly TJ (1995) Genetic analysis of an ARS element from the
fission Yeast Schizosaccharomyces pombe. EMBO Journal 14: 6348-
6357.
De Mercado MEE (1995) Estudos sobre clonagem e expressão gênica na
levedura Kluyveromyces marxianus. Dissertação de Mestrado, UFRS,
Porto Alegre, Brasil.
Dewes and Southeland (1992)………..
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 72
Dubey DD, Kim S, Todorov IT and Huberman JA (1996) Large, complex
modular structure of a fission Yeast DNA replication origin. Current
Biology 6: 467-473.
Fiedurek J and Szczodrak J (1994) Selection of strain, culture conditions and
extraction procedures for optimum production of β-galactosidase from
Kluyveromyces fragilis. Acta Microbiologica Polonica 43 (1): 57-65.
Fournier P, Abbas A, Chasles M, Kudla B, Ogrydziak DM, Yaver D, Xuan
JW, Peito A, Ribet AM, Feynerol C, He F e Gaillardin C (1993)
Colocalization of centromeric and replicative functions on
autonomously replicating sequences isolated from the yeast Yarrowia
lipolytica. Proceedings of the National Academy of Science USA 90:
4912-4916.
Franco G (1986) Tabela de composição química dos alimentos. Livraria
Atheneu, Rio de Janeiro, Brasil, 150 pp.
Furlan SA, Schneider ALS, Merkle R, Jonas MFC and Jonas R (2000)
Formulation of a lactose-free, low cost culture for production of β-D-
galactosidase by Kluyveromyces marxianus. Biotechnology Letters 22:
589-593.
Futcher AB and Cox BS (1984) Copy number and the stability of 2µm circle-
based artificial plasmids of Saccharomyces cerevisiae. Journal of
Bacteriology 157: 283-290.
Gellissen G and Hollenberg CP (1997) Application of Yeasts in gene
expression studies: a comparison of Saccharomyces cerevisiae,
Hansenula polimorpha and Kluyveromyces lactis - a review. Gene 190:
87-97.
Goffeau AL, Barrel BG, Bussey H, Davis RW, Dujon B, Feldmann H,
Galibert F, Hoheisel JD, Jacq C, Johnston M, Louis EJ, Mewes HD,
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 73
Murakami Y, Philippsen P, Tettelin H and Oliver, SG (1996) Life with
6000 genes. Science 274: 546-567.
Grootwassing JWD and Fleming SE (1980) Non-especific b-
fructofuranosidase (inulinase) form K. fragilis, batch and continuous
fermentation simple method and some industrial properties. Enzymatic
Microbiology Technology 2: 45-53.
Guthier C and Fink GR (1991) Guide to yeast genetics and molecular biology.
Methods in Enzymology, Vol. 194. Academic Press, San Diego, CA.
Hensing M, Vrouwenvelder H, Hellinga C, Baartmans R and van Dijken H
(1994) Production of extracellular inulinase in high-cell-density fed-
batch cultures of Kluyveromyces marxianus. Applied Microbiology
Biotechnology 42: 516-521.
Hetzner E and Richarts E (1996) The international market for processed
cheese. International Dairy Federal Bulletin 316: 16-26.
Heyer WD, Sipiczki M and Kohli J (1986) Replicating plasmids in
Schizosaccharomyces pombe: improvement of symmetric segregation
by a new genetic element. Molecular and Cellular Biology 6: 80-89.
Hinnen A, Hicks JB and Fink GR (1978) Transformation of yeast. Proceedings
National Academy of Science USA 75: 1929-1933.
Hosford EA, Sone H and Tanaka J (1992) Enhanced stability of YEp plasmids
in lager brewing yeasts is related to larger brewing yeast 2µm DNA.
Current Genetics 22: 357-361.
Hottiger T, Kuhka J, Pohlig G, Furst P, Spielmann A, Garn M, Haemmerli S
and Heim J (1995) 2µm vectors containing the Saccharomyces
cerevisiae metalothionein gene as a selectable marker: excelent
stability in complex media, and high level expression of a recombinant
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 74
protein from a CUP1-promoter-controlled expression cassette in cis.
Yeast 11: 1-14.
Hsieh HP and da Silva NA (1998) Partial-pKD1 plasmids provide enhanced
structural stability for heterologous protein in Kluyveromyces lactis.
Applyed Microbiological Biotechnology 49: 411-416.
Iborra F (1993) High efficiency trasnformation of Kluyveromyces marxianus
by a replicative plasmid. Current Genetics 24: 181-183.
Iborra F and Ball MM (1994) Kluyveromyces marxianus small DNA
fragments containing both autonomous replicative and centromeric
elements that also functions in Kluyveromyces lactis. Yeast 10: 1621-
1629.
Jenness R and Koops J (1962) Preparation of a salt solution which simulates
milk ultrafiltrate. Milk and Dairy Journal, 16(3): 153-164.
Johnston JR (1994) Molecular genetics of Yeast, IRL Press, Oxford, UK.
Laloux O, Cassart JP, Delcor J, Van Beeumen J and Vandenhaute J (1991)
Cloning and sequencing of inulinase gene of Kluyveromyces marxianus
ATCC 12424. FEBS Letters 289: 64-68.
Llorente B, Malpertruy A, Blandin G, Artigueneve F, Winker P and Dujon B
(2000) Genomic exploration of the Hemiascomycetous yeasts: 12.
Kluyveromyces marxianus var. marxianus. FEBS Letters 487: 71-75.
Longhi LGS, Luvizetto DJ, Ferreira LS, Rech R, Ayub MAZ and Secchi AR
(2004) A growth kinetic model of Kluyveromyces marxianus cultures
on cheese whey as substrate. Journal of Industrial Microbiology and
Biotechnology 31: 35-40.
Lowry et al., 1951
Lucena BTL de (2002) Cariotipagem molecular de leveduras de fermentação
alcoólica. Monografia, UFPE, Recife, Brasil.
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 75
Macreadie IG, Horaitis O, Verkuylen AJ and Savin KW (1991) Improved
shuttle vectors for cloning and high-level Cu2+-mediated expression of
foreign genes in yeasts. Gene 104: 107-111.
Miller GL (1959) Use of dinitrosalicilic acid reagent for determination of
reducing sugars. Analytical Chemistry 32: 426-428.
Moreira KA (2003) Produção e purificação de DNA plasmidial a pertir de
Escherichia coli recombinante. Tese de Doutorado, UFPE, Recife,
Brasil.
O’Kennedy RD, Baldwin C, and Keshavarz-Moore E (2000) Effects of growth
medium selection on plasmid DNA production and initial processing
steps. Journal of Biotechnology 76:175-183.
Okuno Y, Okazaki T and Masukata H (1997) Identification of predominant
replication origin in fission yeast. Nucleic Acids Research 25: 530-536.
Oliver SG (1996) From DNA sequence to biological function. Nature 379:
597-600.
Olsson L and Nielsen J (2000) The role of metabolic engineering in the
improvement of the Saccharomyces cerevisiae: utilization of industrial
media. Enzyme and Microbial Technology 26: 785-792.
Perez-Ortin JE, Matallana E and Franco L (1989) Cromatin structure of yeast
genes. Yeast 5: 219-238.
Phaff HJ (1990) Isolation of yeast from natural source. In: Labeda (ed)
Isolation of Biotechnological Organisms from Nature. Mc-Graw-Hill
Inc., US, pp 53-59.
Phaff HJ and Stamer WT (1987) Yeast associated with plants, insects and soil.
In: The Yeast. London Academic Press 1: 123-180.
Rech R, Cassini CF, Secchi A and Ayub MAZ (1999) Utilization of protein-
hydrolyzed cheese whey for production of β-galactosidase by
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 76
Kluyveromyces marxianus. Journal of Industrial Microbiology and
Biotechnology 23: 91-96.
Reiser J, Glumoff V, Kälin M and Ochsner U (1990) Transfer and expression
of heterologous genes in yeasts other than Saccharomyces cerevisiae.
Advanced Biochemistry Engineering Biotechnology 43: 75-102.
Revillion JPP, Brandelli A and Ayub MAZ (2003) Production of yeast extract
from whey using Kluyveromyces marxianus. Brazilian Archives of
Biology and Technology 46: 121-127.
Romanos MA, Scorer CA and Clare JJ (1992) Foreign gene expression in
yeast: a review. Yeast 8: 423-488.
Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular cloning: a laboratory
manual. Vols. 1, 2 and 3, 2nd ed. Cold Spring Habor laboratory Press,
Cold Spring Habor, USA.
Silva MC e Martins, S (1990). Models of lactose uptake in the yeast species
Kluyveromyces marxianus. Antonie van Leeuwenhoek 57: 77-81.
Soni R, Carmichael JP and Murria JAH (1993) Parameters affecting lithium
acetate-mediated transformation of Saccahromyces cerevisiae and
development of a rapid and simplified procedure. Current Genetics 24:
455-459.
Souza PRE, Souza Júnior CG, Martins DBG, Morais Júnior, MA, Lima Filho
JL (2003) Production of single cell protein by Kluyveromyces
marxianus in urea and ammonia sulphate as nitrogen sources. In: Anais
do XXII Congresso Brasileiro de Microbiologia (Resumo). Sociedade
Brasileira de Microorganismos, Florianópolis-SC, Brasil.
Souza Júnior CG (1999) pDblet, um vetor plasmidial desenvolvido para a
levedura de fissão Schizossacharomyces pombe, pode ser usado como
Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 77
vetor de clonagem da levedura de brotamento Kluyveromyces
marxianus. Dissertação de Mestrado,UFPE, Recife, Brasil.
Souza Júnior, CG and Morais Júnior MA (2000) The use of the replicating
pDblet plasmid as a cloning vector with enhancer stability in
Kluyveromyces marxianus. Biotechnology Letters 22: 43-45.
Steensma HY and Ter Linde JJM (2001). Plasmids with the Cre-recombinase
and the dominant nat marker, suitable for use in prototrophic strains of
Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces lactis. Yeast 18: 469-
472.
Van den Berg JA, Van Der Laken KJ, Van Ooyen AJJ; Renniers TCHM,
Rietveld K, Schaap A, Braker AJ, Bishop RJ, Shultz K, Meyer D,
Richman N and Shuster JL (1990) Kluyveromyces as a host for
heterologous gene expression: expression and secretion of
prochymosin. Biotechnology 8: 135-139.
Van der Aar PC, Lopes TS, Klootwijk J, Groeneveld P, Van Verseveld HW
and Stouthamer AH (1990) Consequences of phosphoglycerate kinase
overproduction for the growth and physiology of Saccharomyces
cerevisiae. Applyed Microbiological Biotechnology 32: 577-587.
Walker GM (1998) Yeast Phisiology and Biotechnology. John Wiley and Sons
Ltd. England.
Zhang Z, Môo-Young M, and Chisti, Y. (1996) Plasmid stability in
recombinant Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Advances 14:
401-435.