7/23/2019 Desarrollo Del Inoculo y Cultivo Celular Por Lotes de Kluyveromyces Marxianus Nrrl y http://slidepdf.com/reader/full/desarrollo-del-inoculo-y-cultivo-celular-por-lotes-de-kluyveromyces-marxianus 1/38 Página 3 DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES DE Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571 RESUMEN En el presente trabajo se ha desarrollado el cultivo celular de la cepa Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571 realizando su manipulación desde su estado inactiva en agar. El cual ha seguido una serie de procedimientos secuenciales tales como activación en estufa, inoculación en agar, dándole todas las condiciones y facilidades para que pueda crecer, asimismo siguiendo con la secuencia se inoculo en un medio denominado rico (3ml!, el cual tiene todos los nutrientes que esta levadura requiere para su óptimo desarrollo. "uego de un evidente crecimiento en el medio rico, la totalidad de este medio es diluido dentro de otro medio al que se denomina m#nimo (3 ml! por sus limitaciones en cuanto a nutrientes, ya que este contiene solo los componentes necesarios para que el microorganismo pueda subsistir, tales como fuente de carbono que en nuestro caso fue $ructosa. %e trata entonces de observar y comparar como se va produciendo el crecimiento celular con los nutrientes e&actamente necesarios para tal acción y al mismo tiempo como va disminuyendo el sustrato en este caso principalmente la fructosa. ' esto es posible determinar haciendo evaluaciones tales como crecimiento de biomasa mediante absorbancia () nm en el espectrofotómetro! y el ensayo con reactivo *+% para el caso del sustrato con una absorbancia de ) nm en el espectrofotómetro y la generación de productos como el etanol el cual será medido mediante - (cromatograf#a de gases! usando como factor e&terno n/propanol. %e obtuvo un rendimiento promedio de0 biomasa de ,132 gg glucosa. 4 partir de la biomasa obtenida se pudieron obtener los parámetros cin5ticos los cuales fueron un µ ma& 6 ,11 hr /7 , ' 8% 67,23 & 7 /3 g de Etanolg de $ructosa, 9 :% 6 , g de ;iomasahora.
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Desarrollo Del Inoculo y Cultivo Celular Por Lotes de Kluyveromyces Marxianus Nrrl y
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7/23/2019 Desarrollo Del Inoculo y Cultivo Celular Por Lotes de Kluyveromyces Marxianus Nrrl y
En la actualidad muchos de los alimentos son obtenidos gracias al manejo yconocimiento del crecimiento de microorganismos. <esulta entonces importante el
conocimiento de las condiciones en que estos microorganismos puedan optimizar sus
productos. 8ara ello la preparación de medios de cultivo para estos microorganismos es un
buen punto de partida para conocer sobre su comportamiento as# como tambi5n el
seguimiento de la cin5tica nos proporciona datos mucho más prácticos y e&actos sobre la
velocidad y caracter#sticas del crecimiento del microorganismo tratado.
"a preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa
fundamental para asegurar la productividad de los mismos. "os componentes de los medios
constituyen los efectores e&ternos de naturaleza qu#mica que desempe=an un rol esencial en
los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formación
de productos y además suministrar energ#a para la s#ntesis de metabolitos y para el
mantenimiento celular. +o obstante que los microorganismos var#an considerablemente
respecto de los nutrientes que pueden necesitar.
Es as# que para esta práctica hemos centrado nuestra atención en el tratamiento deun microorganismo ( Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571!, iniciando desde su
siembra partiendo desde su estado en cepa congelada , para luego sembrarlo en medio rico,
empleando la glucosa como fuente de carbono, procurando su rápida activación, para que
luego de un determinado tiempo podamos sembrar la bacteria pero en un medio m#nimo>
es decir con los m#nimos requerimientos> en el cual es más factible determinar la cin5tica
de crecimiento.
*entro de su importancia en la agroindustria la Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-
757 1es muy valiosa para la conversión de fructosa en etanol que puede mejorar la
econom#a de una planta transformadora de azucares naturales de frutas a etanol. -on la
conversión de la fructosa, la potencial reducción del precio está en función de tres
parámetros de fermentación0 el rendimiento, la tolerancia de etanol y la productividad.
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p@ intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las c5lulas ya que,
en muchos casos, la obtención de energ#a metabólica depende de la e&istencia de
una diferencia en la concentración de protones a ambos lados de la membrana
citoplásmica. @ay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el p@
del medio de cultivo suele tender a bajar durante el cultivo. El decremento del p@
se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberación de ácidos
orgánicos de cadena corta (fórmico, ac5tico, láctico!. 8or consiguiente, es necesario
controlar el p@ de los cultivos para evitar que un descenso e&cesivo pueda producir
la auto esterilización del cultivo
E# p&$en%i"# +e'&) 4 e# &),*en& %on factores determinantes del crecimiento y del
metabolismo del cultivo. El potencial redo& del medio de cultivo nos indica sucapacidad para aceptar o donar electrones, esto es0 sus caracter#sticas o&idantes o
reductoras. Ino de los factores que intervienen en el potencial redo&, aunque no el
Anico, es la concentración de o&#geno, B1. @ay microorganismos que requieren
ambientes o&idantes para crecer, mientras que otros necesitan ambientes
reductores. El requerimiento de condiciones o&idantes o reductoras no debe
confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de o&#geno para que se
produzca el crecimiento.
In microorganismo es aerobio cuando necesita o&#geno para vivir y es anaerobio
cuando o bien no lo necesita (anaerobios facultativos! o anaerobios aerotolerantes
como las bacterias lácticas o cuando muere en presencia de o&#geno (anaerobios
estrictos como los clostridios!. El rendimiento '&sde los procesos fermentativos es
menor que el de los respiratorios0 las bacterias y las levaduras producen menos
biomasa cuando crecen fermentando que cuando lo hacen respirando.
L" %&n%en$+"%in 'e #&s %&pues$&s 6ue se ne%esi$"n p"+" e# %+e%iien$&
Es importante porque puede provocar una disminución de la tasa de crecimiento a
causa de la alta presión osmótica del medio. @emos visto que en el curso de la fase
e&ponencial del crecimiento , las tasas de crecimiento era independiente de la
concentración de los distintos componentes del medio de cultivo .8or debajo de
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B. C&p&si%in0 Ledio sint5tico o qu#micamente definido
Re6ue+iien$&s nu$+i%i&n"#es 8ara ello utilizamos un Ledio de cultivo m#nimo.
$uente de carbono y energ#a 0 lucosa -@71B
$uente de + 0 %ulfato de amonio (+@)!1%B)
$uente de % 0 %ulfato de amonio (+@)!1%B)
$uente de 8 0 $osfato diácido de potasio M@18B)
$uente de M 0 $osfato diácido de potasio M@18B)
$uente de Lg 0 %ulfato de magnesio heptahidratado
Lg%B).2@1B
$uente de % 0 %ulfato de magnesio heptahidratadoLg%B).2@1B
OB=ETIVOS
1.1 OB=ETIVOS ENERALES
*ise=ar un medio de cultivo celular por lotes en matraces, usando como
fuente de carbono glucosa y empleando una cepa de Pichiastipitis +<<" '/
271)*eterminar los parámetros cin5ticos de la cepa Pichiastipitis +<<" '/271)
1.( OB=ETIVOS ESPECÍ!ICOS
*eterminar la cin5tica de crecimiento de Pichiastipitis +<<" '/271)*eterminar la cin5tica de consumo de la fuente de carbono glucosa.*eterminar la cin5tica de generación de etanol*eterminar el OL ,':%, '8%.
Evaluar el valor del p@ durante la cin5tica.
MATERIALES Y METODOS
M"$e+i"# Bi&#*i%& Cep" #i&2i#i>"'" 'e KluyveromycesMarxianusNRRL Y-7571
PREPARACI?N DE S?LIDO DE MANTENCI?N M"$e+i"#es 4 E6uip&s
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$igura +G7. -in5tica de -recimiento de la "evadura Kluyveromyces Marxianus
NRRL Y !"!1
En la figura se pueden distinguir tres zonas0
#ase $e latencia. En esta fase, el microorganismo, sometido a un crecimiento
previo en un inóculo, se adapta a las condiciones del caldo de fermentación.;ásicamente es un periodo de ajuste metabólico. El crecimiento es bajo, y prácticamente no se presenta producción de etanol. *ebido a la transferencia delmicroorganismo del inóculo al nuevo medio, 5ste puede verse afectado por cambios en el p@, aumento en el suministro de nutrientes y descenso en losinhibidores de crecimiento
#ase ex%onencial . Esta fase es la más importante para el proceso, ya que lamayor parte del etanol se produce en este periodo. *epende parcialmente de laconcentración inicial del sustrato, y la cantidad de etanol a producir estácondicionada por la duración de esta fase. El tiempo en esta fase duro H horas.
#ase estacionaria. En este punto se detiene el crecimiento, debido alagotamiento de los nutrientes en el caldo de fermentación, as# como al efectoinhibidor que provoca la concentración de etanol en el medio. "a masa de losmicroorganismos permanece constante en esta fase, por el equilibrio que se daentre los que permanecen vivos y los muertos. +o se pudo determinar #" 2"se 'e ue+$e & 'e%"iien$& ya que se paró lafermentación por motivos de tiempo.
En la tabla 7 se muestra los valores e&perimentales del crecimiento en función al
tiempo de fermentación y en la $ig. 7 se observó que el crecimiento celular se
realizó rápidamente, esto probablemente ocurrió por la fuente de carbono utilizada,
la $<I-KB%4, que como se recuerda en la ruta metabólica todo nace en la
"I-B%4, la cual todav#a tiene que e&istir una enzima isomerasa para formar la
$<I-KB%4, entonces todo estas reacciones bioqu#micas ya no ocurren, entonces
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e&iste un ahorro de energ#a, lo que demuestra que la levadura reconoció fácilmente
al medio.
El crecimiento microbiano de la Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571 se dio
debido a que utilizamos fructosa como fuente de carbono y una alta concentración
de e&tracto de levadura, entre los demás nutrientes y sales. "os compuestos
carbonados son utilizados por las levaduras a la vez como fuente de energ#a y como
fuente de carbono.
E# ni$+*en& es cuantitativamente el segundo constituyente aportado por el medio
de cultivo. Es utilizado por las c5lulas en los aminoácidos, los nucleótidos y algunas
vitaminas. 8ueden ser utilizadas numerosas fuentes de nitrógeno. Kodas laslevaduras son capaces de utilizar el nitrógeno en forma de ion amonio. "os iones
amonio pueden ser aportados en el medio por el cloruro amoniaco, el nitrato
amónico, el fosfato amónico y sobre todo el sulfato amónico, mejor compuesto pues
aporta al mismo tiempo el azufre necesario para la s#ntesis de ciertos aminoácidos.
(KR&'&R N R*+, 19-).
L&s e)$+"%$&s 'e #e@"'u+" son e&celentes substratos para muchos
microorganismos. %on productos a partir de la levadura de panader#a mediante
autolisis a F -.
El e&tracto de levadura contiene aminoácidos, p5ptidos, vitaminas solubles en agua
y carbohidratos. (OL', 199)
L" $epe+"$u+" corriente de cultivo de las levaduras se sitAa entre 1 y 3- que
permite efectivamente el crecimiento de la mayor parte de las levaduras. %in
embargo estas temperaturas no son reguladas a las temperaturas óptimas de
crecimiento que las levaduras que se encuentran en su hábitat natural. %iendo la
membrana citoplasmática de las c5lulas cultivadas a temperatura elevada mas
resistente a las desnaturalizaciones t5rmicas que la de las c5lulas cultivadas a baja
temperatura. (L/ON y 0R*N'L& 19).
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*e acuerdo la composición del medio de cultivo se observa que el crecimiento de la
Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571 es óptimo lo cual demuestra que el
medio es propicio para el desarrollo del cultivo y cumple con los requerimientos
m#nimos que necesita las c5lulas para crecer.
De$e+in"%in De# MF De# Mi%+&&+*"nis& Kluyveromyces Marxianus NRRL Y
!"!1 en un Cu#$i@& p&+ L&$e %&n !RUCTUOSA %&& !uen$e 'e C"+&n&
4justando nuestros puntos, reconocimos la zona de fase e&ponencial en el cual se tuvo unmá&imo crecimiento celular de las levaduras Kluyveromyces Marxianus NRRL Y !"!1.
Tiep& LN
G&H:
1.5 .HH72
/ 7.12127H32
0 7.77)21)
%abemos que la cin5tica de crecimiento microbiano, está dado matemáticamente por lasiguiente ecuación0
dx
dt =µ.x
dx
x =µ.dt
C+KE<4+*B0
ln ( xf
xo )=µ.t
raficando0
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En la figura 3, se puede ver el consumo de sustrato en el medio de fermentación quecomenzó rápidamente, motivo por el cual anteriormente se observó unainsignificante fase de latencia. Pemos que el microorganismo metabolizórápidamente al sustrato, esto en parte se debió a las buenas condiciones inicialesque se tuvo tales como el p@óptimo, temperatura, buena aireación y por su puesto
un rico medio de cultivo.%egAn Mosaric et al, 7HR2, H refiere En la fermentación por lotes, se cargan en elreactor el caldo de fermentación (sustrato! y una solución esterilizada previamenteinoculada con losmicroorganismos. 4 lo largo dela fermentación suele a=adirsealgo de o&#geno (en forma deaire!, agente antiespumante,ácidos o bases para controlar el p@, nutrientes (si se requieren!y antibióticos> asimismo sea=ade inóculo fresco si esnecesario."a conversión de azAcares enun sistema por lotes simple esde 2/H? del valor teórico, con una concentración final de etanol de 7/7? envolumen. "a productividad usual de procesos por lotes simples y convencionales esde 7.R/1. g de etanol por litro del volumen del fermentador por hora.
C. DESARROLLO DEL INOCULO EN EL TIEMPO DE !ERMENTACION
Entonces, se puede decir que se tiene una mayor productividad en la zona decrecimiento e&ponencial esto es debido, a que e&iste una mayor aumento dela biomasa celular.
Ai+e"%in Es un factor muy importante, ya que contribuye considerablemente aladecuado crecimiento de los microorganismos. El o&#geno es especialmente necesariocuando se lleva a cabo una fermentación por lotes con altos niveles de azAcares querequieran un crecimiento prolongado de la levadura, o en procesos continuos, ya que la
levadura es incapaz de crecer por más de cuatro o cinco generaciones en condicionestotalmente anaeróbicas (Mosaric et al, 7HR2, 3!. 8ara ello, es necesario disponer de unsistema adecuado de agitación, de tal forma que haya un contacto permanente entre lasc5lulas y el sustrato nutritivo> asimismo, es importante desalojar el dió&ido de carbonoque se va produciendo, ya que en concentraciones relativamente peque=as inhibe elcrecimiento celular. ANALISIS DEL p3
*x6.373H)12 gl.h
Q)K :.15/;;:0 *#.
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"a variación del p@ fue debido a la producción de metabolitos producto de la
fermentación la cual estuvo en mayor concentración que los iones @T que se
libera al consumir el cloruro de amonio, lo cual implica que en vez que el p@
baje este tienda a subir y se vuelva casi un p@ neutro. "as levaduras crecen bien
en medios con el p@ ajustado entre 3. y 3.R, el grado de tolerancia a los ácidos
var#a segAn la cepa y la especie, desde p@ 1.1 a R.. (8elczar U. Lichael, 7HR1!
En los medios de cultivo, los nitritos forman a p@ inferior a acido nitroso que
es to&ico para las c5lulas. "a mayor parte de los aminoácidos pueden ser
utilizados como fuente de nitrógeno. %in embargo, segAn los aminoácidos, latasa de crecimiento de la levadura var#a. "as mezclas de aminoácidos permiten
un mejor crecimiento que un solo aminoácido. %i están disponibles
simultáneamente varias fuentes de nitrógeno estas no van hacer utilizadas a la
misma velocidad sino que la levadura va a consumir preferencialmente la
VmejorW. (-BB8E< 7HR1! define una buena fuente de nitrógeno por tres
criterios0 penetración rápida, conversión rápida en la c5lula con el m#nimo de
tapas en amoniaco o acido glutámico o en los dos y sin efecto secundario to&ico .
P"+9e$+&s %in8$i%&s 'e$e+in"'&s en #" e)pe+ien%i" +e"#i>"'" 'e #" Kluyveromyces
Marxianus NRRL Y-7571 u$i#i>"n'& 2+u%$&s" %&& 2uen$e 'e %"+&n&.