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Universidad Autnoma Metropolitana
Unidad Xochimilco
Divisin de Ciencias Biolgicas de la Salud
Licenciatura en Qumica Farmacutica Biolgica
Obtencin de Metabolitos de Inters Industrial para la Salud
OBTE NCI N D E -FRUCTOFUR AN OSID AS A POR
Kluyveromicesmarx ianusA PARTI R DE SA CA ROS A C OMO FU ENTE D
E
CAR BON O
Rosa Eugenia Reyes Reyes
Juan Esteban Barranco Florido
Alavez R. C; Garca P. D; Mungua L. R; Osorio S. A; Rodrguez N.
S.
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Contenido
Introduccin
...............................................................................................................
1
Marco terico
.............................................................................................................
1
Enzimas
..............................................................................................................................
1
Levadura
............................................................................................................................
2
Kluyveromices marxianus
...............................................................................................
2
-fructofuranosidasa o invertasa (EC 3.2.1.26)
............................................................. 2
Produccin y regulacin catablica de enzimas
.......................................................... 3
Mtodos analticos
...........................................................................................................
4
Cintica enzimtica
.................................................................................................................................
4
Concentracin de
substrato...................................................................................................................
4
VMX
...........................................................................................................................................................
6
KMX
...........................................................................................................................................................
6
Efecto del pH sobre la actividad enzimtica
.......................................................................................
7
Temperatura
............................................................................................................................................
8
Concentracin de enzima
......................................................................................................................
9
Inhibicin enzimtica
..............................................................................................................................
9
Hiptesis
...................................................................................................................
10
Objetivos
..................................................................................................................
10
Metodologa
.............................................................................................................
10
Microorganismo
..............................................................................................................
10
Medios de cultivo
............................................................................................................
10
Inculo
....................................................................................................................................................
10
Fermentacin
.........................................................................................................................................
11
Condiciones de cultivo
..................................................................................................
11
Determinacin del crecimiento.
....................................................................................
11
Mtodos analticos.
........................................................................................................
11
Determinacin de azcares reductores
.............................................................................................
11
Cuantificacin de protenas.
................................................................................................................
12
Actividad enzimtica
.............................................................................................................................
13
Caracterizacin parcial de la -fructofuranosidasa de
Kluyveromyces marxianus.
..........................................................................................................................................
14
Determinacin del efecto del pH.
.......................................................................................................
14
Efecto de la temperatura.
....................................................................................................................
15
Catalizadores inicos de la enzima.
...................................................................................................
16
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Determinacin de Km y Vmx aparente de la -fructofuranosidasa o
Invertasa en clulas
libres.
......................................................................................................................................................
16
REFERENCIA
...........................................................................................................
18
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1
Introduccin
La importancia de las enzimas en la biotecnologa ha ampliado su
campo de aplicacin en
la industria utilizndolas como herramientas para mejorar la
produccin y la obtencin de
metabolitos.
Para la produccin de estos metabolitos se utilizan
microorganismos los cuales pueden
ser bacterias, hongos y levaduras.
De estas ltimas podemos localizar al Kluyveromices marxianus,
que forma parte de la
clase Ascomicetos, familia Saccharomycetaceae, sub-familia
Saccharomycetoideae, del
gnero Kluyveromices y de la especie marxianus.
K. marxianus es una levadura utilizada en la industria debido a
que una de sus
propiedades ms importante es la produccin de enzimas nativas,
como -
fructofuranosidasa, -galactosidasa y pectinasas. La
-fructofuranosidasa es un tipo de
enzima reprimible con actividad de invertasa.
Marco terico
Enzimas
Las enzimas presentan diversas ventajas sobre los catalizadores
qumicos. Una de las
ms importantes es su especificidad para determinadas reacciones.
Esta especificidad se
limita a una sola o a un grupo muy restringido de sustancias
qumicas relacionadas con
ella, y excluye reacciones colaterales, con lo que se eliminan
subproductos indeseables;
traducindose esto en un incremento de la productividad.
Estas catalizan las reacciones bajo condiciones moderadas de
temperatura, presin y pH.
Esto disminuye los requerimientos energticos, y por tanto, los
costos de produccin.
Las enzimas se encuentran en cualquier organismo vivo: plantas,
animales o
microorganismos. Estos ltimos son la fuente preferida a nivel
industrial, debido a que
presentan ventajas importantes en su produccin, como:
La sntesis de enzimas es ms predecible y controlable Se cuenta
con un amplio espectro de caractersticas, tales como intervalos de
pH,
resistencia a altas temperaturas Existe suficiente
disponibilidad de materias primas con una composicin
relativamente constante Su produccin no est sujeta a variaciones
estacionales, ni existe riesgo de
escasez por cambios climticos o situaciones geogrficas La
manipulacin gentica ha incrementado considerablemente las
posibilidades de
optimizar los rendimientos a travs de mutaciones, de seleccin de
cepas y de condiciones de crecimiento y ms recientemente, mediante
la tecnologa del DNA recombinante.
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2
Diseo de enzimas mejoradas por ingeniera de protenas.
Las levaduras constituyen un importante grupo en cuanto a la
produccin de diversas enzimas comerciales.
Levadura
Las levaduras son los microorganismos ms importantes desde el
punto de vista
industrial, porque muchas de las especies pueden convertir los
azucares en alcohol etlico
y dixido de carbono. Participan en la produccin de cerveza,
vino, glicerol y dems. Las
clulas de levadura se utilizan tambin en la industria de la
panificacin y como alimento
animal y humano, por su alto contenido proteco. (Hernndez,
2001)
Las levaduras son hongos microscpicos que, en un estadio de su
ciclo biolgico, se
presentan en forma unicelular y se multiplican por gemacin. Este
grupo de
microorganismos comprende unos 60 gneros y unas 500 especies. Se
agrupan
principalmente en dos clases Ascomycotina y Basidiomycotina.
Entre las levaduras de uso industrial se encuentran
Saccharomyces cerevisiae,
Saccharomyces ellipsoideus, Kluyveromices marxianus. Siendo esta
ultima el eje de la
investigacin.
Kluyveromices marxianus
Kluyveromices marxianuses una de las dos levaduras que ms
abundan en los productos
lcteos. Produce -galactosidasa y son fermentadoras potentes de
los azcares, incluida
la lactosa (Jay, 1999), es capaz de hidrolizar la lactosa y de
fermentar la galactosa. Posee
estatus GRAS (Generally Recognized As Safe) y QPS (Qualified
Presumption of Safety),
es decir, se considera segura para su uso en la industria de
alimentos.
K. marxianus sintetiza dos tipos de invertasa; interna y
externa, ambos tipos de enzima
presentan la misma actividad especfica sobre sacarosa.
-fructofuranosidasa o invertasa (EC 3.2.1.26)
La invertasa cataliza la hidrolisis de restos terminales no
reductores -D-fructofuranosdicos de fructofuransidos.
La denominacin trivial de invertasa, con la que tambin se
conoce, hace referencia al
hecho de que los productos de la reaccin son conocidos desde
antiguo como azcar
invertido ya que mientras la sacarosa es dextrorrotatoria, la
mezcla equimolecular de
glucosa y fructosa que resulta de su hidrlisis es
levorrotatoria, por lo que en el
proceso se origina un cambio de signo (de positivo a negativo)
del valor de rotacin
ptica.
Un mecanismo de regulacin en la sntesis de la invertasa, en el
cual existe interaccin de
molculas de sacarosa con el receptor en la membrana celular
generando seales
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3
qumicas que podran ser trasladadas y amplificadas por
monofosfato de adenina cclico
(cAMP) en el ncleo celular comenzando la induccin de la sntesis
de invertasa a nivel
de ADN. El ARNm podra trasladar la informacin de la sntesis de
invertasa a los
ribosomas, para despus ser sintetizada y secretada al espacio
periplsmico, o bien en la
pared celular. (Figura 1)
Figura 1. Sntesis de la invertasa
Estas enzimas, tienen actividad sobre los enlaces de tipo
-fructosdico hidrolizando la
molcula de sacarosa a glucosa y fructosa (Figura 2)
Figura 2. Hidrlisis de la sacarosa
Produccin y regulacin catablica de enzimas
La expresin gentica es un mecanismo en los microorganismos, la
glucosa y otras
fuentes de carbono (rpidamente metabolizables) reprimen la
expresin de genes de
enzimas relacionadas con el metabolismo de otras fuentes de
carbono. El grado de
represin causado por glucosa depende fuertemente de la enzima
afectada y la cepa
usada. La represin por glucosa es el principal sistema de
regulacin en levaduras en la
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4
expresin de un gran nmero de enzimas involucradas en el
metabolismo de
carbohidratos. En presencia de glucosa, la sntesis de las
enzimas de la gluconeognesis,
del ciclo de Krebs, la respiracin y otras especficas para la
asimilacin de galactosa,
maltosa y sacarosa son fuertemente reprimidas.
Mtodos analticos
Cintica enzimtica
La cintica enzimtica estudia el mecanismo, velocidad y los
factores que modifican las
reacciones catalizadas por enzimas. Los factores que
estudiaremos son la concentracin
de substrato, temperatura, pH, concentracin de enzima, e
inhibidores enzimticos.
Concentracin de substrato
La concentracin del substrato tiene un efecto importante en la
velocidad de las
reacciones enzimticas. El anlisis del efecto del cambio de
concentracin de substrato,
proporciona informacin respecto del mecanismo de reaccin,
especificidad y
propiedades cinticas de las enzimas.
En 1902, al estudiar la cintica de la hidrlisis de Sacarosa,
Adrian Brown descubre la
saturacin de la enzima Invertasa (EC 3.2.1.26) y propone que la
reaccin se efecta en
dos etapas, primero la enzima (E) y el sustrato (S), se unen
para formar un complejo (ES):
Que se disocia liberando el producto (P)
En 1913, Leonor Michaelis y Maude L. Menten corrigieron el
trabajo de Brown y Henri.
Aplican condiciones estrictas para la medicin de la actividad
enzimtica, y suponen que
la formacin del complejo ES, es rpida y reversible, mientras que
la liberacin del
producto es lenta.
Rpida Lenta
Con base en este supuesto, proponen el modelo del Equilibrio
Instantneo para
determinar la relacin entre la concentracin de substrato y la
velocidad de las reacciones
enzimticas y obtienen una relacin matemtica que describe dicho
efecto, la cual se
conoce como la ecuacin de Michaelis y Menten:
Donde:
v = velocidad de la reaccin [S] = Concentracin de substrato VMAX
= Mxima actividad enzimtica KM = Constante de Michaelis
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5
La ecuacin de Michaelis y Menten es una hiprbola; para valores
pequeos de [S] la
cantidad del substrato limita la velocidad; mientras que con
valores grandes el lmite es la
cantidad de enzima. (Monroy, 2004)
Las condiciones de equilibrio instantneo, propuestas por
Michaelis y Menten consisten
en suponer que E y S reaccionan muy rpidamente para formar ES
mientras que la
disociacin del complejo hacia producto es relativamente lenta
porque k2 es muy
pequea. Por lo tanto, el complejo ES se encuentra en equilibrio
con E y S. En estas
condiciones, KM es igual a la constante de equilibrio de la
disociacin del complejo ES:
Ya que k2 es pequea, a menudo es el factor que limita la
velocidad y por ello se conoce
como la constante cataltica (kcat) de la enzima.
Grfico 1. Cintica de Michaelis
Aos despus, en 1925 George E. Briggs y John B. S. Haldane
corrigieron el trabajo de
Michaleis al establecer que la suposicin de que k1 y k-1 son
mucho mayores que k2 no
siempre se cumple, por lo tanto no se alcanza el equilibrio de
la disociacin de ES. En su
lugar proponen que la concentracin de ES se encuentra en un
Estado Estacionario en el
que la velocidad de formacin de ES, es igual a la de
descomposicin por disociacin y
por formacin de producto. Con esta suposicin la ecuacin no
cambia de forma pero KM
ya no es igual a la constante de disociacin de ES, ahora es:
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Grfico 2. Variacin de la concentracin de E, S y es durante una
reaccin enzimtica.
VMX
Es la mxima actividad que puede alcanzar una enzima, tericamente
se logra en
condiciones de [S] grande, porque entonces la enzima se satura y
trabaja tan rpido como
es posible. En la prctica es imposible que la enzima alcance el
valor de VMAX, debido a
limitaciones de difusin de productos y sustratos, desde y hacia
el sitio activo. (Aldave,
2004)
KMX
Si la suposicin de Michaelis y Menten es vlida, KM es la
constante de disociacin de ES
a E + S, igual a k-1/k1. Por lo tanto, es una medida de la
afinidad de la enzima por su
substrato. Si KM es grande significa que k-1 es grande o que k1
es pequea por lo que la
reaccin inversa es ms favorecida que la reaccin directa y con
ello la afinidad de la
enzima por su substrato es baja. Por el contrario, si KM es
pequea, la afinidad de la
enzima por el substrato es grande.
Por otro lado, segn Briggs y Haldane, KM representa el cociente
(k-1 +k2)/k1, este
cociente sigue siendo la constante de disociacin de ES, pero
ahora tanto hacia S como
hacia P, porque se supone que k2 contribuye en forma
significativa a la desaparicin de
ES. De cualquier manera, valores de KM grandes representan baja
afinidad por el
substrato y valores pequeos afinidad alta.
El valor de KM tambin corresponde a la concentracin de S en la
cual v = VMAX/2, que se
interpreta como la concentracin a la cual la enzima est saturada
slo a la mitad.
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Cuando ms de una enzima cataliza una reaccin, o si no estamos
seguros de cul es el
substrato verdadero de una enzima, los valores de KM indican la
relacin ms apropiada.
Tpicamente, si la enzima trabaja con varios substratos podra
suponerse que el substrato
con el KM ms bajo es el substrato verdadero. (Monroy, 2004)
Efecto del pH sobre la actividad enzimtica
La actividad de un enzima se ve afectada por el pH al cual se
lleva a cabo la reaccin. La
curva actividad-pH puede ser diferente para cada tipo de enzima
(Fig. 2). En el caso ms
general la curva tiene forma de campana. El valor de pH al cual
la actividad es mxima se
denomina pH ptimo; dicho pH no tiene porque coincidir con el pH
intracelular. La relacin
entre el pH y la actividad depende del comportamiento cido-base
del enzima y del propio
sustrato. Sustrato y enzima (centro activo) pueden contener
grupos funcionales cidos y
bsicos, siendo su grado de disociacin dependiente del pH, lo que
determinar, entre
otros aspectos, la conformacin de la protena, la capacidad de
unin del sustrato al
centro activo del enzima (Km). Los estudios cinticos a
diferentes valores de pH nos
proporcionan informacin sobre el mecanismo cataltico de los
enzimas y la naturaleza de
los aminocidos ms directamente implicados en la catlisis.
(Aldave, 2004)
Grafico3.Efecto del pH sobre la actividad de diversos
enzimas.
El pH del medio afecta la actividad de las enzimas, porque
muchos de los aminocidos
tiene restos ionizables. Los cambios de pH modifican el grado de
ionizacin de todos o
alguno de estos grupos, lo que repercute en la ionizacin total
de la molcula de enzima
modificando su actividad al menos por tres mecanismos.
1. Los pH extremos, por debajo de 4.0, o por arriba de 10.0,
cambian el grado de
ionizacin de casi todos los restos de aminocidos de la enzima,
de forma que
puede alterarse su estructura tridimensional. Si este cambio es
suficientemente
grande, se desnaturaliza la enzima y se pier- de su actividad de
forma irreversible.
Incluso, la disminucin del pH, que se presenta en las muestras
de fluidos
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corporales o de tejidos por dao o muerte celular, puede
ocasionar la des-
naturalizacin de las enzimas.
2. Las variaciones de pH ms pequeas, entre 4 y 10, afectan a un
nmero menor de
grupos ionizables, pero si stos estn presentes en el sitio
activo, la actividad
enzimtica cambia en forma importante. Sin embargo, este cambio
normalmente
es reversible.
3. La variacin del pH tambin puede alterar la ionizacin del
substrato, y modificar la
unin enzima substrato.
Para muchas enzimas, el efecto del pH tiene forma de campana con
un valor de pH
ptimo bien definido, pero para otras, la forma de la curva es
muy diferente; por ejemplo,
cuando en la interaccin enzima substrato participan muchos
grupos ionizables. Los
puntos de inflexin de la curva pH/actividad corresponderan a los
pK de los grupos
responsables de la dependencia frente al pH. Este tipo de
informacin se ha utilizado para
identificar de los aminocidos del sitio activo.
Grfico 4. Efecto del ph sobre la actividad enzimtica.
Algunas enzimas estn adaptadas para funcionar al pH propio de su
ambiente. Por
ejemplo, la Pepsina tiene un pH ptimo de 2.0, que corresponde
aproximadamente al pH
del jugo gstrico. Por otro lado, el pH ptimo de ciertas enzimas
intracelulares est muy
alejado del pH intracelular; por ejemplo, la Glicerato cinasa
(EC 2.7.1.31) tiene un pH
ptimo de 9.8, y la Fosfogliceratomutasa (EC 5.4.2.1) de 5.9.
Esto puede deberse a que
las enzimas manifiestan propiedades di- ferentes in vitro e in
vivo, donde la interaccin
con los componentes celulares pueda modificar su dependencia del
pH. (Monroy, 2004)
Temperatura
Igual que ocurre en las reacciones qumicas, al aumentar la
temperatura aumenta la
velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Esto se
debe a que un mayor
nmero de molculas alcanzan la energa cintica necesaria para
superar la energa de
activacin de la reaccin. Sin embargo, el aumento de temperatura
tambin disminuye la
estabilidad de la estructura de las protenas y las enzimas
comienzan a desnaturalizarse,
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de modo que a medida que aumente la temperatura la actividad
enzimtica tiende a bajar.
Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento de
temperatura, existe una
Temperatura ptima en la cual la actividad enzimtica tiene un
mximo. Es de suponer
que a la temperatura normal de los organismos las enzimas sean
estables, y por lo tanto
estn por debajo de su temperatura ptima. (Aldave, 2004)
Grfico 5. Efecto de la temperatura sobre la actividad
enzimtica.
La mayora de enzimas se desnaturalizan rpidamente a 100 C y
pierden mucha de su
actividad al ser expuestas a temperaturas superiores a 60 C, an
por perodos de tiempo
cortos.
Concentracin de enzima
Como se explic antes, la velocidad de la actividad enzimtica,
depende de la constante
cataltica y la concentracin del complejo enzima substrato
S la enzima se encuentra en condiciones de [S] constante, o de
saturacin, su actividad
depende solamente de la concentracin de enzima con una cintica
de orden 1 esto es, al
aumentar la concentracin de enzima la actividad enzimtica
aumenta en la misma
proporcin. Este efecto tiene relevancia biolgica en los procesos
de induccin
enzimtica, cuando la actividad de una enzima que no exista o
estaba a un nivel muy
bajo, aumenta por la sntesis de la misma, provocada por la
acumulacin de su sustrato.
(Hestrin, 1998)
Inhibicin enzimtica
Los inhibidores enzimticos son molculas que se unen a las
enzimas y disminuyen su
actividad. Las clulas emplean como inhibidores molculas de
intermediarios metablicos
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10
o iones, para controlar la actividad enzimtica como parte de la
regulacin del
metabolismo. En investigacin se usan inhibidores para estudiar
las propiedades de las
enzimas. Muchos inhibidores enzimticos son usados como
medicamentos, venenos,
pesticidas, etc. Existen dos tipos generales de inhibidores
enzimticos: Reversibles e
Irreversibles.
Los inhibidores irreversibles se combinan o destruyen un grupo
funcional de la enzima,
necesario para la actividad cataltica. Los inhibidores
irreversibles se disocian muy
lentamente de la enzima porque se unen con fuerza, ya sea en
forma covalente, la
mayora, o no covalente, por tal motivo se dice que no se pueden
eliminar. (Lampen,
1980)
Hiptesis
La enzima -fructofuranosidasa producida por K. marxianus a
partir de un medio rico en
sacarosa, presenta actividad enzimtica. Si se cambian las
condiciones ptimas de
temperatura, pH y efecto de cationes modificara su actividad
enzimtica
Objetivos
Analizar la actividad de la enzima -fructofuranosidasa mediante
ensayos enzimticos y
parmetros cinticos de crecimiento.
Obtencin de la enzima -fructofuranosidasa.
Compara la actividad enzimtica mediante dos fuentes de carbono
(sacarosa y
glucosa)
Modificar y evaluar las condiciones de la -fructofuranosidasa
(pH, temperatura y
efecto de cationes).
Determinar parmetros cinticos y obtencin de Vmx y Km.
Metodologa
Microorganismo
Para este estudio se utilizara la levadura Kluyveromyces
marxianus.
Medios de cultivo
Inculo
Se prepararan 50 mL del medio. Con una composicin de 5% de
sacarosa, 0.5% de
extracto de levadura y 5 mg de ampicilina.
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11
Fermentacin
Se utilizaran 2 medios de cultivo para la fermentacin, de
acuerdo al control que se
requiere:
Control negativo
Se prepararan 150 mL con una composicin de 0.5 % de extracto de
levadura y 1% de
glucosa.
Control positivo
Se prepararan 150 mL con una composicin de 0.5% de extracto de
levadura y 1% de
sacarosa.
Todos los medios de cultivo se preparan en matraces de 250 mL
con tapn de algodn, y
se ajustan a un pH de 4.5, esterilizar a 10 lb de presin por 10
minutos.
Condiciones de cultivo
Todos los medios de incuban a 30C con agitacin de 180 rpm.
Determinacin del crecimiento.
Cada hora tomar de 10 mL de la muestra a partir del tiempo cero
durante 12
horas. Posteriormente guardar 5 mL en refrigeracin y con los 5
mL restantes
centrifugar a 5000 rpm a 4C. Al sobrenadante se le mide pH y
azcares totales, el
paquete celular se resuspender en 5 mL de agua y se medir su
absorbancia a una
DO de 660 nm, calcular a travs de acuerdo con la curva estndar
de peso seco
vs. DO.
Los cinco mL de muestra para congelacin se colocarn en tubos
falcon para
posteriormente medir la actividad enzimtica.
La curva estndar nos proporciona la ordenada al origen (b), la
pendiente (m) y la
lectura (y)
Mtodos analticos.
Determinacin de azcares reductores
Realizar una curva de calibracin y cuantificar los azucares
reductores por el
mtodo propuesto Miller,G.L.(1959)
Preparar curva estndar. Tabla 1
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Preparar una mezcla de reaccin con un volumen final de 1.5 ml en
agua destilada
1 ml del reactivo de DNS
Hervir las muestras por 5 minutos
Dejar enfriar a temperatura ambiente
Llevar a volumen final de 10 ml con agua destilada
Agitar y leer a 550 nm de UV/Vis
Tabla 1. Curva estndar azucares reductores
Glucosa
(ml)
H2O
(ml)
Vol final
(ml)
Conc. Final
glucosa
(g/ml)
Reactivo
DNS
(ml)
Hervir H2O
(ml)
0.0
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.5
1.4
1.3
1.1
0.9
0.7
0.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
0
100
200
400
600
800
1000
1
1
1
1
1
1
1
5 min
5 min
5 min
5 min
5 min
5 min
5 min
7.5
7.5
7.5
7.5
7.5
7.5
7.5
Cuantificacin de protenas.
Realizar la curva de calibracin con BSA como estndar y
cuantificar las protenas
mediante la tcnica propuesta por Lowry,H y cols. (1951) Tabla
2.
Preparar la solucin estndar y procedimiento:
Albmina 1mg/ml. 10 mg para 10 ml de agua destilada.
Tomar 0.3 ml de esta solucin y agregar 2.7 ml de agua destilada
para una
solucin de 100 g/ml
Colocar en un tubo alcuota de estndar de protena
Llevar a 1 ml con agua destilada
Agregar 3 ml reactivo E y agitar vigorosamente
Dejar reposar 10 min. a T. ambiente
Agregar 0.3 ml reactivo fenol 1:1, agitar
Dejar reposar a T. amb.
Leer a 540 nm UV-Vis
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Tabla 2. Curva estndar cuantificacin de protenas
Std albmina
(ml)
Conc. Final
albmina
H2O
(ml)
Reactivo E
(ml)
Folin 1:1
(ml)
0
0.125
0.250
0.500
0.750
1.0
0
12.5
25
50
75
100
1
0.875
.750
.500
.250
0
3
3
3
3
3
3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
Actividad enzimtica
Establecer el tiempo para una segunda fermentacin.
Determinar la actividad enzimtica con las muestras en
congelacin.
Centrifugar las muestras a 5000 rpm a 4 C.
Resuspender el extracto enzimtico en 5 mL de agua destilada
(realizar 2
veces el lavado).
Preparar una solucin estndar de sacarosa 5% en amortiguador
de
acetatos pH 5.0. esta reaccin deber realizarse a 50 C. durante
30 min,
con agitacin constante.
Medir los productos de la reaccin enzimtica por la tcnica de
azcares
reductores.
Realizar la reaccin como se indica en la siguiente tabla. Tabla
3.
Tabla 3. Condiciones para la determinacin de la actividad
enzimtica
Muestra
de
clulas
(mL)
Agua
destilada
(mL)
Sol.
Estndar
de
sacarosa
5%(mL)
Temperatura
de incubacin
Muestra
T=0
min
(mL)
Muestra
T=30
min
(mL)
DNS
despus
de 30
min
0.2
0.8 4.0
50 C 0.1
0.1
3
3
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14
Leer las muestras a 550 nm. En el espectrofotmetro de
UV/Vis.
Realizar las diluciones necesarias para que los valores de la
absorbancia
obtenidos queden dentro de la curva estndar de calibracin.
Caracterizacin parcial de la -fructofuranosidasa de
Kluyveromyces
marxianus.
Determinacin del efecto del pH.
El pH es determinado por medio de soluciones amortiguadoras en
una escala de pH =
3.5 hasta pH= 8.5. Tabla 4.
Preparar las siguientes soluciones amortiguadoras:
Buffer de citrato-fosfato 0.1M pH 4-5.
Buffer de fosfatos 0.1 M pH 6-8.
Disolver en cada caso la sacarosa al 5%.
Realizar por duplicado.
Tabla 4. Determinacin de pH
pH Muestra
de
clulas
(mL)
Agua
destilada
(mL)
Sol.
Estndar
de
sacarosa
5%(mL)
Temperaura
de
incubacin
Muestra
T=0
min
(mL)
Muestra
T=30
min
(mL)
DNS
despus
de 30
min
4.0 0.2
0.8 4.0
50 C 0.1
0.1
3
3
5.0 0.2
0.8 4.0
50 C 0.1
0.1
3
3
6.0 0.2
0.8 4.0
50 C 0.1
0.1
3
3
7.0 0.2
0.8 4.0
50 C 0.1
0.1
3
3
8.0 0.2
0.8 4.0
50 C 0.1
0.1
3
3
-
15
Efecto de la temperatura.
Preparar una solucin estndar de sacarosa 5% en amortiguador de
acetatos pH 5.0. Esta reaccin deber realizarse a diferentes
temperaturas, durante 30 min, con agitacin constante. Tabla 5.
Tabla 5.Determinacin de temperatura
Muestra
de
clulas
libres
(mL)
Agua
destilada
(mL)
Sol. Std
Sacarosa
(mL)
Temperatura
C
Muestra
1
T=0 min
(mL)
Muestra
2
T=30 min
(mL)
DNS
despus
de 30
min (mL)
0.2 0.8 4 40 C 0,1 0.1 3
3
0.2 0.8 4 50 C 0.1 0.1 3
3
0,2 0.8 4 60 C 0.1 0.1 3
3
0.2 0.8 4 70 C 0.1 0.1 3
3
0.2 0.8 4 80 C 0.1 0.1 3
3
-
16
Catalizadores inicos de la enzima.
Preparar una solucin estndar con un amortiguador de acetatos a
pH con sacarosa al 5%.
Agregar los cationes con una concentracin de 5mM para cada catin
estudiado.
Tabla 6.Determinacin de catalizadores inicos de la enzima
Cationes
(mL)
Muestra
de
clulas
(mL)
Agua
destilada
(mL)
Sol.
Estndar
de
sacarosa
5%(mL)
Temperaura
de
incubacin
Muestra
T=0
min
(mL)
Muestra
T=30
min
(mL)
DNS
despus
de 30 min
Mg2+ 0.2
0.8 4.0
50 C 0.1
0.1
3
3
Fe3+ 0.2
0.8 4.0
50 C 0.1
0.1
3
3
Cu2+ 0.2
0.8 4.0
50 C 0.1
0.1
3
3
Zn2+ 0.2
0.8 4.0
50 C 0.1
0.1
3
3
El control tendr amortiguador de acetatos a pH 5.0 con sacarosa
al 5 % sin ningn catin. La actividad enzimtica del control se tomar
como 100 % y se compararn con los resultados de actividad enzimtica
en presencia de cationes porcentualmente
Determinacin de Km y Vmx aparente de la -fructofuranosidasa
o
Invertasa en clulas libres.
Preparar soluciones de acetatos pH 5.0 con diferentes
concentraciones de sacarosa. (5%,2.5%,1%,0.5%,0.25%)
Medir la actividad a 3 diferentes tiempos.
Observar Tabla 7.
-
17
Tabla 7. Determinacin de Km y Vmax
Concentracin de
sacarosa en % t1 t2 t3
5 0 5 10
2.5 0 4 8
1 0 3 6
0.5 0 2 4
0.25 0 1 2
-
18
REFERENCIA
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Ed. pg. 7
2. Jay, M. (1999) Microbiologa moderna de los alimentos 4ta
edicin Editorial
ACRIBIA, S.A.
3. Monroy. M, Ordorica, M. A. (2004), Termodinmica, Cintica y
Enzimas
file:///C:/Users/V5%20Touch/Documents/Unidad41.pdf Actual
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4. Aldave, M. Jorrn J. (2004) Estudio cintico de la actividad
invertasa de levadura
de panadera. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular.
5. Hestrin S, Feingold DS, Schramm M (1998): -Fructofuranosidade
(invertase) from
yeast. Methods in Enzymology 1: 251-257.
6. Lampen JO (1980): Yeast and Neurospora invertases. En: Boyer
PD (ed): The
Enzymes, 3 ed. Vol V. Academic Press (New York, USA), pp
291-305.