ANJA CEROVŠEK OSAMITEV IN IDENTIFIKACIJA GLIV S ČLOVEŠKEpefprints.pef.uni-lj.si/5912/1/Anja_Cerovšek_Diplomsko... · Cerovšek A. Osamitev in identifikacija gliv s človeške

UNIVERZA V LJUBLJANI

PEDAGOŠKA FAKULTETA

ANJA CEROVŠEK

OSAMITEV IN IDENTIFIKACIJA GLIV S ČLOVEŠKE

RIBICE IN NJENEGA NEPOSREDNEGA VODNEGA

OKOLJA

DIPLOMSKO DELO

LJUBLJANA, 2019

UNIVERZA V LJUBLJANI

PEDAGOŠKA FAKULTETA

DVOPREDMETNI UČITELJ BIOLOGIJE IN KEMIJE

ANJA CEROVŠEK

MENTORICA: DOC. DR. POLONA ZALAR

OSAMITEV IN IDENTIFIKACIJA GLIV S ČLOVEŠKE RIBICE IN

NJENEGA NEPOSREDNEGA VODNEGA OKOLJA

DIPLOMSKO DELO

LJUBLJANA, 2019

Cerovšek A. Osamitev in identifikacija gliv s človeške ribice in njenega neposrednega vodnega okolja.

Dipl. delo. Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija-kemija, 2019

I

Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študija programa Biologija in kemija. Opravljeno

je bilo v laboratoriju Katedre za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov na

Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani.

Študijska komisija na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete je za mentorico diplomskega

dela imenovala doc. dr. Polono Zalar.

Mentorica: doc. dr. Polona Zalar

Recenzent:

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik: dr. Iztok Tomažič

Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Članica: doc. dr. Polona Zalar


Članica: prof. dr. Nina Cimerman-Gunde


Datum zagovora: __________________________________________

Podpisana izjavljam, da je naloga rezultat lastnega raziskovalnega dela. Izjavljam, da je

elektronski izvod identičen tiskanemu. Na univerzo neodplačno, neizključno, prostorsko in

časovno neomejeno prenašam pravici shranitve avtorskega dela v elektronski obliki in

reproduciranja ter pravico omogočanja javnega dostopa do avtorskega dela na svetovnem spletu

preko Digitalne knjižnice Pedagoške fakultete.

Anja Cerovšek



II

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Dn

DK

KG glive / Aspergillus / Candida / Cladosporium / Exophiala / Saprolegnia / človeška ribica

/ Proteus / ITS rDNA

AV CEROVŠEK, Anja

SA ZALAR, Polona (mentor) / PRIIMEK, Ime (recenzent)

KZ SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16

SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in kemija

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

LI 2019

IN OSAMITEV IN IDENTIFIKACIJA GLIV S ČLOVEŠKE RIBICE IN NJENEGA

NEPOSREDNEGA VODNEGA OKOLJA

TD diplomsko delo (univerzitetni študij)

OP IX, 63 str., 21 pregl., 14 sl., 2 pril., 71 vir.

IJ sl

JI sl/en

AI Dvoživke, vključno s človeško ribico, spadajo med ogrožene skupine živali v svetovnem merilu.

Med glavne grožnje spadajo uničevanje in onesnaževanje njihovega naravnega habitata ter

podnebne spremembe. Glede na skromne podatke o patogenih človeške ribice v ujetništvu in

prosto živečih populacijah, smo v diplomski nalogi želeli ugotovili, če dodatno grožnjo

predstavljajo tudi glive. Zanimala nas je pojavnost oportuno patogenih gliv, ki so bile nedavno

odkrite kot povzročiteljice hitridiomikoz, mukormikoz, kromomikoz in saproleginoz. Poleg tega

pa smo želeli ugotoviti prisotnost gliv v kožnem mikrobiomu človeške ribice, saj o tem ni

podatkov. Tekom diplomske naloge smo izolirali glive iz neposrednega vodnega okolja

človeške ribice v naravi kot tudi v ujetništvu. Na lokacijah Jelševnik, Krška in Planinska jama

smo vzorčili vodo, ter v njej nastavili vabe. Iz istih lokacij in dodatno iz Postojnske jame smo

jemali brise površine živali, tako zdravih kot bolnih, in jih gojili na različnih gojiščih pri 15 °C

in 20 °C. Iz vseh vzorcev smo osamili 113 glivnih sevov, ki smo jih na podlagi nukleotidnih

zaporedij molekularnih označevalcev, predvsem ITS rDNA, uvrstili v 43 rodov. V umetnem in

naravnem okolju človeške ribice se nahajajo potencialno nevarne glive rodov: Aspergillus,

Candida, Cladosporium, Exophiala, Mucor in Saprolegnia, ki so znani povzročitelji bolezni

dvoživk. V vzorcih vode, kot tudi na mikrobioloških vabah smo opazili pojavnost istih rodov

gliv, prevladovala sta rodova Mucor in Trichoderma. Nabor gliv izoliranih s površine proteusov

se je delno prekrival s tistimi iz okolja, vendar pa je bila ponovljivost izolacije istih rodov pri

različnih osebkih zelo majhna, prav tako so se kolonije gliv pojavljale sporadično. Opazili smo

razlike v pojavnosti rodov gliv izoliranih z zdravih in bolnih osebkov. Pri zdravih osebkih so se

na koži največkrat pojavljale glive rodov Exophiala in Cladosporium (tri živali), pri bolnih pa

Saprolegnia (2 živali). Vrste rodu Candida so se pojavljale pri dveh zdravih in eni bolnih živali

izključno v ujetništvu.



III

KEY WORDS DOCUMENTATION

ND Dn

DC

CX fungi /Aspergillus / Candida / Cladosporium / Exophiala / Saprolegnia / Proteus

anguinus / Proteus/ ITS rDNA

AU CEROVŠEK, Anja

AA ZALAR, Polona (supervisor) / PRIIMEK, Ime (reviewer)

PP SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16

SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Faculty of education, Biology-chemistry

University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Biology

PY 2019

TY ISOLATION AND IDENTIFICATION OF FUNGI, COLLECTED FROM PROTEUS

ANGUINUS AND ITS IMMEDIATE AQUATIC ENVIRONMENT

DT Graduation Thesis (University studies)

NO IX, 63 p., 21 tab., 14 fig., 2 ann., 71 ref.

LA sl

Al sl/en

AB Amphibians, including human fish, belong on a global scale to endangered groups of animals.

The main threats include the destruction and pollution of their natural habitats and climate

change. Considering the modest data of human fish pathogens in captivity and wild populations,

we wanted to find out whether the fungi are also an additional threat. We were interested in the

incidence of opportunistic pathogens that were recently detected as the causative agents of

hitridiomycosis, mucormycosis, chromomycosis and saproleginosis. In addition, since there is

no data available, we wanted to determine the presence of fungi in human fish microbial skin.

During the diploma we isolated fungi from the immediate water environment of the human fish

in nature and in captivity. At the locations such as Jelševnik, Krška and Planinska jama we

sampled the water and we set the microbiological baits there. From the same locations, and

additionally from Postojna Cave, we were taking samples from healthy and sick animals’

surfaces, and they were grown on different media at 15 ° C and 20 ° C. All samples were isolated

from 113 fungal strains, which were classified into 43 genera on the basis of nucleotide

sequences of molecular markers, especially ITS rDNA. In the artificial and natural environment

of the human fish there are potentially dangerous fungi of the genera: Aspergillus, Candida,

Cladosporium, Exophiala, Mucor and Saprolegnia, known as causative agents of diseases of

amphibians. In the water samples, as well as on microbiological baits, the appearance of the

same fungus species was observed, with the genus Mucor and Trichoderma predominant. The

set of samples isolated from the surface of proteus were partially similar to those taken from the

environment. However, the reproducibility of isolation of the same genera in the various animals

was very small, and the fungal colonies appeared sporadically. We observed differences in the

incidence of fungal species isolated from healthy and sick animals. With healthy animals, the

most commonly occurring genera were Exophila and Cladosporium (three animals), and with

sick animals Saprolegnia (2 animals). Candida species appeared with two healthy and one sick

animal exclusively in captivity.



IV

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

μ mikroliter (10-6 litra)

°C stopinje celzija

% odstotek

BLAST osnovno iskalno orodje lokalne poravnave (»Basic Local Alignment Search

Tool«)

CBS mikrobiološka zbirka gliv »Centraalbureau voon Schimmelcultures«, Utrecht

Ch antibiotik kloramfenikol

CTAB cetil trimetil amonijev bromid

DNA deoksiribonukleinska kislina

dNTP deoksinukleotid trifosfat

DRBC gojišče z dikloranom in barvilom rose bengal

EDTA etidiaminotetrocetna kislina

EXF oznaka za glive v mikrobiološki zbirkiekstremofilnih glivExna Katedri za

molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov, Oddelek za biologijo,

Biotehniškefakultete, Univerzev Ljubljani

g gram

ITS notranji distančniki, ki ločujejo rDNA posameznih ribosomskih podenot.

(»internal transcribed spacer«)

L liter

MEA agar s sladnim ekstraktom (»Malt Extract Agar«)

NCBI internetna baza podatkov (»National Center for Biotechnology Information«)

Npr. na primer

PCR polimerazna veriţna reakcija (»Polymerase Chain Reaction«)

Pen. antibiotik penicilin

rRNA ribosomska ribonukleinska kislinasp.Vrsta (»species«)

SNA minimalno gojišče ( ”synthetic nutrient agar”)

SSS raztopina za pripravo suspenzije spor (»spore suspension solution«)

Strep. antibiotik streptomicin

TGhL tripton-želatinski hidrolizatlaktozni agar



V

KAZALO VSEBINE

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ................................................ II

KEY WORDS DOCUMENTATION ............................................................................ III

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI .......................................................................................... IV

KAZALO PREGLEDNIC ............................................................................................. VII

KAZALO SLIK ............................................................................................................ VIII

KAZALO PRILOG ......................................................................................................... IX

1 UVOD .......................................................................................................................... 1

NAMEN ................................................................................................................ 1

HIPOTEZE ........................................................................................................... 2

2 PREGLED OBJAV .................................................................................................... 3

ČLOVEŠKA RIBICA ........................................................................................... 3

2.1.1 Ontogeneza/razvoj človeške ribice ................................................................ 3

2.1.2 Troglomorfne značilnosti .............................................................................. 3

2.1.3 Telesne značilnosti in prilagojenost .............................................................. 4

2.1.4 Neotenija ........................................................................................................ 5

2.1.5 Varovanje in vzroki za upad števila osebkov ................................................ 5

GLIVE IN GLIVAM PODOBNI PATOGENI ORGANIZMI ............................. 7

2.2.1 Hitridiomikoza ............................................................................................... 7

2.2.2 Mukormikoza ................................................................................................ 8

2.2.3 Kromimikoza ali feohifomikoza .................................................................... 9

2.2.4 Saprolegniaza................................................................................................. 9

3 MATERIALI, APARATURE IN METODE ......................................................... 11

GOJIŠČA, RAZTOPINE, ZMESI IN REAGENTI ............................................ 11

3.1.1 Gojišča ......................................................................................................... 11

3.1.2 Raztopine in zmesi ...................................................................................... 12

LABORATORIJSKE APARATURE IN KEMIKALIJE ................................... 13

3.2.1 Laboratorijske aparature .............................................................................. 13

3.2.2 Kemikalije ................................................................................................... 14

3.2.3 Materiali ...................................................................................................... 15

METODE ............................................................................................................ 16

3.3.1 Postavitev in vzročenje vab ......................................................................... 17

3.3.2 Izolacija gliv ................................................................................................ 19

3.3.3 Identifikacija na podlagi fenotipa ................................................................ 21

3.3.4 Identifikacija na podlagi genotipa ............................................................... 22



VI

3.3.5 Shranjevanje izoliranih kultur gliv ............................................................... 27

4 REZULTATI ............................................................................................................. 28

VABE .................................................................................................................. 28

4.1.1 Mikroskopija vab ......................................................................................... 29

4.1.2 Gojenje vsebine z brisov živali na primarnih izolacijskih ploščah ter določanje

števila CFU ................................................................................................................. 31

IDENTIFIKACIJA GLIV ................................................................................... 34

4.2.1 Vzorci vode .................................................................................................. 34

4.2.2 Vabe ............................................................................................................. 35

4.2.3 Brisi osebkov................................................................................................ 37

IZOLACIJA ČISTIH KULTUR VAB ................................................................ 40

4.3.1 Rezultati izolacije čistih kultur gliv iz vab inkubiranih pri 15 °C in 20 °C 40

IZOLACIJA ČISTIH KULTUR GLIV Z BRISOV OSEBKOV ........................ 42

4.4.1 Število izoliranih sevov različnih rodov gliv pri zdravih in bolnih osebkih 42

5 RAZPRAVA .............................................................................................................. 44

VABE .................................................................................................................. 44

5.1.1 Rod Mucor ................................................................................................... 44

5.1.2 Rod Trichoderma ......................................................................................... 45

5.1.3 Rod Rhizomucor ........................................................................................... 46

5.1.4 Rod Saprolegnia .......................................................................................... 46

BRISI ŽIVALI .................................................................................................... 46

5.2.1 Rodovi, ki so se pojavili le pri zdravih osebkih ........................................... 47

5.2.2 Rodovi, ki so se pojavili pri bolnih osebkih................................................. 48

5.2.3 Rodovi, ki so se pojavili pri zdravih in bolnih osebkih ............................... 49

5.2.4 Primerjava med pojavnostjo rodov v umetnem in naravnem okolju ........... 51

5.2.5 Zigomikoze .................................................................................................. 52

5.2.6 Saprolegnioze ............................................................................................... 52

5.2.7 Hitridiomikoze ............................................................................................. 52

5.2.8 Kromomikoze............................................................................................... 52

6 SKLEPI ...................................................................................................................... 54

7 POVZETEK .............................................................................................................. 55

8 VIRI ........................................................................................................................... 57

ZAHVALA ........................................................................................................................ 65

PRILOGA .......................................................................................................................... 67



VII

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Seznam uporabljenih naprav in njihov proizvajalec......................................... 13

Preglednica 2: Seznam uporabljenih kemikalij in njihov proizvajalec .................................... 14

Preglednica 3: Seznam uporabljenih materialov in njihov proizvajalec .................................. 15

Preglednica 4: Vzorčene vabe iz Jelševnika (po 3 mesecih inkubacije), Krške jame in

Planinske jame (po 6 mesecih inkubacije) ............................................................................... 18

Preglednica 5: Vzorčeni brisi iz naravnega in umetnega okolja .............................................. 19

Preglednica 6: Uporabljena gojišča pri izolaciji kultur gliv iz vab in brisov živali ................. 20

Preglednica 7: Priprava PCR mešanice .................................................................................... 24

Preglednica 8: Seznam uporabljenih začetnih oligonukleotidov za identifikacijo gliv ............ 24

Preglednica 9: PCR program za pomnoževanje ....................................................................... 24

Preglednica 10: Prikaz števila kolonijskih enot gliv na 30 oz. 50 µL brisa živali bivajočih v

umetnem (vivarij) in naravnem okolju. .................................................................................... 31

Preglednica 11: Rezultati identifikacije gliv iz vode v Jelševniku ob nastavitvi vab na podlagi

ITS nukleotidnih zaporedij ....................................................................................................... 34

Preglednica 12: Rezultati identifikacije gliv iz vode v Planinski jami ob nastavitvi vab na

podlagi ITS nukleotidnih zaporedij .......................................................................................... 35

Preglednica 13: Rezultati identifikacije gliv z vab inkubiranih v Jelševniku (B01) po 3

mesecih inkubacije, na podlagi ITS nukleotidnih zaporedij .................................................... 35

Preglednica 14: Rezultati identifikacije gliv z vab inkubiranih v Krški jami (B10-KJ) po 6

mesecih inkubacije, na podlagi ITS nukleotidnih zaporedij .................................................... 36

Preglednica 15: Rezultati identifikacije gliv iz vab inkubiranih v Planinski jami (B10-PJ) po 9

mesecih inkubaciji na podlagi ITS nukleotidnih zaporedij ...................................................... 37

Preglednica 16: Rezultati identifikacije gliv iz brisov živali iz Jelševnika na podlagi ITS

nukleotidnih zaporedij .............................................................................................................. 37

Preglednica 17: Rezultati identifikacije gliv iz brisov živali iz Planinske jame na podlagi ITS

nukleotidnih zaporedij .............................................................................................................. 38

Preglednica 18: Rezultati identifikacije gliv iz brisov živali iz Postojnske jame – Črne jame

(naravno okolje) in vivarija (umetno okolje) na podlagi ITS nukleotidnih zaporedij .............. 38

Preglednica 19: Rezultati identifikacije gliv iz vab .................................................................. 41

Preglednica 20: Primerjava zastopanosti posameznih rodov izoliranih iz vab ........................ 41

Preglednica 21: Povzetek števila izoliranih sevov določenih rodov gliv z zdravih in bolnih

osebkov, iz naravnega okolja in ujetništva ............................................................................... 43



VIII

KAZALO SLIK

Slika 1: Človeška ribica (Delo, Maja Prijatelj Videmšek) ......................................................... 4

Slika 2: Shema raziskovalnega dela diplomske naloge ........................................................... 16

Slika 3: Izgled in postavitev vab v naravno okolje .................................................................. 17

Slika 4: Vabe iz Jelševnika in Krške jame (1 in 2: vaba Jelševnik (B01); 1-kačja koža, 2-

perje, 3 in 4: vaba Krška jama (B10); 3- kačja koža, 4- vodni agar iz dializne cevi) .............. 28

Slika 5: Mikroskopija vab iz Jelševnika (1-4) in Krške jame (5-8) ......................................... 30

Slika 6: Primarne izolacijske plošče osebka Paa19 gojene pri 15 °C in 20 °C ........................ 32




Slika 10: Primarne izolacijske plošče osebka Pap32 gojene pri 15 °C in 20 °C ..................... 34

Slika 11: Rod Mucor na primarni izolacijski plošči ................................................................ 45

Slika 12: Rod Trichoderma na primarni izolacijski plošči ...................................................... 46

Slika 13: Zaplesnjen del zadnje nogice osebka Paa25 (Avtor: Lilijana Bizjak-Mali, 2019) ... 49

Slika 14: Prikaz s filamenti obdane nogice osebka Paa25, 100x povečava (Avtor: Polona

Zalar, 2019) .............................................................................................................................. 49



IX

KAZALO PRILOG

Priloga A .................................................................................................................................. 67

Priloga B .................................................................................................................................. 68



1

1 UVOD

Človeška ribica z znanstvenim imenom Proteus anguinus je z obema podvrstama Proteus

anguinus anguinus in Proteus anguinus parkelj karizmatična dvoživka, endemična za skrite in

nedostopne podzemne vode dinarskega krasa. Pogoje za uspešno življenje najde le v okolju, na

katerega je dobro prilagojena. Je edini evropski predstavnik evolucijsko stare skupine vodnih

repatih dvoživk, ki spadajo v družino Proteidae ali močerilarji (Langecker, 2000).

Človeška ribica je v Sloveniji zavarovana z Uredbo o prosto živečih živalskih vrstah (Ur. l.

RS2004), na rdečem seznamu Svetovne zveze za varstvo narave (IUCN) pa je opredeljena kot

ranljiva. Evropska unija si prizadeva vrsto in njen habitat obdržati v ugodnem ohranitvenem

stanju (Hudoklin, 2011).

Skupina dvoživk zaradi svoje odvisnosti od vodnih virov sodi med najbolj ranljive vretenčarske

skupine, saj se kakovost podzemnih voda poslabšuje. Povečana onesnaženost njenega

življenjskega prostora z nevarnimi in strupenimi organskimi snovmi ter kovinami pa je zanjo

lahko usodna. Človeška ribica namreč živi v povprečju 68,5 let in je zato dolgoročno

izpostavljena različnim stresom. Na povečano koncentracijo kovin se lahko odzove s

prekomernim kopičenjem le teh v tkivih oziroma organih, kar lahko resno ogrozi njen obstoj.

Poleg uničevanja in onesnaženja naravnega habitata človeške ribice, spreminjanja podzemnega

okolja z organskimi in anorganskimi onesnažili, so vse večja grožnja tudi okužbe z mikrobi.

Glavno grožnjo za dvoživke, ki so jo dokumentirali in povzročitelja poimenovali l. 1993,

predstavlja glivna bolezen, imenovana hitridiomikoza, sledijo pa ji še druge bolezni, ki jih

povzročajo glive in drugi patogeni mikroorganizmi, kot so: saproleginoze, kromomikoze in

mukormikoze. Zaradi fizioloških in ekoloških značilnosti dvoživk je njihovo naravno vodno

okolje glavni medij prenosa okužb. V ujetništvu pa so živali še bolj dovzetne za posamezne

okužbe. Zaradi stresa in posebnih pogojev gojenja v ujetništvu, se poleg vode, okužbe prenašajo

tudi s hrano in rokovanjem (Seyedmousavi, Guillot in De Hoog, 2013).

NAMEN

Cilj diplomske naloge je bil osamiti in identificirati glive iz rodnega in umetnega okolja

človeške ribice, ter oceniti stanje ogroženosti človeške ribice v naravnem podzemnem in

umetnem okolju. Izolirane glive smo želeli identificirati na osnovi danes uveljavljenih metod,

kot so primerjava nukletodnih zaporedij ITS rDNA in drugih DNA označevalcev za posamezne



2

rodove. Zanimalo nas je predvsem, katere glive uspevajo v naravnem okolju človeške ribice in

so zanjo lahko potencialno nevarne. Hkrati nas je zanimala pojavnost oportuno patogenih gliv,

ki so bile nedavno odkrite kot povzročiteljice hitridiomikoz, kromomikoz, feohifomikoz in

saproleginoz.

Glede na skromne podatke o patogenih človeške ribice v ujetništvu in glede na to, da imamo

malo podatkov o mikrobiološkem statusu prosto živečih populacij, bodo rezultati doprinesli

vpogled v mikrobiološko aktivnost, povezano s človeško ribico in izpostavljenost te vrste

porajajočim se patogenom v naravnih in umetnih okoljih.

Zavedati se moremo, da varstvo človeške ribice posredno zagotavlja tudi varstvo celotne

jamske biodiverzitete, saj je človeška ribica primerna indikatorska vrsta stanja podzemnih

habitatov. Njene ekološke zahteve namreč večinoma pokrivajo tudi ekološke zahteve večine

jamskih vodnih vrst (Hudoklin, 2011).

HIPOTEZE

- Pričakovali smo, da bomo s površine človeških ribic izolirali raznolike glive, ki se bodo

pojavljale tudi v vodi.

- Predvidevali smo, da bomo z bolnih osebkov izolirali in identificirali manj pogoste glive,

patogene za dvoživke.

- Predvidevali smo, da bomo s površine kože prostoživečih živali v primerjavi z živečimi v

ujetništvu izolirali različne vrste.



3

2 PREGLED OBJAV

ČLOVEŠKA RIBICA

Človeška ribica, imenovana tudi močeril ali proteus (znanstveno ime Proteus anguinus) je

dvoživka, ki živi v podzemnih vodah Dinarskega krasa od porečja reke Soče pri Trstu v Italiji,

preko južne Slovenije in jugozahodne Hrvaške, do reke Trebišnice v Hercegovini (Sket, 1997).

V Sloveniji živita dve podvrsti, to sta beli močeril, ki predstavlja prevladujoči del populacije,

ter črni močeril, ki pa je poznan samo z belokranjskega krasa. V Sloveniji je znanih približno

160 najdišč človeške ribice, med katerimi je kar dobra polovica na Dolenjskem (Hudoklin,

2011).

2.1.1 Ontogeneza/razvoj človeške ribice

Človeška ribica s povprečno življenjsko dobo 68,5 let sodi med eno izmed najdlje živečih

dvoživk (Voituron, De Fraipont, Issartel, Guillaume in Clobert, 2011). Reproduktivno obdobje

je prav tako zelo dolgo, traja lahko 30 ali več let (Juberthie, Durand in Dupuy, 1996), vendar je

njihova reprodukcijska stopnja precej nizka (Holtze idr., 2017). Reprodukcijski uspeh se

dodatno zmanjša zaradi izredno majhne kloake in nizke valilne stopnje (Voituron idr., 2011).

Določitev spola z zunanjimi lastnostmi osebka ni mogoča, saj so samci in samice monomorfni

(Holtze idr., 2017).

Človeška ribica je dvoživka, kar pomeni, da ličinke leže v vodo, po preobrazbi pa gre odrasla

žival nazaj na kopno (Štangelj in Ivanovič, 2013). Spolno dozori šele po 14 letih življenja, jajca

pa odlaga v izredno dolgih časovnih intervalih (Voituron idr., 2011). Samica izleže do 70 jajc,

ki jih pritrdi med skale. Embrionalni razvoj človeške ribice traja v naravnih razmerah približno

140 dni, pri 10 °C (Štangelj in Ivanovič, 2013). Po skoraj štirih mesecih postanejo ličinke po

obliki podobne odraslim živalim, razvoj pa je močno odvisen od temperature vode (Durand in

Delay, 1981). Ličinke merijo okoli 2 cm, samostojno pa se začnejo prehranjevati po približno

115 dneh, ko porabijo vso zalogo v črevesni steni (Aljančič G. in Aljančič M., 1998).

2.1.2 Troglomorfne značilnosti

Človeška ribica je edini jamski vretenčar v Evropi s troglomorfnimi značilnostimi, kot so

specializacija čutilnih organov, depigmentacija kože in podaljšanje nekaterih telesnih delov,

kot so nesorazmerna rast glave v dolžino (Istenič in Bulog, 1979). Med te karakteristike

vsekakor lahko prištevamo tudi reducirane oči, upočasnjen metabolizem in odpornost proti

stradanju (Christansen, 1992).



4

2.1.3 Telesne značilnosti in prilagojenost

Močeril ima telo kačaste oblike, ki zraste do dolžine 30 cm (Weber, 2000). Premika se s

kačastim zvijanjem telesa (Bizjak-Mali, 2003). Je plenilec, ki se v jesenskem času prehranjuje

z raki in polži, poleti pa prehrano dopolnjuje z žuželkami. Plen ne razkosa, temveč ga celega

pogoltne (Bulog, 1994).

Slika 1: Človeška ribica (Delo, Maja Prijatelj Videmšek)

Ker človeška ribica živi globoko v podzemlju, kjer vlada stalna tema, so njene oči izgubile

svojo vlogo (Štangelj in Ivanovič, 2013). Pomanjkanje pigmentacije in očesna degeneracija se

smatrata kot dve bistveni karakteristiki adaptacije živali na podzemske biotope. Komunikacijo,

orientacijo ter zaznavanje živega plena jim omogoča zmožnost zaznavanja električnega polja z

elektroreceptorni ampularnimi organi, ki so nameščeni na glavi (Bulog, 1994). Pri migracijah

na večje razdalje jim je še v dodatno pomoč zaznavanje zemeljskega magnetnega polja

(Štangelj in Ivanovič, 2013).

Med drugimi prilagoditvami na jamsko življenje je tudi sposobnost izredno dolgega stradanja-

tudi do 10 let (Bulog, 1994). To ji omogoča zmožnost konzumacije velike količine hrane

naenkrat in porabo lastnih rezerv, shranjenih v obliki večjih količin lipidov in glikogena v jetrih.

Ob večjem pomanjkanju hrane lahko tudi zmanjšajo svojo aktivnost in stopnjo metabolizma

(Bizjak-Mali, 2003).

Raziskave človeške ribice so potrdile izredno sposobnost zaznavanja zvočnega valovanja pod

vodo. Notranje uho pri močerilu predstavlja pomemben mehanoreceptorni čutilni organ, ki

živali omogoča orientacijo v svojevrstnem podzemnem vodnem naravnem okolju. Zaznavanje



5

zvočnih valovanj, nastalih pri dvigovanju ravni podtalnice, jim služi pri pravočasnem umiku

pred nevarnostjo (Štangelj in Ivanovič, 2013).

Človeška ribica diha s škrgami in tudi s kožo. Ob pomankanju kisika v vodi živali gredo na

površino po zrak, kjer se poveča tudi razmeroma majhna dihalna vloga pljuč (Bulog, 1994).

Pomankanje kisika zaznajo s specifičnimi brstiči, ki se nahajajo ob vhodu v škržne reže. Ti

služijo za preizkušanje kemizma vode. Ob deoksigenerizaciji vode sprožijo ustrezno senzorično

informacijo, ki sproži zračno dihanje (Štangelj in Ivanovič, 2013).

2.1.4 Neotenija

Za človeško ribico je značilna neotenija. To je fenomen, pri katerem osebki dosežejo

reproduktivno zrelost, hkrati pa ohranjajo nekatere zunanje juvenilne (mladostne) znake.

Mednje sodijo zunanje škrge, škržne reže in koža z mnogimi značilnostmi ličinke. Pri

dvoživkah preobrazbo regulira hormon tiroksin, ki ga izloča ščitnica (Bulog, 1994). Vzrok za

pojav neotenije pri človeški ribici naj bi bil oviran odziv ciljnih tkiv na hormone ščitnice

(Langecker, 2000). Po vsej verjetnosti pride tako tudi do upočasnjenega somatskega razvoja pri

hitrosti dozorevanja spolnih organov. Znano je, da se neotenija pri repatih dvoživkah pojavlja

v relativno stabilnem vodnem okolju z zadostnimi viri hrane, brez predatorjev (Bulog, 1994).

2.1.5 Varovanje in vzroki za upad števila osebkov

Trenutno so dvoživke skupina živali z največjim deležem vrst, ki jim grozi izumrtje (IUCN,

2015). Po poročilu Agencije za oceno globalne ogroženosti dvoživk je 43% populacij dvoživk

v upadu, dodatnih 32% pa je ogroženih (La’Toya in Klaphake, 2013).

Človeška ribica je na rdečem seznamu Svetovne zveze za varstvo narave (IUCN) opredeljena

kot ranljiva, zato jo na ravni Evropske unije varuje več nacionalnih in mednarodnih predpisov.

Zavarovana je z Uredbo o prosto živečih živalskih vrstah (Ur. l. RS 46/2004), na ravni Evropske

unije (Direktive o habitatih (92/43/EEC) pa smo dolžni vrsto in njen habitat ohranjati v

ugodnem ohranitvenem stanju z opredelitvijo posebnih varstvenih območij, ki sestavljajo

omrežje Natura 2000. V slovenski del tega omrežja je uvrščenih 92 lokalitet človeške ribice v

okviru 24 območij (Hudoklin, 2011).

Kljub varovanju se je populacija človeške ribice do danes zmanjšala, saj se število opaženih

osebkov na dobro poznanih in pogosto obiskanih lokacijah manjša (Hudoklin, 2011).

Ključne grožnje predstavljajo različne vrste onesnaževanja okolja, kot so intenzivno kmetijstvo,

industrijski in komunalni odpadki, vse večja urbanizacija in divja odlagališča, ki se nahajajo v



6

območju podzemnih in ponornih tokov. S tem se kakovost in velikost habitata neizmerno

manjšata (Hudoklin, 2011).

Ker je habitat človeške ribice v večji meri človeku nedostopen, je pri oceni stanja ključnega

pomena kakovost podzemske vode (Hudoklin, 2011). S stališča ogrožene jamske favne je zlasti

pomembna prisotnost povečanih količin nitratov, težkih kovin, metaloidov in pesticidov

(Bulog, 2009).

Pri oceni kakovosti podzemne vode so nam v pomoč rezultati državnega monitoringa kakovosti

površinskih (stanje ponoric) in podzemnih voda (stanje izvirov), ki v skladu z zahtevami Vodne

direktive poteka od leta 2007 (Hudoklin, 2011).

Zadnje raziskave so pokazale, da so vrednostni pragi z Uredbo o standardih kakovosti

podzemne vode (Ur. l. RS 100/05) za večino parametrov ustrezni. Izjema so nitrati, pri katerih

normativ za podzemno in pitno vodo znaša 50 mg/L, kar je težko sprejemljivo za človeško

ribico. Že iz raziskav Buloga (2009) lahko razvidimo, da dušikova umetna gnojila (amonijev

nitrat, kalijev nitrat in natrijev nitrat) skupaj s pesticidi odločilno prispevajo k upadanju števila

dvoživk. Koncentracije nitrata, večje od 10 mg NO3/L, neugodno vplivajo na populacijo

človeške ribice, saj imajo škodljiv vpliv na larvalne stadije (ličinke) in neotenične oblike

(Hudoklin, 2011).

V prispevku Hudoklin (2011) ocenjuje stanje ključnih lokalitet habitata človeške ribice na

Dolenjskem, vključenih v območja Natura 2000. Iz rezultatov kemijskega stanja podzemne

vode in ekološkega stanja površinskih vod je bilo 23% lokalitet ocenjeno kot ugodnih. To so

bili predvsem izviri na neposeljenih in gozdnatih območjih. Problematično stanje je obsegalo

kar 42% lokalitet, na območju podzemne Krke, Krupe, Temenice in Rinže. Vzroki za takšno

stanje so bili intenzivno kmetijstvo, nelegalni izpusti kanalizacije in pa vode, ki se izlivajo v

podzemlje iz nekdanjega rudniškega območja. V rečnem sedimentu in tkivih človeške ribice so

še vedo prisotni PCB-ji in koncentracije težkih kovin. Ker človeška ribica živi več deset let,

lahko kopičenje teh toksičnih substanc dolgoročno resno ogrozi njen obstoj (Hudoklin, 2011).

Poleg uničevanja in onesnaževanja naravnih habitatov človeške ribice ter podnebnih sprememb

so v zadnjem času največja grožnja glivne okužbe (La’Toya in Klaphake, 2013). Naraščajoče

bolezni prostoživečih živali so resna grožnja za biotsko raznovrstnost (Daszak, Cunningham in

Hyatt, 2000).



7

GLIVE IN GLIVAM PODOBNI PATOGENI ORGANIZMI

Glive in glivam podobni organizmi predstavljajo sorazmerno pogoste patogene nižjih

vretenčarjev, zlasti v vodnih okoljih. V mnogih primerih so prisotni povsod v naravi in vplivajo

na poškodovane ali imunsko oslabljene posameznike. Nekatere glive so sekundarni ali

oportunistični patogeni, nekateri pa so resni primarni patogeni (Densmore in Green, 2007).

Seznam glivnih patogenov, o katerih so poročali v povezavi z opazovanimi lezijami ali

umrljivostjo dvoživk je precej dolg, a veliko bolezni ni dobro opisanih ali se o njih ni poročalo.

Mednje spadajo hitridiomikoze, zigomikoze, kromomikoze in saprolegnioze (Densmore in

Green, 2007).

2.2.1 Hitridiomikoza

Trenutno je najpomembnejši in dobro opisan patogen dvoživk hitridna gliva Batrachochytrium

dendrobatidis, ki povzroča dramatično upadanje in izumrtje populacij dvoživk po vsem svetu

(Berger, Longcore, Speare, Hyatt in Skerratt, 2009). Druga vrsta rodu Batrachochytrium, B.

salamandrivorans, odkrita leta 2013, pa povzroča hitridiomikozo pri močeradih (Martel idr.,

2013).

Berger idr., (1998) in Pessier idr., (1999) so hitridiomikozo najprej opisali pri prostoživečih

populacijah dvoživk v Avstraliji in Srednji Ameriki sredi devetdesetih, njen izvor pa je še danes

neznan. V skladu z nedavno globalno oceno je bil B. dendrobatidis odkrit v več kot 52 državah

in sicer pri 42% vrstah dvoživk (Olson idr., 2013).

Glede na število prizadetih vrst in njeno nagnjenost k izumrtju populacij dvoživk, je

hidridiomikoza imenovana kot najhujša nalezljiva bolezen, ki je bila kdaj zabeležena med

vretenčarji (Gascon idr., 2007).

Hitride so vseprisotne, keratinofilne ali hitinofilne, sporogene glive, ki se nahajajo v vlažnih in

vodnih okoljih. Za te primitivne mikroskopske glive so značilne gibljive spore ali tako

imenovane zoospore (Van Rooij, Martel, Haesebrouck in Pasmans, 2015). Klinični simptomi

bolezni najpogosteje vključujejo čezmerno izločanje kože, hiperkeratozo ter rdečico kože ali

razbarvanje. Hiperkeratoza je zgoščevanje kože dvoživk, ki moti osmotsko ravnovesje, ko se

okužba širi po koži, kar povzroči smrt zaradi srčnega zastoja (Longcore, Pessier in Nichols,

1999).



8

Različni rodovi in vrste hitridnih gliv so znani patogeni rastlin, protistov in nevretenčarjev,

vendar rod Batrachochytrium združuje edini vrsti hitrid, znani kot povzročiteljici bolezni

vretenčarjev (Longcore idr., 1999).

Batrachochytrium dendrobatidis ima dve primarni življenjski stopnji: reproduktivni

zoosporangij in gibljive zoospore, ki nastajajo v zoosporangiju (Parker, 2002). Zoospore so

sposobne kemotaksije in se lahko premikajo proti različnim molekulam, ki so prisotne na

površini dvoživk, kot so sladkorji, beljakovine in aminokisline (Moss, 2008). B. dendrobatidis

vsebuje tudi številne proteolitične encime in esteraze, ki pomagajo pri prebavi celic dvoživk in

tako uporabijo kožo dvoživk kot hranilo (Rosenblum, Poorten, Joneson in Settles, 2012).

Njen življenjski cikel se začne v celicah povrhnjice gostitelja, kjer zoospore tvorijo sferično

steljko, ki ob dozoritvi z nespolnim razmnoževanjem proizvaja nove zoospore. Zoospore se

nato sprostijo s površine kože in obnovijo cikel okužbe, ki se širi z vodo in z neposrednim

stikom med živalmi (Fisher in Garner, 2007).

Na splošno je prisotnost B. dendrobatidis povezana z okolji s sorazmerno hladnimi do zmernimi

temperaturami med 17 °C in 25 °C, čeprav lahko tudi preživi temperaturo med 4 °C in 28 °C.

Širok temperaturni razpon za rast, vključno z zmožnostjo preživetja pri 4 °C, daje glivi

zmožnost preživetja v celicah gostitelja tudi takrat, kadar so temperature v vodnih okoljih nizke

(Piotrowski, Annis in Longcore, 2004).

2.2.2 Mukormikoza

Mukormikoza ali zigomikoza je bolezen, ki jo povzročajo zigomicete vrste Mucor

amphibiorum. Je smrtna bolezen, ki spodbuja tvorbo granuloma, sestavljenega iz vnetnih celic

in fibroznega tkiva v večini organov. Jetra po obdukciji vsebujejo majhne blede vozle do

premera približno 5 mm, običajno v velikem številu (Speare idr., 1997).

Mucor amphibiorum je dimorfna gliva, saj je v gostitelju podobna kvasovkam, v okolju pa je

filamentozna. Zunaj gostitelja živi v obliki hif, ki tvorijo micelij. Ko se hife srečajo, tvorijo

odporne strukture imenovane zigospore. Spore se sčasoma oblikujejo in te predstavljajo grožnjo

dvoživkam, če jih te zaužijejo. M. amphibiorum raste in sporulira v tleh, iz česar sledi, da se

lahko dvoživke okužijo takrat, kadar ujamejo plen, ki je kontaminiran z zemljo, ki vsebuje spore

(Berger, 2009).

Čeprav se mukormikoza pojavlja pri dvoživkah v ujetništvu, je v naravi stopnja smrtnosti na

račun okužbe s temi glivami nizka. Mogoče običajni odmerek inokulacije v naravi ni dovolj



9

visok, da bi povzročil epidemične bolezni. O okužbi prostoživečih dvoživk z vrsto M.

amphibiorum so poročali le iz Avstralije (Berger, 2009).

2.2.3 Kromimikoza ali feohifomikoza

Kromomikoza je bolezen, ki jo povzročajo pigmentirani glivni patogeni iz rodu Cladosporium,

Exophiala, Fonsecaea, Ochroconis in Phialophora (Juopperi, Karli, De Voe in Grindem,

2002). Nahajajo se v tleh in odmrlem rastlinskem materialu. Klinični znaki bolezni vključujejo

neješčnost, izgubo telesne teže, razjede ali granulomi kože, otekanje in poškodbe notranjih

organov, vključno z vranico, jetri in ledvicami (Wright in Whitaker, 2001). Smrt običajno

nastopi v roku enega do šestih mesecev po prvih znakih okužbe (Cicmanec, Ringler in Beneke,

1973).

Prenos je običajno posledica kontaminacije iz okolja, poškodbe kože pa lahko prispevajo še k

večji možnosti okužbe (Juopperi idr., 2002). Na osnovi raziskav sklepajo, da ima stres glavno

vlogo pri patogenezi okužbe. V eni izmed študij je skupina dvoživk, ki so bile pod stresom,

podlegla bolezni, medtem ko se ostale niso okužile (Schmidt, 1984).

Kromomikoza je razširjena po celem svetu, čeprav se pogosteje pojavlja v tropskih ali

subtropskih območjih (Emmons, Binford in Utz, 1970). Večina zgodnjih poročil o

kromomikozi dvoživk je prišla iz Južne Amerike (CORREA, 1968). Poznamo pet vrst, ki

povzročajo večino bolezni: Fonsecaea pedrosoi je najpogostejša v tropskih regijah z visoko

stopnjo vlažnosti in padavin, Cladophialophora carrioni je pogost v tropskih državah z malo

padavinami, kot so Kuba, Venezuela, Avstralija in Južna Afrika. Druge vrste so še Exophiala

dermatitides, Cladophialophora ajelloi, Taniolella bopii in Exophiala spinifera (Anaissie,

McGinnis in Pfaller, 2009)

2.2.4 Saprolegniaza

Vodne oomicete rodov Saprolegnia in Aphanomyce so odgovorne za uničujoče okužbe rib in

dvoživk. Vrste rodu Saprolegnia povzročajo saprolegniazo, bolezen, za katero je značilen pojav

glivnega micelija bombažaste strukture, vidnih glivnih filamentov in zoospor v lezijah.

Saprolegnia se s pomočjo nekroze kože začne razprostirati po površini gostitelja kot bombažni

film. Čeprav pogosto ostane v epidermalnih plasteh, je Saprolegnia običajno usodna in sčasoma

povzroča hemodilucijo. Mesto začetne okužbe, stopnja rasti in sposobnost organizma na stres

močno odloča o preživetju organizma (Densmore in Green, 2007).



10

Simptomi bolezni so pogosto eritem, kožne razjede na repu in zadnjih ekstremitih, škrgah in

ustni sluznici. Lezije včasih globoko prodrejo tudi v spodnja tkiva. Dodatni simptomi lahko

vključujejo še anoreksijo, hujšanje, letargijo, bruhanje in težave z dihanjem (Frye in Gillespie,

1989). Saprolegniazo lahko diagnosticiramo z opazovanjem, vendar je dokončna diagnoza

odvisna od histologije in molekularne potrditve (Taylor, Green, Wright in Whitaker, 2001).

Ker so ti organizmi prisotni povsod v vodnem okolju, so pogosti primarni patogeni ustne votline

ličink dvoživk in kot sekundarni povzročitelj površinske okužbe vodnih brezrepih dvoživk in

kaudatov. Prav tako okužijo ribe, kar nakazuje na verjetnost medsebojnega prenosa okužbe med

ribami in dvoživkami (Kiesecker, Blaustein in Miller, 2001). Blaustein (1998) nakazuje tudi na

možnost povezave vpliva na plodnost odraslih osebkov in smrtnost jajčec dvoživk.

Življenjski cikel saprolegnije ima, tako kot pri drugih oomicetah, nespolno fazo, kjer se

razvijejo sporangiji in zoospore, ter spolno fazo, kjer nastanejo oospore. Nespolna faza je

primarna za okužbo novih gostiteljev, ker se v okolje sproščajo zoospore, ki prosto plavajo. Za

tvorbo spolnih oospor je značilno, da povečajo preživetje v stresnih razmerah, kot so ekstremno

nizke temperature ali izsušitev. Tako ostanejo vse do izboljšanja pogojev. Za nekatere vrste

rodu Saprolegnia (vključno z večino sevov S. parasitica) smatrajo, da nimajo spolnega cikla in

ne proizvajajo oospor (Stewart idr., 2017).



11

3 MATERIALI, APARATURE IN METODE

GOJIŠČA, RAZTOPINE, ZMESI IN REAGENTI

3.1.1 Gojišča

Glive so heterotrofni organizmi, zato njihova gojišča sestojijo iz organskih virov ogljika,

vsebujejo pa tudi vire dušika, vitaminov in različnih mineralov. Za sporulacijo moramo včasih

uporabiti specifične vire ogljika in dušika. Glive večinoma gojimo na trdnih agarnih gojiščih

(Zalar, 2017), vodne plesni, kamor spadajo saprolegnije in hitride, pa v tekočih gojiščih.

Primarne izolacijske plošče za izolacijo gliv morajo vsebovati širokospektralne antibiotike, ki

omejujejo in zatirajo rast bakterij. Iz primarnih izolacijskih plošč glive cepimo v čiste kulture

na gojišča brez antibiotikov, ker le-ti lahko vplivajo na njihovo rast in morfologijo (Zalar,

2017).

Za izolacijo in gojenje gliv smo uporabili različna gojišča, ki so navedena v nadaljevanju.

Gojišče za izolacijo so vsebovala antibiotik kloramfenikol (50 mg/L pri MEA gojišču in 2 mg/L

pri DRBC gojišču), ki smo jih v gojišče dodali pred avtoklaviranjem. Gojišči TGhL in SABG

sta vsebovali mešanico penicilina G (200 mg/L) in streptomicin sulfata (400 mg/L), ki smo jo

filtersko sterilizirano dodajali v predhodno avtoklavirana gojišča, ko so se ohladila na 55 °C.

Gojišče SNA ni vsebovalo antibiotikov.

MEA + Ch (agarno gojišče s sladnim

ekstraktom) (Zalar, 2017):

sladni ekstrakt 20 g

pepton 1,0 g

glukoza 20 g

agar 20 g

destilirana voda do 1000 ml

antibiotik

kloramfenikol

0,05 g

DRBC + Ch –gojišče z dikloranom in

barvilom rose bengal ter

kloramfenikolom

pepton 5g

glukoza 10g

KH2PO4 1g

MgSO4 0,5 g

Bengal rose barvilo 0,025 g

kloramfenikol 0,100g

dikloran 0,002g

agar 15,0g

destilirana voda 1000ml



12

TGhL + Pen /Strep

tripton 8 g

želatina hidrolizat 2 g

laktoza 4 g

agar 10 g

penicilin G 0,2 g

streptomicin sulfat 0,4 g

destilirana voda 1000 ml

Tekoče gojišče za izolacijo DNA (Raper

in sod., 1972)

glukoza 10 g

pepton 2,0 g

kvasni ekstrakt 2,0 g

MgSO4 X 7H20 0.5g

K2PO4 0,46 g

K2HPO4 1,0 g


SNA – minimalno gojišče ( ”synthetic

nutrient agar”) (Zalar, 2017)

KH2PO4 1 g

KNO3 1 g

MgSO4.7H2O 0,5 g

KCl 0,5 g

glukoza 0,2 g

saharoza 0,2 g


SABG + Pen/ Strep

glukoza 40g

pepton 10g

agar 20g

streptomicin sulfat 0,4 g

penicili G 0,2 g


3.1.2 Raztopine in zmesi

Pufer CTAB (Sambrook in sod., 1989)

Tris 2,42 g

NaCl 8,2 g

Na-EDTA 0,74 g

CTAB 2,0 g

bidestilirana voda do 100 ml

pH 7,5; uravnavamo z 1M HCl

Pufer TE (Sambrook in sod., 1989)

Tris 0,12 g

Na-EDTA 0,04 g

bidestilirana voda do 100 ml

pH 8,0; uravnavamo z 1M HCl

Fiziološka raztopina NaCl

NaCl 9 g




13

Pufer 1x TAE (Sambrook in sod., 1989)

Tris baza 242,0 g

ocetna kislina 57,1 g

0,5 M EDTA (pH) 100 ml


SSS (Raztopina za pripravo suspenzije

spor) (CBS katalog, 2001):

Tween 80 0,5 g

agar 0,5 g

destilirna voda 1000 ml

LABORATORIJSKE APARATURE IN KEMIKALIJE

3.2.1 Laboratorijske aparature

Uporabljene laboratorijske aparature so prikazane v Preglednici 1.

Preglednica 1: Seznam uporabljenih naprav in njihov proizvajalec.

Naprava Proizvajalec

Avtomatske pipete Eppendorf, Hamburg, Nemčija

Bunsenov gorilnik TLOS, Zagreb, Hrvaška

Centrifuga Eppendorf, Hamburg, Nemčija

Digestorij Variolab Molibien W90 Waldner, Wangen, Nemčija

Digitalna kamera DP12 Olympus, Tokyo, Japonska

Električni transformator za elektroforezo

Consort E143

Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ZDA

Elektroforezna banjica E33 Hoefer, San Francisco, CA, ZDA

Laminarij IBK 1 V2 Iskra, Šentjernej,Slovenija

Magnetno mešalo Rotamix 550MMH Tehtnica, Železniki, Slovenija

Mikroskop Olympus BX51 Olympus, Tokyo, Japonska

Mikrovalovna pečica Gorenje, Velenje, Slovenija

PCR sistem Eppendorf, Hamburg, Nemčija

Stereomikroskop Steri SV11 z virom

svetlobe KL1500 LCD

Zeiss, Oberkochen, Nemčija

Tehtnica Et-1111 Tehtnica, Železniki, Slovenija

Transluminator SYNGENE; a division of synoptics Limited

Vrtinčasto mešalo (vortex) Železniki, Slovenija



14

3.2.2 Kemikalije

Uporabljene kemikalije in njihovi proizvajalci so prikazani v Preglednici 2.

Preglednica 2: Seznam uporabljenih kemikalij in njihov proizvajalec

Kemikalija Proizvajalec

Agaroza Carl Roth Gmbh + Co

CaCl2 Gram d.o.o., Zagreb, Hrvaška

CTAB Sigma Chemical C., Luis, Mo., ZDA

dNTP Applied Biosystem, Callifornia, ZDA

Etanol 96% Chemo d.d., Ljubljana, Slovenija

Etanol 70% Chemo d.d., Ljubljana, Slovenija

Glukoza Kemika, Zagreb, Hrvaška

KH2PO4 Kemika, Zagreb, Hrvaška

Kloramfenikol Sigma Chemical C., Luis, Mo., ZDA

Kloroform Kemika, Zagreb, Hrvaška

Komplet reagentov PowerSoil® Mo Bio, ZDA

MgCl2× 6 H2O Kemika, Zagreb, Hrvaška

MgSO4× 7 H2O Merck, Darmastadt, Nemčija

NaCl Merck, Darmastadt, Nemčija

Na-EDTA Kemika, Zagreb, Hrvaška

10× PCR pufer brez MgCl2

Lestvica: ʺ100bp DNA Ladder Plusʺ

Fermentas Life Sciences, Litva

Pepton Merck, Darmastadt, Nemčija

Potato dextrose agar Biolife, Milan, Italija

RNA-ze Fermentas Life Sciences, Litva

Silikagel Merck, Darmastadt, Nemčija

Sladni ekstrakt Biolife, Milan, Italija

Syber safe Invitrogen

YNB Beton, Dickinson and Company, Sparks, MD

Taq polimeraza (5U/μl) Fermentas Life Sciences, Litva



15

3.2.3 Materiali

Uporabljeni materiali in njihovi proizvajalci so prikazani v Preglednici 3.

Preglednica 3: Seznam uporabljenih materialov in njihov proizvajalec

Material Proizvajalec

Dializne cevi SIGMA D-9527

Bris palčke »Eswab« s tekočino za

prenašanje (Eswab Liquid Amies

Collection and Transport System)

ThermoFisher Scientific



16

METODE

Raziskovalno delo je potekalo v večih korakih, ki so prikazani na Sliki 2.

Slika 2: Shema raziskovalnega dela diplomske naloge



17

Iz vzorcev vode, vab in brisov, ki smo jih odvzeli na mestih vzorčenja osebkov človeške ribice,

iz bolnih osebkov in iz živali brez vidnih okužb, smo izolirali glive in oomicete. Vzorce smo

gojili na več različnih gojiščih pri temperaturi 15 °C in 20 °C. Kasnejšo identifikacijo smo

večinoma izvedli s pomočjo molekularnih metod.

3.3.1 Postavitev in vzročenje vab

Številne glive imajo specifično potrebo po hranilih ali pa so specializirane za razgradnjo

določenih snovi, ki jih druge glive ne morejo razgrajevati. To lahko izkoristimo pri izolaciji.

Določeno substanco namestimo v okolje, ki ga naseljuje iskana gliva. Specifične substance v

tem primeru delujejo kot vabe (Zalar, 2017). Vabe so bile v našem poskusu namenjene

predvsem detekciji in izolaciji keratinofilnih gliv, kot so hitride.

Za naš poskus smo izbrali keratinske vabe (kačja koža – lev, perje kokoši) ter oligotrofno vabo

(vodni agar) ovito z dializno cevjo, ki smo jih namestili v 50 ml centrifugirke po Falconu in jih

zatesnili z najlonsko nogovico. V posamezne centrifugirke smo namestili obojega po 5 paralelk

in jih postavili v plastično perforirano posodo, ki smo jo različno dolgo, od 30 in 270 dni

inkubirali v okolju.

Slika 3: Izgled in postavitev vab v naravno okolje



18

Vzorci proučevanih vab so podani v Preglednici 4.

Preglednica 4: Vzorčene vabe iz Jelševnika (po 3 mesecih inkubacije), Krške jame in Planinske jame (po 6 mesecih inkubacije)

Oznaka vab Datum postavitve vabe v

okolje, kraj

Kraj in datum

vzorčenja

Opis

B01 28.7.2017, Jelševnik 28.10.2017 Perje, kačja koža

B01_kačjakoža 28.7.2017, Jelševnik 28.10.2017 Kačja koža

B10_KJ_kačjakoža 5.6.2017, Krška jama 8.12.2017 Kačja koža

B10_KJ_dial.cev 5.6.2017, Krška jama 8.12.2017 Dializna cev

B10_KJ_WA 5.6.2017, Krška jama 8.12.2017 Vodni agar

B10_PJ 8.5.2017, Planinska jama 25.5.2018 Kačja koža

B13_PJ_WA_DC 22.2.2018, Planinska jama 23.8.2018 Vodni agar in

dializna cev

3.3.1.1 Jemanje brisov s površine živali

Z metodo odvzema brisa površine kože smo vzorčili 10 zdravih in 4 bolne živali, skupno smo

odvzeli 14 brisov. Od teh smo štiri osebke vzorčili v ujetništvu, dva zdrava in dva bolna.

Brise s površine osebkov je jemala skupina Katedre za zoologijo. Pri delu so uporabljali sterilne

rokavice. Pred vzorčenjem so izbran osebek sprali s 100 ml sterilne vode, tako, da je vzorec

predstavljal dejansko samo mikrobe s kože osebkov in ne tudi iz okolja. Nato so s pomočjo

posebne vatenke (Eswab) s plastičnim držalom odvzeli bris tako, da so žival prebrisali od glave

do repa, vključno s predelom trebuha, hrbta in udov. Vatenko so vstavili v sterilno plastično

epruveto z Amies tekočino, v katero naj bi se sprostili vsi delci z brisa. Tekočino smo naprej

obdelovali najkasneje po 24 urah, do takrat pa smo jo spravili v hladilnik. Po odvzemu brisa

so živali takoj izpustili nazaj v njihovo naravno okolje. Osebkom, ki so imeli simptome bolezni

ali so bili mrtvi, so brisi bili odvzeti le v predelih, kjer so bili vidni znaki bolezni. Vse odvzete

brise so kasneje shranili na –2 °C , mrtve osebke pa v 70% etanolu.

Oznake vzorčenih živali, njihovi opisi in statusi ter lokacije vzorčenj so podani v Preglednici

5.



19

Preglednica 5: Vzorčeni brisi iz naravnega in umetnega okolja

Oznaka

brisa

osebka

Kraj in datum

vzorčenja

Okolje

(naravno/umetno)

Opis osebka

Pap1 Jelševnik,

28.7.2017

naravno zdrav

Pap32 Jelševnik,

5.10.2018

naravno zdrav

Paa4 Planinska jama,

22.8.2017

naravno zdrav


22.8.2017

naravno zdrav


22.8.2017

naravno zdrav


22.8.2017

naravno zdrav


8.3.2018,

naravno zdrav, prinešen v vivarij zoologije

Paa19,

feces

Postojnska jama,

16.4.2018

umetno

(vivarij)

bolan

(suh, ni hotel jesti)

Paa20 Postojnska jama,

16.4.2018

umetno

(vivarij) zdrav (na ogled obiskovalcem)

Paa21 Postojnska jama,

16.4.2018

umetno

(vivarij)

zdrav (na ogled obiskovalcem)

Paa22,

noga

mrtvega

osebka

Postojnska jama,

8.5.2018

umetno

(v vivariju 1 mesec)

bolan, vzorčena noga; (okužba

noge, težave s plovnostjo, veliko

parazitov v telesu (ježerilci);

prenešen na Odd. za biologijo

usmrtitev)

Paa23 Postojnska jama

(Črna jama),

8.5.2018

naravno bolan, z edemom.

Odvzet iz luže (50 m2), brez

povezave z vodotokom, bil je

napihnjen (edem), v tej luži so bile

tudi mrtve ribice.

Paa24 Postojnska jama

(Črna jama),

8.5.2018

naravno zdrav osebek

Paa25 Vilharjev rov,

Planinsko-

Postojnski sistem,

26.4.2018

naravno bolan; micelij na glavi in

okončinah, sum na Saprolegnia

3.3.2 Izolacija gliv

3.3.2.1 Izolacija gliv z vab in brisov osebkov

Pri izolaciji smo uporabili posredne gojitvene tehnike.



20

Vabe smo prejeli zaprte v 50 ml centrifugirke po Falconu. Pregledali smo jih tako, da smo jih

prenesli v sterilno petrijevko in jih očistili z destilirano vodo. Nato smo jih s skalpelom prerezali

in jih prenesli na spodaj podanih pet različnih gojišč. Poleg tega smo vse vabe prenesli tudi v

petrijevke s prej prekuhanimi konopljinimi semeni.

Brise osebkov smo prav tako precepili na pet različnih gojišč podanih v spodnji Preglednici 6.

Z vsebino gojišča lahko bistveno vplivamo na rast gliv. Vsem gojiščem smo dodali antibiotike,

bodisi kloramfenikol ali mešanico penicilina in streptomicina. Za dodatno izolacijo oomicet,

tako iz vzorcev vode in brisov, smo uporabili sterilno vodo s konopljinimi semeni. Vse smo

nacepili v duplikatih in inkubirali pri 15 in 20 ˚C do vidne rasti.

Preglednica 6: Uporabljena gojišča pri izolaciji kultur gliv iz vab in brisov živali

GOJIŠČE OPIS

DRBC+Ch dikloran-rose bengal kloramfenikolni agar

MEA+Ch agarno gojišče s sladnim ekstratom in dodanim kloramfenikolom

TGhL+Pen/strep tripton-želatinski hidrolizatlaktozni agar z mešanico penicilina in

streptomicina

SABG+Pen/strep Sabouraudov glukozni agar z dodano mešanico penicilina in

streptomicina

SNA minimalno gojišče

Konopljina semena gojišče s konopljinimi semeni smo pripravili tako, da smo jih

približno 20 minut prekuhavali v destilirani vodi in jih nato

prerezali s skalpelom.

3.3.2.2 Izolacija gliv s primarnih izolacijskih plošč

S pomočjo stereomikroskopa smo na primarnih izolacijskih gojiščih izbrali različne kolonije,

ki smo jih v mikrobiološki zaščitni komori izolirali v čiste kulture. Način izolacije kultur je bil

odvisen od strukture kolonij.



21

3.3.2.2.1 Sporulirajoče kolonije

Če gliva sporulira, je najprimernejši način izolacije kultur iz spor. Pri izolaciji je pomembno,

da spor ne nacepimo točkovno, temveč da jih redčimo po površini gojišča, bodisi s koščkom

agarja v obliki iglice ali pa s sterilno cepilno zanko pomočeno v SSS raztopino. Dotaknemo se

nespolno sporulirajoče kolonije glive in spore “redčimo” z enkratnim potegom po sredini sveže

agarne plošče. Na ta način inokulum redčimo v črti in lahko bolje opazimo morebitno

kotaminacijo (Zalar, 2017).

3.3.2.2.2 Nesporulirajoče glive

Nesporulirajoče glive v čiste kulture nacepimo z izrezom micelija iz posamezne kolonije.

Izberemo kolonijo, ki se ne prekriva z drugimi in izrežemo cca. 0,25–0,5 cm2 micelija z roba

kolonije (Zalar, 2017).

3.3.2.2.3 Kvasovke

Kvasovke smo izolirali tako, da smo se s sterilno cepilno zanko dotaknili željene kolonije, ter

jo do posameznih kolonij v treh potezah nanesli na sveže gojišče.

Nacepljene agarne plošče smo zalepili s parafilmom in jih inkubirali v duplikatih pri

temperaturi 15 °C in 20 °C. Kulture smo pregledali čez en teden pod stereomikroskopom. Če

niso bile čiste, smo jih ponovno nacepili. Ob ponovni prisotnosti bakterij smo uporabili MEA

gojišče z antibiotikom. Ko smo uspeli dobiti čiste kulture na vseh gojiščih, smo vse precepili

na MEA poševnike in na tekoče gojišče za DNA izolacijo. Plošče s čistimi kulturami smo

nadalje hranili pri 15 °C.

3.3.3 Identifikacija na podlagi fenotipa

3.3.3.1 Morfologija

Morfologija navkljub številnim genetskim tehnikam še vedno predstavlja temelj taksonomije

gliv. Morfološke znake delimo na makroskopske (oblika, barva micelija ter razmnoževalnih

struktur) in mikroskopske (oblika, barva, dimenzije spor ter drugih mikroskopskih struktur)

(Zalar, 2017).

Preparate za opazovanje mikroskopskih znakov smo pripravili tako, da smo s pinceto odščipnili

košček sporulirajočega micelija in ga položili v kapljico barvila anilin modro v mlečni kislini.

Preparate smo opazovali pod mikroskopom Olympus BX 51 in jih fotografirali z digitalno

kamero Olympus DP71.



22

3.3.4 Identifikacija na podlagi genotipa

Identifikacija samo na ravni fenotipa je mnogokrat zavajajoča in nezanesljiva, saj na

proučevane lastnosti vplivajo pogoji gojenja. Zato kot standard pri identifikaciji gliv

uporabljamo molekularne metode, predvsem primerjavo nukleotidnih zaporedij ITS rDNA ali

pa zaporedij za zapise drugih hišnih genov z zapisi deponiranimi v svetovne baze podatkov

(Zalar, 2017).

3.3.4.1 Izolacija genomske DNA

3.3.4.1.1 Izolacija DNA kvasovk

Postopek izolacije DNA kvasovk je potekal tako, da smo v sterilno 2 ml mikrocentrifugirko

odpipetirali 40 μl kita DNA Prepman Ultra. S sterilno cepilno zanko smo prenesli majhno

količino kolonij kvasnih celic. Mikrocentrifugirke smo inkubirali pri 100 °C v termo bloku 10

minut, nato smo centrifugirke centrifugirali 5 minut pri 14000 obratov na minuto. V 1.5 ml

mikrocentrifugirko smo odpipetirali 40 μl supernatanta, v katerem je bila DNA. Izolirano DNA

kvasnih celic smo shranili pri –20 °C.

3.3.4.1.2 Izolacija DNA filamentoznih in sporulirajočih gliv

Ekstrakcija DNA z mehansko lizo se uporablja za izolacijo DNA gliv predvsem zaradi trše

celične stene. Po tej metodi ne dobimo povsem čiste DNA, vendar je kvaliteta ustrezna za

pomnoževanje določenih regij z verižno reakcijo s polimerazo (Zalar, 2017).

Postopek:

V sterilno 2 ml mikrocentrifugirko smo dodali sterilno kovinsko kroglico in mešanico finega

peska (celit in silikagel v razmerju 1:2). V mikrocentifugirko smo odpipetirali 500 μl CATB

pufra ter s sterilno spatulo prenesli micelij zrasel na površini tekočega gojišča ali 1 cm2 micelija,

vzgojenega na agarnem gojišču. Celice smo strli z uporabo homogenizatorja, in sicer s

frekvenco 30 tresljajev na sekundo 1 minuto.

Pridobljeni homogenizat smo nato inkubirali vsaj 30 minut v termobloku pri 65 °C. Po

opravljeni inkubaciji smo v mikrocentrifugirko v digestoriju dodali 500 μl kloroforma in

premešali na mešalu za 1–2 sekundi, ter mešanico centrifugirali 5 min pri 14000 obratov na

minuto. V drugo sterilno 1,5 ml mikrocentrifugirko smo odpipetirali supernatant in dodali



23

dvakratni volumen ledenega 96% etanola in dodali 400 μl kloroforma, ter ponovno stresali na

mešalu 1–2 sekundi in centrifugirali pri enakih pogojih.

Supernatant smo zopet odpipetirali v svežo 1,5 ml mikrocentrifugirko in mu dodali dvakratni

volumen ledenega 96 % etanola. Mikrocentrifugirko smo pazljivo ročno premešali in inkubirali

pri temperaturi –20 °C preko noči, da je prišlo do precipitacije DNA. Naslednji dan smo vzorec

centrifugirali 5 minut pri 14000 obratih na minuto. Po centrifugiranju smo odpipetirali

supernatant, pelet pa sprali s 500 μl ledenega 70 % etanola in ponovno centrifugirali 5 minut

pri 14000 obratih na minuto. Zopet smo previdno odstranili celotni supernatant, pelet pa

posušili v topli sobi do suhega, 45 minut, nato pa ga resuspendirali v 50 μl TE pufra in inkubirali

5–30 minut v termobloku pri temperaturi 37 °C (Zalar, 2017).

Z uporabo te metode se DNA sprosti iz glivnih celic. Proteini, encimi in celični ostanki

precipitirajo v kloroformu. V vodni fazi-pufer CTAB ostane DNA, ki tvori kompleks s CTAB

(Zalar, 2017).

3.3.4.2 Verižna reakcija s polimerazo (PCR)

Z dvema oligonukleotidnima začetnikoma smo izbrali željen predel genoma. Za to reakcijo

potrebujemo enojno vijačnico, ki nastane po denaturaciji pri visoki temperaturi. Princip PCR

reakcije je ponavljajoči cikel denaturacije, podaljševanja verige in renaturacije (Zalar, 2017).

Ribosomska DNA sestoji iz ponovljivih zaporedij, ki vsebujejo malo ribosomsko podenoto

(SSU ali 18S), regijo notranjega distančnika 1 (ITS1), 5,8S podenoto, regijo notranjega

distančnika 2 (ITS2) in veliko ribosomsko podenoto (LSUali 28S). Te ponovitve so ločene z

neprepisljivimi zaporedji – NTS.

Za identifikacijo gliv smo uporabili odsek prepisljivih notranjih distančnikov 1 in 2 (ITS 1 in

ITS 2) vključno z 5.8S rDNA (ITS rDNA). Uporabili smo nukleotidna začetnika ITS4 in ITS5,

navedena v preglednici 8. Za identifikacijo kvasovk pa smo v nekaterih primerih pomnožili

odsek variabilnih domen D1/D2 velike ribosomske podenote LSU. Uporabili smo nukleotidna

začetnika NL1 in NL4 (Preglednica 8).

Postopek:

Odseke DNA smo pomnožili s pomočjo PCR reakcije. Na ledu smo v 1,5 ml mikrocentrifugirki

pripravili mešanico reagentov, ki je vsebovala vodo, pufer Dreamtaq, mešanico nukleotidov

(dNTP), začetna oligonukleotida 1 in 2 ter DNA polimerazo Dreamtaq. 34 μl mešanice smo

odpipetirali v 0,2 ml mikrocentrifugirke in dodali 1 μl vzorčne DNA. Imeli smo tudi negativno



24

kontrolo, ki smo ji namesto DNA dodali sterilno bidestilirano vodo. Reakcijska mešanica za

eno reakcijo je podana v Preglednici 7.

Preglednica 7: Priprava PCR mešanice

REAGENT ITS

H2O 26,82

pufer 3,5

dNTP (AB) (10mM) 0,7

začetni oligonukletid 1(10pmol/μl) 1,4

začetni oligonuletid 2 (10pmol/μl) 1,4

Dream Taq(5U/μl 0,18

DNA 1

vsota 35

Nukleotidni začetniki, ki smo jih uporabili za pomnoževanje različnih odsekov DNA, so

navedeni v preglednici navedenih reagentov.

Preglednica 8: Seznam uporabljenih začetnih oligonukleotidov za identifikacijo gliv

ZAČETNI NUKLEOTIDI NUKLEOTIDNO ZAPOREDJE

NL1 5`-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3`

NL4 5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’

ITS4 5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3`

ITS5 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3`

Program za pomnoževanje predela ITS, D1/D2 28S rDNA in ACT

Preglednica 9: PCR program za pomnoževanje

ITS D1/D2 ACT

začetna denaturacija: 95 °C 2 min 2 min 3 min

denaturacija: 95 °C 45 sek 45 sek 30 sek 30 sek

vezava začetnih oligonukleotidov: 54 °C, 30 sek 54 °C, 30 sek 55 °C,

30 sek

53 °C,

30 sek

elongacija: 72 °C 2 min 2 min 45 sek 45 sek

št. ciklov 30 30 7 25

končna elongacija: 72 °C 4 min 4 min 5 min



25

3.3.4.3 Gelska elektroforeza

Prisotnost in dolžino fragmentov, ki smo jih pomnožili s PCR, smo preverili z gelsko

elektroforezo in primerjavo s standardnimi dolžinami DNA.

Za pripravo 1% gela smo uporabili 0,6 g agaroze, 60 ml TAE pufra z barvilom SYBERsafe.

Zatehtano agarozo smo prenesli v 100 ml Erlenmeyerjevo stekleničko, ter jo segrevali v

mikrovalovni pečici dokler se ni raztopila. Po segrevanju smo dolili toliko destilirane vode, kot

jo je izparelo. Ko se je raztopljena agaroza deloma ohladila, smo dodali še barvilo. Mešanico

smo pazljivo premešali in jo vlili v pripravljen model z glavnički.

Elektroforeza je potekala v 1× TAE pufru. V levi in desni rob gela smo v luknjico nanesli po 2

μl DNA lestvice, v ostale pa po 4 μl vzorca pomnožka, zmešanega z 2 μl nanašalnega pufra. V

zadnjo luknjico pa smo odpipetirali negativno kontrolo. Elektroforeza je trajala približno 30

minut pod napetostjo 90–100 V. Po končani elektroforezi smo gel pogledali v transiluminatorju

z računalniškim programom UVI.

3.3.4.4 Določevanje in obdelava nukleotidnih zaporedij

Uspešno pomnožena zaporedja smo poslali na sekvenciranje in kot rezultat dobili sekvence v

kromatogramu in tekstovnem fasta formatu.

Nukleotidna zaporedja smo primerjali z javno dostopno podatkovno bazo NCBI

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Sekvenco smo skopirali v okence »Enter accession number(s),

gi(s), or FASTA sequence(s)«, izbrali blast opcijo.

Za vsako zaporedje smo si zapisali prekritosti nukleotidnih zaporedij, % identičnosti

primerjanih zaporedij in iz katerega okolja izhajajo zaporedja. Poimenovanje smo preverili v

bazi Index Fungorum (http://www.indexfungorum.org/names/Names.asp).

3.3.4.5 Izolacija DNA s PowerLyzer PowerSoil kompletom za izolacijo DNA

Komplet za izolacijo DNA je namenjen izolaciji genomske DNA vzorcev iz narave, ki

vsebujejo visoko vsebnost huminske kisline iz različnih tal, vključno s kompostom in

sedimenti. Izolirana DNA ima visoko stopnjo čistosti, ki omogoča uspešnejše PCR

pomnoževanje.



26

Potek:

V laminarju smo sterilno prenesli do 0,25 grama vzorca v prej označene epice. Nato smo dodali

750 μl raztopine Bead Solution in nekaj sekund mešali na vibracijskem mešalu. Nato smo dodali

60 l prej segrete raztopine C1, ki vsebuje SDS in druge snovi, potrebne za popolno lizo celic.

SDS deluje tudi kot anionski detergent, ki razgrajuje maščobne kisline in lipide, povezane s

celično membrano.

Nato smo vzorce stresali na vibracijskem mešalu 10 minut pri najvišji hitrosti. S stresanjem

smo omogočili trke kroglic in agensov ob mikrobne celice in s tem omogočili lizo celic. Nato

smo centrifugirali vzorce 30 sekund na 10,000 x g, tako da se je pelet posedel. Supernatant smo

prenesli v nove čiste epice in dodali 200 l raztopine C2, ki vsebuje reagent za obarjanje

organskih in anorganskih snovi, ki niso del DNA, vključno s huminskimi snovmi, celičnimi

ostanki in beljakovinami. Pomembno je, da odstranimo kontaminirajoče organske in

anorganske snovi, ki lahko zmanjšajo čistost DNA in zavirajo nadaljnje aplikacije DNA.

Vzorce smo premešali na vibracijskem mešalu in jih inkubirali pet minut na 4 °C. Nato smo

vzorce spet centrifugirali 1 minuto pri pri 10.000 x g. 600 μl supernatanta smo prenesli v 2-ml

čiste epice, pelet pa smo zavrgli. saj vsebuje organske in anorganske snovi, ki niso DNA,

vključno s huminsko kislino, celičnimi ostanki in beljakovinami.

Nato smo dodali 200 μl raztopine C3 in na kratko premešali na vibracijskem mešalu. Raztopina

C3 prav tako kot C2 odstranjuje inhibitorje in obraja dodatno organski in anorganski material,

ki ni DNA. Vzorce smo inkuburali 5 minut na 4 ° C.

Epruvete smo nato centrifugirali pri sobni temperaturi 1 minuto pri 10.000 x g. Prenesli smo do

750 μl supernatanta v čisto 2 ml epico. Dodali smo 1,2 ml raztopine C4, ki vsebuje visoko

koncentracijo soli. Ker se DNA močno veže na silicijev dioksid pri visokih koncentracijah soli,

bo to omogočilo vezavo DNA na spin filter brez anorganskih in organskih snovi, ki niso del

DNA.

675 μl vzorca smo odpipetirali v epico s spin filtrom in centrifugirali pri 10.000 x g 1 minuto.

Nato smo zavrgli tekočino, ki je ostala na dnu epice in dodali ponovno 675 μl supernatanta.

Centrifugirali smo pri 10.000 x g 1 minuto pri sobni temperaturi. To smo ponovili trikrat.

S tem korakom smo omogočili, da se je DNA vezala na kremenovo membrano v epici Spin

Filter. Onesnaževalci so prehajali skozi filtrirno membrano, pri čemer ostane le DNA vezana

na membrano.



27

Potem smo dodali 500 μl raztopine C5 in centrifugirali pri sobni temperaturi 30 sekund pri

10.000 x g. Raztopina C5 je pralna raztopina na osnovi etanola, ki se uporablja za dodatno

čiščenje DNA, ki je vezana na membrano silikatnega filtra v Spin filtru. Ta pralna raztopina

odstrani preostalo sol, huminsko kislino in druge onesnaževalce, hkrati pa omogoča, da DNA

ostane vezana na silikatno membrano.

Po centrifugiranju smo zavrgli tekočino, ki se je odstranila z membranskega filtra. Ponovno

smo centrifugirali in nato spin filter previdno prenesli v čisto 2 ml epico.

Dodali smo 100 μl raztopine C6 točno na sredino filtrirne membrane, ki zagotovi, da se vsa

membrana navlaži in posledično učinkovitejše sprosti DNA. Ponovno centrifugiramo 30

sekund pri 10.000 x g in zavrzemo Spin filter. DNA, ostalo v epici hranimo na –20 do –80 °C

do nadaljnje uporabe.

3.3.5 Shranjevanje izoliranih kultur gliv

Izolirane seve smo shranili v Mikrobiološko zbirko Ex Infrastrukturnega centra MYCOSMO,

MRIC UL, Slovenija na Oddelku za biologijo, Biotehniška fakulteta, Ljubljana, in sicer

kvasovke na –80 °C, filamentozne glive na poševike, ki so shranjeni v hladilniku, ter glive rodu

Saprolegnia v vodi na konopljinih semenih, hranjeni v hladilniku.



28

4 REZULTATI

Raziskovalno delo je potekalo od februarja 2018 do aprila 2019. Celoten potek, razen vzorčenja

vode, vab in brisov človeške ribice, je potekal v laboratorijih Katedre za molekularno genetiko

in biologijo mikroorganizmov. Vzorčenje pa je potekalo na različnih lokacijah Slovenije– v

Jelševniku, Postojnski jami, Krški jami, Planinski jami in Kompoljski jami.

VABE

Iz Jelševnika smo vabe pobrali po 3 mesecih inkubacije (B01), iz Krške jame po 6 mesecih

inkubacije (B10-KJ), iz Planinske jame po 9. mesecih inkubacije (B10-PJ). Vabo smo najprej

sprali v sterilni destilirani vodi. Del vabe smo ločili za izolacijo celokupne DNA s kompletom

reagentov PowerLyzer PowerSoil, del pa smo nacepili na izolacijska gojišča.

Po odvzemu po 3. in 6. mesecih sta bili tako kačja koža kot tudi perje videti še nerazgrajeni

(Slika 4).

Slika 4: Vabe iz Jelševnika in Krške jame (1 in 2: vaba Jelševnik (B01); 1-kačja koža, 2- perje, 3 in 4: vaba Krška jama (B10); 3- kačja koža, 4- vodni agar iz dializne cevi)



29

4.1.1 Mikroskopija vab

Nekatere vabe smo pregledali pod mikroskopom.

Na vzorcih vab kačje kože in perja, inkubiranih na lokaciji Jelševnik 3 mesece, gliv nismo

opazili (Slike 1‒4). Opazili smo le vijolične regije, iz česar smo domnevali, da je to bila

bakterija Jantinobacterium. Na vzorcu dializne cevi, inkubiranem v Krški jami 6 mesecev, smo

opazili tanke domnevno glivne hife (Slika 5 in 6). Na vzorcu kačje kože, inkubiranem 3

mesecev v Krški jami, gliv nismo opazili (Slika 7 in 8).



30

Slika 5: Mikroskopija vab iz Jelševnika (1-4) in Krške jame (5-8)

Legenda slik: Oznake 1–4: Jelševnik (B01); 1- perje, 100x povečava, 2- perje, 400x povečava, 3-kačja koža, 100x povečava, 4- kačja koža, 400x povečava.

Oznake 5–8: Krška jama (B10); 5- dializna cev, 100x povečava, 6- dializna cev, 400x povečava, 7- kačja koža, 100 povečava, 8- kačja koža, 400 povečava.



31

4.1.2 Gojenje vsebine z brisov živali na primarnih izolacijskih ploščah ter določanje

števila CFU

Na gojišča SABG Pen/Strep, TGhL Pen/Strep, MEA Ch in DRBC smo nanesli po 30 µl

tekočine brisov osebka odzetih iz naravnega in umetnega okolja (akvarij) (Slike v prilogi B).

En set plošč smo inkubirali pri 15 °C in drugega pri 20 °C. Po 10 dneh inkubacije smo prešteli

kolonije in določili št. kolonijskih enot (CFU) na 1 ml. En ml je volumen amies tekočine, v

katero je bila pomočena Flox vatenka. Ker je bil z eno vatenko odvzet bris ene živali, je torej

količnina CFU v 1 ml enaka količini CFU brisa enega osebka (CFU/ml = CFU/bris). V

Preglednici 10 je prikazano celokupno število zraslih kolonij gliv (filamentoznih in kvasovk)

na primarnih izolacijskih ploščah preračunano na 1 ml tekočine.

Preglednica 10: Prikaz števila kolonijskih enot gliv na 30 oz. 50 µL brisa živali bivajočih v umetnem (vivarij) in naravnem okolju.

Oznaka

živali

(volumen

brisa µl)

TGhL

CFU/ploščo

*(CFU/mL)

SABG

CFU/ploščo

*(CFU/mL)

DRBC

CFU/ploščo

*(CFU/mL)

MEA

CFU/ploščo

*(CFU/mL)

ko-

noplja

15 °C 20 °C 15 °C 20 °C 15 °C 20 °C 15 °C 20 °C 20 °C

Pap1 (50) 0 0 0 0 0 0 0 0 4

Paa4 (50) / 1 / 0 / 0 / 0 0

Paa5 (50) / 1 / 0 / (β) / 0 0

Paa6 (50) / 0 / 1 / (β) / (β) 0

Paa7(50) / 0 / 0 / 0 / 1 0

Paa15(30) 0 / 0 / 0 / 1 / 0

Paa18

(noga)

/ 5 / 7 / 0 / 1 0

Paa19(30) 7

(2,3.102)

11

(3,7.102)

TNTC

27

(9,0.102)

24

(8,0.102)

10

(3,3.102)

66

(2,2.103)

27

(9,0.102)

0

Paa20(30) 12

(4,0.102)

17

(5,7.102)

27

(9,0.102)

33

(1,1.103)

32

(1,1.103)

- 4

(1,3.102)

7

(2,3.102)

0

Paa21(30) 53

(1,8.103)

73

(2,4.103)

77

(2,6.103)

44

(1,5.103)

100

(3,3.103)

84

(2,8.103)

57

(1,9.103)

86

(2,9.103)

0

Paa24(30) 0

-

0

-

1

-

1

-

(β)

1

-

0

-

0

-

0

Paa25(30) 0 1 1 1 (β) (β) (β) (β) 0

Pap32(30) - - - - - - - - 0

Legenda: Obarvani deli s sivo so brisi živali iz umetnega okolja (vivarij), neobarvani pa brisi živali iz

naravnega okolja β – bakterije na plošči; / - ni podatka. *Kjer so bile plošče števne (10-100 kolonij),

smo preračunali št. CFU/1mL amies tekočine.



32

Slika 6: Primarne izolacijske plošče osebka Paa19 gojene pri 15 °C in 20 °C




33


Slika 9:Primarne izolacijske plošče osebka Paa24 gojene pri 15 °C in 20 °C



34

Slika 10: Primarne izolacijske plošče osebka Pap32 gojene pri 15 °C in 20 °C

IDENTIFIKACIJA GLIV

4.2.1 Vzorci vode

Vodo smo vzorčili le na dveh lokacijah, in sicer v času nastavitve vab. Podane so identifikacije

gliv iz vode v Jelševniku (Preglednica 11) in vode v Planinski jami (Preglednica 12). Na

izbranih gojiščih so v Jelševniku prevladovali izolati rodov Fusarium, v Planinski jami pa rodu

Trichoderma. Oba rodova tvorita hitro rastoče kolonije, ki so lahko zavrle rast oz. prerastle

morebitne druge glive v vzorcih.

Preglednica 11: Rezultati identifikacije gliv iz vode v Jelševniku ob nastavitvi vab na podlagi ITS nukleotidnih zaporedij

EXF št.

gojišče

tempe-

ratura

(°C)

Identifikacija

podobnost

ITS sekvence

tipskim sevom

(%)

13269 DRBC 15 Fusarium sporotrichioides 100

13382 SNA Cladosporium herbarum

kompleks vrst

97-100

12661 MEA 20 Clonostachys rosea f. catenulata 99

12658 TGhL Clonostachys rosea 99



35

12659 Fusarium circinatum 99

12660 SABG Fusarium dlaminii 100

12662 SNA Trichoderma atrobrunneum 99

Preglednica 12: Rezultati identifikacije gliv iz vode v Planinski jami ob nastavitvi vab na podlagi ITS nukleotidnih zaporedij

EXF št.

gojišče

tempe-

ratura

(°C)

Identifikacija

podobnost

ITS sekvence

tipskim sevom

(%)

12825

MEA 20 Trichoderma sp.

(hamatum/pubescens/yunnanense)

99

12826 SNA Trichoderma hamatum 100

12827 TGhL Trichoderma harzianum

100

12828

SABG Trichoderma citrinoviride 100

4.2.2 Vabe

Vabe smo vzorčili na vseh navedenih lokacijah razen v Postojnski jami. Identifikacije gliv z

Jelševnika po 3. mesečni inkubaciji so podane v Preglednici 13, Krške jame po 6 mesecih

inkubacije v preglednici 14, Planinske jame po 9. mesecih inkubacije pa v Preglednici 15.

Predvsem v Jelševniku in Krški jami prevladujejo izolati rodov Mucor in Trichoderma medtem

ko je nabor rodov v Planinski jami drugačen in zajema še predstavnike rodov Cylindrodendrum,

Fusarium, Neopyrenochaeta in Penicillium. Le v Krški jami smo zasledili vrsto oomicet

Saprolegnia delica.

Preglednica 13: Rezultati identifikacije gliv z vab inkubiranih v Jelševniku (B01) po 3 mesecih inkubacije, na podlagi ITS nukleotidnih zaporedij

EXF št.

substrat

gojišče

tempe-

ratura

(°C)

Identifikacija

podobnost

ITS

sekvence

tipskim

sevom (%)

13332

perje SNA 15 Mucor sp. (hiemalis, corticola,

racemosus)

99

13325 20 Trichoderma sp. (hamatum,

viride, harzianum, pubescens,

asperellum)

99

13333 DRBC 15 Mucor moelleri 100



36

13326 20 Trichoderma hamatum 100

13334 SABG 15 Mucor circinelloides 99

13348

koža SNA 15 Trichoderma sp. (hamatum,

viride, harzianum)

100

13346 20 Trichoderma spirale 99

13347 DRBC 15 Trichoderma atroviride 100

13327 20 Trichoderma sp. (viride,

samuelsii, koningii)

100

13335 SABG 20 Mucor laxorrhizus 99

Preglednica 14: Rezultati identifikacije gliv z vab inkubiranih v Krški jami (B10-KJ) po 6 mesecih inkubacije, na podlagi ITS nukleotidnih zaporedij

EXF št.

substrat

gojišče

tempe-

ratura

(°C)

Identifikacija

podobnost

ITS

sekvence

tipskim

sevom (%)

13338 koža MEA 20 Mucor sp. -

13337 DRBC 15 Mucor laxorrhizus 75

13328 20 Trichoderma atroviride 100

13349 TGhL 15 Mucor laxorrhizus 99

13339 20 Mucor circinelloides 94

13336 SABG 15 Mucor laxorrhizus 99

13343 dial.cev MEA 15 Mucor laxorrhizus 99

13330 DRBC 20 Trichoderma harzianum 99

13331 Trichoderma asperellum 99

13345 TGhL 15 Rhizomucor regularior 99

13344 20 Mucor laxorrhizus 99

13351 SABG 20 Mucor heterogamus 93(slaba

sek.) 13329 WA DRBC 20 Trichoderma harzianum 99

13340 TGhL 15 Mucor circinelloides 99

13342 20 Mucor laxorrhizus 99

13350 SABG 20 Saprolegnia delica 99



37

Preglednica 15: Rezultati identifikacije gliv iz vab inkubiranih v Planinski jami (B10-PJ) po 9 mesecih inkubaciji na podlagi ITS nukleotidnih zaporedij

EXF št.

substrat

gojišče

tempe-

ratura

(°C)

Identifikacija

podobnost

ITS

sekvence

tipskim

sevom (%)

13864 Kačja

koža

DRBC

20

Trichoderma hamatum 99,6%

14026 SABG

Fusarium

nepalense/lunulosporum/bothii

99,4%

14150 Kačja

koža,

konoplja

MEA 20 Neopyrenochaeta acicola 99%

14151 Cylindrodendrum hubeiense 99,6%

14022

Dializna

cev

DRBC

15 Penicillium expansum 99,8%

14023 Mucor circinelloides 99,5%

14024

SABG

Mortierella minutissima var.

dubia

100%

4.2.3 Brisi osebkov

Rezultati identifikacije brisov osebkov so podani v Preglednicah 16–18, glede na lokacijo, in

sicer iz Jelševnika v Preglednici 16, Planinske jame v Preglednici 17, ter Postojnske jame v

Preglednici 18. Edina lokacija, kjer smo vzorčili črni proteus (Proteus anguinus parkelj) je bila

v Jelševniku. Z dveh različnih osebkov smo izolirali različne glive (Preglednica 16). Z brisov

proteusa iz Planinske jame smo povzorčili 7 osebkov, od teh sta bila dva brisa negativna na

glive, iz ostalih pa smo pridobili večinoma le po en izolat ( Preglednica 17).

Preglednica 16: Rezultati identifikacije gliv iz brisov živali iz Jelševnika na podlagi ITS nukleotidnih zaporedij

Paa št.

EXF št.

gojišče

tempe-

ratura

(°C)

Identifikacija

podobnost

ITS

sekvence

tipskim

sevom (%)

Pap1 12651

konoplja 20

Pyrenochaetopsis leptospora 99,8

12901 Fusarium sporotrichoides 99,8 (ni T)

12652 Aaosphaeria arxii 99,6 (ni T)

12653 Aaosphaeria arxii 99,6 (ni T)

Pap32 13833 TGhL 15

Cystofilobasidium macerans 96,9

13835 Cystofilobasidium macerans 96,9



38

13834 Debaryomyces hansenii 100

13836 Penicillium bialowiezense 100

13837 DRBC

Penicillium sp.

(kongii, brevicompactum)

99,6

Preglednica 17: Rezultati identifikacije gliv iz brisov živali iz Planinske jame na podlagi ITS nukleotidnih zaporedij

Paa št.

EXF št.

gojišče

tempe-

ratura

(°C)

Identifikacija

podobnost

ITS

sekvence

tipskim

sevom (%)

Paa4 12832 TGhL 20 Trichoderma harzianum 100

Paa5 12833 20 Nigrograna norvegica 94

Paa6 12834 SABG 20 Aquilomyces sp. nov. 87

Paa7 12835 MEA 20 Trametes versicolor 99

12900 konoplja 20 Cladosporium

pseudocladosporioides

96

Paa8 /

Paa9 /

Paa15 13582

13583

MEA 20 Ochroconis globalis 99

13583 DRBC 20 Cladosporium sp.(sloanii)

psychrotolerans, neolangeronii)

100

Preglednica 18: Rezultati identifikacije gliv iz brisov živali iz Postojnske jame – Črne jame (naravno okolje) in vivarija (umetno okolje) na podlagi ITS nukleotidnih zaporedij

Paa št.

EXF št.

gojišče

tempe-

ratura

(°C)

Identifikacija

podobnost

ITS

sekvence

tipskim

sevom (%)

Brisi živali iz vivarija v Postojnski jami

Paa18 13584 TGhL 20 Sydowia polyspora 100

13585 20 Penicillium sp. (rubens,

chrysogenum, dipodomyicola)

100

13586 SABG 20 Trichoderma sp. (citrinum,

americana)

100

Paa19 13530 DRBC 15 Candida sake 100

13529 20 100

13531 SABG 20 100

Paa20

13534 TGhL 20

Acremonium sclerotigenum 90

13539 Cutaneotrichosporon cutaneum 100

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr_1442963681



39

13542 Cyphellophora olivacea 99

13547 Acremonium persicinum 97

13537 MEA 20 Lambertella sp. 99


13548 Debaryomyces hansenii 99

13544 SABG

20 Acremonium sclerotigenum 90


13532 TGhL 15 Sporobolomyces ruberrimus 99


13535 Pseudogymnoascs pannorum 100

13541 Exophiala castellanii 99

13549 [Candida] friedrichii 100

13540 MEA 15 Cyphellophora olivacea 99

13546 Lachnum pudibundum 99

Paa21 13557 TGhL 20 Cyphellophora olivacea 99

13559 MEA Talaromyces rugulosus 100

13550 DRBC [Candida] saitoana 100

13556 SABG Exophiala castellani 99

13553 TGhL 15 Candida saitoana 100

13554 Roussoellopsis macrospora 100

13551 MEA [Candida] saitoana 100

13552 SABG [Candida] saitoana 100

13555 Alfaria caricicola 88


Bris noge osebka (kasneje usmrčen) (oznaka Paa22 ) iz Črne jame - Postojnske jame (akvarij)

Paa22

13518 TGhL 20 Aspergillus sp.( parasiticus,

sydowii, versicolor)

100

13519 Rutstroemia conformata 100

13523 MEA 20 Chalara holubovae 99

13520 SABG 20 Penicillium citrinum 99

13575 Saprolegnia sp. (salmonis,

parasitica)

99

13521 SABG 15 Aspergillus sp. (versicolor,

creber, jensenii)

100

Bris živali, Postojnska jama (Črna jama iz luže), naravno okolje



40

Paa23 13525 TGhL 20 Cladosporium macrocarpum 100

13526 Neobulgaria sp.

Heliotales sp.

98

13528 MEA 20 Cadophora sp.(malorum, melinii,

spadicis)

99

13536 SABG 20 Talaromyces sp. (verruculosus,

marneffei)

99

13561 Juxtiphoma eupyrena, Uncultured

Psiloglonium

100

13524 TGhL 15 Plectosphaerella sp. (populi,

cucumerina)

100

13560 SABG 15 Neobulgaria sp. 99

13562 DRBC_ 15 Truncatella angustata 99

Paa24 13697 TGhL 20 Cladosporium sp.

(perangustum/drugi)

100

Bris živali, Vilharjev rov, Planinsko Postojnski sistem, naravno okolje

Paa25 13577 TGhL 20 Saprolegnia sp. (salmonis,

parasitica)

99

13579 MEA 20 Saprolegnia sp.( salmonis,

parasitica)

99

13578 SABG 20 Saprolegnia sp.(salmonis,

parasitica)

99

13576 konoplja 20 Saprolegnia sp.(salmonis,

parasitica)

99

13580 Saprolegnia sp.(salmonis,

parasitica)

99

13581 Saprolegnia sp.(salmonis,

parasitica)

99

Legenda: Paa številke v debelem tisku predstavljajo bolne živali, podatki pa so navedeni v sivih vrsticah.

IZOLACIJA ČISTIH KULTUR VAB

4.3.1 Rezultati izolacije čistih kultur gliv iz vab inkubiranih pri 15 °C in 20 °C

Iz vab človeške ribice smo pri 15 °C in 20 °C osamili predstavnike rodov Mucor, Trichoderma,

Rhizomucor, Saprolegnia, Penicillium, Mortierella, Fusarium, Neopyrenochaeta in

Cylindrodendrum.

Opazili smo večja pojavljanja rodu Mucor pri 15 °C in rodu Trichoderma pri 20 °C. Izolirali

smo 33 izolatov, od katerih so se nukleotidna zaporedja ITS rDNA 29 izolatov 99–100%

ujemala s poznanimi vrstami, pri 4 izolatih pa je bilo ujemanje zaporedij manj kot 95%.



41

Preglednica 19: Rezultati identifikacije gliv iz vab

Oznaka vabe

/gojišča

DRBC (15/20

°C)

MEA

(15/20 °C)

SABG

(15/20 °C)

TGhL

(15/20 °C)

SNA

(15/20 °C)

B01

(koža)

Trichoderma

/

Trichoderma

/

-

/

Mucor

/

Trichoderma

/

Trichoderma

B01

(perje)

Mucor

/

Trichoderma

/

Mucor

/

-

/

Mucor

/

Trichoderma

B10_KJ

(dializna_cev)

-

/

Trichoderma

Mucor

/

-

-

/

Mucor

Rhizomucor

/

Mucor

/

B10_KJ

(koža)

Mucor

/

Trichoderma

-

/

Mucor

Mucor

/

Mucor

Mucor

/

-

/

B10_KJ

(vodni agar)

-

/

Trichoderma

/

-

/

Saprolegnia

Mucor

/

Mucor

/

B10_PJ Penicillium,

Mucor

/

Trichoderma,

Fusarium

-

/

Neopyreno-

chaeta,

Cylindro-

dendrum

Mortierella

/

-

/

/

B13-PJ

(vodni agar,

dializna cev)

/

-

/

Trichoderma

-

/

Trichoderma

-

/

Trichoderma

-

/

Trichoderma

Preglednica 20: Primerjava zastopanosti posameznih rodov izoliranih iz vab

JELŠEVNIK KRŠKA JAMA PLANINSKA JAMA

ROD vod

a

B01

(koža

)

B01

(perje

)

vod

a

B10

(dializn

a cev)

B10

(koža

)

B10

(vodn

i

agar)

vod

a

B10_P

J kačja

koža

B10_P

J

Diaizn

a cev

B13

_PJ

(vodni

agar +

dializn

a cev)

Cladosporium + /

Clonostachys + /

Cylindrodendr

um

/ +

Fusarium + / +

Mortierella / +

Mucor + + / + + +

Neopyrenochae

ta

/ +

Penicillium / +

Rhizomucor / +

Saprolegnia / +



42

Trichoderma + + + / + + + + +

Legenda: + vrsta izolirana, / - ni podatka.

IZOLACIJA ČISTIH KULTUR GLIV Z BRISOV OSEBKOV

4.4.1 Število izoliranih sevov različnih rodov gliv pri zdravih in bolnih osebkih

Mikrobiom kože zdravih osebkov je vseboval glive kvasovke rodov Aaosphaeria, Candida,

Debaryomyces, Cutaneotrichosporon, Cystofilobasidium, Sporobolomyces, Penicillium in

Pyrenochaetopsi. Prisotne so bile tudi črne kvasovke rodov Exophiala in Ochroconis.

Filamentozne glive so pripadale rodovom Acremonium, Alfaria, Aquilomyces, Cladosporium,

Cyphellophora, Lachnum, Lambertella, Nigrograna, Pseudogymnoascus, Plectosphaerella,

Talaromyces, Trametes in Trichoderma.

Pri bolnih osebkih smo prav tako izolirali kvasovke rodu Candida ter filamentozne glive rodov

Cladosporium, Plectospharella in Talaromyces, ostalo pa so bili predstavniki drugih rodov

gliv: Aspergillus, Cadophora, Chalara, Entomocorticium, Juxtiphoma, Neobulgaria,

Truncatella, Saprolegnia, Rutstroemia in Talaromyces.

Opazimo, da je število izolatov gliv različnih rodov višje pri temperaturi 20 °C v primerjavi s

temperaturo 15 °C. Izolirali smo 69 izolatov, od tega so se nukleotidna ITS zaporedja 99–100%

ujemala pri 59 sevih, manj kot 98 % ujemanje pa je bilo pri 10 sevih.

V naslednji preglednici (Preglednici 21) so v prvi tretjini preglednice (neobarvane vrstice) po

abecedem vrstnem redu navedeni rodovi, ki so se pojavljali pri zdravih osebkih, v drugi tretjini

rodovi, ki so se pojavljali pri bolnih osebkih sivo obarvane vrstice) in v tretjem delu rodovi, ki

so se pojavljali v obeh skupinah (neobarvane vrstice). Obarvane kolone pomenijo, da so bile

vzorčene živali v ujetništvu.



43

Preglednica 21: Povzetek števila izoliranih sevov določenih rodov gliv z zdravih in bolnih osebkov, iz naravnega okolja in ujetništva

ZDRAVI OSEBKI

(Paa številke)

BOLNI OSEBKI

(Paa številke)

ROD IN ŠTEVILO

IZOLATOV

1 4 5 6 7 15 20 21 32 19 22 23 25 18

Aaosphaeria 1

Acremonium 5 1

Alfaria 1

Aquilomyces 1

Cutaneotrichosporon 1

Cyphellophora 3 2

Cystofilobasidium 2

Debaryomyces 1 1

Exophiala 1 2 1

Fusarium 1

Lachnum 1

Lambertella 1

Nigrograna 1

Ochroconis 1

Penicillium 1

Pseudogymnoascus 1 1

Pyrenochaetopsis 1

Sporobolomyces 1

Trametes 1

Aspergillus sp. 3

Cadophora 1

Chalara holubovae 1

Entomocorticium sp. 1

Juxtiphoma 1

Neobulgaria 2

Rutstroemia 1

Saprolegnia 1 6

Truncatella 1

Candida 2 4 3

Cladosporium 1 1 1 1

Plectosphaerella 1 1

Trichoderma 1 1

Talaromyces 1 1

število različnih

rodov izoliranih s

posamezne živali

3 1 1 1 2 4 11 7 3 1 5 7 1 1



44

5 RAZPRAVA

V diplomskem delu smo naredili analizo prisotnosti gliv na zdravih in bolnih primerkih

človeške ribice, ter v njihovem naravnem in umetnem okolju. Posebej nas je zanimala pojavnost

patogenih gliv. Kot umetna okolja smo vzorčili akvarije, kjer človeške ribice bivajo v

ujetništvu. Kot naravna okolja pa smo vzorčili vode in v njih inkubirane vabe na lokacijah, kjer

smo izlovili človeške ribice za vzorčenje (Krška jama, Planinska jama, Postojnska jama) oz.

kjer je bila potrejna prisotnost te živali, mi pa je sicer nismo vzorčili (Krška jama).

Največja raznolikost gliv je bila razvidna iz brisov osebkov. Rezultati identifikacije gliv na

molekularnem nivoju kažejo, da so v vzorcih iz naravnega okolja in tudi umetnega bile prisotne

tako nepatogene kot tudi patogene glive.

VABE

Iz vab v naravnem okolju smo najpogosteje izolirali glive rodu Mucor in Trichoderma. Za oba

rodova velja, da sta ena izmed najpogostejših, vseprisotnih gliv v naravi. Iz vab smo izolirali le

eno potencialno nevarno glivo iz rodu Saprolegnia. Ta se je nahajala v vabi napolnjeni z

dializno cevjo iz kraja Krška jama.

5.1.1 Rod Mucor

Rod Mucor spada v red Mucorales. Te glive so vseprisotni saprofiti, ki so razpršeni po naravi–

tleh, zraku in tudi hrani (Nagao idr., 2005). Zanje so značilne hitrorastoče brezbarvne do

rumenkaste kolonije, z razvojem sporangijev pa postanejo sive. Pravimo, da so dimorfne glive

saj imajo poleg filamentozne oblike tudi kvasno obliko (Zalar, 2017).

Rod Mucor vsebuje okoli 50 vrst, od katerih ima večji del njih pomemben gospodarski pomen.

Večino okužb živali povzročajo vrste M. circinelloides, M. indicus, M. ramosissimus, M.

irregularis in M. amphibiorum, slednja vrsta je edina znana kot povzročiteljica bolezni

zigomikoze pri dvoživkah (Mycology Online, b.d).

Pri naši raziskavi smo molekularno izolirali 15 sevov rodu Mucor iz krajev Jelševnik, Krške in

Planinske jame. Največ izolatov smo pridobili na gojišču SABG in TGhL. Izolati so pripadali

sedmim različnim vrstam– M. hiemalis/M. corticola/M. racemosus, M. moelleri, M. laxorrhizus

in M. heterogamus. Od tega je bila ena vrsta, ki potencialno lahko povzroča okužbe –M.

circinelloides.



45

Slika 11: Rod Mucor na primarni izolacijski plošči

5.1.2 Rod Trichoderma

Iz rodu Trichoderma smo izolirali 11 sevov, vrst T. asperellum, T. atroviride T. hamatum, T.

harzianum, T. koningii, T. pubescens, T. samuelsii, T. spirale, in T. viride. Rod Trichoderma se

je pojavil v vseh krajih– Jelševnik, Krška jama in Planinska jama. Največ izolatov smo pridobili

pri 20 °C na gojišču DRBC in SNA.

Vrste rodu Trichoderma sodijo med najpogostejše glive, ki so pogosto izolirane kot saprofiti iz

zemlje, tal, gnijočega lesa in korenin (Druzhinina idr., 2011).

Znane so po uporabnosti v biotehnološki industriji, zlasti proizvodnji celulaz in hemicelulaz

(Kubicek, 2013). Vrsta T. reesei je pomembna pri proizvodnji druge generacije biogoriv iz

celuloznih odpadkov. Sevi rodu Trichoderma se uporabljajo tudi kot fungicidi, zlasti T.

harzianum sensu lato, T. atroviride, T. virens, T. asperellum in T. asperelloides (Harman,

Howell, Viterbo, Chet in Lorito, 2004). Nedavno odkritje nakazuje tudi na uporabnost vrst

Trichoderma za biološko gnojilo (Harman, 2011).

Poleg zelo koristnih in pogosto uporabljenih vrst, rod Trichoderma obsega tudi oportunistične

človeške patogene, ki kažejo učinkovito rast pri telesni temperaturi in mikoparazitskih vrstah,

ki predstavljajo pomembno grožnjo v gojilnicah gob. Med kliničnimi izolati je najpogostejši T.

longibrachiatum (Schuster in Schmoll, 2010).



46

Slika 12: Rod Trichoderma na primarni izolacijski plošči

5.1.3 Rod Rhizomucor

Rod Rhizomucor smo izolirali le na eni izmed plošč– TGhL pri 15 °C. Od rodu Mucor se

razlikuje po termofilni naravi in prisotnosti rizoidov na bazi sporangioforov (Zalar, 2017).

Oportunistična patogena R. pusillus in R. miehei sta povzročitelja pogosto usodnih mikotičnih

bolezni.

V naši raziskavi smo izolirali vrsto Rhizomucor regularior iz Krške jame. Izolirali smo jo iz

vabe napolnjene z dializno cevjo.

5.1.4 Rod Saprolegnia

Rod Saprolegnia smo izolirali iz vzorca vabe iz Krške jame (oznaka B10-KJ), ki je vseboval

vodni agar. Glive so zrasle na gojišču SABG pri 20 °C. Izolirali smo vrsto Saprolegnia delica.

Vrste Saprolegnia so destruktivni patogeni za mnoge vodne organizme in se nahajajo v večjem

delu sveta. So sladkovodni saprofiti, znani tudi kot povzročitelji saprolegniaze. Iz raziskave

Sarowar-ja idr., (2013) je razvidno, da Saprolegnia delica, Saprolegnia hypogyna, Saprolegnia

diclina in Saprolegnia ferax lahko povzročajo bolezni vodnih organizmov.

BRISI ŽIVALI

Iz brisov živali smo izolirali največ gliv iz rodu Acremonium, Aspergillus, Candida,

Cladosporium, Cyphellophora, Exophiala in Saproglenia.



47

Primerjali smo pojavnost različnih gliv pri bolnih in zdravih osebkih iz naravnega in umetnega

okolja.

5.2.1 Rodovi, ki so se pojavili le pri zdravih osebkih

5.2.1.1 Rod Cyphellophora

Cyphellophora je rod črnih kvasovk, za katere je značilno, da imajo preproste fialide z

večseptiranimi, ukrivljenimi konidijami (Feng idr., 2014).

Znano je, da črne kvasovke in njihovi filamentozni sorodniki povzročajo pri zdravih

posameznikih od različnih kožnih površinskih okužb do invazivnih, potencialno usodnih okužb.

Šele pred nekaj časa so odkrili, da so glive, podobne črnim kvasovkam, vseprisotne v zunanjih

in notranjih- umetnih okoljih kot so kopalnice, pomivalni stroji in parne kopeli. Pogosto so

spregledane, saj rastejo počasi hkrati pa jih lahko identificiramo le z molekularnimi tehnikami.

Vrste C. laciniata, C. pluriseptata in C. suttonii so bile doslej izključno izolirane le iz ljudi (

Feng idr., 2013).

Iz naših brisov osebkov smo izolirali 5 sevov vrste C. olivacea na gojiščih SABG, MEACh in

TGhL, pri 15 in 20 °C. Brisi so bili odvzeti iz zdravih človeških ribic Paa20 in Paa21, ki sta

živeli v umetnem okolju Postojnske jame (vivarij), kjer sta bili na ogled obiskovalcem.

5.2.1.2 Rod Acremonium

Za rod Acremonium so značilne počasi rastoče, bele ali svetlo obarvane kolonije. Opisanih je

okoli 100 vrst. So kozmopolitske, večina vrst je saprofitskih na odmrlem rastlinskem materialu

in v tleh, nekatere vrste so patogene za rastline in človeka (Zalar, 2017).

Z brisov površin živali smo izolirali 6 sevov, vrst Acremonium sclerotigenum in Acremonium

persicinum na gojiščih TGhL in SABG pri 15 °C in 20 °C. Izolirani so bili iz zdravega osebka

Paa20 in Paa21 iz umetnega okolja (akvarij) iz Postojnske jame, kjer sta bili živali na ogled

obiskovalcem. Izolat EXF-13547 zaradi nizkega % podobnosti ITS nukleotidnih zaporedij

(98% vrsti A. persicinum) potencialno predsatvlja novo vrsto.

5.2.1.3 Rod Exophiala

Vrste rodu Exophiala so okoljske glive, pogosto povezane z razpadajočim lesom in tlemi,

obogatenimi z organskimi odpadki (Mycology Online, b.d). So potencialno patogene kvasovke

in pri ljudeh povzročajo mikoze. Predvsem vrsti E. jeanselmei in E. spinifera sta dobro poznana



48

človeška patogena. Poznano je, da povzročata lokalizirane kožne, cerebralne okužbe in

podkožne ciste (Mycology Online, b.d). Kvasovke rodu Exophiala rastejo pri zelo visokih

temperaturah, prav tako pri kislem in bazičnem pH-ju, pri visokih koncentracijah soli in ob

prisotnosti agresivnih čistilnih sredstev (Biedunkiewicz in Schulz, 2012).

Na osnovi morfologije in nukleotidnega zaporedja smo identificirali vrsto E. lecanii-corni in E.

castellanii z 99% sekvenčnim ujemanjem, iz 4 sevov, zraslih na gojiščih TGhL, SABG in MEA

pri 15 in 20 °C. Izolirali smo jih iz brisov zdravega osebka Paa15 iz Postojnsko planinskega

sistema (naravno okolje) in zdravih osebkov Paa20 in Paa21 iz Postojnske jame (umetno

okolje).

5.2.2 Rodovi, ki so se pojavili pri bolnih osebkih

5.2.2.1 Rod Aspergillus

Aspergillus ali glavičasta plesen, raste na vseh gojiščih za gojenje gliv. Hitro rastoče kolonije

so bele, rumene, rumeno-rjave, rjave do črne ali zelenkaste barve, zrnatega izgleda (Zalar,

2017).

Za rod je značilno, da je razširjen po celem svetu na različnih substratih– od prsti, rastlin, živali

pa do človeka. Zaradi sposobnosti tvorbe toksičnih sekundarnih metabolitov pa je lahko tudi

patogen (Zalar, 2017). Aspergiloza je izraz, ki zajema širok spekter bolezni, od lokaliziranih do

smrtno razširjenih okužb pri ljudeh in različnih živalih, ki jih povzročajo glive rodu Aspergillus

(Latgé, 1999) Ta do sedaj še ni bila zabeležena pri dvoživkah (Mycology Online, b.d).

Skupaj smo identificirali 3 seve rodu Aspergillus- A. versicoli/ jenessi/ creber in A. parasiticus/

sydowi/versicoli na gojiščih TGhL, SABG in MEA, pri 15 in 20 °C. Brisi so bili odvzeti iz

mrtvega osebka Paa22 iz Postojnske jame, ki je bival v vivariju. Imel je okužbo noge in najdenih

veliko parazitov v telesu.

5.2.2.2 Rod Saprolegnia

Rod Saprolegnia smo izolirali iz umetnega in naravnega Planinsko postojnskega območja. Prvi

osebek Paa22 je bil mrtev. Imel je poškodovano nogo in bil je okužen s paraziti. Osebek Paa25

pa je bil bolan, že pri odvzemu brisa smo imeli sum na saprolegniazo, saj je bil njegov trup

prepreden z belim micelijem (Slika 8 in 9). Izolirali smo 7 sevov dveh različnih vrst S. salmonis

in S. parasitica na različnih gojiščih MEA, TGhL, SABG in gojiščem s konopljo, vse pri 20

°C.



49

Slika 13: Zaplesnjen del zadnje nogice osebka Paa25 (Avtor: Lilijana Bizjak-Mali, 2019)

Slika 14: Prikaz s filamenti obdane nogice osebka Paa25, 100x povečava (Avtor: Polona Zalar, 2019)

5.2.3 Rodovi, ki so se pojavili pri zdravih in bolnih osebkih

5.2.3.1 Rod Candida

Candida je rod kvasovk, ki predstavljajo najpogostejši vzrok glivičnih okužb po vsem svetu

(Manolakaki, 2010). Nahajajo se na večini površin sluznice, predvsem v prebavnem traktu.

Znani so kot oportuni patogeni, saj so primarno neškodljivi endosimbionti z živalmi, vključno

z ljudmi. Če pride do poškodbe sluznice ali oslabljenega imunskega sistema, potem napadejo

in povzročijo bolezni, imenovane kandidoze (Kourkoumpetis, 2011). Najpogostejši



50

povzročitelji bolezni pri ljudeh in nekaterih živalskih vrstah so C. albicans (Ryan, 2004), C.

krusei, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. pseudotropicalis, C. dubliniensis, C.

guilliermondii in C. lusitaniae (Pfaller, 1996).

Vrste rodu Candida smo identificirali makroskopsko na podlagi barve in oblike kolonij in na

molekularni ravni. Na gojišču kandide tvorijo večje, okrogle, bele do umazano bele kolonije.

Iz naših brisov živali smo izolirali vrste Candida sake, Candida friedich in Candida saitoana z

100% sekvenčnim ujemanjem. Izolirali smo 9 sevov na gojiščih (TGhL, SABG, DRBC in

MEACh) pri 15 °C in 20 °C iz brisov zdravih osebkov Paa20 in Paa21, ki sta bila vzorčena v

umetnem okolju Postojnske jame. Hkrati smo rod Candida izolirali tudi iz bolnega osebka

Paa19 iz umetnega okolja Postojnske jame. Kot pri človeku bi lahko tudi pri človeški ribici

kandide bile komenzali, ki potencialno glede na oslabljen imunski status okužijo žival.

Pri gojenju brisov na primarnih izolacijskih ploščah smo opazili, da imajo živali v ujetništvu, v

našem primeru sobivajoče v istem akvariju, na površini kože večje število kvasnih celic, ki se

z vodo lahko prenašajo med živalmi, v primerjavi z vzorčenimi živalmi iz naravnega okolja

(Preglednica 10). Kandide so se edine izmed gliv na koži pojavljale v večjem št. CFU, tudi do

2,1 x 104/bris živali. V največjem številu so zrasle na gojiščih SABG pri 15 °C.

5.2.3.2 Rod Cladosporium

Rod Cladosporium, znana kot grmičasta plesen, je morfološko lahko prepoznati po temno

zelenih kolonijah, večinoma olivno zelene do črno rjave barve, žametne ali razpuščene

površine. Kasneje postajajo praškaste s produkcijo številnih konidijev. Zelo značilna je črna

barva reverza. Spadajo med najpogostejše glive v zraku, kozmopolitske narave. Nekatere vrste

so zelo pogosti patogeni rastlin, ki so oportuno povezani z gostiteljskimi rastlinami (Zalar,

2017).

V raziskavi smo izolirali 4 seve rodu Cladosporium, vrste C. cf. herbarum, C.

sloanii/psychrotolerans/neolangeronii in C. pseudocladosporioides iz gojišč DRBC, TGhL,

MEA in konoplje, pri 15 °C in 20 °C. Izolirali smo jih iz zdravih osebkov Paa7 in Paa15, ki so

živeli v naravnem okolju Planinske jame, zdravega osebka Paa20 iz Postojnske jame (umetnega

okolja- vivarij) in bolnega osebka Paa23, ki je živel v Postojnski jami (vivarij).



51

5.2.4 Primerjava med pojavnostjo rodov v umetnem in naravnem okolju

5.2.4.1 Umetno okolje

Osebki, vzorčeni v umetnem okolju, natančneje v vivariju Postojnske jame so bili Paa19, Paa20,

Paa21 in Paa22.

Osebka Paa19 in Paa22 sta bila bolna. Iz brisov osebkov smo izolirali nekaj potencialno

nevarnih rodov kot so: Saprolegnia, Aspergillus in Candida. Vrsti, ki smo jih molekularno

določili, Saprolegnia parasitica in Aspergillus parasiticus, sta znani povzročiteljici bolezni,

tako da lahko predpostavljamo, da je njihovo umetno okolje problematično.

Brisi zdravih osebkov Paa20 in Paa21 so prav tako vsebovali nekaj potencialno nevarnih rodov

kot so Exophiala in Candida. Predpostavljamo lahko, da tem organizmom rodovi ne škodujejo,

vendar lahko ob imunski oslabelosti začnejo napadati kot oportuno patogeni.

Ponavadi se bolezni pojavijo takrat, kadar je živali pod stresom, in to je največkrat takrat, kadar

odstranimo žival iz naravnega habitata (Densmore in Green, 2002).

5.2.4.2 Naravno okolje

Osebki, vzorčeni iz naravnega okolja, Planinske in Postojnske jame so bili skoraj vsi zdravi

razen osebki Paa23 in Paa25.

Osebek Paa23 je bil odvzet iz luže, brez povezave z vodotokom v kateri so bile mrtve ribe.

Njegovo telo je bilo napihnjeno. Tu smo bili pozorni na to, da so glivne bolezni dvoživk tesno

povezane z boleznimi drugih ektotermnih vretenčarjev. Prenos se ponavadi pojavi preko

kontaminacije iz okolja ali prenosa med vrstami (npr. iz rib na dvoživke), ki lahko prispevajo

k okužbi (Juopperi, 2002). Iz njegovega brisa smo izolirali glive rodu Cladosporium,

Truncatella, Neobulgaria, Plectosphaerella, Cadophora, Talaromyces in Juxtiphoma. Od teh

sta potencialno nevarna rodova Cladosporium, ki je odgovoren za nastanek kromomikoz in

Talaromyces, ki vsebuje vrsto Talaromyces marneffei, ki povzroča smrtno mikozo pri posebej

oslabljenih posameznikih, vendar do sedaj opisanih le pri ljudeh (Yilmaz, 2014).

Osebek Paa25 je imel na telesu razrasel micelij, zaradi katerega smo takoj imeli sum na okužbo

s saprolegnijo, ki smo jo kasneje tudi izolirali in jo molekularno identificirali.



52

5.2.5 Zigomikoze

V diplomski nalogo smo bili pozorni tudi na mogoče prisotne patogene glive, kot so Mucor

amphibiorum in Rhizopus, znana kot povzročitelja zigomikoz. Predstavnike rodov Mucor smo

izolirali le iz vab v vseh krajih, vendar vrste Mucor amphibiorum nismo dokazali.

5.2.6 Saprolegnioze

Potrdili smo prisotnost potencialnih patogenih mikroorganizmov oomicet vodne plesni, ki

povzročajo Saprolegniozo. Izolirali smo jih iz osmih vzorcev, natančneje vab in brisov osebkov,

kar je precej zaskrbljujoče.

Iz vabe Krške jame, ki je vsebovala vodni agar smo izolirali vrsto Saprolegnia delica, ki se je

sekvenčno ujemala 99%. Ostalih sedem sevov smo izolirali iz brisov dveh različnih osebkov iz

Postojnske jame in Planinsko postojnskega sistema. Prvi osebek iz umetnega okolja, Paa22, je

bil mrtev z okuženo nogo. Iz njega smo izolirali vrsto Saprolegnia salmonis/ parasitica, drug

osebek Paa25 pa je bil bolan, odvzet iz naravnega okolja, že pri vzemu brisa smo predvidevali

okužbo s Saprolegnio. Na različnih gojiščih drugega osebka smo izolirali prav tako

salamonis/parasitica z 99% ujemanja sekvenc.

5.2.7 Hitridiomikoze

Hitridna gliv B.dendrobatidis, znana kot povzročiteljica bolezni hitridiomikoz povzroča močan

upad populacij in izumrtje več kot 200 vrst dvoživk po celem Svetu. V naši raziskavi smo ovrgli

prisotnost Batrachochytrium salamandrivorans in B. dendrobatidis s PCR v realnem času na

osnovi izolirane celokupne DNA z brisov živali.

5.2.8 Kromomikoze

Poleg hitridnih gliv smo bili pozorni še na ostale možne infekcijske bolezni dvoživk. Vemo, da

kožno in razširjeno sistematsko kromomikozo dvoživk v naravi povzročajo pigmentirani glivni

patogeni iz debla Ascomycota, predstavniki rodov Cladosporium, Exophiala, Fonsecaea,

Ochroconis, Phialophora in Scolecobasidium (Dhaliwal in Griffiths, 1963). Od teh smo uspeli

izolirati predstavnike rodu Cladosporium, Exophiala in Ochroconis.

Predstavnike rodov Exophiala smo uspeli izolirati pri osebkih iz umetnega okolja osebka Paa20

in Paa21 iz Postojnske jame ter Paa15 iz naravnega okolja Planinske jame. Vsi so bili zdravi.



53

Okužbe z Ochroconis se lahko pojavijo pri zdravih in izčrpanih gostiteljih, kot so divje živali v

ujetništvu; te okužbe so kožne ali sistemske (Seyedmousavi idr., 2013).

Predstavnike rodu Ochroconis smo izolirali prav tako iz zdravega osebka Paa15, ki je živel v

Planinski jami.

Predstavnike rodu Cladosporium smo izolirali iz zdravih osebkov Paa7 in Paa15, ki sta živela

v Planinski jami. Hkrati smo jih izolirali iz bolnega osbka Paa23, odvzetega iz luže, brez

povezave z vodotokom. Bil je napihnjen, obdan z mrtvimi ribicami. Na molekularni ravni smo

določili vrsto kot sorodno vrsti Cladosporium herbarum.

V rodu Cladosporium sta C. herbarum in C. cladosporioides med najpogostejšimi vrstami v

zunanjem in notranjem okolju; so tudi najpogostejše vrste, o katerih so poročali kot o

onesnaževalcih v zaprtih prostorih, ki so občasno povezani z zdravstvenimi težavami (Bensch

idr., 2018).



54

6 SKLEPI

Glede na hipoteze o izvoru in vrsti gliv prisotnih v vabah in brisih človeške ribice, ki smo jih

postavili v uvodu, smo prišli do naslednjih sklepov:

- Z diplomsko nalogo smo na človeški ribici in tudi v njenem okolju dokazali prisotnost glivnih

vrst, tako filamentoznih gliv kot kvasovk.

-V naravnem okolju človeške ribice in na človeški ribici se nahajajo potencialno nevarne glive

rodov: Cladosporium, Aspergillus, Candida, Exophiala in Saprolegnia, ki so znani

povzročitelji bolezni.

- Opazili smo, da kožo zdravih in bolnih osebkov naseljujejo glive različnih rodov.

- Kožo živali v ujetništvu naseljujejo kvasovke, in sicer v velikem številu (do nekaj tisoč

CFU/bris).

- Kožo živali v naravnih okoljih sporadično naseljujejo zelo različne vrste filamentoznih gliv.

- Nevarnost človeškim ribicam v slovenskem okolju predstavljajo vodne plesni rodu

Saprolegnia, ki smo jih zaznali v podzemnih vodah in na bolnih živalih.

- Pri višji temperaturi gojenja (20 °C) so glive zrasle v večjem številu, razen pri kvasovkah.

- Na bogatih gojiščih, kot so (navedite) je zraslo več kolonij gliv v primerjavi z revnejšimi

(navedtie katero).



55

7 POVZETEK

Dvoživke, vključno s človeško ribico, spadajo med ogrožene skupine živali. Med glavne

grožnje spadajo uničevanje in onesnaževanje njihovega naravnega habitata ter podnebne

spremembe. V diplomski nalogi pa smo ugotovili, da grožnjo predstavljajo tudi spremembe v

sestavi mikrobioma človeške ribice. Svetovne raziskave nas opozarjajo na ogrožajoče patogene,

predvsem nekatere vrste gliv, katerih prisotnosti v Sloveniji še ne poznamo docela, zato smo

bili še posebej osredotočeni na omenjene. Zanimala nas je pojavnost oportuno patogenih gliv,

ki so bile nedavno odkrite kot povzročiteljice hitridiomikoz, kromomikoz, feohifomikoz in

saproleginoz. Poleg tega pa smo želeli ugotoviti prisotnost gliv v kožnem mikrobiomu človeške

ribice, saj o tem ni podatkov.

Tekom diplomske naloge smo izolirali glive iz neposrednega vodnega okolja človeške ribice v

naravi kot tudi v ujetništvu. Na lokacijah Jelševnik, Krška in Planinska jama smo vzorčili vodo,

ter v njej nastavili vabe. Iz istih lokacij in dodatno iz Postojnske jame smo jemali brise površine

živali, tako zdravih kot bolnih. Na slednji lokaciji so bile živali bivale v vivarijih.

Glive iz vzorcev vode, vab in brisov smo nanesli na več različnih gojišč in inkubirali pri 15 °C

in 20 °C. Z uporabo ustreznih tehnik izolacije in identifikacije smo uspeli karakterizirati

mikobioto v naravi in v ujetništvu živečih človeških ribic. Iz vzorcev vode, vab in brisov živali

smo osamili 113 glivnih sevov, ki smo jih na podlagi taksonomskih označevalcev uvrstili v 43

rodov. Poleg tega smo ovrgli prisotnost Batrachochytrium salamandrivorans in B.

dendrobatidis s PCR v realnem času na osnovi izolirane celokupne DNA z brisov živali.

Iz vab človeške ribice smo osamili predstavnike rodov Mucor, Trichoderma, Rhizomucor,

Saprolegnia, Penicillium, Mortierella, Fusarium, Neopyrenochaeta in Cylindrodendrum. Iz

vzorev vode smo izolirali enake rodove, razen Clonostachys.

Največja raznolikost gliv je bila razvidna iz brisov osebkov, ki pa so se večinoma pojavljale kot

posamezne kolonije. V naravnem okolju človeške ribice smo izolirali potencialno patogene

glive iz rodov: Cladosporium, Aspergillus, Candida, Exophiala in Saprolegnia. Nabor gliv

izoliranih s površine proteusov se je delno prekrival s tistimi iz okolja, vendar pa je bila

ponovljivost izolacije istih rodov pri različnih osebkih zelo majhna. Opazili smo razlike v

pojavnosti rodov gliv izoliranih z zdravih in bolnih osebkov. Pri zdravih osebkih so se na koži

največkrat pojavljale glive rodov Exophiala in Cladosporium (tri živali), pri bolnih pa

Saprolegnia (2 živali). Vrste rodu Candida so se pojavljale pri zdravih (dve živali) in bolnih

(ena žival). Brisi živali v ujetništvu so bili bistveno bolj raznoliki kar se tiče pripadnosti izolatov



56

različnim rodovom (od 1 do 11) v primerjavi z živalmi iz naravnih okolij (od 1 do 3). Izgleda,

da imajo živali v ujetništvu, v našem primeru sobivajoče v istem akvariju, na površini kože

večje število kvasnih celic, ki se z vodo lahko prenašajo med živalmi. Kandide so se edine

izmed gliv na koži pojavljale v večjem št. CFU, do 4 x 103 / bris živali.



57

8 VIRI

Aljančič, M., & Aljančič, G. (1998). Žival meseca oktobra: Človeška ribica. Proteus

anguinus, 61(2), 85.

Anaissie, E. J., McGinnis, M. R., & Pfaller, M. A. (2009). Clinical Mycology E-Book.

Elsevier Health Sciences.

Bensch, K., Groenewald, J. Z., Meijer, M., Dijksterhuis, J., Jurjević, Ž., Andersen, B., &

Samson, R. A. (2018). Cladosporium species in indoor environments. Studies in

mycology, 89, 177-301.

Berger, L., Longcore, J. E., Speare, R., Hyatt, A., & Skerratt, L. F. (2009). Fungal diseases

in amphibians. Amphibian biology, 8, 2986-3052.

Berger, L., Speare, R., Daszak, P., Green, D. E., Cunningham, A. A., Goggin, C. L., &

Hines, H. B. (1998). Chytridiomycosis causes amphibian mortality associated with

population declines in the rain forests of Australia and Central America.

Proceedings of the National Academy of Sciences, 95(15), 9031-9036.

Biedunkiewicz, A., & Schulz, Ł. (2012). Fungi of the genus Exophiala in tap water-

potential etiological factors of phaeohyphomycoses. Medical Mycology, 19(1), 23.

Bizjak-Mali L. (2003). Vpliv stradanja na ultrastrukturo hepatocitov močerila (Proteus

anguinus, Amphibia, Urodela). Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljani.

Blakeslee A.F. 1915. Lindner's roll tube method of separation cultures. Phytopathology, 5,

68-69

Blaustein, A.R., Wake, D. B., 1998. The Puzzle of Declining Amphibian Populations.

Scientific American, 272(4), 52–57.

Brownell I, Pomeranz M, Ma L (2005). "Eumycetoma". Dermatol. Online J. 11 (4): 10

PMID 16403382. Davidson's principles and practice of medicine (20th ed.).

Churchill Livingstone Elsevier. 2006. p. 373. ISBN 9780443101335.

Bulog, B. (1994). Dve desetletji funkcionalno-morfoloških raziskav pri močerilu (Proteus

anguinus, Amphibia, Caudata): Two decades of functional-morphological studies

of Proteus anguinus (Amphibia, Caudata).

http://dermatology.cdlib.org/114/NYU/NYUtexts/0419058.html

https://en.wikipedia.org/wiki/PubMed_Identifier

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16403382

https://en.wikipedia.org/wiki/International_Standard_Book_Number

https://en.wikipedia.org/wiki/Special:BookSources/9780443101335



58

Christiansen, K. (1992). Biological processes in space and time: cave life in the light of

modern evolutionary theory. The natural history of biospeleology, 453-478.

Cicmanec, J. L., Ringler, D. H., & Beneke, E. S. (1973). Spontaneous occurrence and

experimental transmission of the fungus, Fonsecaea pedrosoi, in the marine toad, Bufo

marinus. Laboratory animal science, 23(1), 43.

CORREA, E. G. (1968). Lesiones micoticas cromomicosis) observadas en sapos (Bufosp.)-

Informe preliminar. Ant. Med, 18(3), 175-184.

Daszak, P., Cunningham, A. A., & Hyatt, A. D. (2000). Emerging infectious diseases of

wildlife--threats to biodiversity and human health. Science, 287(5452), 443-449.

Densmore, C. L., & Green, D. E. (2007). Diseases of amphibians. Ilar Journal, 48(3), 235-

254.

Dhaliwal ss, Griffiths DA (1963) Nature 197, 467-569

Druzhinina, I. S., Seidl-Seiboth, V., Herrera-Estrella, A., Horwitz, B. A., Kenerley, C. M.,

Monte, E., & Kubicek, C. P. (2011). Trichoderma: the genomics of opportunistic

success. Nature reviews microbiology, 9(10), 749.

Durand J.P. & Delay B. (1981). Influence of temperature on the development of Proteus

anguinus (Caudata: Proteidae) and relation with its habitat in the subterranean

world. Journal of Thermal Biology 6(1), 53-57.

Emmons, C. W., Binford, C. H., & Utz, J. P. (1970). Medical mycology. Medical

mycology.

Feng, P., Lu, Q., Najafzadeh, M. J., van den Ende, A. G., Sun, J., Li, R., ... & De Hoog, G.

S. (2014). Cyphellophora and its relatives in Phialophora: biodiversity and possible

role in human infection. Fungal Diversity, 65(1), 17-45.

Feng, P., Klaassen, C. H., Meis, J. F., Najafzadeh, M. J., Van Den Ende, A. G., Xi, L., &

De Hoog, G. S. (2013). Identification and typing of isolates of Cyphellophora

and relatives by use of amplified fragment length polymorphism and rolling circle

amplification. Journal of clinical microbiology, 51(3), 931-937.



59

Fisher, M. C., & Garner, T. W. (2007). The relationship between the emergence of

Batrachochytrium dendrobatidis, the international trade in amphibians and

introduced amphibian species. Fungal Biology Reviews, 21(1), 2-9.

Frye, F. L., & Gillespie, D. S. (1989). Saprolegniasis in a zoo collection of aquatic

amphibians.In Orlando: International Colloquium on the Pathology of Reptiles and

Amphibians. P (Vol. 43).

Gascon C, Collins JP, Moore RD, Church DR, McKay JE, Mendelson JR III (2007).

Amphibian conservation action plan. IUCN/SSC Amphibian Specialist Group,

Gland

Harman, G. E. (2011). Multifunctional fungal plant symbionts: new tools to enhance plant

growth and productivity. New Phytologist, 189(3), 647-649.

Harman, G. E., Howell, C. R., Viterbo, A., Chet, I., & Lorito, M. (2004). Trichoderma

species— opportunistic, avirulent plant symbionts. Nature reviews

microbiology, 2(1), 43.

Holtze, S., Lukač, M., Cizelj, I., Mutschmann, F., Szentiks, C. A., Jelić, D., & Hildebrandt,

T. B. (2017). Monitoring health and reproductive status of olms (Proteus

anguinus) by ultrasound. PloS one, 12(8), e0182209.

Hüpop K. (2000). How do cave animals cope with the food scarcity in caves?. V: Culver

D.C. s sod. (ur.): Ecosystems of the world: Subterranean Ecosystems, pp. 159-188.

Amsterdam: Elsevier.

Hudoklin, A. (2011). Are we guaranteeing the favourable status of the Proteus anguinus in

the Natura 2000 network in Slovenia. Pressures and Protection of the Underground

Karst– Cases from Slovenia and Croatia. Inštitut za raziskovanje krasa ZRC SAZU,

Postojna, 169-181.

Istenič, L., & Bulog, B. (1979). Strukturne diferenciacije ustno-žrelne sluznice pri močerilu

(Proteus anguinus Laur).

IUCN, I. (2010). Red list of threatened species. International Union for Conservation of

Nature (Available at: www. iucnredlist. org/mammals, 2008).



60

Juberthie, C., Durand, J., & Dupuy, M. (1996). La reproduction des Protées (Proteus

anguinus): bilan de 35 ans d'élevage dans les grottes-laboratoires de Moulis et

d'Aulignac. Mémoires de biospéologie, 23, 53-56.

Juopperi, T., Karli, K., De Voe, R., & Grindem, C. B. (2002). Granulomatous dermatitis in

a spadefoot toad (Scaphiopus holbrooki). Veterinary clinical pathology, 31(3), 137-

139.

Kiesecker, J. M., Blaustein, A. R., & Miller, C. L. (2001). Transfer of a pathogen from fish

to amphibians. Conservation Biology, 15(4), 1064-1070.

Kourkoumpetis TK, Velmahos GC, Ziakas PD, Tampakakis E, Manolakaki D, Coleman

JJ, Mylonakis E (2011). "The effect of cumulative length of hospital stay on the

antifungal resistance of Candida strains isolated from critically ill surgical

patients". Mycopathologia. 171 (2): 85–91.

Kubicek, C. P. (2013). Systems biological approaches towards understanding cellulase

production by Trichoderma reesei. Journal of biotechnology, 163(2), 133-142.

Langecker, T. G. (2000). The effects of continuous darkness on cave ecology and

cavernicolous evolution. Ecosystems of the world, 135-158.

Latgé, J. P. (1999). Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical microbiology reviews,

12(2), 310-350.

La’Toya, V. L., & Klaphake, E. (2013). Selected emerging diseases of amphibia.

Veterinary Clinics: Exotic Animal Practice, 16(2), 283-301.

Longcore, J. E., Pessier, A. P., & Nichols, D. K. (1999). Batrachochytrium dendrobatidis

gen. et sp. nov., a chytrid pathogenic to amphibians. Mycologia, 91(2), 219-227.

Manolakaki, D.; Velmahos, G.; Kourkoumpetis, T.; Chang, Y.; Alam, H. B.; De Moya, M.

M.; Mylonakis, E. (2010). "Candida infection and colonization among trauma

patients". Virulence. 1(5): 367–75.

Martel, A., Spitzen-van der Sluijs, A., Blooi, M., Bert, W., Ducatelle, R., Fisher, M. C., &

Pasmans, F. (2013). Batrachochytrium salamandrivorans sp. nov. causes lethal

chytridiomycosis in amphibians. Proceedings of the National Academy of Sciences,

110(38), 15325-15329.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4093797





61

Moss, A. S., Reddy, N. S., Dortaj, I. M., & San Francisco, M. J. (2008). Chemotaxis of the

amphibian pathogen Batrachochytrium dendrobatidis and its response to a variety

of attractants. Mycologia, 100(1), 1-5.

Nagao, K., Ota, T., Tanikawa, A., Takae, Y., Mori, T., Udagawa, S. I., & Nishikawa, T.

(2005). Genetic identification and detection of human pathogenic Rhizopus

species, a major mucormycosis agent, by multiplex PCR based on internal

transcribed spacer region of rRNA gene. Journal of dermatological science, 39(1),

23-31.

Nickerson, C. A., Ott, C. M., Castro, S. L., Garcia, V. M., Molina, T. C., Briggler, J. T., &

Nickerson, M. A. (2011). Evaluation of microorganisms cultured from injured and

repressed tissue regeneration sites in endangered giant aquatic Ozark hellbender

salamanders. PLoS one, 6(12), e28906.

Olson, D. H., Aanensen, D. M., Ronnenberg, K. L., Powell, C. I., Walker, S. F., Bielby, J.,&

Fisher, M. C. (2013). Mapping the global emergence of Batrachochytrium

dendrobatidis, the amphibian chytrid fungus. PloS one, 8(2), e56802.

Parker, J. M., Mikaelian, I., Hahn, N., & Diggs, H. E. (2002). Clinical diagnosis and

treatment of epidermal chytridiomycosis in African clawed frogs (Xenopus

tropicalis). Comparative medicine, 52(3), 265-268.

Pessier, A. P., Nichols, D. K., Longcore, J. E., & Fuller, M. S. (1999). Cutaneous

chytridiomycosis in poison dart frogs (Dendrobates spp.) and White's tree frogs

(Litoria caerulea). Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 11(2), 194-199.

Pfaller, M. A. (1996). Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs, and modes of

transmission. Clinical infectious diseases, 22(Supplement_2), S89-S94.

Piotrowski JS, Annis SL, Longcore JE (2004) Physiology of Batrachochytrium

dendrobatidis, a chytrid pathogen of amphibians. Mycologia 96(1), 9–15.

Rosenblum, E. B., Poorten, T. J., Joneson, S., & Settles, M. (2012). Substrate-specific gene

expression in Batrachochytrium dendrobatidis, the chytrid pathogen of amphibians.

PLoS One, 7(11), e49924.

Ryan, K. J., & Ray, C. G. (2004). Medical microbiology. McGraw Hill, 4, 370.



62

Sarowar, M. N., Van Den Berg, A. H., McLaggan, D., Young, M. R., & Van West, P.

(2014). Reprint of: Saprolegnia strains isolated from river insects and amphipods

are broad spectrum pathogens. Fungal biology, 118(7), 579-590.

Samson R.A., Frisvad J.C. 2004. Penicillium subgenus Penicillium: new taxonomic

schemes and mycotoxins and other extrolites. Utrecht, Centraalbureau voor

Schimmelcultures: 253 str.

Schmidt, R. E. (1984). Amphibian chromomycosis. In Diseases of amphibians and reptiles

(pp.169-181). Springer, Boston, MA.

Schuster, A., & Schmoll, M. (2010). Biology and biotechnology of Trichoderma. Applied

microbiology and biotechnology, 87(3), 787-799.

Seyedmousavi, S., Guillot, J., & De Hoog, G. S. (2013). Phaeohyphomycoses, emerging

opportunistic diseases in animals. Clinical microbiology reviews, 26(1), 19-35.

Sket, B. (1997). Distribution of Proteus (Amphibia: Urodela: Proteidae) and its possible

explanation. Journal of Biogeography, 24(3), 263-280.

Speare, R., Berger, L., O'Shea, P., Ladds, P. W., & Thomas, A. D. (1997). Pathology of

mucormycosis of cane toads in Australia. Journal of Wildlife Diseases, 33(1), 105-

111.

Stewart, A., Jackson, J., Barber, I., Eizaguirre, C., Paterson, R., van West, P., & Cable, J.

(2017). Hook, line and infection: a guide to culturing parasites, establishing

infections and assessing immune responses in the three-spined stickleback. In

Advances in parasitology (Vol. 98, pp. 39-109). Academic Press.

Štangelj, M., & Ivanovič, M. (2013). Narava Bele krajine. PMS in povezano.

Taylor, S. K., Green, D. E., Wright, K. M., & Whitaker, B. R. (2001). Amphibian medicine

and captive husbandry. Krieger Publishing Company.

Van Rooij, P., Martel, A., Haesebrouck, F., & Pasmans, F. (2015). Amphibian

chytridiomycosis: a review with focus on fungus-host interactions. Veterinary

research, 46(1), 137.



63

Voituron, Y., De Fraipont, M., Issartel, J., Guillaume, O., & Clobert, J. (2010). Extreme

lifespan of the human fish (Proteus anguinus): a challenge for ageing mechanisms.

Biology Letters, 7(1), 105-107.

Weber A. (2000). Fish and amphibia. V: Culver D.C. s sod. (ur.): Ecosystems of the world:

Subterranean Ecosystems, pp. 109-132. Amsterdam: Elsevier.

Wright, K. M., & Whitaker, B. R. (2001). Amphibian medicine and captive husbandry.

Krieger Publishing Company.

Zalar P., Gunde-Cimerman N. (2002). Taksonomija in identifikacija gliv. Ljubljana,

Scripta, Študentska založba: 92 str.

Zalar P. (2017). Mikrobna raznolikost in identifikacija gliv: Glive. Ljubljana, Navodila in

delovni zvezek za vaje, Študentska založba

Zalar P. (2019). Mikologija: Priročnik za vaje s teoretičnimi osnovami pri izbirnem

predmetu za študente Biologije. Ljubljana, Skripta, Študenska založba.

ZAHVALA

Rada bi se zahvalila svoji mentorici doc. dr. Poloni Zalar za sprejeto mentorstvo in za pomoč

pri izdelavi diplomske naloge. Zahvalila bi se ji za strokovno svetovanje, predvsem za

potrpežljivost in dragoceni čas pri nastajanju diplomskega dela. Zahvaljujem se tudi prof. dr.

Nini Gunde-Cimerman, ki me je napotila k izvedbi raziskave.

Zahvaljujem se vsem, ki so mi ob izdelavi diplomske naloge stali ob strani in mi na kakršenkoli

način pomagali. Iskrena hvala tudi dragi mami, očetu in sestri za vso podporo in finančno

pomoč pri študiju.

PRILOGA

PRILOGA A

PREGLED IZOLIRANIH GLIV IZ VODE IN VAB NA TRDNIH GOJIŠČIH

Fotografija primarne izolacijske plošče vode iz Jelševnika (Oznaka B01). Preko filtra velikosti por 0,45

µm smo prefiltrirali 50 mL vode, filtre pa nanesli na plošče in jih inkubirali pri 20 °C (Zalar, 2019).

Fotografija primarne izolacijske plošče vode iz Planinske jame (Oznaka B10). Preko filtra velikosti por

0,45 µm smo prefiltrirali 50 mL vode, filtre pa nanesli na plošče in jih inkubirali pri 20 °C (Zalar, 2019).

PRILOGA B

PREGLED IZOLIRANIH GLIV IZ BRISOV ŽIVALI NA TRDNIH GOJIŠČIH

Fotografija primarne izolacijske plošče (po 50 µL nanesene amies tekočine) brisov z osebkov Paa4,

Paa5 in Paa6, Plošče so bile inkubirane pri 20 °C (Zalar, 2019).

Fotografija primarne izolacijske plošče (po 50 µL nanesene amies tekočine) brisov z osebkov Paa7,

Pa8 in Paa9, Plošče so bile inkubirane pri 20 °C (Zalar, 2019).

Fotografija primarne izolacijske plošče (po 30 µL nanesene amies tekočine) brisa z osebka Paa15.

Plošče so bile inkubirane pri 15 °C (Zalar, 2019).


Plošče so bile inkubirane pri 15 (levo) in 20 °C (desno) (Zalar, 2019).


Plošče so bile inkubirane pri 15 (levo) in 20 °C (desno) (Zalar, 2019).

ANJA CEROVŠEK OSAMITEV IN IDENTIFIKACIJA GLIV S ČLOVEŠKEpefprints.pef.uni-lj.si/5912/1/Anja_Cerovšek_Diplomsko... · Cerovšek A. Osamitev in identifikacija gliv s človeške

Documents