7 IDENTIFIKACIJA GLJIVA ANTIMIKOGRAM

1. Principi LDg PGI: dlake nokta kože sluzokože oka uva

1. Principi LDg PGI: dlake nokta kože sluzokože oka uva

Cilj nastave:

2. Principi LDg IGI:

aglutinacija, precipitacija, ELISA, PCR, PH

invazivna aspergiloza (IA) invazivna kandidijaza (IC) zigomikoze Pneumocystis pneumonija

2. Principi LDg IGI:

aglutinacija, precipitacija, ELISA, PCR, PH

invazivna aspergiloza (IA) invazivna kandidijaza (IC) zigomikoze Pneumocystis pneumonija

3. Metode identifikacije gljiva

Metode ispitivanja

osetljivosti gljiva na AM Difuzija Dilucija Etest

3. Metode identifikacije gljiva

Metode ispitivanja

osetljivosti gljiva na AM Difuzija Dilucija Etest

4. Epidemiologija GI

Rizične grupe pacijenata Endemske GI

(bifazne i subkutane mikoze)

Mikoalergeni i mikoalergoze Mikotoksini i mikotoksikoze

4. Epidemiologija GI

Rizične grupe pacijenata Endemske GI

(bifazne i subkutane mikoze)

Mikoalergeni i mikoalergoze Mikotoksini i mikotoksikoze

Identifikacija i karakterizacija izolovanih gljiva vrši se na osnovu:

Makroskopskih kulturalnih karakteristika

Mikroskopskih kulturelnih karakteristika (preparat sa SDA, HA, PDA, DTM, MSIA)

Specifičnosti rasta na diferencijalnim podlogama (GACA)

Fizioloških karakteristika (germinacija, produkcija ureaze, kapsule...)

Biohemijske identifikacije (API, Candida Chrom Agar...)

Odredjivanja antigenske gradje izolovanih gljiva (npr. LA)

Odredjivanja DNK sekvenci karakterističnih za vrstu (npr. PCR)

Odredjivanja faktora virulencije (detekcija enzima, mikotoksina...)

Odredjivanja rezistencije na AM (rezistotipija)

Identifikacija i karakterizacija izolovanih gljiva vrši se na osnovu:

Makroskopskih kulturalnih karakteristika

Mikroskopskih kulturelnih karakteristika (preparat sa SDA, HA, PDA, DTM, MSIA)

Specifičnosti rasta na diferencijalnim podlogama (GACA)

Fizioloških karakteristika (germinacija, produkcija ureaze, kapsule...)

Biohemijske identifikacije (API, Candida Chrom Agar...)

Odredjivanja antigenske gradje izolovanih gljiva (npr. LA)

Odredjivanja DNK sekvenci karakterističnih za vrstu (npr. PCR)

Odredjivanja faktora virulencije (detekcija enzima, mikotoksina...)

Odredjivanja rezistencije na AM (rezistotipija)

Metode identifikacije gljiva:

Na osnovu specifičnosti rasta na diferencijalnim podlogama

(GACA razlikovanje C. neoformans od Candida; kukuruzni agar hlamidospore formira samo C. albicans)

Na osnovu fizioloških karakteristika

(germinacija karakterstika C. albicans; produkcija kapsule karakteristika C. neoformans)

Na osnovu biohemijskih karakteristika

(API sistemi za fermentaciju i asimilaciju; podloge sa hromogenim suptancama Chrom-agar)

Na osnovu specifičnosti rasta na diferencijalnim podlogama

(GACA razlikovanje C. neoformans od Candida; kukuruzni agar hlamidospore formira samo C. albicans)

Na osnovu fizioloških karakteristika

(germinacija karakterstika C. albicans; produkcija kapsule karakteristika C. neoformans)

Na osnovu biohemijskih karakteristika

(API sistemi za fermentaciju i asimilaciju; podloge sa hromogenim suptancama Chrom-agar)

Hrom agar – IDENTIFIKACIJA kvasnica

C. tropicalisC. tropicalis

C. glabrataC. glabrata C. kruseiC. krusei

C. albicansC. albicans

Biohemijska karakterizacija IDENTIFIKACIJA kvasnica

Identifikacija i ispitivanje njihove osetljivosti Candida

Biohemijska serija ID32 (bioMerieux, Paris) UNI-YEAST-TEC PLATE

Biohemijska identifikacija kvasnica

API ZYM - enzimska karakterizacija gljiva

C. parapsilosis C. dubliniensis

ANTIMIKOGRAM I ANTIMIKOTICI

• Ozbiljan i često loš klinički tok i prognoza IGI, RVVK i sl.

• Promenjen empirijski koncept lečenja gljivičnih infekcija zasnivan na pretpostavci da su gljive generalno osetljive na antimikotike (AM)

• Toksičnost i druga neželjena dejstva AM i ograničena primena

• Veći izbor AM, posebno za parenteralnu primenu

• Ozbiljan i često loš klinički tok i prognoza IGI, RVVK i sl.

• Promenjen empirijski koncept lečenja gljivičnih infekcija zasnivan na pretpostavci da su gljive generalno osetljive na antimikotike (AM)

• Toksičnost i druga neželjena dejstva AM i ograničena primena

• Veći izbor AM, posebno za parenteralnu primenu

Zbog čega antimikogram?

Metode ANTIMIKOGRAMA: Difuzija Dilucija Etest

Metode ANTIMIKOGRAMA: Difuzija Dilucija Etest

UPOTREBA AM: Profilaksa Empirujska th “Pre-emptive” th Specifična th

UPOTREBA AM: Profilaksa Empirujska th “Pre-emptive” th Specifična th

Geo

rgop

apad

akou

NH

, Wa l

s h T

. Nat

u re

1994

; 264

: 371Membrane function:

Amphotericin BCellwall synthesis:

Echinocandins

Ergosterol synthesis:Azoles

Ciljne strukture gljiva i mehanizmi dejstva AM

Nys

tatin

Am

phot

eric

in B

(195

8)

Gris

eofu

lvin

5-FCMiconazole

KetoconazoleFluconazole

Itraconazole

L-AmB ABCD ABLC

Terbinafine

VoriconPosacon

XM

P

Sordarins

Cas

po

fun

gin

MicafunRavucon

Ani

du

lafu

ngi

n

# broj lekova

0

2

4

6

8

10

12

14

1950 1960 1970 1980 1990 2000

Razvoj AM

Kombinovani metod (E test)48 h48 h

Difuzioni metod24-48 h24-48 h

Dilucioni metod48 - 72 h48 - 72 h

Automatski sistemi – identifikacija i AM>> 2 24 h4 h

Metode antimikograma

Disk difuzija, Etest i mikrodilucioni metod

100 µl100 µl

suspenzijasuspenzija

AM (µg/ml)AM (µg/ml)

BujonBujon

MFK = 0,5 µg/mlMFK = 0,5 µg/mlMFKMFK

MIKMIK MIK = 0,25 µg/mlMIK = 0,25 µg/ml

++

24 h24 h37°C37°C

2424 hh37°C37°C

0,030,030,060,060,1250,1250,250,250,50,5

MIKMIK: najmanja : najmanja koncentracija AM koja koncentracija AM koja inhibira porast gljiva inhibira porast gljiva (bujon ostaje bistar)(bujon ostaje bistar)

MFKMFK: presejavanjem svih : presejavanjem svih razblaženja koja inhibiraju porast razblaženja koja inhibiraju porast gljiva gljiva

Bujon dilucioni metod

24 h24 h

37°C37°C

111.51.5

.75.75

.50.50

.35.35

.25.25

.10.10

.05.05

.02.02

.01.01

223344881212

Plastična traka impregniranaPlastična traka impregniranaAM u gradijentuAM u gradijentu

koncentracijekoncentracije

11

1.51.5

.75.75

.50.50

.35.35

.25.25

.10.10

.05.05

.02.02.01.01

22

334488

1212

• Zasniva se na principu difuzije AM kroz čvrstu hranljivu podlogu (agar) prethodno zasejanu ispitivanom kulturom• Opadajući gradijent koncentracije AM na traci E testa

Zona inhibicijeZona inhibicije

elipsaelipsa

MIKMIK

Kombinovani metod - E test

REZISTENCIJA GLJIVA NA AM

Klinička rezistencija

Primarna (unutrašnja) prisutna i pre izlaganja tj. kontakta gljive sa AM (genetski predodredjena -spontatne mutacije)

Sekundarna (stečena) - razvila se u toku/ posle primene terapije - rezultat genotipskih i fenotipskih promena indukovanih antimikotikomOtpornost na doze hemioterapeutika koje se postižu pri optimalnim/ maksimalno dozvoljenim terapijskim dozama (toksičnost!)

Klinička rezistencija

Primarna (unutrašnja) prisutna i pre izlaganja tj. kontakta gljive sa AM (genetski predodredjena -spontatne mutacije)

Sekundarna (stečena) - razvila se u toku/ posle primene terapije - rezultat genotipskih i fenotipskih promena indukovanih antimikotikomOtpornost na doze hemioterapeutika koje se postižu pri optimalnim/ maksimalno dozvoljenim terapijskim dozama (toksičnost!)

REZISTENCIJA: odsustvo terapijskog efekta primenom odgovarajućih terapijskih doza AM

Za sve izolate gljiva iz primarno sterilnih regija – OBAVEZAN je antimikogram

MEHANIZMI REZISTENCIJE GLJIVA

1. Prekomerna produkcija ciljnog enzima

2. Izmena ciljnog mesta

3. Efluksne pumpe

4. Sprečen ulazak 5. Zaobilazni metabolički putevi

6. Inhibicija enzima aktivatora leka

7. Degradacija leka EC enzimima

1. Prekomerna produkcija ciljnog enzima

2. Izmena ciljnog mesta

3. Efluksne pumpe

4. Sprečen ulazak 5. Zaobilazni metabolički putevi

6. Inhibicija enzima aktivatora leka

7. Degradacija leka EC enzimima

█ > 75% senzitivnost, █ 50%, █ < 5%; (O'Brien et al., ASH Edu 2003)

Vrste gljiva AmB Fluconazol Itrakonazol Vorikonazol Caspofungin 5-FC

C. albicans

C. parapsilosis

C. tropicalis

C. glabrata

C. krusei

A. fumigatus

A. flavus

A. terreus

Zygomycetes

Fusarium spp.

NAJČEŠĆE VRSTE GLJIVA I OSETLJIVOST NA AM

00

3636

3737

3838

3939

4040

4411

Tem

per

atu

re (

°C)

Tem

per

atu

re (

°C)

KKulturulturaaKKulturulturaa +TTkivokivoTTkivokivo +

AntigeniAntigeniAntigeniAntigeni +

PCRPCRPCRPCR +

Terapija

Verovatnoća IGI

-7-7 00 77 1414 2121 2828 3535 4242 4949 5656 6363-14-14

0.10.1

11

1010

DaDani posle ni posle transplant transplantacijeacije

Gra

nu

locy

tes

(lo

gG

ran

ulo

cyte

s (l

og

1010x

10x1099 /

L)

/L)

EmpiriEmpirijskajska

MogucaMoguca

ProProfifilalaktickakticka

RRizikizik

SpecifiSpecificnacna

DokazanaDokazana

Pre-emptivePre-emptive

VerovatnaVerovatna

CT

Savremena terapija i značaj laboratorijske dijagnoze