UNIVERSIDADE VALE DO RIO DOCE FACULDADE DE CIÊNCIAS E SAÚDE MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Suzana Coelho Soares Moraes Achillea millefolium L – ASTERACEAE PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA, PERFIL ESPECTROMÉTRICO E ATIVIDADE ANTIFÚNGICA. Governador Valadares 2008
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UNIVERSIDADE VALE DO RIO DOCE FACULDADE DE CIÊNCIAS E SAÚDE
MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Suzana Coelho Soares Moraes
Achillea millefolium L – ASTERACEAE PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA, PERFIL ESPECTROMÉTRICO E AT IVIDADE
ANTIFÚNGICA.
Governador Valadares 2008
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SUZANA COELHO SOARES MORAES
Achillea millefolium L . – ASTERACEAE PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA, PERFIL ESPECTROMÉTRICO E AT IVIDADE
ANTIFÚNGICA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Biológicas da Faculdade de Ciências da Saúde da Univale, para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas. Área de Concentração: Imunopatologia das doenças infecto-contagiosas.
Análise espectral. 4. Análise antifúngica. I. Peres, Rodrigo Loreto. II. Universidade Vale do Rio Doce. III. Título.
CDD 581.634
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Ao meu querido esposo Cícero – meu eterno
amor.
Aos meus lindos filhos Gabriel e Henrique –
meus maiores presentes.
À minha família: Matozinhos, Izaura, Suzete e
Weber – meu bem maior.
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AGRADECIMENTOS:
Á DEUS, que me guiou nos caminhos dando força e persistência para alcançar meu objetivo.
Ao meu orientador Prof. Dr. Rodrigo Loreto Peres pelo apoio, incentivo e conhecimentos os
quais foram muito importantes para a realização desse trabalho.
Ao Prof. Dr. Marcelo Barcelos da Rosa, que necessitou se afastar, mas mesmo à distância,
continuou apoiando e ajudando-me a concluir o presente trabalho.
À Professora Drª. Alda Maria Soares Oliveira pela implantação do Mestrado na UNIVALE,
pela confiança, incentivo, amizade e “boa conversa” sempre que nos encontramos.
Aos alunos de iniciação científica do laboratório de química da UNIVALE, principalmente à
Paula Alves Ferreira cuja ajuda foi imprescindível na realização da primeira parte
experimental do trabalho.
À Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais, FAPEMIG, pelo suporte financeiro.
Aos alunos do curso de mestrado pela amizade e boa convivência durante o período de aulas
do curso.
MUITO OBRIGADA!!!
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“(...) Uma descoberta não consiste em ver o que
todo mundo não viu, mas em pensar o que
ninguém pensou”.
Goethe
“(...) Aquilo que você mais sabe ensinar, é o que
mais precisa aprender...”
Richard Bach (Ilusões)
“(...) Mestre não é quem sempre ensina, mas
quem de repente aprende.”
João Guimarães Rosa
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RESUMO
A Achillea millefolium é uma planta da família Asteraceae, conhecida popularmente como milfolhas, erva-do-carpinteiro, tem sido usada na medicina popular desde a antiguidade com várias finalidades: antiinflamatória, antifúngica, antibacteriana, entre outras. Os objetivos do presente estudo foram realizar a prospecção fitoquímica e traçar o perfil espectrométrico da planta em solventes polares e apolares, avaliando a influência do pH sobre o extrato aquoso, a influência de diversos tempos e concentrações de carvão ativo na extração da clorofila e dos compostos da planta, comparar a extração utilizando ultra-som e sem ultrasom e avaliar a atividade antifúngica da planta em fitopatógeno (Colletotrichum musae) utilizando o método de infusão do extrato no meio de cultura. Os bioensaios foram realizados com o extrato etanólico seco. Esse extrato foi submetido à cromatografia preparativa em camada delgada (CCD) sendo realizado o fracionamento dos componentes da amostra. Observou-se a separação de seis frações as quais foram biomonitoradas. Os resultados obtidos na prospecção fitoquímica revelaram a presença de flavonóides, taninos e cumarinas. Os perfis espectrais apresentaram o metanol como melhor solvente na extração dos compostos polares e apolares da Achillea millefolium. Referente às análises de pH, verificou-se que em pH alcalino os componentes químicos do extrato tornam-se deprotonados. O uso do carvão ativo 1g/10 minutos, mostrou ser o tempo e concentração ideais para extração de 90% da clorofila e 80% dos constituintes da planta.Constatou-se uma maior eficiência de extração com ultra-som em cerca de 20%. A atividade antifúngica foi evidenciada contra Colletotrichum musae sendo que o extrato seco etanólico inibiu em cerca de 56% o crescimento do patógeno e a fração A6 produziu 100% de inibição do crescimento micelial.
ABSTRACT Achillea millefolium (Asteraceae), known as milefolio, yarrow, has been used in folk medicine since antiquity with several activites: anti-inflamatory, antifungal, antibacterial, analgesic and others. The aim of the present study was to take the fitoquimic assay and to obtain the spectrophotometer profile using polar and apolar solvents, evaluating the influency of the pH in the aqueous extract and the influence of the different times and concentrations of active coal in the chlorophyll and compounds of plant extraction and to compare the extraction using ultrasound and without ultrasound. The antifungal activity in phytopatogenic (Colletotrichum musae) was investigated using extract infusion method in the fungus culture.The bioassays were evaluated using dry ethanol extract and after the preparative chromatography was used to separate the fractions of the components of the sample. 6(six) fractions were detected and bio-monitoring. The results from phytochemical assays presented flavonoids, coumarins and tanning barks. The spectrometric profiles showed the methanol as the best solvent to extract the polar and apolar compounds. About the pH, it was verified that in alkaline it made deprotonations of the quimic compounds of the extract.The use of active coal 1g for 10min, as the concentration and the ideal time for the 90% of chlorophyll extraction and 80% of plant compounds extraction Using ultrasound it was 20% more efficient to extract the compounds of the extract.Antifungal activity in Colletotrichum musae using dry ethanol extract produced 56% of inhibition of the phytopatogenic and the A6 fraction showed 100% of inhibition of the microorganism. Key words: Achillea millefolium, Fenolic composts, Antifungal activity, Spectrophotometer.
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Molécula de etoposídeo............................................................................................17
Figura 2 - Molécula de artemisinina.........................................................................................17
Figura 3 - Molécula de taxol.....................................................................................................17
Figura 4 - Principais vias do metabolismo secundário.............................................................21
Figura 5 - Rota de biossíntese de compostos fenólicos derivados da fenilalanina...................22
Figura 6 - Rota de síntese de flavonóides.................................................................................23
Figura 7 - Exemplos de cumarinas............................................................................................23
Figura 8 - Procedimentos gerais para obtenção de compostos biologicamente ativos.............24
Figura 9 - Gráfico de crescimento da bolha com o tempo........................................................28
Figura 10 - Foto do momento da implosão da bolha de cavitação...........................................28
Figura 11 - Espectrofotômetro de varredura UV-visível Femto modelo 800 XI......................30
Figura 12 - Detalhes de A. millefolium L e folha da planta.......................................................39
Figura 13 - Flores de A. millefolium.........................................................................................40
Figura 14 - Exemplo de componentes do óleo essencial de A. millefolium..............................42
Figura 15 - Exemplos de flavonóides de A.millefolium............................................................43
Figura 16 - Exemplos de outros compostos presentes em A.millefolium..................................43
Figura 17 - Fluxograma das análises experimentais realizadas com A.millefolium..................48
Figura 18 - Esquema de distribuição do extrato em cavidade central na placa de Petri com
conídios suspensos no meio de cultura BDA................................................... 54
Figura 19 - Perfil espectrofotométrico da Achillea millefolium para diferentes solventes.......60
Figura 20 - Influência de valores extremos de pH sobre o extrato aquoso da Achillea
Tabela 9 - Efeito de diferentes frações do extrato seco etanólico de A.millefolium sobre o crescimento radial do fungo Colletotrichum musae em meio BDA, a 28ºC.
Tratamento Diâmetro Médio do
Crescimento Radial do Fungo (cm)
Redução do Crescimento
(%) BDA 8,20 A 0 BDA + DMSO 8,20 A 0 Aquiléia fração 2 8,17 A 0 Aquiléia fração 1 7,87 A 4 Aquiléia fração 4 7,40 A B 10 Aquiléia fração 5 6,13 B C 25 Aquiléia fração 3 5,73 C 30 Aquiléia fração 6 0,00 D 100
CV (%) 7,04 DMS 1,44
Médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (0,05).
A fração de número seis foi a que apresentou 100% de inibição o que é extremamente
desejável para um produto natural. Tal fração possivelmente apresentaria constituintes polares
já que o solvente de eluição utilizado foi o hexano, o qual é altamente apolar e a mesma
apresentou índice de retenção igual à zero, ou seja, o solvente não conseguiu eluir os
constituintes polares da fração.
Figura 30 - Resultado do teste de inibição do patógeno Colletotrichum musae por ação das frações A3, A5 e A6
da A.millefolium.
A5
A6
A3
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Estudos anteriores sinalizam para flavonóides (SIMÕES et al., 2004; COWAN, 1999)
e taninos (WAAGE et al., 1984; MARWAN & NAGEL, 1986) como agentes antifúngicos os
quais foram caracterizados na marcha fitoquímica. Os flavonóides possuem uma variedade de
efeitos biológicos em várias partes celulares. São conhecidos por serem sintetizados por
plantas em resposta a infecções microbianas, justificando assim sua ação frente a vários
microrganismos. Esta atividade se dá provavelmente por complexação com a parede
bacteriana. Os flavonóides mais lipofílicos podem lisar a parede microbiana (COWAN,
1999).
Os efeitos inibitórios dos taninos sobre bactérias e fungos derivam de 3 hipóteses:
inibição das enzimas de bactérias e fungos e/ou complexação com os substratos dessas
enzimas; ação sobre as membranas celulares dos microrganismos, modificando seu
metabolismo; complexação com íons metálicos diminuindo a disponibilidade desses para o
metabolismo dos microrganismos (SIMÕES et al., 2004).
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5 CONCLUSÃO
5.1 PERFIL FITOQUÍMICO PRELIMINAR
Extratos aquosos de folhas e caules de Achillea millefolium avaliados à 01:20 ml de
solvente são mais eficientes na extração dos compostos químicos polares tais como
flavonóides, taninos e cumarinas.
5.2 ANÁLISES ESPECTROMÉTRICAS
Dentre os extratos em água, metanol, etanol, éter, diclorometano e hexano de caules e
folhas de Achillea millefolium, 1/100ml de solvente, o extrato metanólico se apresenta como o
mais eficiente na extração de compostos polares e apolares da planta, entretanto, optou-se
pelo uso do etanol, o qual apresentou perfil espectral semelhante ao metanol, por ser menos
tóxico e não interferir nos testes microbiológicos em quantidades/traço. Em meio aquoso,
1/100ml, o pH alcalino ocasiona formação de dois pontos isosbésticos determinando mudança
na estrutura das moléculas às quais se tornam deprotonadas. Com relação ao uso do carvão
ativo na extração da clorofila e compostos da planta, concluiu-se que 1,0g de carvão ativo por
10 min retirando 90% da clorofila e 80%dos constituintes da planta, revelaram-se a melhor
condição para realização dos experimentos da prospecção fitoquímica. Comparando-se a
extração dos constituintes da planta em extrato metanólico, 1/100ml, por maceração e por
sonicação, verificou-se que o processo físico do ultra-som mostrou-se mais eficiente na
extração dos constituintes da planta em cerca de 20% justificando assim seu uso.
5.3 ANÁLISE ANTIFÚNGICA
O extrato seco etanólico na concentração de 2000 ppm, apresentou inibição de 56%
sobre o patógeno estudado, Colletotrichum musae.
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Com o fracionamento realizado por CCD foi possível detectar duas frações do extrato
(A3 e A5) com razoável ação fungicida, 30 e 25% respectivamente. A fração A6 apresentou
100% de inibição do crescimento micelial, tornando-se uma fração com potencial muito
grande para estudos avançados na identificação dos compostos presentes na fração isolada.
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6 PERSPECTIVAS
Monitoramento dos efeitos edafoclimáticos na obtenção de extratos em solventes de
diferentes polaridades;
Utilizar a fração de maior atividade (A6) para caracterização estrutural (RMN, Massas, IV,
ultravioleta) dos compostos presentes na fração;
Após a padronização do extrato será possível desenvolver um concentrado emulsionável com
a referida fração e realizar testes in vivo.
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