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Etude des mécanismes cellulaires et moléculaires desleucémies pédiatriques à mauvais pronostic présentant la

fusion ETO2-GLIS2Cecile Lopez

To cite this version:Cecile Lopez. Etude des mécanismes cellulaires et moléculaires des leucémies pédiatriques à mauvaispronostic présentant la fusion ETO2-GLIS2. Hématologie. Université Paris Saclay (COmUE), 2018.Français. �NNT : 2018SACLS413�. �tel-03008820�

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Etude des mécanismes cellulaires et moléculaires des leucémies à mauvais pronostic présentant la

fusion ETO2-GLIS2

Thèse de doctorat de l'Université Paris-Saclay Préparée à l’université Paris-Saclay

École doctorale n°582 cancérologie : biologie, médecine, santé (CBMS) Spécialité de doctorat: Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Thèse présentée et soutenue à Villejuif, le 16 novembre 2018, par

Cécile Lopez

Composition du Jury :

Mr Thierry Jaffredo Directeur de recherche, INSERM (U1156) Président

Mme Véronique Maguer-satta Directrice de recherche, INSERM (U1052) Rapporteur

Mr Eric Delabesse Professeur, Université de Toulouse Rapporteur

Mme Marie-laure Arcangeli Chargée de recherche, INSERM (UMR967) Examinateur

Mme Leïla Maouche-chretien Chargée de recherche, INSERM (U1163) Examinateur

Mr Thomas Mercher Directeur de recherche, INSERM (U1170) Directeur de thèse

Mr Olivier Bernard Directeur de recherche, INSERM (U1170) Co-directeur de thèse

NN

T :

20

18

SA

CLS

413

2

3

REMERCIEMENTS

Je tiens tout d’abord à remercier la Cancéropole Ile de France et la Fondation Recherche

Médicale d’avoir financé cette thèse. Merci à Véronique Maguer-satta et Eric Delabesse

d’avoir accepté d’évaluer ce travail, ainsi qu’à Marie-Laure Arcangeli, Leïla Maouche-

Chretien et Thierry Jaffredo pour faire partie de mon jury de thèse.

À Thomas, mon directeur de thèse, je tiens à te remercier pour ces 9 années passées dans

ton équipe. Merci pour les premières années en tant qu’ingénieur, j’ai adoré travailler avec

toi, Clarisse, Vincianne, Paola et le reste de l’équipe. Tu m’as fait découvrir le monde de

l’hématologie avec beaucoup de patience et de pédagogie. L’experte souris qui n’en avait

jamais touché une à bien grandit. Merci aussi de m’avoir poussé plus loin, et notamment

jusqu’à cette thèse. Tu m’as toujours chalengée et c’était très stimulant. J’ai adoré nos

discussions scientifiques aussi. Et surtout merci d’avoir composé avec mon caractère, hum,

doux et tellement facile à vivre …

À Olivier, mon deuxième directeur de thèse, merci de m’avoir permis de réaliser cette thèse

au sein de ton équipe et pour tes conseils.

À Jurg Schwaller, en premier lieu je tiens à te remercier pour le modèle de la fusion ETO2-

GLIS2 qui a été au cœur de ce travail et qui m’a permis de répondre à bon nombre de

questions. Merci aussi pour tous les échanges que nous avons pu avoir et qui m’ont toujours

beaucoup apporté. Et enfin, merci pour toutes les analyses d’histologies et de cytospins que

j’ai pu t’envoyer (et il y en a eu des colis fedex !!!). Ton expertise a été d’une aide précieuse !

La recherche est une grande aventure prenante, passionnante et pas toujours évidente.

Mais elle m’a permis de rencontrer des personnes incroyables au cours de ces 9 années :

mon boubou (alias Clarisse), Vinciane, Paola, Laurianne (mon cerveau externe), Aline,

Carrèle, Morgane, Elodie, Lucile, Claire, Enguerran, Damien, Dom et Olive merci pour tous

ces moments partagés à la paillasse et ailleurs.

4

Merci à tous les membres de l’équipe Erythro-Méga-Lympho. À Sébastien, je te remercie

pour ta disponibilité et toutes les discussions scientifiques que nous avons pu échanger

avant ton départ pour le pays des kangourous.

À Zak, un énorme merci ! J’ai adoré (et j’adore encore !) maniper avec toi. Tu es toujours

prête à aider tout le monde et c’est un vrai plaisir de t’avoir dans l’équipe. Merci pour ta

bonne humeur, toute l’aide que tu m’as apportée et tous les bons moments partagés. Merci

aussi pour tous les jeux de mot volontaire et involontaire qui ont mené à de cocasses

situations et à de nombreux fous rires. Tu es quelqu’un de génial. :)

À Anouch (et Robert), ma chouchou, Madame Prout-Prout, ça a été un vrai plaisir de

partager toutes ces pauses en ta compagnie, de te voir évoluer et grandir entre ton M2 et ta

quatrième année de thèse. Tu es un petit rayon de soleil, ne change pas ! Plein de bisous et

de bon courage pour la suite.

À Alex, Laetitia, Fabien, Julie et Muriel, merci pour tous ces moments passés avec vous. Les

réunions d’équipes et repas sont rarement mornes et silencieux en votre compagnie. Et un

énorme merci pour toute l’aide apportée : relecture, discussion, partage d’information, aide

de manip mais aussi pour les bons moments : gâteaux, apéro et fous rires.

Aux bio-informaticiens, Kadija et Esteve (prononcé « Steba », aller comprendre…), qui ont

énormément contribués à l’avancé des projets. Merci pour toute l’aide apportée. Kadija

merci pour ta disponibilité et ta pédagogie. La compréhension de la bioinformatique sous

ton aile a été précieuse !!!

Merci aux différents membres de l’unité U1170 avec une mention particulière pour véro.

Ma véro, tellement de chose à te dire que je ne sais par où commencer. J’ai adoré partager le

bureau avec toi pendant toutes ces années. Tu es toujours disponible et de bonne humeur.

Merci pour tous tes conseils et tous ces moments inoubliables. Je nous reverrais toujours

nous lançant « bille en tête » dans des analyses FACS alors qu’aucune de nous deux ne

savais l’utiliser (merci à William et Philippe de nous avoir sauvées du naufrage !) ou encore

en injectant des cellules à des souris qui n’étaient pas les nôtres… Vive l’isoflurane !

À Paule, merci pour tout ce que tu fais pour nous tous. Tu es la meilleure !!

5

A Yann, merci pour toutes ces heures passées avec toi devant l’ARIA. Grâce à toi j’ai appris à

compenser même avec de la Cherry, du PE (« P » « I » comme dirait ton amie M), du Pc7 et

du PercP5.5 ! Finger in the nose !!! À Valou, Madame Super Formatrice IVIS ! Merci !

Toujours disponible pour répondre aux milles questions ou faire des tests au pied levé (pas

toujours fructueux, la GFP ne se détecte pas dans les C57bl6 ! maintenant je le sais !). À

Karine, tu m’auras finalement appris à mettre une blouse pour maniper… Merci à vous trois

pour votre soutient, vos encouragements et toutes les discussions sur le perron de l’IGR (je

ne regarde plus les chats, les chiens et les canards de la même façon).

À toute l’équipe du PFEP, merci pour le bien être apporté aux petites pensionnaires et pour

votre aide.

À mes amis, (enfance, collège, lycée, FAC, colo…), merci à tous d’avoir été présent malgré

mon « hibernage » de ces 4 dernières années. J’ai une chance folle de vous avoir auprès de

moi et j’espère bien que l’on partagera encore longtemps les évènements importants

(mariage, naissance…) et les non moins importants (soirée crêpe annuelle, soirée jeux,

dégustation de vin…).

À ma famille, ma sœur, mon grand-père, ma mamie, mes tontons, tatas, cousines et pièces

rapportées, merci pour tous ces moments passés en famille. Nous avons la chance d’avoir

une famille unie et c’est toujours un plaisir de vous retrouver.

À mes neveux d’amour, j’ai eu la chance d’être tata deux fois pendant cette thèse et je ne

saurais vous dire à quel point cela a été une joie immense (Sébastien pourra en témoigner).

C’est un plaisir de vous voir grandir. Vous êtes mes rayons de soleil.

À mes parents, je tiens à vous remercier pour tout le soutien inconditionnel que vous

m’avez apporté. Cette belle aventure n’aurait pas pu avoir lieu sans vous deux. Vous m’avez

toujours épaulé et encouragé tout au long de ces 4 années (et bien plus encore) de la

meilleur de façon. Merci pour tout. Je vous aime énormément.

6

En guise de préface, voici une discussion que j’ai eue avec mon grand-père sur mon

orientation professionnelle…

Et maintenant laissons place à la science et aux « oncle Eugène » (oncogènes)…

7

TABLE DES MATIERES

INDEX DES FIGURES ET DES TABLEAUX ...................................................................................... 11

INTRODUCTION .................................................................................................................................... 14

I/ Hématopoïèse : ...................................................................................................................................... 15

A/ Ontogenèse du système hématopoïétique : .......................................................................... 15

1/ Les premières cellules hématopoïétiques dites « primitives » : .............................. 16

2/ Les cellules hématopoïétiques dites « définitives » transitoires : ........................... 17

3/ Les cellules souches hématopoïétiques HSC : ................................................................. 18

a/ Émergence des HSC : ............................................................................................................ 18

b/ Amplification des HSC : ....................................................................................................... 19

B/ Organisation de l’hématopoïèse adulte .................................................................................. 20

1/ Caractéristiques cellulaires des cellules souches hématopoïétiques adultes ..... 21

a/ Différenciation : ...................................................................................................................... 21

b/ Autorenouvellement : .......................................................................................................... 22

c/ Quiescence : .............................................................................................................................. 23

2/ Modèles de hiérarchie hématopoïétique ........................................................................... 23

a/ Modèle (pré)historique : ..................................................................................................... 24

b/ Vers des modèles de continuum : .................................................................................... 25

3/ Myélopoïèse : ............................................................................................................................... 28

a/ Monocyte et macrophage : ................................................................................................. 28

b/ Les cellules dendritiques : .................................................................................................. 29

c/ Granulocytes : .......................................................................................................................... 29

8

4/ Mégacaryopoïèse : ...................................................................................................................... 30

a/ Généralités :.............................................................................................................................. 30

b/ Origine des progéniteurs mégacaryocytaires ............................................................. 31

c/ Maturation des mégacaryocytes ...................................................................................... 32

d/ Différence fœtal et adulte ................................................................................................... 35

C/ Régulation de l’hématopoïèse : .................................................................................................. 36

1/ La niche hématopoïétique : .................................................................................................... 36

2/ Communication entre HSC et cellules de la niche : les voies de signalisation .... 38

a/ Contact cellule-cellule, exemple de la voie Notch : ................................................... 39

b/ Facteur soluble et récepteur, exemple de la TPO :.................................................... 39

c/ Exemple de la voie Sonic Hedgehog ................................................................................ 41

3/ Régulation transcriptionnelle : ............................................................................................. 41

a/ Facteur de transcription et complexe transcriptionnel .......................................... 42

b/ Organisation chromatinienne ........................................................................................... 46

II/ Hémopathies malignes ...................................................................................................................... 51

A / Les leucémies aiguës myéloïdes : ............................................................................................ 51

1/ Classification des LAM .............................................................................................................. 51

2/ Anomalies génétiques des LAM ............................................................................................ 52

a/ Types d’altérations génétiques ......................................................................................... 53

b/ Conséquences fonctionnelles des mutations .............................................................. 54

c/ Coopération oncogénique et évolution clonale .......................................................... 56

3/ Les cellules souches leucémiques ........................................................................................ 58

a/ Propriétés des LSC ................................................................................................................. 58

9

b/ Origine cellulaire .................................................................................................................... 59

4/ Différence entre leucémies pédiatriques et leucémies de l’adulte .......................... 60

a/ Différence de répartition des sous-types de LAM et génétique ........................... 61

b/ Origine in utero des leucémies pédiatriques ............................................................... 62

B/ Les LAM-M7 pédiatriques ............................................................................................................ 63

1/ Présentation clinique et traitements .................................................................................. 64

2/ Génétique des LAM-M7 pédiatriques ................................................................................. 65

a/ LAM-M7 associées aux trisomies 21 constitutionnelles ......................................... 66

b/ LAM-M7 de novo ..................................................................................................................... 67

3/ Modélisation fonctionnelle des LAM-M7 .......................................................................... 71

a/ LAM7 associées aux trisomies 21 constitutionnelles : ............................................ 71

b/ Fusion OTT-MAL : .................................................................................................................. 72

c/ Fusion NUP98-KDM5A :....................................................................................................... 73

d/ Fusions MLL ou HOX : .......................................................................................................... 73

3/ La fusion ETO2-GLIS2 ............................................................................................................... 74

RESULTATS ............................................................................................................................................ 78

CONTEXTE ET OBJECTIFS ................................................................................................... 79

ARTICLE 1 .................................................................................................................................. 86

ARTICLE 2 ............................................................................................................................... 112

DISCUSSION .......................................................................................................................................... 158

LISTE DES ABREVIATIONS .............................................................................................................. 170

ANNEXES ............................................................................................................................................... 174

Pediatric Acute Megakaryoblastic Leukemia : Multitasking Fusion Proteins

and Oncogenic Cooperations ........................................................................................... 174

10

Molecular pathways driven by ETO2-GLIS2 in aggressive pediatric leukemia

..................................................................................................................................................... 188

Leucémies à mégacaryoblastes de l’enfant : une affaire de complexes .......... 192

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES .............................................................................................. 213

11

INDEX DES FIGURES ET DES TABLEAUX

Figure 1: Apparition spatiale et temporelle des cellules hématopoïétiques pendant le

développement murin et humain. ....................................................................................................... 16

Figure 2: Production des cellules hématopoïétiques au cours du développement

embryonnaire murin. ............................................................................................................................... 17

Figure 3 : Représentation schématique du mécanisme EHT lors de la formation des HSC. .. 19

Figure 4: Les stades de différenciation des HSC. ..................................................................................... 21

Figure 5: Modèles de l’hématopoïèse. ......................................................................................................... 25

Figure 6 : Évolution du modèle hématopoïétique. ................................................................................. 27

Figure 7 : La mégacaryopoïèse ....................................................................................................................... 31

Figure 8 : Processus d’endomitose lors de la mégacaryopoïèse. ...................................................... 33

Figure 9 : Processus de mégacaryopoïèse. ................................................................................................ 34

Figure 10 : Différenciation hématopoïétique fœtale et adulte. .......................................................... 35

Figure 11 : Organisation spatiale des cellules dans la moelle osseuse. .......................................... 37

Figure 12 : Voie de signalisation de la TPO. .............................................................................................. 40

Figure 13 : Activation de la transcription par les facteurs de transcriptions. ............................. 43

Figure 14 : Régulation de la transcription via les complexes transcriptionnels. ........................ 45

Figure 15 : Les différents niveaux de condensation de la chromatine. .......................................... 46

Figure 16 : Régulation de la transcription par des modifications épigénétiques. ...................... 47

Figure 17 : Le complexe de cohésines est un régulateur-clé de la transcription et de la

formation de boucle chromatinienne. ................................................................................................ 50

12

Figure 18 : Exemple d’évolution clonale de leucémie aiguë promyélocytaire (LAM-M3). ..... 57

Figure 19 : Répartition des sous-groupes de LAM en fonction de l’âge. ........................................ 61

Figure 20 : Modèle de transformation par la fusion TEL-AML1 chez des jumeaux. .................. 63

Figure 21 : Survie Globale (OS) d’une cohorte française de LAM pédiatriques. ......................... 65

Figure 22 : Altérations génétiques entre les LAM-M7 pédiatriques et adultes. .......................... 65

Figure 23 : Développement leucémique des DS-LAM-M7. .................................................................. 67

Figure 24 : Mutations additionnelles des LAM-M7. ............................................................................... 69

Figure 25 : Représentation schématique des gènes ETO2 et GLIS2 et des transcrits de fusion.

........................................................................................................................................................................... 75

Figure 26 : Influence de l’ontogenèse hématopoïétique sur le phénotype des leucémies. .. 167

Tableau 1 : Combinaison de marqueurs de surface pour identifier les progéniteurs

hématopoïétiques murins et humains. .............................................................................................. 26

Tableau 2 : Fréquence des altérations génétiques des LAM-M7 de novo. ..................................... 68

Tableau 3 : Modèles de LAM-M7 pédiatriques. ........................................................................................ 72

13

14

INTRODUCTION

15

I/ Hématopoïèse :

Le système sanguin est composé de cellules matures circulantes qui assurent certaines

fonctions indispensables au bon fonctionnement de l’organisme incluant le transport de

l’oxygène par les érythrocytes, la prévention des hémorragies par les plaquettes, ainsi que

la lutte contre les infections par les cellules myéloïdes (monocytes/macrophages et

neutrophiles) et les lymphocytes. Ces cellules matures ont une durée de vie généralement

courte, il est donc nécessaire de les renouveler tout au long de la vie. Chez l’Homme entre

1010 et 1012 cellules sanguines sont produites par jour par un processus très régulé connu

sous le nom d’hématopoïèse.

Les différents travaux de James Till et Ernest McCulloch ont permis la découverte d’une

cellule immature, appelée cellule souche hématopoïétique (HSC), présente dans la moelle

osseuse et ayant la capacité de former les cellules matures composant le sang (1). Depuis,

l’hématopoïèse est généralement décrite comme une hiérarchie avec au sommet les cellules

souches hématopoïétiques (HSC) capables de maintenir la production des différentes

cellules sanguines tout au long de la vie de l’individu.

A/ Ontogenèse du système hématopoïétique :

Les cellules hématopoïétiques apparaissent au cours de l’embryogenèse en plusieurs

vagues spatiales (différents organes comme le sac vitellin, le foie ou encore la moelle

osseuse) et temporelles (Figure 1). Par la suite, les HSC colonisent la moelle osseuse qui

représente le siège de l'hématopoïèse chez l'adulte. L’hématopoïèse embryonnaire a

principalement été étudiée dans des modèles animaux (murin, poisson zèbre…) à cause des

difficultés d'accès aux étapes précoces du développement humain. Les observations

obtenues dans le modèle murin seront principalement décrites ici.

16

Figure 1: Apparition spatiale et temporelle des cellules hématopoïétiques pendant le développement

murin et humain. Développement de l’hématopoïèse murine (A) et humaine (B). (Issue (2)).

1/ Les premières cellules hématopoïétiques dites « primitives » :

Les premières cellules sanguines sont détectées dans le sac vitellin au jour E7-7,5 du

développement murin (Figure 2), avant l’apparition de la circulation sanguine qui a lieu à

E8,5 (3). Les érythroblastes, les macrophages (3) et les mégacaryocytes (4) observés

descendraient d’un progéniteur commun aux cellules endothéliales, l’« hémangioblaste »

(5,6). Cette première vague hématopoïétique transitoire est également nommée

«primitive » Pour revue (7) car les cellules présentent des caractéristiques différentes des

cellules synthétisées lors de l’hématopoïèse adulte appelée « définitive ».

Ainsi, alors que les érythrocytes adultes sont énuclées, les érythroblastes primitifs

présentent un noyau et l’expression d’une hémoglobine fœtale (2) ; Pour revue (8).

Il est généralement admis que cette hématopoïèse primitive participe au développement de

l’embryon en oxygénant et en phagocytant les cellules durant la formation des tissus par les

érythrocytes et les macrophages, respectivement. Les mégacaryocytes assurent la

production de plaquettes qui participent à l'homéostasie du système vasculaire sanguin. De

plus, les macrophages participent à la protection l’embryon contre les infections.

Les cellules hématopoïétiques primitives sont amplifiées entre E7 et E8,25 et ne sont plus

détectées vers E9.

17

2/ Les cellules hématopoïétiques dites « définitives » transitoires :

Chez l’embryon, une deuxième vague de cellules sanguines transitoires dérivant de

progéniteurs érythro-myéloïde et lymphoïde est décrite avant l’émergence des cellules

souches hématopoïétiques (HSC) qui présentent une capacité de reconstitution

multipotente à long-terme.

À un stade de développement précoce vers E8,25, les cellules de la lignée myéloïde

dérivent d’un progéniteur bipotent EMP (Erythro-Myeloid Progeniteur) qui émerge dans le

sac vitellin (3). Ce progéniteur prolifère puis migre dans le foie fœtal vers E10,5 pour

produire les cellules matures érythrocytes, mégacaryocytes, et les différentes cellules

myéloïdes (macrophages, neutrophiles, basophiles, éosinophiles). Les cellules EMP

expriment les marqueurs de surface Kit, CD41 puis CD16/32 vers E9,5 (Figure 2, (9)).

Figure 2: Production des cellules hématopoïétiques au cours du développement embryonnaire murin. Les premières cellules hématopoïétiques composées d’érythrocytes, de mégacaryocytes et de macrophages apparaissent au stade E7-7,5 dans le sac vitellin. Par la suite les progéniteurs EMP (Erythro-myeloid Progenitors) et lymphoïdes (B-Lymphoid) se développent vers E8,25-8,5 dans le sac vitellin et la région de l’AGM (Aorte-Gonade-Mésonéphros) avant la formation des HSC au stade E10,5. (Issue de (9)).

18

La greffe de ces progéniteurs EMP dans des souris hôtes irradiées, confirme la capacité de

différenciation de ces progéniteurs vers les lignées myéloïdes et non vers les lignées

lymphoïdes. Ces progéniteurs ne semblent pas posséder de potentiel de reconstitution à

long terme dans ces analyses.

Une hypothèse récente suppose que les macrophages résidents des tissus de l’adulte

proviennent des progéniteurs EMP du sac vitellin (10).

La lignée lymphoïde est observée entre les stades E8,5 et E9,5 du développement

embryonnaire murin avec la présence des progéniteurs lymphoïdes dans le sac vitellin et la

région AGM (Aorte-Gonade-Mésonéphros) (11–13).

Un progéniteur pouvant se différencier vers les lignées myéloïdes (granulocytes et

monocytes) et lymphoïdes est aussi observé au stade E9,5 dans le sac vitellin (14).

La formation de ces cellules spécifiques du système immunitaire permet de protéger

l’embryon des pathogènes.

3/ Les cellules souches hématopoïétiques HSC :

Les HSC sont définies par leur capacité de reconstitution hématopoïétique à long terme de

toutes les cellules matures. Historiquement, les cellules de différents organes à différents

temps gestationnels ont donc été testées pour leur capacité de reconstitution lors d'une

greffe dans des animaux receveurs irradiés. Le développement d'anticorps spécifiquement

dirigés contre des protéines de surface, utilisées comme marqueurs cellulaires, a permis la

caractérisation phénotypique et fonctionnelle des HSC au cours du développement

embryonnaire ainsi que chez l’adulte.

a/ Émergence des HSC :

Les premières cellules souches hématopoïétiques sont détectées au stade E10,5 dans des

foyers de cellules hématopoïétiques attachés à l’endothélium de l’aorte de la région AGM

(Figure 3, (15,16)). Comme dans le cas de l'hémangioblaste, les premières HSC définitives

19

dérivent de cellules endothéliales embryonnaires présentant un potentiel hémogénique,

appelées les cellules endothéliales hémogéniques (HEC, hematopoietic endothelial cell).

Seulement certaines cellules endothéliales formant l’aorte sont des HEC qui présentent des

marqueurs endothéliaux (CD31) mais aussi hématopoïétiques (Sca1). Les HEC subissent

une transition morphologique et moléculaire, passant d’une forme endothéliale aplatie à

une cellule hématopoïétique ronde exprimant les marqueurs CD31+ Sca1+ Kit+ CD41+. Ce

mécanisme de transition d’une cellule endothéliale vers une cellule hématopoïétique est

appelé EHT (Endothelium to Hematopoietic Transition) (17,18), pour revue (7) et est un

processus conservé entre les espèces (19–21).

Plusieurs foyers de cellules hématopoïétiques sont observés à E10,5 au niveau de l’aorte

mais seulement quelques-uns semblent présenter des HSC fonctionnelles (22).

Figure 3 : Représentation schématique du mécanisme EHT lors de la formation des HSC.

Un sous-groupe de cellules endothéliales composant l’aorte, appelées cellules endothéliales hémogéniques (HE), peuvent subir un mécanisme de transdifférenciation pour former un foyer de cellules hématopoïétiques (IAHC) composé de cellules souches hématopoïétiques (HSC). (Issue de (7)).

Les HSC sont aussi détectées à E10,5 dans d’autres lieux comme le sac vitellin et le placenta

avant leur apparition dans la circulation sanguine supposant qu’un mécanisme similaire a

lieu dans différents territoires embryonnaires (23,24).

b/ Amplification des HSC :

Les HSC formées dans les différents sites colonisent ensuite le foie fœtal à partir de E11 et y

prolifèrent entre E12 et E16 (25).

Vers E15,5 les HSC migrent vers la rate, qui est un organe hématopoïétique important chez

la souris contrairement à l’Homme, pour s’y amplifier (26,27). A partir de E17,5 les HSC

20

sont aussi détectées dans la moelle osseuse où elles résideront tout le reste de la vie adulte

Pour revues (28,29).

Les HSC fœtales sont définies par leur capacité de prolifération importante (nécessaire pour

la mise en place du système hématopoïétique adulte), contrairement aux HSC adultes qui

assurent l’homéostasie. De même les HSC fœtales présentent un cycle cellulaire actif alors

que les HSC adultes sont majoritairement quiescentes (30). Ces caractéristiques permettent

une reconstitution de l’hématopoïèse plus rapide à partir des HSC fœtales lors de greffes

compétitives (31,32). Ces capacités de prolifération sont modifiées entre 3 et 4 semaines

après la naissance ou post greffe, une fois que le système hématopoïétique est mis en place,

pour adopter les caractéristiques des HSC adultes (32).

Les HSC peuvent être enrichies par cytométrie en flux sur la base de l’absence de certains

marqueurs de surface présents sur les cellules matures et de la présence d'une combinaison

d’autres marqueurs comme Sca1+ Kit+ CD45+ CD11b+ CD48- CD150+ Pour revue (33).

L’expression de certains marqueurs de surface comme CD11b et CD41, exprimés à la

surface des HSC fœtales va être modifiée durant l’acquisition des caractéristiques des HSC

adultes.

B/ Organisation de l’hématopoïèse adulte

La fonction de l’hématopoïèse adulte est la production en continu des cellules matures pour

assurer le maintien de l’homéostasie à la fois dans des conditions normales ou de stress (ex:

infections).

Historiquement, les cellules hématopoïétiques ont été classées en 4 groupes en fonction de

leur capacité d’autorenouvellement, de prolifération et de leur état de différenciation: 1-les

HSC, cellules immatures ayant une capacité d’autorenouvellement importante mais une

prolifération faible, 2-les progéniteurs hématopoïétiques (HPC) ayant une capacité

proliférative importante et pouvant se différencier vers plusieurs lignées différentes, 3-les

précurseurs, cellules immatures pouvant être identifiées sur leur morphologie et perdant

progressivement leurs capacités prolifératives pour donner les 4-cellules matures libérées

dans la circulation sanguine Pour revue (34). Le concept de cellule souche a développé la

21

vision de l’hématopoïèse en organisation hiérarchique où la HSC se différencierait en HPC

puis en précurseurs jusqu’aux cellules matures en une série d’étapes définies pour produire

la grande quantité de cellules nécessaire par jour. Cette organisation est classiquement

représentée sous la forme d’un « arbre hématopoïétique ».

1/ Caractéristiques cellulaires des cellules souches hématopoïétiques

adultes

Les HSC sont des cellules peu nombreuses (chez la souris, environ 3-4 HSC pour 105 cellules

de la moelle osseuse, pour revue (35)) localisées dans la moelle osseuse, et présentant des

caractéristiques particulières permettant leur maintien et leur différenciation (Figure 4).

L’analyse des HSC est généralement observée dans des souris transplantées pour vérifier

leur capacité d’autorenouvellement et de différenciation.

Figure 4: Les stades de différenciation des HSC. Les HSC quiescentes (phase G0 du cycle cellulaire) peuvent être activées pour entrer dans le cycle cellulaire (phase G1/S/G2/M) et permettre l'autorenouvellement et la différenciation. (Issue de (36)).

a/ Différenciation :

La différenciation cellulaire est le processus de formation d’une cellule spécialisée à partir

d’une cellule immature présentant le même matériel génétique.

22

Les HSC ont la capacité de se différencier vers toutes les cellules spécialisées du sang

incluant les érythrocytes, les mégacaryocytes, les cellules myéloïdes (monocytes,

macrophages, neutrophiles) et les lymphocytes. Les modèles de transplantation ainsi que

de nouveaux modèles d’étude utilisant des souris transgéniques ont contribué à la

compréhension du potentiel de différenciation des cellules souches hématopoïétiques.

Les mécanismes moléculaires contrôlant la différenciation seront plus amplement détaillés

par la suite.

b/ Autorenouvellement :

L’autorenouvellement, qui est la possibilité d’une cellule à se diviser en deux cellules filles

dont au moins une conserve les propriétés de la cellule mère, est une caractéristique des

cellules souches hématopoïétiques permettant de maintenir le pool des HSC constant. Deux

types de divisions peuvent être à l'origine de l'autorenouvellement. Lors d'une division

asymétrique, seulement une des 2 cellules filles conserve les caractéristiques de la cellule

mère alors que la seconde se différencie. Lors d’une division symétrique, les 2 cellules filles

obtenues peuvent présenter les mêmes caractéristiques que la cellule mère, conduisant

ainsi à une amplification des HSC. Dans le cas d’une division symétrique où les 2 cellules

filles obtenues s’engagent dans la différenciation, cela conduit à une diminution du nombre

absolu de HSC.

Plusieurs cellules présentent des capacités d’autorenouvellement à plus ou moins long

terme. Elles ont été classées en fonction de leur durée de reconstitution dans les souris

hôtes: <6 mois (Short Term-HSC, ST-HSC), >6mois (Intermédiaire) et >12 mois (Long Term

HSC, LT-HSC) Pour revues (37,38).

Une étude a pu mettre en évidence la présence d’une population LT-HSC conservant le

marqueur H2B-GFP in vivo sur une période de 22 mois. Cette population effectuerait 4

divisions symétriques pour amplifier le pool des LT-HSC avant d’entrer en phase de

quiescence (39).

23

c/ Quiescence :

Le cycle cellulaire est caractérisé par 4 phases : l’interphase G1, la phase de synthèse S,

l’interphase G2 puis la phase de mitose M. Les cellules peuvent sortir du cycle cellulaire et

entrer en phase G0 aussi appelée quiescence ou encore dormance Pour revue (36). En

utilisant l’expression du Ki67 (marqueur de prolifération) avec un intercalant de l’ADN

(Dapi), il a été montré que 70% des HSC sont en phase G0 du cycle cellulaire (40).

La quiescence est une caractéristique importante des HSC, qui permet de réguler leur

nombre et de les protéger de l’acquisition de mutation Pour revue (41,42). Il a été montré

que la résistance des HSC aux agents antiprolifératifs comme le 5 Fluorouracil (5FU) est due

à cet état quiescent Pour revue (43).

Le cycle cellulaire est un mécanisme fortement régulé, de même que l’entrée ou la sortie en

phase G0. Les cytokines sont des facteurs extrinsèques importants, dont certaines (SCF,

TPO…) ont été impliquées dans le maintien de la phase quiescente des HSC (44). De même,

plusieurs facteurs de transcription (PU.1, CEBPA) ont eux aussi été identifiés comme

régulateurs de la quiescence des HSC. Le facteur de transcription PU.1, en régulant

l’expression d’un certain nombre de régulateurs du cycle cellulaire (GFI1, E2F1, CDK1),

influence le statut du cycle cellulaire des HSC. Effectivement, le modèle murin hypomorphe

pour PU.1 présente une diminution de la quiescence des HSC. Le facteur CEBPA joue un rôle

important sur le changement de statut prolifératif à quiescent observé entre le HSC fœtales

et les HSC adultes, notamment par la régulation du facteur Mycn (45), pour revue (36).

Il a été montré que les HSC quiescentes peuvent être rapidement activées en réponse à

certains stimuli (inflammation, stimulation au G-CSF) puis retourner à leur état quiescent

une fois l’homéostasie rétablie (40,46).

2/ Modèles de hiérarchie hématopoïétique

Les étapes d'engagement précoce des HSC vers les différentes lignées sont généralement

étudiées au sein de la fraction de cellules négatives pour les marqueurs des lignées matures

tel que Ter119 (marquant les érythrocytes), B220 (les lymphocytes B), CD3 (les

24

lymphocytes T), Gr1 et CD11b (les myéloïdes), appelée fraction "lineage-negative" (LIN-).

L'utilisation de différents marqueurs de surface a permis de raffiner progressivement

l'identification de populations enrichies en cellules souches, en progéniteurs ou en

précurseurs. Il est apparu que le pool des HSC lui même est hétérogène sur le plan

fonctionnel et moléculaire Pour revues (47,48). L’utilisation de nouvelles technologies

comme le profil transcriptionnel à l’état unicellulaire, le profil chromatinien et le suivi de

différenciation à l’état homéostatique permet maintenant de suggérer que la différenciation

hématopoïétique est comparable à un continuum de progéniteurs hétérogènes ayant un

potentiel de différenciation flexible pour répondre au besoin de l’organisme (39,49,50).

a/ Modèle (pré)historique :

Les progéniteurs multipotents, présents dans la fraction LIN-Kit+Sca1+ (LSK) constituent

0,05% des cellules de la moelle. Ils sont enrichis en cellules souches et peuvent être divisés

en 3 sous-populations : Les LT-HSC, les ST-HSC et les progéniteurs multipotents (MPP). Le

système hématopoïétique est représenté comme une pyramide où les LT-HSC génèrent les

ST-HSC qui à leur tour vont donner les MPP (51,52). Le premier modèle d’hématopoïèse

décrit implique une première séparation entre les potentiels de différentiation lymphoïde

(Lymphocytes B, T et NK) et myéloïde (monocyte, granulocyte, macrophage, érythrocyte et

mégacaryocyte) avec la caractérisation des progéniteurs lymphoïdes communs (CLP)(53)

et des progéniteurs myéloïdes communs (CMP)(54). Dans ce modèle, les CMP et CLP

présents dans la fraction LIN-Sca1-Kit+ sont les premiers progéniteurs à présenter une

capacité non-multipotente de différenciation. Par la suite, les CMP se différencient en

progéniteurs granulocytaires et macrophagiques (GMP) formant les granulocytes, les

monocytes et les macrophages, et en progéniteurs érythro-mégacaryocytaires (MEP)

formant les érythrocytes et les progéniteurs mégacaryocytaires (MkP) conduisant aux

plaquettes (Figure 5A).

25

Figure 5: Modèles de l’hématopoïèse. A. Modèle hématopoïétique où la séparation des lignées myéloïdes et lymphoïdes s’effectue au niveau

des progéniteurs communs CLP et CMP. (53,54). B. Découverte du progéniteur LMPP présentant un potentiel myéloïde et lymphoïde sans capacité

érythroïde-mégacaryocytaire. (55–57).

b/ Vers des modèles de continuum :

Par la suite, l'utilisation de marqueurs additionnels et d'autres tests fonctionnels ont

conduit à remettre en question la proximité de certaines lignées. Par exemple, les cellules

érythroïdes, mégacaryocytaires et myéloïdes ne semblent pas aussi proches les unes des

autres. L’identification d’un progéniteur LMPP (55) présentant une capacité de

différenciation à la fois lymphoïde et myéloïde (en CLP et GMP sans passer par le

progéniteur CMP) avec une faible capacité de différenciation érythroïde et

mégacaryocytaire (56)(Figure 5B) suggère une séparation précoce entre les lignées

lymphoïdes/myéloïdes d'un côté et les lignées érythro/mégacaryocytaires d'un autre (57).

Dans ce modèle, il a été proposé que les MEP dérivent directement des ST-HSC.

Au cours de la dernière décennie, le compartiment des LSK a été divisé en sous-populations

sur la base de l’expression de marqueurs de surface : CD150, CD34, CD48 et CD135 (40)

associé à une caractérisation fonctionnelle in vivo et in vitro. A ce jour, une nomenclature

impliquant l'existence d'au moins 5 populations est largement utilisée pour réaliser les

26

analyses fonctionnelles. Ainsi, on peut identifier les HSC (LT-HSC), les MPP1 (ST-HSC), les

MPP2, les MPP3 et les MPP4 (aussi appelés LMPP, (55)) (Tableau 1, (58)).

Tableau 1 : Combinaison de marqueurs de surface pour identifier les progéniteurs hématopoïétiques

murins et humains.

Les HSC, MPP1-2 présentent une capacité de différenciation multipotente mais diffèrent sur

leur capacité d’autorenouvellement/reconstitution à long-terme in vivo et de prolifération.

Un biais de différenciation est observé pour les MPP3 vers la lignée myéloïde et pour les

MPP4 vers la lignée lymphoïde.

Au cours des dernières années, les analyses fonctionnelles de "lineage-tracing" in vivo

(49,59), de transplantation à l'état unicellulaire des HSC (60,61) ainsi que les

caractérisations moléculaires à l’état unicellulaire (ex: transcriptome, (50,61,62)) tendent à

montrer que l’engagement des HSC dans la différenciation vers une lignée se ferait de façon

précoce et graduelle et serait associée à un continuum de capacités d’autorenouvellement,

de multipotence et de différenciation Pour revues (47,48).

Ainsi, la notion de bipotentialité des progéniteurs LIN-Sca1+Kit+ au sein des compartiments

CMP, GMP et MEP a été remise en cause. En effet, les progéniteurs CMP semblent en fait être

Murin Humain

LT-HSC LSK+ CD150+CD34-CD48-CD135- LIN-Kit+CD34+CD38-CD90+CD45RA-

MPP1 LSK+ CD150+CD34+CD48-CD135-

LIN-Kit+CD34+CD38-CD90-CD45RA- MPP2 LSK+ CD150+CD34+CD48+CD135-

MPP3 LSK+ CD150-CD34+CD48+CD135-

MPP4 LSK+ CD150-CD34+CD48+CD135+

CLP LIN-Sca1low

Kit+CD135+IL7R+CD34+CD25+ LIN-Kitlow

CD34+CD38+CD90-CD45RA-

CMP LIN-Sca1-Kit+CD16/32low

CD34+ LIN-CD34+CD38+CD90-CD45RA-IL3Rlow

GMP LIN-Sca1-Kit+CD16/32+CD34+CD150- LIN-CD34+CD38+CD90-CD45RA-IL3+

MEP LIN-Sca1-Kit+CD16/32-CD34-CD150+ LIN-CD34+CD38+CD90-CD45RA-IL3-

27

une population hétérogène composée de progéniteurs déjà engagés vers une lignée (soit

érythro-mégacaryocytaire soit myéloïde ; (50,62,63)). De même, les MEP définis dans le

premier modèle présentent un programme transcriptionnel exclusivement érythroïde,

suggérant qu'ils sont en très grande majorité composés des progéniteurs érythroïdes et non

mégacaryocytaires (50). Ces différentes analyses ont suggéré que l’engagement vers une

lignée se fait bien plus précocement qu’initialement proposé (Figure 6A).

Figure 6 : Évolution du modèle hématopoïétique.

A. La séparation entre les différentes lignées s’effectue plus précocement (50,62). Remise en cause des progéniteurs multipotents du compartiment des LIN-Sca1-Kit+ (CMP, MEP).

B. Ce modèle de différenciation hématopoïétique est basé sur le modèle de Waddington (1957). Le développement d’une cellule immature (HSC) peut être conceptuellement representé par une balle au sommet d’une montagne, qui va être déviée vers la gauche ou la droite (engagement vers une lignée) jusqu'à atteindre la vallée qui correspond aux cellules matures (D’après de (49)).

Le développement de modèles murins permettant de suivre la capacité de différenciation

des HSC à l’état homéostatique a lui aussi grandement contribué à l’évolution du modèle

hématopoïétique (49). Le progéniteur commun aux lignées monocytes et granuleux (GMP)

a été confirmé dans ce modèle, en revanche le progéniteur commun aux érythrocytes et

mégacaryocytes (MEP) n’a pas été identifié. Les progéniteurs MPP3 se différencient

28

principalement vers les lignées érythroïdes et myéloïdes alors que les MPP4 conservent une

différenciation lympho-érythro-myéloïde. Les MPP2 semblent produire majoritairement la

lignée mégacaryocytaire (63) et conserver une capacité multipotente restreinte. De plus,

dans ce modèle une partie des LT-HSC se différencierait directement en progéniteur

mégacaryocytaire sans passer par les différents intermédiaires du compartiment MPP

(Figure 6B).

3/ Myélopoïèse :

Les cellules myéloïdes sont composées des granulocytes, monocytes, macrophages et

cellules dendritiques jouant un rôle élémentaire dans l’immunité. Elles sont présentes dans

la circulation sanguine, le système lymphatique, certains tissus et sont rapidement

mobilisées par chimiotactisme sur un lieu endommagé ou infecté. A l’état non

inflammatoire, elles participent au développement et à la réparation tissulaire. Toutes ces

cellules dérivent d’un progéniteur commun (49,54). Une séparation entre les granulocytes

et les autres cellules est observée avec les progéniteurs monocyte/macrophage et cellules

dentritiques (MDP) et aux progéniteurs granulocytaires. Les progéniteurs MDP vont donner

lieu aux progéniteurs monocytaires communs (cMoPs) et aux précurseurs communs des

cellules dendritiques (CDP, (64)).

a/ Monocyte et macrophage :

La monopoïèse, régulée principalement par le facteur de transcription PU.1, et les cytokines

M-CSF et IL34, permet la formation des monocytes. Une forte expression de PU.1 va activer

les gènes spécifiques comme IRF8, KLF4, CD115 (récepteur au M-CSF) et inhiber les facteurs

de transcription spécifiques d’autres lignées comme GATA1, GATA2 ou encore CEBPA. Les

monocytes localisés dans la circulation sanguine jouent un rôle essentiel dans

l’inflammation ainsi que la régulation du nombre de certains pathogènes. Ils peuvent

infiltrer les tissus en traversant l’endothélium vasculaire et se différencier en macrophages.

Monocytes et macrophages sont de grosses cellules arrondies présentant un noyau excentré

29

et des vacuoles dans le cytoplasme. Leur rôle est de phagocyter les débris cellulaires ainsi

que les agents pathogènes. Ces cellules expriment les marqueurs Gr1+ F4/80+ (64).

La durée de vie d’un macrophage peut aller de plusieurs mois à plusieurs années.

b/ Les cellules dendritiques :

Les cellules dendritiques (DC) sont des cellules présentatrices d’antigènes permettant la

mise en place de l’immunité adaptative. Elles sont présentes dans les différents tissus

lymphoïdes tels la rate, les ganglions lymphatiques et la moelle osseuse.

La différenciation vers la lignée dendritique est dépendante des facteurs de transcription

PU.1, GFI1 et CBFB.

Les cellules dendritiques ont une durée de vie allant de 3 à 6 jours.

c/ Granulocytes :

Les granulocytes sont les cellules myéloïdes les plus représentées du système sanguin et

sont composées des neutrophiles, basophiles et éosinophiles. Elles dérivent du progéniteur

granulocyte/monocytaire commun (GMP) et expriment les marqueurs CD11b+ et Gr1+. La

granulopoïèse est dépendante des facteurs de transcription PU.1, CEBPA, GATA2 et des

cytokines GM-CSF et G-CSF.

Les neutrophiles, formés dans la moelle osseuse, sont attirés par les macrophages sur un

lieu endommagé ou infecté pour aider à l’élimination du pathogène par phagocytose.

Les éosinophiles sont principalement localisés dans les tissus et participent à l’homéostasie

tissulaire et immunitaire.

Les basophiles circulent dans le sang et jouent un rôle important dans la réponse

inflammatoire et les réactions allergiques.

30

4/ Mégacaryopoïèse :

a/ Généralités :

La mégacaryopoïèse est le processus de synthèse des mégacaryocytes (Mk) à partir de la

cellule souche hématopoïétique et qui se finit par la plaquettogenèse conduisant à la

libération des plaquettes sanguines dans le sang circulant.

Les plaquettes sanguines sont de petites cellules (2 à 5 microns) anucléées présentes dans

la circulation sanguine et qui proviennent de la fragmentation du cytoplasme des

mégacaryocytes, cellules rares et polyploïdes présentes dans la moelle osseuse. Les

plaquettes ont une durée de vie très courte (7 à 9 jours) et sont renouvelées chaque jour

(10.000 nouvelles plaquettes par jour chez l’Homme) pour maintenir leur nombre constant.

La diminution de leur nombre est appelée thrombopénie et engendre un risque élevé

d’hémorragie tandis qu’une augmentation est appelée thrombocytose, pouvant provoquer

des risques de thrombose (obstruction des vaisseaux sanguins). Elles jouent un rôle

primordial dans divers processus biologiques comme l’homéostasie, la cicatrisation,

l’angiogenèse, l’inflammation et l’immunité innée.

Lors d’un endommagement des vaisseaux sanguins, des cellules endothéliales induisent

l'expression du facteur Von Willebrand qui est reconnu par les plaquettes via un complexe

de glycoprotéines composé des molécules CD41, CD61 et CD42 présentes à leur surface.

Cela permet ainsi la formation d'un agrégat plaquettaire qui participe à la réparation

vasculaire indispensable pour l’homéostasie du système vasculaire.

Il a été démontré qu’en cas de thrombopénie, l’état inflammatoire peut engendrer des

hémorragies et des chocs septiques augmentant le risque de mortalité (65,66).

Il est donc primordial de maintenir un niveau constant de plaquettes à l’état homéostatique

et de pouvoir rapidement restaurer l’homéostasie plaquettaire en cas de thrombopénie.

La mégacaryopoïèse peut être schématiquement décrite en trois grandes étapes (Figure 7) :

1-engagement et prolifération des progéniteurs mégacaryocytaires

2-maturations nucléaire et cytoplasmique des mégacaryocytes

31

3-formation et libération des plaquettes dans la circulation sanguine.

Figure 7 : La mégacaryopoïèse La mégacaryopoïèse est composée de 3 étapes : L’engagement d’une cellule souche hématopoiètique vers les progéniteurs mégacaryocytaires (MkP), la maturation (nucléaire et cytoplasmique) jusqu’à la libération des plaquettes dans la circulation sanguine.

b/ Origine des progéniteurs mégacaryocytaires

Notre compréhension de l'origine des progéniteurs mégacaryocytaires a fortement évolué

depuis une 20aine d'années et reste l'objet d'intenses discussions. Dans le modèle

historique impliquant des étapes discrètes d'engagement des HSC dans la différenciation,

les progéniteurs mégacaryocytaires (MkP) dérivent des MEP qui eux-mêmes proviennent

des CMP (54). Quelques années après, une étude a suggéré que les MEP dérivent

directement des ST-HSC (56).

Par la suite, de nombreux facteurs communs au développement des HSC et des Mk ont été

mis en évidence et incluent des récepteurs membranaires (ex : MPL, CD150, CD41), des

voies de signalisation (ex : MPL, Notch) et des facteurs de transcriptions (ex : RUNX1, TAL1,

32

GATA2, GATA1) (56,57,67,68). Ces similarités moléculaires et phénotypiques ont conduit à

l’hypothèse d’un lien directe entre les HSC et la lignée mégacaryocytaire.

L’équipe de Sanjuan-Pla a observé qu’une partie des LT-HSC (60%) expriment le marqueur

Facteur Von Willebrand (vWF), une protéine impliquée dans l’agrégation des plaquettes et

présente sur les mégacaryocytes (69). Ces LT-HSC vWF positives présentent une capacité

de différenciation mégacaryocytaire, une capacité d’autorenouvellement à très long terme

ainsi que la capacité de former toutes les lignées cellulaires contrairement aux HSC vWF

négatives qui montrent un engagement préférentiel vers la lignée lymphoïde. La grande

majorité des LT-HSC du foie fœtal au stade E14,5 (LSK+CD48-CD150+) expriment aussi le

marqueur vWF. Il a été proposé que ces LT-HSC biaisées-Mk sont au sommet de la

hiérarchie hématopoïétique (69). En effet l’analyse de l’hématopoïèse à l’état

homéostatique a aussi confirmé qu’une partie des LT-HSC se différencient directement en

progéniteur mégacaryocytaire et que ces HSC « engagées » conservent une capacité

multipotente lors de transplantation dans des souris hôtes (49).

Une autre étude a montré qu’en cas de stress induit par des infections, certaines HSC

présentant un biais de différentiation vers la lignée mégacaryocytaire vont très rapidement

former des plaquettes sans passer par les différents intermédiaires MPP, CMP, MEP pour

conserver leur nombre constant. Cette voie permet une production rapide et importante de

plaquettes. Les SL-MkP contribuent faiblement à la mégacaryopoïèse à l’état homéostatique

et semblent utilisés principalement en cas de besoin urgent (70).

Ainsi, la mégacaryopoïèse pourrait être une voie de différenciation native des HSC (49) qui

pourrait avoir une origine dans le rôle essentiel de la mégacaryopoïèse au cours du

développement embryonnaire précoce.

c/ Maturation des mégacaryocytes

Les progéniteurs mégacaryocytaires (MkP) expriment des marqueurs immatures LIN-, Kit+,

CD34low, CD150+ et des marqueurs plus spécifiques de la lignée Mk comme le CD41 et le

CD61. Ces progéniteurs sont des cellules diploïdes (2n) qui prolifèrent dans la moelle

osseuse pour se renouveler de la même façon que les autres cellules hématopoïétiques. Les

33

MkP maturent en mégacaryoblastes qui vont devenir polyploïdes avec un contenu en ADN

pouvant aller de 4n à 128n (ploïdie modale: 16n chez l’Homme et la souris) sous la forme

d'un noyau polylobé.

La polyploïdie des Mk résulte de cycles d’endomitose associés à un défaut de karyokinèse

(pas de séparation des noyaux) et un défaut de cytokinèse (pas de séparation des 2 cellules

filles) (Figure 8).

Figure 8 : Processus d’endomitose lors de la mégacaryopoïèse. Le progéniteur mégacaryocytaire entre en mitose, il y a duplication du matériel génétique (passant de 2n à 4n), séparation des chromosomes aux 2 pôles de la cellule mais un défaut de karyokinèse (pas de séparation des noyaux) et un défaut de cytokinèse (pas de séparation des 2 cellules filles) entraînent la formation d’une cellule dont le matériel génétique est de 4n et dont le noyau forme 2 lobes. Cette étape de mitose incomplète peut se répéter jusqu'à former une cellule dont le matériel génétique atteint 128n. (Issue de (71))

Ainsi, dans les progéniteurs MkP qui entrent en endomitose, les chromosomes ségrégent

aux 2 pôles de la cellule mais la formation de la membrane nucléaire est incomplète

(observation de pont nucléoplasmique) ce qui engendre un noyau polylobé. La cytokinèse

est également incomplète aboutissant à la formation d’une cellule où le matériel génétique a

34

doublé. La survenue de plusieurs cycles consécutifs de ce type génère des cellules

polyploïdes de grande taille pouvant aller jusqu'à 100uM (72,73), pour revue (71).

Au cours de cette maturation des récepteurs spécifiques de la lignée mégacaryocytaire sont

exprimés à la surface des cellules comme la glycoprotéine CD42 (74), associée à une perte

des marqueurs immatures comme le CD34 et Kit.

Le processus d’endomitose est accompagné d’une maturation cytoplasmique où le

cytoplasme des cellules est déformé en de longues extensions appelées proplaquettes. Un

mégacaryoblaste peut former entre 10 et 20 proplaquettes qui vont se fragmenter pour

libérer les plaquettes dans la circulation sanguine en nombre suffisant pour le

renouvellement homéostatique (Figure 9). La mégacaryopoïèse est un processus pouvant

durer de 8 à 10 jours.

Figure 9 : Processus de mégacaryopoïèse.

La mégacaryopoïèse « classique » est caractérisée par la formation de proplaquettes et est dépendante de la thrombopoiétine (TPO). Ce mécanisme est mis en place à l’état homéostatique pour une production de plaquettes constante. La mégacaryopoïèse par rupture de la membrane est dépendant de l’IL-1a et est mis en place en période de stress. Ce dernier mécanisme produirait beaucoup plus de plaquettes pour répondre à une demande accrue. (Issue de (75)).

La thrombopoiétine (TPO) est une cytokine majeure de la mégacaryopoïèse, qui sera

présentée plus en détail par la suite. La mégacaryopoïèse est aussi dépendante de facteurs

de transcription, dont GATA1, impliqué dans la différentiation mégacaryocytaire et NFE2,

régulant la formation des proplaquettes Pour revue (76).

35

En cas de thrombopénie, un autre mécanisme est mis en place pour répondre au besoin

rapide de plaquettes.

Ce mécanisme qui semble indépendant de la TPO et de la formation des proplaquettes,

permet de produire un grand nombre de plaquettes fonctionnelles en peu de temps. Ce

mécanisme régulé par l’interleukine 1a (IL1a) permet de modifier la stabilité membranaire

du mégacaryoblaste et conduit à la formation de plaquettes, en nombre 20 fois supérieur

par rapport au mécanisme classique (Figure 8), (75).

Un équilibre entre TPO et IL1a semble donc contrôler la mégacaryopoïèse et permettre une

production en fonction d'un besoin de plaquettes à l'homéostasie ou en condition de stress.

d/ Différence fœtal et adulte

Les Mk sont détectés très tôt au cours du développement, au stade E7,5 chez la souris, et les

plaquettes sont observées dans la circulation sanguine vers E10,5. La mégacaryopoïèse

diffère au cours de l’ontogenèse. Dans le foie fœtal, le potentiel mégacaryocytaire est

observé à partir du compartiment des cellules souches et du compartiment des

progéniteurs alors que chez l’adulte il dérive principalement du compartiment souche

(Figure 10, (77)).

Figure 10 : Différenciation hématopoïétique fœtale et adulte.

36

De plus certaines caractéristiques cellulaires et moléculaires diffèrent. Les Mk fœtaux sont

de petite taille et ont une ploïdie moyenne moins élevée que la ploïdie des Mk adultes. Leur

taille et ploïdie vont augmenter au cours des différents stades du développement pour

atteindre les caractéristiques des Mk adultes vers l’âge de 4 ans chez l’Homme. La capacité

proliférative des Mk fœtaux est largement supérieure aux Mk adultes, mais ils forment 3

fois moins de proplaquettes et donc de plaquettes (78). Ces caractéristiques peuvent être

corrélées aux changements transcriptionnels observés au cours de l’ontogenèse

mégacaryocytaire sur le cycle cellulaire, l’expression de facteurs de transcription (NFE2,

GATA1) et de régulateurs mégacaryocytaires spécifiques (influençant la maturation

mégacaryocytaire) (79).

C/ Régulation de l’hématopoïèse :

Le nombre des cellules souches hématopoïétiques résulte d'un équilibre entre quiescence,

autorenouvellement et différentiation. L'équilibre entre ces propriétés varie en fonction du

stade de développement et du besoin en cellules matures et est contrôlé par des facteurs

extrinsèques (également appelés « niche hématopoïétique ») et intrinsèques.

1/ La niche hématopoïétique :

La niche hématopoïétique est composée de différentes cellules assurant des fonctions

régulatrices distinctes Pour revue (80).

Les avancées technologiques d’imagerie cellulaire ont permis de visualiser les HSC et leurs

cellules avoisinantes dans la moelle osseuse. L’implication des cellules dans la régulation

des HSC a ensuite été validée à l’aide de modèles d’inactivation conditionnelle permettant

de cibler spécifiquement certaines populations entourant les HSC.

Les cellules périvasculaires ou péricytes, sont des cellules encerclant les vaisseaux sanguins.

Il existe différents péricytes classées sur l’expression des marqueurs de surface NG2+ et

37

LepR. Un groupe de péricytes exprimant fortement la cytokine CXCL12, appelées cellules

CAR (CXCL12-abundant reticular) est fréquemment retrouvé près des cellules souches (81).

Les cellules de Schwann (82), les nerfs sympathiques, les ostéoclastes, les cellules endothéliales,

les macrophages, les neutrophiles, les lymphocytes T CD4+ et les mégacaryocytes font partie

des cellules fréquemment retrouvées près des HSC et ont été associées à leur régulation

(83), pour revue (80).

Différentes niches ont été observées dans la moelle osseuse adulte : la niche artériolaire où

les HSC sont situées à proximité des artérioles et la niche sinusoïde, dont la composition

cellulaire varie. La niche artériolaire présente des péricytes NG2+, des cellules de Schwann

(82,84) ainsi que des nerfs sympathiques. La niche sinusoïde est composée de péricytes

LepR+ et de cellules CAR (Figure 11) Pour revues (80,85).

Figure 11 : Organisation spatiale des cellules dans la moelle osseuse.

Les cellules souches hématopoïétiques sont localisées dans la moelle osseuse dans différentes niches : la niche artériolaire composée des péricytes NG2+ et la niche sinusoïdale avec les péricytes LepR+ (Issue de (85)).

38

Ces deux niches joueraient un rôle différent sur la régulation des HSC. La niche artériolaire

serait associée à la maintenance des HSC, en régulant notamment leur statut cellulaire

(quiescentes) et leur mobilisation. En effet, la déplétion des péricytes NG2+ induit l’entrée

en cycle des HSC ainsi que leur mobilisation réduisant ainsi leur capacité de repopulation à

long terme (86).

Plus récemment, il a été montré que ces différentes niches étaient associées à différents

sous-types de HSC. La niche sinusoïdale, composée aussi de mégacaryocytes, serait la niche

préférentielle des cellules souches vWF+ (HSC qui présentent un biais vers la lignée

mégacaryocytaire et myéloïde et pouvant redonner toutes les cellules (69) alors que la

niche artériolaire régulerait les HSC vWF- (HSC associée aux lignées lymphoïdes)(87).

Les cellules de la niche hématopoïétique vont sécréter des facteurs solubles ou interagir

physiquement avec les cellules souches hématopoïétiques pour moduler l’expression des

gènes et influencer leur devenir.

2/ Communication entre HSC et cellules de la niche : les voies de

signalisation

De nombreuses voies de signalisation médient l'interaction des cellules hématopoïétiques

avec leur environnement. Les voies de signalisation sont fréquemment activées par

l’interaction entre deux protéines qui peuvent être un récepteur et son ligand. Ces ligands

peuvent être des molécules transmembranaires, impliquant que l'activation de la voie de

signalisation nécessite un contact entre 2 cellules comme pour la voie de signalisation

Notch. D'autres sont des molécules solubles comme les cytokines. Les voies de signalisation

impliquent généralement une succession d’intermédiaires et conduisent fréquemment à la

modulation de l’expression des gènes.

39

a/ Contact cellule-cellule, exemple de la voie Notch :

La signalisation de la voie Notch nécessite l’interaction entre 2 cellules via un récepteur et

son ligand, tous deux transmembranaires. Chez les mammifères il existe 4 récepteurs Notch,

NOTCH1 à NOTCH4 et 5 ligands, Jagged1, Jagged2, Delta-like1, Delta-like2, Delta-like4. La

partie extracellulaire du récepteur interagit avec son ligand, ce qui va entraîner une

succession de modifications et de clivages de la partie intracellulaire de NOTCH permettant

la libération du fragment NICD (Notch Intra Cellular Domain). Ce fragment va être

transporté dans le noyau et interagir avec un complexe protéique incluant RBPJ et MAML1

pour moduler l’expression de ces gènes cibles (HES1, GATA2…). En absence d’activation de

NOTCH, RBPJ interagit avec des co-represseurs comme SMRT, SHARP ou OTT1 pour inhiber

leur expression.

La voie Notch a été impliquée dans l’établissement et le maintien des HSC au cours de

l’ontogenèse hématopoïétique. Le ligand Jagged1, exprimé par les cellules endothéliales de

la moelle osseuse, participe à l’autorenouvellement des HSC adultes à l’état homéostatique

mais aussi à leur capacité régénérative (88), pour revue (89).

La génération des HSC au cours de l’embryogenèse (au stade E10,5 chez la souris) ainsi que

leur capacité multipotent est dépendante de la voie de signalisation Notch (90,91).

La voie Notch est aussi impliquée dans l’engagement hématopoïétique vers la lignée

lymphocytaire T Pour revue (92) et mégacaryocytaire (93).

b/ Facteur soluble et récepteur, exemple de la TPO :

Les cytokines sont des protéines produites par différentes cellules, pouvant agir sur

plusieurs cellules cibles dont la cellule sécrétrice (action autocrine), localement (action

paracrine) ou à distance (effet endocrine). Les cytokines peuvent avoir un effet redondant

(exercer la même action biologique), agir en synergie ou encore avoir des effets

antagonistes. Elles permettent la communication intercellulaire, sans contact entre les

cellules via la fixation à un récepteur.

La liaison des cytokines sur leurs récepteurs spécifiques va induire un signal intracellulaire.

40

Des études récentes ont montré qu’une grande variété de cytokines pouvait agir sur les

HSC tel SCF, TPO, CXCL12, CXCL4, TGFB, G-CSF…

La TPO est une cytokine largement impliquée dans la mégacaryopoïèse (engagement et

prolifération des progéniteurs mégacaryocytaires et influençant leur ploïdie) mais aussi

dans le maintien des HSC dans la moelle osseuse (94,95). Elle est synthétisée

principalement par le foie et se fixe sur son récepteur MPL présent sur les HSC, les

mégacaryocytes et les plaquettes. Le récepteur MPL ne possède pas d’activité kinase

intrinsèque mais s'associe avec des tyrosines kinases dont la protéine JAK2. La TPO en se

fixant à son récepteur MPL, entraîne sa dimérisation, un changement de conformation et le

rapprochement des protéines JAK qui vont s’activer par transphosphorylation et

phosphoryler les résidus tyrosines du récepteur. Cela conduit ensuite à l'induction de

plusieurs voies de signalisation incluant: JAK/STAT, PI3K/AKT et ERK/MAPK (Figure 12).

Figure 12 : Voie de signalisation de la TPO. La TPO en se fixant à son récepteur MPL entraîne sa dimérisation, un changement de conformation, le rapprochement des protéines JAK qui vont s’activer par transphosphorylation et phosphoryler les résidus tyrosines du récepteur. Plusieurs voies vont être activées : la voie JAK/STAT, PI3K/AKT et ERK/MAPK. (D’après (96)).

Exemple d’activation : la voie JAK/STAT. Il existe 4 membres de la famille JAK : JAK1 à 3 et

TYK2. Ces tyrosines kinases sont associées à la partie cytoplasmique des récepteurs

41

membranaires sans activité kinase. Les protéines de la famille STAT (STAT1 à 6 dont

STAT5a et STA5b) vont s’associer au récepteur phosphorylé et être phosphorylées par les

protéines JAK. Leur phosphorylation entraîne leur dimérisation puis leur migration dans le

noyau pour réguler l’expression de leurs gènes cibles (97).

La TPO induit l’activation de STAT3, STAT5a et STAT5b (98,99). STAT3 jouerait un rôle

dans l’expansion des progéniteurs mégacaryoblastiques (96), tandis que STAT5a et b

joueraient un rôle dans la formation des plaquettes, puisque les souris STAT5(a et b)-/-

présentent une thrombopénie (100).

c/ Exemple de la voie Sonic Hedgehog

Une autre voie activée par des molécules secrétées est la voie Sonic Hedgehog qui joue un

rôle au cours de l’embryogenèse en participant à la mise en place de différents tissus (tube

neural, poumons, peau…). Cette voie a aussi été impliquée dans la régulation des cellules

hématopoïétiques primitives via les protéines BMP dont BMP4 (101).

Il existe 3 ligands chez les vertébrés : Desert Hedgehog (DHH), Indian Hedgehog (IHH) et

Sonic Hedgehog (SHH), et deux récepteurs : PTCH1 et SMOH.

En absence de ligand, PTCH1 réprime l’activité de SMOH. Lorsque que SHH se lie à PTCH1,

cela induit l’internalisation du récepteur, la levée de la répression de SMOH et l’activation

des facteurs de transcription de la famille GLI. Les facteurs GLI migrent alors dans le noyau

pour réguler l’activité des gènes cibles de la voie (gènes HOX, BMP, BCL2, PDGFRA…).

In fine, cette voie participe à la prolifération et à la différenciation cellulaire. Elle est

principalement active au cours du développement embryonnaire et réprimée dans les

cellules adultes en dehors des progéniteurs immatures. Il a été montré que cette voie

participe au développement leucémique via une activation anormale Pour revue (102).

3/ Régulation transcriptionnelle :

La régulation transcriptionnelle de l’hématopoïèse implique plusieurs niveaux, incluant le

niveau d'expression des facteurs de transcription, la régulation de leur activité par des

42

mécanismes post-traductionnels, mais également leur accessibilité à l'ADN contrôlée par

l’organisation épigénétique de la chromatine.

a/ Facteur de transcription et complexe transcriptionnel

La découverte de l’activité ARN polymérase remonte aux débuts des années 1960, avec la

première synthèse in vitro d’un brin d’ARN complémentaire à la matrice ADN, ce qui a initié

la recherche de la régulation transcriptionnelle. La transcription des ARN messagers par

l’ARN polymérase PolII nécessite qu'elle soit guidée sur le locus à transcrire par des

facteurs de transcription liant spécifiquement l'ADN et nécessite également le recrutement

de facteurs généraux de la transcription Pour revue (103).

Les facteurs de transcription se fixent à des régions de l'ADN appelées promoteurs ou

"enhancers" Pour revue (104).

Les promoteurs sont les régions sur lesquelles la machinerie transcriptionnelle se fixe pour

initier la transcription du gène. Elles sont généralement situées juste en amont du gène et

permettent de définir le site d'initiation de la transcription ou Transcription Start Site (TSS).

Les enhancers sont des régions régulatrices de la transcription qui influencent l’activité

transcriptionnelle des promoteurs (Figure 13). Les enhancers peuvent être localisés à

plusieurs dizaines (voir centaines) de kilobases des gènes/promoteurs ciblés (cette

localisation varie en fonction du type cellulaire) et plusieurs enhancers peuvent réguler

l'expression d'un seul gène. Les enhancers présentent généralement des sites de liaison de

nombreux facteurs de transcription.

La différenciation des progéniteurs hématopoïétiques vers les différentes lignées est

associée à l’activation de programmes transcriptionnels régulés par des facteurs ou

combinaisons de facteurs de transcription spécifiques d’une lignée incluant, par exemple,

les facteurs GATA1, PU.1 et CEBPA Pour revue (29).

43

Figure 13 : Activation de la transcription par les facteurs de transcriptions. Les facteurs de transcription, en se fixant sur leur site de liaison (promoteur, enhancer), vont recruter la machinerie transcriptionnelle et moduler l’expression des gènes. (Issue de (105))

Le facteur de transcription GATA1 appartient à une famille de 6 membres (incluant GATA2

et GATA3 également exprimé dans le système hématopoïétique) qui possèdent un domaine

de liaison à l’ADN sur des séquences consensus de type (A/TGATAA/G) et un domaine de

transactivation permettant la transcription de ces gènes cibles. GATA1 est essentiel pour la

différenciation érythroïde, mégacaryocytaire et des éosinophiles. Pour la lignée

mégacaryocytaire, il a été montré qu’une absence de GATA1 était associée à une

prolifération des progéniteurs mégacaryocytaires dont la ploïdie est diminuée et présentant

un défaut de formation des proplaquettes. Au niveau transcriptionnel, les gènes clés

spécifiques de la lignée mégacaryocytaire comme NFE2, GP1bA (CD42b) et PF4 sont

fortement diminués en absence de GATA1 Pour revue (106).

Le facteur PU.1 (fréquemment appelé SPI1) est un facteur déterminant pour le

développement de différentes lignées myéloïdes et lymphoïdes. Son niveau d’expression

influence l’engagement vers une lignée par rapport à l’autre où une expression importante,

intermédiaire ou faible est associée aux macrophages, lymphocytes B ou les cellules

érythroïdes et mégacaryocytaires respectivement Pour revue (107). De même, il a été

enhancer'

enhancer'

enhancer'

44

montré qu’une faible expression de PU.1 dans les HSC adultes murines engendre une perte

de la quiescence des HSC et une augmentation de leur prolifération (108).

Le facteur CEBPA influence la différenciation myéloïde notamment granulocytaire et

macrophagique en régulant des gènes spécifiques de ces lignées et en bloquant la

prolifération cellulaire Pour revue (109). Une étude récente implique directement CEBPA

dans l’engagement de toutes les lignées myéloïdes (110). La perte de CEBPA dans les HSC

adultes est associée à une réactivation du programme transcriptionnel fœtal ainsi qu’à une

augmentation de leur prolifération (45) supposant un rôle de CEBPA dans la régulation de

l’état quiescent des HSC adultes.

Les facteurs de transcription peuvent agir de concert au sein de complexe (111,112). Un

complexe nommé « heptad » composé des facteurs SCL, GATA2, RUNX1, ERG, LYL1, LMO2 et

FLI-1 influence l’expression des gènes importants pour l’émergence, le maintien et la

prolifération des cellules souches hématopoïétiques. L’inactivation complète de Gata2

(Gata2-/-), Runx1 (Runx1-/-) et à l’état hétérozygote de ces 2 gènes (Gata2+/- Runx1+/-)

entraîne la mort des embryons murins (112–114) suggérant que GATA2 et RUNX1

contrôlent ensemble l’expression de certains gènes importants pour le bon développement

de l’embryon.

La formation des cellules souches hématopoïétiques se fait par un processus de transition

des cellules endothéliales (mécanisme EHT). Ce processus nécessite l’expression de certain

gènes (comme GPR56) régulée par le complexe « heptad » (18).

Une variation de la composition de ces complexes transcriptionnels a également été

impliquée dans la progression de la différenciation hématopoïétique, notamment

mégacaryocytaire. GATA1 et GATA2 sont des facteurs de transcription qui reconnaissent un

motif similaire sur l’ADN. Il a été montré que GATA1 remplaçait GATA2 dans un processus

appelé « GATA switch » au cours de la différenciation (115). Dans les progéniteurs

hématopoïétiques, le complexe « heptad », composé de GATA2, lie un certain nombre de

gènes spécifiques de la lignée mégacaryocytaire. L’expression de ces gènes est fortement

augmentée dans les cellules mégacaryocytaires où le remplacement de GATA2 par GATA1 a

eu lieu (Figure 14). C’est le cas pour le gène GP1bA (CD42b) et PF4 (116).

45

Figure 14 : Régulation de la transcription via les complexes transcriptionnels. Le complexe heptad composé notamment du facteur de transcription GATA2 se fixe sur certains gènes spécifiques de la lignée mégacaryocytaire, qui vont être faiblement exprimés dans les progéniteurs hématopoïétiques (HSPC). Dans les progéniteurs mégacaryocytaires, GATA2 est remplacé par GATA1 et l’expression des gènes est fortement augmentée. Dans la lignée érythroïde le même mécanisme se met en place ainsi qu’une fixation sur de nouveaux sites. (Issue de (116)).

L’expression de certains facteurs transcriptionnels, organisés au sein de complexes, joue

donc un rôle important sur le contrôle hématopoïétique. Leur mode d’action nécessite

l’accès à leur séquence de liaison sur l’ADN.

46

b/ Organisation chromatinienne

La molécule d’ADN, d’une taille d’environ 2 mètres, est compactée au sein de complexes

nucléoprotéiques formant ainsi la chromatine, dans le noyau des cellules dont la taille est

de quelques micromètres. L’ADN s’enroule autour d’un octamère d’histones (H3, H4, H2A et

H2B), structure appelée nucléosome, via des interactions électrostatiques entre l’ADN

chargé négativement et les histones chargées positivement. L’enchaînement régulier des

nucléosomes forme le nucléofilament qui se structure, à l’aide de l’histone H1, pour former

une fibre chromosomique (Figure 15).

Figure 15 : Les différents niveaux de condensation de la chromatine. La double hélice d’ADN s’enroule autour des nucléosomes qui vont à leur tour s’organiser en fibre chromosomique puis en chromosome. (D’après le manuscrit « Biologie moléculaire de Joelle Brodeur et martin toussaint, 2006).

47

Les modifications épigénétiques peuvent affecter l’ADN ou les histones et vont influencer la

compaction de l’ADN et l’accessibilité de certaines régions aux facteurs de transcription,

participant ainsi au contrôle de l’expression génique (117), pour revues (118,119).

- Modifications épigénétiques :

Les modifications épigénétiques sont des marques biochimiques déposées par des enzymes

spécifiques sur l’ADN ou les histones. Elles sont nombreuses et ont diverses fonctions.

Les mieux caractérisées sont les groupements méthyles, apposés sur l’ADN, ainsi que les

modifications des histones comme la méthylation et l’acétylation qui seront présentées par

la suite (Figure 16).

Figure 16 : Régulation de la transcription par des modifications épigénétiques.

La méthylation de l’ADN (représentée par un rond rouge) est associée à la condensation de l’ADN et donc une répression transcriptionnelle, alors que les régions hypométhylées (rond bleu), comme les îlots CpG, sont associées à une activation transcriptionnelle. La modification des histones peut être associée à l’activation ou à la répression transcriptionnelle en fonction des histones et de la modification (ex: méthylation, acétylation) (D’après (120)).

48

La méthylation de l’ADN correspond à l’ajout d’un groupement méthyles –(CH3) sur un

résidu cytosine suivi d’une guanine, appelé dinucléotide CpG. Certaines régions promotrices

des gènes présentent un regroupement de dinucléotides CpG, appelé « îlots CpG ».

Cette modification épigénétique est régulée par des enzymes : les DNA méthyltransférases

(DNMT3a, DNMT3b, DNMT1) et est associée à un état condensé de la chromatine et donc à

une répression transcriptionnelle (Figure 16).

DNMT3a/b méthylent des sites de novo contrairement à DNMT1 qui permet la maintenance

des sites déjà méthylés pendant de la réplication. Le niveau de méthylation de l’ADN joue un

rôle dans la régulation de l’autorenouvellement des HSC ainsi que dans la différenciation,

notamment dans l’engagement vers une lignée. L’engagement myéloïde est associé à un

niveau de méthylation moins important que l’engagement vers les lignées lymphoïdes

(121). DNMT3a joue un rôle important dans la différenciation en réprimant les gènes

impliqués dans l’autorenouvellement des HSC comme RUNX1 et GATA3 (122).

La déméthylation de l’ADN s’effectue via des protéines dioxygénases comme les protéines

TET qui catalysent la conversion des 5-methylcytosines (5mC) en 5-

hydroxymethylcytosines (5hmC) Pour revue (123). Les protéines TET, dont TET2 et TET3,

travaillent en synergie avec les facteurs de transcription E2A et PU.1 pour déméthyler

l’ADN et permettre l’accessibilité de certains enhancers spécifiques de la lignée

lymphocytaire B. L’activité des protéines TET est nécessaire pour l’expression de IRF4, gène

cible de PU.1 (124).

Les modifications post-traductionnelles des histones comme la méthylation et l’acétylation

sont des phénomènes réversibles.

Le processus de méthylation des histones est dépendant de deux sortes d’enzymes: les

histones méthyltransférases et les histones déméthylases. Les lysines des histones peuvent

être mono-, bi- ou triméthylées par les histones méthyltransférases (K-methylases) et le

même résidu peut être modifié par différentes enzymes. C’est le cas de la lysine 9 de

l’histone H3 (H3K9) qui peut être modifiée par les protéines SUV39H1/2, G9a et SETD1B.

Certaines protéines n’agissent que sur un seul résidu, comme par exemple EZH2

responsable de la triméthylation de la lysine 27 de l’histone H3 (H3K27). Les histones

49

déméthylases permettent de déméthyler les histones comme la protéine JARID qui

déméthyle les lysines de l’histone H3.

L’acétylation des histones est le mécanisme de transfert d’un groupe acétyle sur certaines

lysines des histones par des acétyltransférases (HAT pour histone acétyltransférase). Cette

modification est associée à un changement de structure de la chromatine permettant ainsi

l’accessibilité des facteurs de transcription à certaines régions. La désacétylation est

effectuée par les histones désacétylases (HDAC), et est associée à une compaction de la

chromatine et une répression transcriptionnelle.

Les analyses d’immunoprécipitation de chromatine associée au séquençage (ChIPseq) ont

permis de corréler certaines marques (comme la marque H3K4me3) à l’activation de la

transcription et d'autres (comme la marque H3K27me3) à la répression de la transcription.

Parmi les marques généralement associées à l'activation transcriptionnelle, certaines (ex:

H3K4me3) sont associées préférentiellement aux promoteurs actifs et d'autres (ex:

H3K4me1 ou H3K27Ac) sont plus intenses au niveau des enhancers.

Les Super-Enhancers (SE) sont des enhancers de grande taille présentant une intensité

importante de marques H3K27Ac et H3K4me1 sur une large région chromosomique. Ces

régions sont généralement associées à la présence de nombreux facteurs de transcription et

du complexe co-activateur Mediator (dont Med12 et BRD4). Il a été montré que les SE sont

associés à des gènes clés spécifiques de l’identité cellulaire, ils sont donc très variables d'un

type cellulaire à l'autre (125). Dans les progéniteurs lymphoïdes B, les SE sont fortement

liés par le facteur PU.1 alors que dans les macrophages, les SE sont fixés par le facteur

CEBPA (126).

- Organisation chromatinienne :

Les cohésines forment un complexe multiprotéique jouant un rôle dans divers processus

biologiques comme la réplication (cohésion entre les chromatides sœurs), l’apoptose ou

encore la réparation de l’ADN (Figure 17, Pour revue (127)).

Elles participent aussi à la régulation hématopoïétique en modulant l’accessibilité de la

chromatine aux facteurs de transcription. L’utilisation de mutant des cohésines a montré

50

une fixation accrue de certains facteurs comme ERG, GATA2 et RUNX1 sur l’ADN, entraînant

une augmentation du programme transcriptionnel associé aux cellules souches et un

blocage de la différenciation dans des cellules primaires humaines (128).

Un autre rôle des cohésines a été proposé dans les interactions entre les promoteurs et les

enhancers en association avec la protéine CTCF. La formation de boucles permet le

rapprochement d’un promoteur avec un enhancer éloigné, ou au contraire une séparation

entre ces deux régions régulatrices, agissant ainsi sur la transcription (129).

Figure 17 : Le complexe de cohésines est un régulateur-clé de la transcription et de la formation de

boucle chromatinienne. Le complexe permet la cohésion entre les deux chromatides, interagit avec CTCF, forme des boucles chromatiniennes, recrute des facteurs de transcriptions et des complexes participant au contrôle de la transcription. (Issue de (127)).

L’ensemble de ces mécanismes permet une régulation fine de l’hématopoïèse. Leur

dérégulation peut engendrer un défaut de différentiation et/ou une production incontrôlée

de cellules, pouvant causer une hémopathie maligne.

51

II/ Hémopathies malignes

Le terme « hémopathie », composé des racines grecques « hémo » (sang) et « pathos » (ce

qu’on éprouve), désigne les maladies du sang et de ses composants. Les hémopathies

malignes sont diverses et les leucémies aiguës représentent généralement une forme

d’hémopathie agressive. Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) seront présentées plus en

détail ci-dessous.

A / Les leucémies aiguës myéloïdes :

1/ Classification des LAM

Les leucémies aiguës myéloïdes sont un groupe de leucémies cliniquement hétérogènes,

dues à la prolifération incontrôlée de blastes dans la moelle osseuse, pouvant engendrer

une diminution de l’hématopoïèse normale avec l’observation d’une anémie (diminution

des globules rouges), une neutropénie (diminution des globules blancs) ainsi qu’une

thrombopénie (diminution des plaquettes).

Depuis les années 1970, une classification internationale appelée FAB (pour Franco-

Américano-Britannique) est utilisée pour classer les leucémies, basée essentiellement sur la

morphologie des blastes. Dans les leucémies aiguës myéloïdes, huit sous-groupes sont

observés, notés de 0 à 7, classés historiquement sur la base de leurs statuts de

différenciation (130).

LAM0 : avec différenciation minime

LAM1 : sans maturation

LAM2 : avec maturation

LAM3 : LA promyélocytaire

LAM4 : LA myélomonocytaire

LAM5 : LA monoblastique/monocytaire

LAM6 : LA érythroïde

LAM7 : LA mégacaryoblastique

52

L’organisation mondiale de la santé (OMS, ou World Health Organization en anglais, WHO) a

progressivement intégré les données immunophénotypiques puis génétiques (c.f. infra)

pour affiner cette classification (131,132).

Il a ainsi été mis en évidence que certaines anomalies génétiques sont associées

spécifiquement à un sous-groupe FAB comme RUNX1-RUNX1T1 pour les LAM-M2, PML-

RARA pour les LAM-M3, ou encore OTT-MAL pour les LAM-M7. La recherche et la détection

de ces anomalies rendent possibles un diagnostic plus précis et l’utilisation d’un traitement

thérapeutique ciblé. Le sous-groupe des LAM-M3 présentant la mutation PML-RARA est

maintenant traité avec succès en utilisant l’acide rétinoïque (133).

2/ Anomalies génétiques des LAM

Les cellules cancéreuses sont caractérisées par des anomalies du matériel génétique (ADN)

porté par les chromosomes. Cette hypothèse découle des observations de David von

Hansemann et de Theodor Boveri sur la présence d’altérations des chromosomes dans les

cellules cancéreuses Pour revue (134).

L’observation des chromosomes et du caryotype par les approches de cytogénétique

(caryotype, fluorescent in situ hybridization: FISH) puis l'évolution des techniques de

séquençage (Sanger puis séquençage à haut débit) a ensuite permis d'identifier les

anomalies génétiques récurrentes.

Les mutations sont à la base de l’évolution des espèces. En effet, une mutation survenue

dans les cellules germinales et conférant un avantage sélectif, peut être transmise à la

descendance. Dans le cas des leucémies aiguës, les mutations apportent un avantage sélectif

aux progéniteurs hématopoïétiques (avantage prolifératif, d’autorenouvellement, de

résistance aux traitements) au détriment de la différenciation et de la production des

cellules matures et fonctionnelles, déséquilibrant ainsi l’homéostasie hématopoïétique. Les

mutations retrouvées dans les leucémies sont majoritairement somatiques (dans les

cellules hématopoïétiques). Elles sont parfois germinales (dans les cellules des gamètes)

53

comme dans le cas de pathologies familiales telles que le syndrome plaquettaire familial où

la mutation du gène RUNX1 est transmissible et prédispose au développement d’une LAM.

a/ Types d’altérations génétiques

La plupart des cellules humaines sont diploïdes (2n), c’est à dire que chaque chromosome

est représenté en deux exemplaires dans la cellule. Des anomalies de nombre peuvent être

observées avec la perte ou le gain d’un chromosome entier (ex: monosomie 7 ou trisomie

21) ou d'une région d'un chromosome (délétion ou duplication/amplification). Ces

anomalies peuvent entraîner des anomalies de dosage génique (surexpression ou sous-

expression) d’un ou plusieurs gènes. D’autres anomalies de structure fréquemment

retrouvées dans les leucémies sont les translocations chromosomiques (échange de

segments entre 2 chromosomes) et les inversions chromosomiques (échange au sein du

même chromosome).

Le développement des techniques de séquençage haut débit (NGS) a permis l’analyse de

plusieurs gènes simultanément dans un grand nombre d'échantillons tumoraux, et la

détection de mutations dites "ponctuelles" incluant les substitutions et les

insertions/délétions de petite taille, et dans certains cas, les altérations de structure

chromosomique.

Quand elles surviennent dans la séquence codante d'un gène, les mutations peuvent avoir

différentes conséquences incluant la substitution d’un nucléotide par un autre, conduisant

soit à une mutation silencieuse (mutation codant pour le même acide-aminé), une mutation

faux-sens (mutation modifiant l’acide aminé) ou une mutation non-sens (substitution par

un codon stop).

54

b/ Conséquences fonctionnelles des mutations

Les modifications génétiques qui contribuent fonctionnellement au développement

leucémique sont appelées mutations « driver » par opposition aux autres mutations dites

"passagères" Pour revue (135).

Un projet de séquençage à grande échelle des échantillons tumoraux dont le but est

l’identification des gènes directement impliqués dans la leucémogenèse a identifié une

centaine de gènes mutés dans les LAM (COSMIC,

https://cancer.sanger.ac.uk/census#cl_download). A l’état normal, ces gènes sont

impliqués dans divers processus biologiques comme les voies de signalisation (JAK2, FLT3),

la régulation transcriptionnelle (RUNX1, CEBPA), la régulation épigénétique (TET2,

DNMT3A), ou encore les cohésines (RAD21).

Les conséquences fonctionnelles de ces mutations sont variées et les plus fréquentes sont

décrites ci-dessous.

- Mutations activatrices :

Certaines mutations peuvent engendrer l’activation constitutive d’une protéine. C’est le cas

de la mutation faux-sens du gène JAK2 V617F où la substitution de la Guanine en position

1849 par la Thymine (G1849T) entraîne une modification de la séquence protéique. Cette

mutation est fréquemment retrouvée dans les hémopathies (136).

- Mutations inactivatrices :

L’inactivation de certains gènes par une grande variété de mutations (mutations

ponctuelles, délétion…) contribue à l’expansion des cellules tumorales Pour revue (137).

Ces gènes ont été nommés « gène suppresseur de tumeur » car à l’état normal ils

interviennent comme régulateurs négatifs de la prolifération cellulaire (ex : RB1, TP53). Le

premier gène caractérisé comme tel a été le gène RB1 dans les rétinoblastomes (tumeurs de

l’œil), où l’inactivation des 2 copies du gène est nécessaire pour le développement tumoral

(138). Dans certains cas, l’inactivation d’une des deux copies du gène peut

empêcher/limiter son rôle et favoriser l’apparition de cancers, il s’agit d’haplo-insuffisance.

C’est le cas du gène suppresseur de tumeur TET2 retrouvé muté dans 15% des hémopathies

55

myéloïdes mais où tous les patients ne présentent pas d’inactivation des 2 copies du gène

Pour revue (139).

- Création de gènes de fusion :

Les translocations ou les inversions chromosomiques peuvent engendrer des protéines de

fusion, protéine obtenue par la combinaison de 2 protéines différentes. C’est le cas de la

translocation t(8;21) associée aux leucémies LAM-M2 où les protéines AML1 (aussi appelée

RUNX1) et ETO sont fusionnées. La protéine AML1-ETO recrute des régulateurs

épigénétiques modifiant l’expression des gènes, dérégule les gènes cibles d’AML1 et

interfère dans le recrutement de cofacteurs essentiels pour la différentiation myéloïde

comme CEBPA et PU.1 Pour revue (140).

- Création de nouvelle fonction :

Dans ce type de mutation, la protéine issue de l’allèle muté fonctionne différemment de la

protéine physiologique. Par exemple les mutations des gènes IDH, fréquemment retrouvées

dans les LAM et autres cancers, modifient les propriétés enzymatiques de IDH1 ou IDH2.

Les protéines IDH1 et IDH2 sont des isocitrates déshydrogénases qui convertissent

l’isocitrate en Ketoglutarate. La protéine IDH1 mutée peut convertir l’Ketoglutarate

(KG) en 2-hydroxyglutarate, augmentant cette nouvelle molécule dans la cellule au

détriment de l’KG, réduisant ainsi l’activité des enzymes KG-dépendantes comme

certaines méthyltransférases (ex: TET2). Certaines mutations d'enzyme du métabolisme

pourraient donc in fine affecter la régulation transcriptionnelle et participer au

développement leucémique Pour revue (141).

- Modification du niveau d’expression :

Parmi les mutations décrites précédemment, plusieurs participent à l’altération du niveau

d’expression de gène dans les leucémies. Par exemple, l’amplification de certaines régions

ainsi que les anomalies du nombre de chromosomes comme la trisomie 21, conduisent à la

présence de trois copies de certains gènes. Le gène ERG, localisé sur le chromosome 21 est

56

fréquemment surexprimé dans les leucémies associées à un mauvais pronostic (142). Sa

surexpression dans des modèles murins conduit au développement de leucémies (143,144).

Certaines altérations modifient les régions régulatrices comme les promoteurs ou

enhancers, ce qui va avoir un impact direct sur l’expression des gènes associés. Certains

réarrangements chromosomiques, comme l’inversion du chromosome 3, sont associés à la

surexpression d’EVI1 et à l’inhibition de GATA2 dans certaines LAM. Cette dérégulation

transcriptionnelle est due au repositionnement d’un enhancer causé par la translocation

(145).

c/ Coopération oncogénique et évolution clonale

Dans certaines leucémies pédiatriques, le nombre de mutations est particulièrement faible

et suggère qu'une seule mutation driver serait nécessaire pour la transformation.

Cependant la plupart des LAM présentent plusieurs mutations « drivers » au sein d’un

même échantillon (146), pour revues (135,147).

La présence de combinaison récurrente de mutations et la modélisation de ces mutations in

vivo a ainsi conduit à la notion de coopération oncogénique. Par exemple, les mutations

activatrices du gène FLT3 (un intermédiaire de voie de signalisation), appelées FLT3-ITD,

font parties des mutations les plus récurrentes des LAM. Cependant, le modèle murin de

surexpression de Flt3 n’est pas suffisant à lui seul pour induire une leucémie aiguë.

Plusieurs coopérations ont été mises en évidence entre les mutations FLT3 et PML-RARA

pour le développement de leucémies promyélocytaires (LAM-M3) (148,149) ou une

surexpression de RUNX1, dans d'autres LAM (150).

La nécessité de l’acquisition de plusieurs mutations dans la même cellule pour le

développement tumoral est appelée « évolution clonale » Pour revue (146,151). Ce

processus peut conduire à l'apparition de différentes populations présentant diverses

combinaisons d'altérations génétiques, appelées clones. Cette hétérogénéité tumorale a des

conséquences sur l’initiation et la progression de la maladie ainsi que sur la survenue

d’éventuelles rechutes suite aux traitements.

57

Dans de nombreux cas de leucémies aiguës, l'hypothèse est que le premier évènement

mutationnel, appelé mutation initiatrice, confère un avantage compétitif aux progéniteurs

hématopoïétiques, conduisant à l'amplification d'un clone dit pré-leucémique, mais sans les

symptômes immédiats de leucémie.

Deux exemples illustrent cette hypothèse. Dans les leucémies de l'enfant, la fusion TEL1-

AML1 est retrouvée chez des jumeaux monozygotes qui peuvent développer des leucémies

avec des latences très différentes (c.f. infra). Dans les leucémies de l'adulte, les mutations

DNMT3A ou TET2 sont retrouvées chez des individus ne présentant pas de pathologie (152).

Par exemple, chez des individus présentant une LAM associant DNMT3A et NPM1 dans les

blastes leucémiques, certaines HSC présentent la mutation DNMT3A sans la mutation NPM1.

L'impact clinique de ces différences clonales pourrait être dans une réponse différente des

sous-clones aux traitements (Figure 18).

Figure 18 : Exemple d’évolution clonale de leucémie aiguë promyélocytaire (LAM-M3). Les progéniteurs hématopoïétiques acquièrent des mutations « passagères » de façon proportionnelle avec l’âge des patients (« X » représente les mutations « passagères »). La mutation initiatrice est associée à l’étape pré-leucémique qui précède l’acquisition des mutations additionnelles permettant la transformation. La présence de sous-clones ayant acquis des mutations additionnelles différentes peut générer une résistance aux traitements. (Réalisé d’après (146,151)).

58

L’association de données de séquençage et de clonalité des échantillons tumoraux à la

modélisation fonctionnelle permet ainsi de mieux comprendre la contribution de chaque

mutation (mutations initiatrices, coopératrices ou impliquées dans la progression

leucémique) sur le développement leucémique. La compréhension de cette évolution

clonale est donc un élément important d'un point de vue clinique pour évaluer les

conséquences des thérapies sur le clone fondateur ainsi que les sous-clones et limiter le

risque de rechute.

3/ Les cellules souches leucémiques

a/ Propriétés des LSC

L'observation que certains patients rechutent après traitement ainsi que les analyses de

greffe de cellules leucémiques humaines dans des souris immunodéficientes indiquent que

toutes les cellules leucémiques de patients n'ont pas les mêmes capacités et ont généré le

concept de cellules souches leucémiques "LSC".

L’existence de ces LSC a été démontrée dans des analyses de xénotransplantation dans les

années 1990. Plusieurs équipes ont montré que seule une fraction de cellules leucémiques

était capable de générer une leucémie chez ces souris. La capacité d’autorenouvellement est

observée dans des greffes secondaires, et est une propriété importante pour définir les LSC.

Ces cellules peuvent dériver des cellules souches (fraction CD34+CD38-) ou des

progéniteurs plus matures (fraction CD34-) ayant acquis certaines propriétés des HSC

(153,154).

Chez les patients la fréquence des LSC varie et peut être déterminante sur le pronostic des

leucémies. En effet, une forte fréquence de LSC au diagnostic est associée à un pronostic

défavorable (155,156).

Certaines LSC observées dans des modèles de xénotransplantation sont associées à un état

quiescent, ce qui pourrait expliquer leur résistance aux chimiothérapies classiques, qui

agissent sur des cellules prolifératives (157).

59

Le rôle du microenvironnement est aussi important pour les cellules leucémiques (158),

pour revue (159). Dans les modèles de xénotransplantation, il a été montré que les LSC

migraient très rapidement après leur injection dans des régions de la moelle osseuse

attribuées aux HSC normales et y résidaient tout au long du développement leucémique. La

diminution de l’hématopoïèse normale fréquemment observée durant la progression

leucémique, pourrait être due à une compétition entre HSC et LSC pour ce

microenvironnement (157).

Il est donc important d’étudier les cellules souches leucémiques dans l’espoir de trouver des

cibles thérapeutiques spécifiques. Les analyses transcriptionnelles (154,160) et

phénotypiques pourraient aboutir à de nouvelles stratégies. Par exemple, avec l’utilisation

d’anticorps ciblant les marqueurs de surface des LSC comme l’anti-CD33 ou l’anti-CD123.

b/ Origine cellulaire

Une partie de l'hétérogénéité génétique, phénotypique et clinique des leucémies pourrait

être due à des différences d’origine cellulaire, c’est-à-dire le type de cellule

hématopoïétique dans laquelle les mutations s'accumulent. Sur la base des expériences de

xénotransplantation des différentes sous-populations de cellules leucémiques humaines, les

leucémies pourraient dériver d'au moins deux types cellulaires : les cellules souches

hématopoïétiques ou les progéniteurs hématopoïétiques plus engagés dans la

différentiation.

L’hypothèse d’une cellule souche hématopoïétique normale comme origine de la leucémie

découle des caractéristiques similaires observées entre les HSC et les LSC, incluant une

capacité d’autorenouvellement et de maintien d'un état quiescent dans certaines conditions,

ainsi que l’expression de marqueurs de surface en commun (153).

L’hypothèse d’un progéniteur engagé comme cellule cible découle principalement des

différences phénotypiques observées chez les patients. Par exemple, l’association de la

fusion MLL-AF9 avec les LAM myélo-monoblastiques (LAM-M4) suggère l’acquisition de

60

cette altération dans un progéniteur granuleux-macrophagique (GMP) comme origine de la

maladie.

Comme les progéniteurs hématopoïétiques normaux ne possèdent pas de capacité

d’autorenouvellement à long-terme, cette hypothèse implique que les mutations drivers

restaurent/imposent une capacité d’autorenouvellement à long-terme. Certains oncogènes

comme MLL-AF9 ou MOZ-TIF2 semblent capables de cela. En effet, la transduction

rétrovirale de progéniteurs CMP ou GMP purifiés, par la fusion MOZ-TIF2, leurs confère des

propriétés d’autorenouvellement in vitro et permet le développement leucémique in vivo

(161). Pour d’autres oncogènes capables de transformer aussi bien des HSC que des

progéniteurs plus engagés, comme la fusion MLL-AF9, l’utilisation d’un modèle murin

inductible a montré une plus grande agressivité (latence et invasion tissulaire) et une

résistance aux traitements des leucémies générées in vivo à partir de HSC que celles

générées à partir de progéniteur GMP (162).

Cependant, tous les oncogènes ne sont pas capables d’apporter les capacités

d’autorenouvellement nécessaires à la transformation d’un progéniteur engagé comme

observé avec la mutation BCR-ABL1 (161).

4/ Différence entre leucémies pédiatriques et leucémies de l’adulte

Les cancers pédiatriques représentent 1% des nouveaux cas de cancer en France, dont la

fréquence est de 1 enfant sur 450 développant un cancer avant l’âge de 15 ans. Les

leucémies aiguës représentent le cancer pédiatrique le plus fréquent.

Les cancers pédiatriques diffèrent de ceux de l’adulte par leur évolution rapide et une plus

grande sensibilité aux chimiothérapies dans la plupart des cas. Ainsi, la survie à 5 ans des

leucémies de l’enfant de 1 à 15 ans est de 90,6% pour les LAL et de 66,5% pour les LAM

alors que chez l’adulte développant une LAM, la survie est de 30% entre 55 et 65 ans et

diminue à 3% pour les plus de 75 ans.

De plus, la fréquence des leucémies varie drastiquement entre ces deux groupes. Par

exemple, les LAL représentent 80% des leucémies aiguës (LA) pédiatriques et seulement

20% des LA de l’adulte. Au sein des LAM, la répartition des sous-types ainsi que les

61

altérations génétiques observées diffèrent aussi. Les différences entre les leucémies aiguës

myéloïdes pédiatriques et adultes seront présentées plus en détail par la suite.

a/ Différence de répartition des sous-types de LAM et génétique

La répartition des sous-types de LAM de la classification FAB est différente en fonction de

l’âge des patients (Figure 19) et particulièrement pour les patients très jeunes dont l’âge est

inférieur à 2 ans (163,164).

Figure 19 : Répartition des sous-groupes de LAM en fonction de l’âge.

La fréquence des sous-types de LAM varie entre les 3 groupes observés LAM inférieur à 2 ans (<2ans), LAM de 2 à 20 ans et les LAM de l’adulte (>21ans). (D’après (163,164)).

Les leucémies pédiatriques diffèrent également des leucémies observées chez l’adulte par

les altérations génétiques retrouvées. Les leucémies pédiatriques sont associées à peu de

mutations additionnelles, suggérant qu’un nombre faible d’évènements génétiques (1 ou 2)

serait suffisant pour induire une transformation leucémique (165–167). La fréquence des

altérations génétiques observées diffère aussi, comme la fréquence de la fusion MLL-AF9

qui décroît fortement avec l’âge allant de 19,6% chez les enfants de moins de 2 ans à moins

de 2% chez les adultes (168).

< 2 ans 2 à 20 ans

M0M1

M2M4

M5M6

M7

> 21 ans

62

Au vu du très jeune âge de certains patients au diagnostic, l’hypothèse d’une origine

prénatale de certaines leucémies pédiatriques est probable. Dans l’ensemble, ces analyses

suggèrent une influence du stade de développement sur le développement leucémique.

b/ Origine in utero des leucémies pédiatriques

L’analyse génétique de jumeaux monozygotes présentant tous les deux une leucémie a

permis d'affirmer l’origine in utero de certaines mutations observées dans les leucémies

pédiatriques.

La première observation de jumeaux monozygotes (qui possèdent le même matériel

génétique) présentant une leucémie similaire dans l’enfance a été décrite en 1882. Par la

suite, Greaves et ses collègues ont réalisé l’analyse génétique des cellules hématopoïétiques

à la naissance, prélevées lors des tests de Guthrie. Ce test mis en place dans les années

1960-1970, est un prélèvement sanguin effectué au niveau du talon du bébé quelques jours

seulement après sa naissance. Ainsi, en utilisant la séquence du point de fusion des

altérations TEL-AML1 retrouvées dans les échantillons leucémiques, il a pu être mis en

évidence que ce même point de fusion pouvait être détecté dans l'ADN extrait des cellules

présentes dans le test de Guthrie. Ces observations suggèrent qu'un évènement génétique

(fusion TEL-AML1), survenu in utero dans un progéniteur hématopoïétique, a donné lieu à

l'amplification d'un clone muté qui a "colonisé" l'autre jumeau, probablement par la

circulation sanguine, puis a conduit au développement d'une leucémie indépendamment

chez les deux jumeaux (Figure 20)(169,170).

63

Figure 20 : Modèle de transformation par la fusion TEL-AML1 chez des jumeaux.

La mutation initiatrice (TEL-AML1) survient dans un progéniteur hématopoïétique chez un des jumeaux avant la naissance. Ce clone est transmis au deuxième jumeau par la circulation sanguine in utéro. Des mutations coopératrices arrivent indépendamment chez les deux jumeaux conduisant au développement de leucémie dont la latence peut varier. (Réalisé d’après (169,170)).

La fusion MLL-AF4 a également été détectée à la naissance chez 3 jeunes enfants

diagnostiqués à 5, 6 et 24 mois pour une leucémie aiguë lymphoïde.

Ainsi, l'hypothèse actuelle est que la plupart des leucémies pédiatriques (LAM et LAL) ont

une origine prénatale (171). Cependant, les mécanismes cellulaires et moléculaires à

l'origine de la transformation spécifique chez l'enfant restent mal connus et les modèles

disponibles ne permettent généralement pas de reproduire précisément la transformation

par les oncogènes pédiatriques.

B/ Les LAM-M7 pédiatriques

La leucémie aiguë mégacaryoblastique a été décrite pour la première fois en 1931 par Von

Borost et incorporée dans la classification FAB en 1985, comme le sous-type LAM-M7 (172).

64

1/ Présentation clinique et traitements

Les LAM-M7 sont caractérisées par la présence de blastes anormaux dont la morphologie

généralement hétérogène peut rappeler celle des mégacaryoblastes normaux avec, dans

certains cas, des irrégularités cytoplasmiques ou des cellules multi-nucléées de grande taille.

Ces blastes peuvent exprimer les glycoprotéines plaquettaires comme le CD41, CD61 ou

encore le CD42.

Les LAM-M7 sont un sous-groupe de LAM plutôt rare dont la fréquence est plus importante

chez les enfants que chez les adultes (18% chez les moins de 2 ans, 2% de 2 à 21 ans et 1%

pour les plus de 21 ans, (163,164)). Les LAM-M7 pédiatriques peuvent survenir suite à une

prédisposition, telle la trisomie 21 constitutionnelle, également appelée syndrome de Down

(DS-LAM-M7), ou diagnostiquée de novo (sans prédisposition apparente). Chez l’adulte en

revanche, les LAM-M7 sont généralement des leucémies secondaires à un syndrome

myéloprolifératif ou myélodysplasique après chimiothérapie.

Le tableau clinique inclut fréquemment, particulièrement chez les enfants, une anémie, une

thrombopénie, une myélofibrose, une splénomégalie ainsi qu’une hépatomégalie (173). Il

n’existe pas de traitement spécifique pour les LAM-M7 qui repose sur une chimiothérapie

intensive classique en 3 phases (phase d’induction, de consolidation et intensification). La

phase d’induction utilise un mélange de molécules de la famille des anthracyclines (comme

la daunorubicine) associée à la cytarabine. Ces molécules ciblent principalement les cellules

en prolifération. Lorsque le taux de blastes dans la moelle osseuse est inférieur à 5% après

cette première phase, les patients sont dits en « rémission complète ». La phase de

consolidation dépend de la qualité de rémission après l’induction et utilise généralement de

fortes doses des mêmes molécules. La phase d’intensification peut comporter l’utilisation

de molécules anti-cancéreuses ou une transplantation de moelle osseuse (174).

Néanmoins, le risque élevé de rechute confère un pronostic défavorable aux LAM-M7

(Figure 21)(175,176).

65

Figure 21 : Survie Globale (OS) d’une cohorte française de LAM

pédiatriques. Les patients LAM-M7 (AMKL) présentent une survie globale moins bonne que les autres sous-types de leucémies (Other AML). (Issue de (175)).

2/ Génétique des LAM-M7 pédiatriques

Au cours des 20 dernières années, les analyses cytogénétiques puis de séquençage ont

permis de caractériser les altérations génétiques les plus récurrentes des LAM-M7 et ont

révélé une grande hétérogénéité génétique (177–181). Les altérations génétiques

observées sont très différentes entre les LAM-M7 adultes et pédiatriques (Figure 22).

Figure 22 : Altérations génétiques entre les LAM-M7 pédiatriques et adultes.

Les mutations associées aux LAM-M7 pédiatriques de novo ne sont pas retrouvées dans les LAM-M7 de l’adulte en dehors des rares mutations du gène GATA1. (Issue de (179)).

66

Les altérations associées aux LAM-M7 pédiatriques, principalement de novo, sont détaillées

ci-dessous.

a/ LAM-M7 associées aux trisomies 21 constitutionnelles

Les enfants avec un syndrome de Down (trisomie 21 constitutionnelle) présentent un

risque 500 fois plus élevé de développer une LAM-M7 que le reste de la population Pour

revues (182,183). Un certain nombre de nouveau-nés (10%) développent une leucémie

transitoire appelée TMD (pour transient myeloid disorder), caractérisée par la présence de

mégacaryoblastes immatures. Dans la majorité des cas, cette leucémie transitoire régresse

spontanément dans les 3 mois. Cependant 20 à 30% des patients développent une LAM-M7

avant l’âge de 4 ans (182). Le développement leucémique résulte de l’acquisition d’une

succession d’évènements oncogéniques.

La leucémie transitoire TMD est associée à des mutations du gène GATA1, ayant lieu in utero,

engendrant la formation d’une protéine tronquée de l’extrémité N-terminale, appelée

GATA1s (184). Les patients développant une LAM-M7 présentent des mutations

additionnelles (moyenne de 5,8 mutations somatiques par patients) affectant des gènes

codant pour des intermédiaires de voie de signalisation (47%), des régulateurs

épigénétiques (65%) incluant les cohésines, CTCF et les protéines régulant les marques

épigénétiques (185).

Les DS-LAM-M7 résultent donc d’une succession d’altérations incluant: 1- une trisomie du

chromosome 21, 2- des mutations somatiques du gène GATA1 et 3- l’acquisition de

mutations additionnelles (Figure 23). On peut noter que la combinaison de ces trois types

d'altérations est retrouvée dans ~10% des LAM-M7 de novo à ceci près que la trisomie 21

est, dans ces cas-là, acquise de façon somatique et non constitutive.

67

Figure 23 : Développement leucémique des DS-LAM-M7.

L’acquisition de mutations du gène GATA1 in utero chez les enfants présentant une trisomie 21 constitutive (syndrome de Down) conduit au développement d’une leucémie transitoire (TMD) qui régresse de façon spontanée dans la plupart des cas. L’apparition de mutations additionnelles affectant des gènes codant pour des intermédiaires de voie de signalisation (Kinase), des régulateurs épigénétiques (PRC2) ainsi que les cohésines, conduit au développement d’une leucémie aiguë mégacaryoblastique appelée DS-LAM-M7. (Issue de (186)).

Dans l’ensemble, ces patients présentent une meilleure réponse à des doses faibles de

chimiothérapies et un meilleur pronostic que les LAM-M7 de novo (179), pour revue (182).

b/ LAM-M7 de novo

Dans le groupe de LAM7 de novo, la majorité des cas (75%) présente des altérations

chromosomiques conduisant à l’expression d’oncogène de fusion (Tableau 2).

- Oncogènes de fusion :

La première anomalie récurrente identifiée à la fin des années 1980 a été une translocation

entre le chromosome 1 et 22, visible en cytogénétique classique (188,189). L’âge très jeune

des patients et l’observation de cette translocation chez des jumeaux monozygotes

suggèrent une apparition in utero (190). Cette translocation code pour une protéine de

fusion OTT-MAL impliquant la quasi-totalité des deux protéines prédites (177).

68

Tableau 2 : Fréquence des altérations génétiques des LAM-M7 de novo. Fréquence des altérations « drivers » dans une cohorte de LAM-M7 pédiatrique. (Réalisé d’après (179,187)).

Des réarrangements impliquant MLL (également nommé KMT2A) sont retrouvés dans 7 à

17% des cas, alors que la fusion NUP98-KDM5A dans 10 à 15% de LAM-M7 de novo. Ces 2

sous-groupes sont associés à une expression aberrante des gènes homéotiques HOX, dont le

gène HOXA9 a été impliqué dans le développement et la maintenance des cellules

leucémiques (191).

Le rôle de ces gènes dans le développement leucémique est conforté par la présence de

réarrangements impliquant les gènes HOX eux-mêmes associés à leur surexpression dans

15% des LAM-M7 de novo (179).

La fusion ETO2-GLIS2 récemment découverte est présente dans 18 à 27% des LAM-M7 de

novo, ainsi que d'autres fusions plus rares incluant les fusions TLS-ERG, MN1-FLI1, BCR-

69

ABL1, MAP2K2-AF10 (178–181,187). Finalement, 10 à 15% des patients ne présentent pas

de mutation causale identifiée à ce jour.

- Autres mutations :

En plus des oncogènes de fusion, certains sous-groupes de patients présentent des

mutations additionnelles fréquentes (Figure 24).

Figure 24 : Mutations additionnelles des LAM-M7. Représentation de la fréquence des mutations additionnelles observées dans les différents sous-groupes de LAM-M7.

La trisomie du chromosome 21 est retrouvée dans tous les sous-groupes moléculaires de

LAM-M7 avec une fréquence variable de 11% (sous-groupe "OTT-MAL") à 100% (sous-

groupe "Trisomie 21 acquise"). Plusieurs gènes du chromosome 21 ont été proposés pour

jouer un rôle dans le processus de leucémogenèse comme ERG, impliqué dans plusieurs

cancers (cancer de la prostate, sarcome d’Ewing, leucémies) et dont la surexpression est

70

associée à un mauvais pronostic. ERG est un facteur de transcription de la famille ETS ayant

un rôle important dans l’établissement de l’hématopoïèse, et nécessaire à la

mégacaryopoïèse. Son inactivation dans des lignées cellulaires de LAM-M7 (CMY, Meg-01,

tableau 3) impacte la prolifération cellulaire et l’expression de marqueurs

mégacaryocytaires (192), alors que sa surexpression dans des modèles murins induit des

leucémies aiguës lymphoblastiques ou des leucémies érythro-mégacaryoblastiques

(143,192). Ceci suggère que le dosage génique de ERG contribue à la leucémogenèse.

Les mutations GATA1 observées chez les patients DS-LAM-M7 sont aussi retrouvées dans

des sous-groupes de LAM-M7 de novo comme le groupe de trisomie 21 acquise (100%),

NUP98-KDM5A (22%) et les réarrangements MLL (7%). GATA1 interagit avec RB1 et E2F2

pour inhiber la prolifération et induire la différenciation terminale des progéniteurs

érythroïdes (193). De façon intéressante, des mutations inhibitrices de RB1 (délétions,

mutations ponctuelles) sont fréquemment retrouvées, notamment dans le groupe NUP98-

KDM5A (89%) et des réarrangements HOX (15%). Ces mutations sont mutuellement

exclusives avec les mutations GATA1, laissant supposer un rôle de ce complexe dans le

développement des LAM-M7.

Les mutations affectant des intermédiaires de voie de signalisation stimulent généralement

la survie et la prolifération des cellules. Les gènes JAK (JAK1, 2 et 3), STAT, RAS, MPL sont

mutés dans une proportion non négligeable (77% des réarrangements HOX, 50% des

réarrangements MLL, et des trisomies 21 acquises, 47% des DS-LAM-M7, 44% du groupe

« autres ») des différents groupes de LAM-M7.

Les membres du complexe des cohésines sont affectés par des mutations dans 13% des

LAM. L’haploinsuffisance des cohésines induit une augmentation de l’autorenouvellement

des progéniteurs, ainsi qu’une altération de l’accessibilité de la chromatine modifiant

l’expression génique Pour revue (194). Dans le groupe des LAM-M7 ces mutations sont

encore plus représentées que dans la plupart des LAM.

71

3/ Modélisation fonctionnelle des LAM-M7

L’utilisation de xénogreffe de cellules de patients LAM-M7 dans des souris

immunodéficientes ainsi que les lignées cellulaires permettent de modéliser des LAM-M7

humaines in vivo et in vitro (178). Ces modèles permettent l’amplification des cellules

cancéreuses, l’étude moléculaire de ces cellules et permettent de tester in vivo et in vitro de

nouvelles stratégies thérapeutiques. L’efficacité des inhibiteurs de la kinase Aurora A a pu

être testée in vivo (195).

Les lignées cellulaires et les modèles de xénogreffe sont des modèles leucémiques déjà

établis. Pour comprendre l’impact d’une altération génétique sur les différents stades de

l’hématopoïèse, sur le progéniteur cible ou encore la nécessité de coopération pour le

développement leucémique, d’autres modèles d’études sont nécessaires comme les cellules

ES et iPS ou encore les modèles murins. Ces derniers seront plus amplement décrits par la

suite.

Les cellules ES et iPS (cellules somatiques reprogrammées) peuvent être utilisées pour

étudier les conséquences des certaines altérations génétiques sur l’ontogénie

hématopoïétique humaine (Tableau 3).

a/ LAM7 associées aux trisomies 21 constitutionnelles :

Différents modèles murins transgéniques modélisant la trisomie 21 ont été réalisés et

analysés mais aucun ne développe de leucémie (200–202). La coopération de la trisomie 21

avec les mutations GATA1 engendre des anomalies de l'hématopoïèse mais, là encore, sans

développement leucémique (201). Le premier modèle de DS-LAM-M7 a été obtenu par

l'expression de trois évènements génétiques (trisomie 21 + mutation GATA1s + mutation

MPLW515L), confirmant l’importance d'une coopération oncogénique pour le développement

in vivo d'une LAM7 correspondant à ce sous-groupe moléculaire (204).

Une autre équipe a montré l’implication du gène ERG, localisé sur le chromosome 21, dans

le développement des leucémies lymphoïdes et des leucémies érythro-mégacaryocytaires

dans des analyses de transplantation murine (143,192).

72

Cellules humaines Cellules murines

Altérations Lignées (196) PDX iPS / ES / CD34+ Type de modèle : Phénotype

DS-LAM-M7

CMK (197)

(198)

iPS: Trisomie 21 (199) Transgéniques trisomie 21 : absence de leucémie (200–202)

CMY iPS: GATA1s (203) Rétrovirus ERG : LAL, LA érythro-mégacaryoblastique (143)

Transgénique Tri21 + rétrovirus GATA1s : pas de leucémie (201)

Transgénique (Tri21 & GATA1s) + rétrovirus MPLw515l : LAM7 (204)

OTT-MAL (178) iPS/ES: Lentivirus (205) Knock-In : LAM7 avec faible pénétrance (206)

ETO2-GLIS2 MO7e (180) (178) iPS: Knock-In AAVS1 Rétrovirus : absence de maladie (207)

GATA2-HOXA9 Rétrovirus : LAM (207)

NIPBL-HOXB9 Rétrovirus : LAM (207)

NUP98-KDM5A (178)

Rétrovirus : LAM (207)

MLL-AF4 Transgénique conditionnel : Lymphome B (208)

MLL-AF9 (178) Rétrovirus & Transgénique : LAM (162,209)

MLL-AF10 Rétrovirus : LAM (210)

TLS-ERG Rétrovirus : LAM (211)

MN1-FLI1 Rétrovirus : LAM (207,212)

BCR-ABL1 MEG-01, K562 Rétrovirus & Transgénique : LAL-B, LMC (213)

JAK2 T875N CHRF-288-11 (214) Rétrovirus : SMP (214)

JAK3 A572V CMK (197) Rétrovirus : Lymphome T (197)

n.d. CMS, M-MOK

Tableau 3 : Modèles de LAM-M7 pédiatriques.

Un modèle d’iPS dérivées de cellules Trisomie 21 et utilisant un protocole de différenciation

menant à une hématopoïèse de type "primitive" montre une augmentation de la lignée

érythroïde, une diminution de la lignée myéloïde et une absence de différence pour la

formation des mégacaryocytes pour les cellules Trisomie 21 par rapport aux cellules

disomiques (199) mais aucune transformation leucémique n'est observée.

b/ Fusion OTT-MAL :

OTT (aussi appelé RBM15) appartient à une famille de 3 facteurs incluant SPEN et OTT3,

impliqués dans la régulation transcriptionnelle et l’organisation de la chromatine (215,216).

Les membres de la famille OTT ont été impliqués dans la régulation de la voie Notch en

73

s’associant au facteur RBPJ (217). MAL (aussi appelé MKL1) est un coactivateur

transcriptionnel de SRF (Serum response factor) capable de moduler ces gènes cibles. SRF

et MAL jouent un rôle dans la mégacaryopoïèse (218) dont l’inactivation de MAL dans un

modèle murin induit une thrombopénie avec une augmentation des progéniteurs

mégacaryocytaires dans la moelle osseuse (219).

La fusion OTT-MAL induit une LAM-M7 dans un modèle murin Knock-In avec une faible

pénétrance (206) en activant de façon anormale les gènes cibles de Notch régulés par RBPJ.

Cette dérégulation transcriptionnelle est retrouvée chez les patients OTT-MAL.

c/ Fusion NUP98-KDM5A :

NUP98 est une protéine du pore nucléaire, dont le rôle principal est le transport des

macromolécules entre le noyau et le cytoplasme. Le gène est fréquemment réarrangé dans

une grande variété de leucémies pédiatriques (3,8%) dont le pronostic est défavorable. Il

existe une trentaine de partenaires différents (220) dont KDM5A. KDM5A (aussi appelé

JARID1A) est une histone déméthylase, dont la surexpression est retrouvée dans plusieurs

cancers et qui a été impliquée dans le processus de métastase et de résistance aux

traitements (221). La fusion NUP98-KDM5A est une fusion récurrente des LAM-M7

pédiatriques (179,222). La surexpression de NUP98-KDM5A dans des progéniteurs murins

engendre une leucémie myéloïde (207).

Une fusion NUP98-BPTF a récemment été décrite chez un jeune enfant LAM-M7 (223).

d/ Fusions MLL ou HOX :

Le gène MLL code pour une histone méthyltransférase spécifique de la lysine 4 de l’histone

3 (H3K4), qui joue un rôle important dans la régulation transcriptionnelle, notamment des

gènes homéotiques HOX (dont HOXA7, HOXA9). Les gènes HOX sont impliqués dans la

régulation hématopoïétique, et sont fortement exprimés dans les progéniteurs précoces.

MLL est fusionné avec plus de 80 partenaires différents dans les leucémies humaines. Ces

74

fusions engendrent une dérégulation des gènes HOX, participant ainsi au développement

leucémique (224).

Trois partenaires de MLL sont retrouvés dans les LAM-M7 : AF4 (225), AF9 (178) et AF10

(226). Ces protéines font partie d’un complexe liant la polymérase II participant à l’étape

d’élongation de la transcription. Ces différentes fusions sont retrouvées dans d’autres sous-

types de leucémies, et leur expression dans différents modèles murins induit des leucémies

myéloïdes ou lymphoïdes sans phénotype mégacaryoblastique (162,208,210).

De même pour les fusions impliquant les gènes homéotiques HOX eux-mêmes, leur

expression engendre une LAM myéloïde chez la souris (207).

3/ La fusion ETO2-GLIS2

La fusion ETO2-GLIS2 est l’altération génétique la plus fréquemment retrouvée dans les

LAM-M7 de novo, et est associée à un pronostic particulièrement défavorable (178,180,227).

Elle résulte d’une inversion du chromosome 16 qui code pour une protéine de fusion

exprimant la grande majorité des gènes ETO2 et GLIS2. Plusieurs variants ont été observés,

impliquant les exons 10, 11 et 12 de ETO2 et les exons 1, 2 et 3 de GLIS2 (Figure 25).

La fusion ETO2-GLIS2 a été initialement découverte dans des LAM-M7 pédiatriques. Masetti

et coll. ont également identifié cette fusion dans d’autres sous-types de LAM M0 à M5 de la

classification FAB, excluant les groupes M3 et M6 (227), suggérant que cette fusion n’est pas

restreinte au sous-groupe des LAM-M7. Cette altération génétique est associée à un

pronostic particulièrement défavorable indépendamment du sous-type de LAM.

75

Figure 25 : Représentation schématique des gènes ETO2 et GLIS2 et des transcrits de fusion. Les gènes GLIS2 et ETO2 sont localisés sur le chromosome 16. Il existe plusieurs variants de la fusion ETO2-GLIS2 impliquant les exons 10, 11 et 12 de ETO2 et 1, 2 et 3 de GLIS2. La fusion la plus fréquemment retrouvée est la fusion "11-3" indiquée par une étoile rouge.

La fusion ETO2-GLIS2 implique deux régulateurs transcriptionnels.

Le gène ETO2, aussi nommé MTG16 ou CBFA2T3, code une protéine de la famille ETO qui est

exprimée dans toutes les cellules hématopoïétiques. ETO2 est un cofacteur transcriptionnel

qui interagit avec les facteurs de transcription du complexe Heptad (SCL, RUNX1, GATA…).

Une inactivation d'Eto2 chez la souris est associée à une perte de fonction/maintien des

HSC (228,229). ETO2 joue aussi un rôle clé dans la régulation de la mégacaryopoïèse (115)

en réprimant certains gènes impliqués dans la différenciation terminale (comme GATA1 et

PF4)(230).

GLIS2 est un facteur de transcription de la famille GLI impliqué dans la voie de signalisation

Hedgehog. Les patients présentant la fusion ETO2-GLIS2 montrent une signature

transcriptionnelle de surexpression des gènes cibles de cette voie (178). GLIS2 est

fortement exprimé dans le rein et serait impliqué dans le maintien et l’architecture du rein

76

(231). Des mutations de GLIS2 sont associées à une fibrose et une atrophie du rein appelée

néphronophtisie (232). Une étude récente d'inactivation par shRNA dans une approche de

criblage a impliqué GLIS2 dans la régulation de l’hématopoïèse, et plus spécifiquement

comme régulateur positif de la capacité de repopulation des progéniteurs hématopoïétiques

lors de greffe (233). Indépendamment, l'expression de GLIS2 aurait un effet défavorable sur

le processus de reprogrammation cellulaire (234).

Bien que l'expression de la fusion ETO2-GLIS2 conduise à une augmentation de

l’autorenouvellement des progéniteurs hématopoïétiques murin in vitro (180), aucun

modèle de leucémogenèse in vivo par expression de la fusion ETO2-GLIS2 n'a été rapporté à

ce jour.

77

78

RESULTATS

79

CONTEXTE ET OBJECTIFS

La fusion ETO2-GLIS2 a été décrite pour la première fois en 2012 par plusieurs laboratoires

(178,180). Au sein de notre équipe, l'identification et la caractérisation de cette fusion a été

réalisée par une approche combinée de xénogreffe de cellules de patients LAM-M7 et

d'analyse génétique par RNAseq (178). Avant le commencement de ma thèse, j'ai participé à

ce travail par la caractérisation de la récurrence de la fusion dans une cohorte de 31

patients LAM-M7 de novo pédiatriques en collaboration avec Jean-Pierre Bourquin (Zurich,

Suisse). L'identification des patients ETO2-GLIS2+ (26% des LAM7 pédiatriques de novo),

pour lesquels nous avions déjà des profils d'expression, a permis de mettre en évidence que

la fusion ETO2-GLIS2 est associée à une signature transcriptionnelle distincte des autres

LAM7 pédiatriques (235).

La fréquence élevée de la fusion ETO2-GLIS2 au sein des LAM7 pédiatriques de novo, son

association avec un mauvais pronostic (180) et la signature transcriptionnelle spécifique

constituaient des éléments moteurs pour l'étude des mécanismes de transformation par

cette fusion qui étaient inconnus.

Les données fonctionnelles disponibles, détaillées dans l'introduction générale, indiquaient

que ETO2 est un cofacteur transcriptionnel qui interagit avec les facteurs de transcription

du complexe Heptad, et est impliqué dans le maintien, la prolifération et le devenir des

progéniteurs hématopoïétiques. En revanche, aucune donnée n'était disponible pour GLIS2

et dehors de son appartenance à une famille de facteurs de transcription GLI/GLIS/ZIC

incluant les facteurs GLI impliqués dans la réponse transcriptionnelle à une stimulation de

la voie de signalisation Hedgehog. L'hypothèse était donc que la fusion ETO2-GLIS2

implique deux régulateurs transcriptionnels et entraîne une dérégulation de l'expression

génique contribuant à la transformation leucémique.

Notre objectif a donc été de caractériser la signature transcriptionnelle induite par

l'expression de la fusion pour identifier ses gènes cibles, de définir les contributions

relatives des facteurs ETO2 et GLIS2 et de mieux comprendre les mécanismes moléculaires

80

à la base de cette dérégulation transcriptionnelle. Les résultats obtenus ont été publiés dans

l'Article 1.

D'autre part, les capacités de transformation de la fusion ETO2-GLIS2 n'étaient pas connues.

En particulier, les bases cellulaires et/ou moléculaires de l'association spécifique de cette

fusion, tout comme d'autres oncogènes de fusion, avec les leucémies pédiatriques restent

inexpliquées.

Une autre observation importante, rapportée par l'équipe de F Locatelli, rapidement après

son identification, était que la fusion ETO2-GLIS2, initialement découverte chez des enfants

diagnostiqués pour une LAM-M7, est également retrouvée dans d’autres sous-types de LAM

pédiatriques (LAM-M0 à M5).

Afin d'obtenir des données expérimentales permettant de comprendre les déterminants de

la transformation et des phénotypes induits par ETO2-GLIS2, j'ai analysé d'autres

échantillons de patients et développé plusieurs approches de modélisation de l'expression

de la fusion ETO2-GLIS2 chez la souris. Les résultats de ces approches sont l'objet de

l'Article 2 qui est en cours de considération pour publication.

Article 1 :

Au cours de ce travail, réalisé en collaboration avec une autre étudiante en thèse (Cathy

Ignacimouttou) et une post-doctorante (Cécile Thirant) nous avons cherché à répondre à

plusieurs questions.

1-Quelles sont les conséquences de l'expression de la fusion sur la différenciation

mégacaryocytaire et l’autorenouvellement des progéniteurs hématopoïétiques ?

Pour cela, j'ai construit des vecteurs rétroviraux ETO2-GLIS2, ETO2 et GLIS2 qui ont été

utilisés pour transduire des progéniteurs hématopoïétiques murins et montrer que le

phénotype mégacaryocytaire est imposé par la partie GLIS2 de la fusion alors que

l’augmentation de l’autorenouvellement est due à une combinaison des fonctions ETO2 et

GLIS2.

81

2-Quels sont les gènes cibles de la fusion ?

Pour cela, nous avons surexprimé la fusion, ainsi que ETO2 et GLIS2 seuls, dans une lignée

humaine érythro-mégacaryocytaire ne présentant pas de fusion (HEL). L'expression de la

fusion dans ces cellules induit une forte dérégulation transcriptionnelle corrélée à la

signature retrouvée chez les patients. Certains facteurs impliqués dans le complexe avec

ETO2 sont fortement dérégulés dont GATA1 retrouvé diminué et ERG fortement augmenté.

Une dérégulation similaire a été retrouvée chez les patients ET02-GLIS2 par rapport aux

autres patients LAM7 pédiatriques.

3-Comment la fusion dérégule l'expression de ses gènes cibles ?

Pour cela, nous devions ensuite caractériser les sites de fixation de cette fusion, impliquant

deux régulateurs transcriptionnels, sur l'ADN. Une limitation importante était 1-l'absence

d'anticorps spécifique pour GLIS2 (plusieurs anticorps commerciaux ayant été testés sans

succès) et 2-le fait que, dans les cellules ETO2-GLIS2+, un anticorps ETO2 reconnaît à la fois

la fusion mais également ETO2 endogène, exprimé à partir de la deuxième copie d'ETO2

sauvage. Pour note, ce problème n'est pas présent pour GLIS2 dont l'expression est absente

de la différentiation hématopoïétique. J'ai donc réalisé une approche de modification ciblée

du génome de type CRISPR-Cas9 dans la lignée MO7e, dérivée de patient et exprimant de

façon endogène la fusion ETO2-GLIS2, afin d'introduire la GFP en fusion en C-terminal de

ETO2-GLIS2. Cette approche a permis de valider la localisation nucléaire de la fusion par

imagerie et la réalisation d’immunoprécipitation spécifique de la fusion avec un anticorps

anti-GFP pour des approches d'immunoprécipitation de chromatine (ChIPSeq).

La fusion ETO2-GLIS2 se fixe bien à l’ADN sur 1871 régions dans les MO7e. L’analyse des

motifs observés dans ces régions, révèle plusieurs motifs des partenaires d’ETO2 comme

ERG, GATA et RUNX ainsi que des motifs attribués à GLIS2. Ces résultats suggèrent la

fixation de la fusion sur l’ADN via la partie GLIS2 ainsi que par le complexe ETO2

notamment avec le partenaire ERG. En comparant les sites connus de fixation des

partenaires d’ETO2 dans les mégacaryocytes, aux sites de fixation de la fusion dans les

MO7e, nous avons pu voir que plus de la moitié des sites de la fusion sont des sites non

connus (de novo). En corrélant avec l’expression transcriptionnelle obtenue dans les HEL,

82

nous avons pu observer que les gènes associés des sites connus du complexe ETO2 sont

majoritairement inhibés alors que les gènes des nouveaux sites sont plutôt surexprimés en

présence de la fusion ETO2-GLIS2. Dans ces analyses, la fusion impose donc une fixation et

une régulation transcriptionnelle différente aux complexes transcriptionnels incluant ETO2.

Certaines marques épigénétiques sont fortement retrouvées associées aux sites de fixation

d’ETO2-GLIS2 comme la marque H3K27ac, associée aux enhancers et super-enhancers (SE).

Les SE sont des régions de fixation aux facteurs de transcription associés aux gènes clés

spécifiques de l’identité cellulaire. Dans les MO7e, 483 SE ont été observés, qui réguleraient

l’expression de 828 gènes putatifs dont ETO2, ERG et KIT. La fusion se lie à 1/3 des SE, et les

gènes associés sont majoritairement surexprimés (ex: ERG).

Le complexe ETO2 semble jouer un rôle important et particulièrement le facteur ERG,

surexprimé par la fusion et colocalisant fréquemment avec elle. L’inactivation d’ERG par

CRISPR-Cas9 dans les MO7e ou des cellules de patient ETO2-GLIS2 a validé son rôle dans le

maintien des cellules leucémiques et son implication dans la régulation de certains gènes

cibles de la fusion (ex: KIT).

4-Comment est régulée la stabilité de ces complexes protéiques ?

Nous sommes partis de l'observation que les protéines de la famille ETO, dont fait partie

ETO2, présentent un domaine NHR2 indispensable pour leur oligomérisation et pour le

recrutement de co-facteurs. Il a été montré, avec la fusion AML1-ETO, l’importance de ce

domaine sur l’autorenouvellement des cellules leucémiques, en utilisant un peptide nommé

NC128, contenant la séquence protéique du domaine NHR2 de ETO.

Nous avons montré que la fusion ETO2-GLIS2 peut également interagir avec elle-même et

avec ETO2. Étant donnée la grande homologie de séquence protéique entre ETO et ETO2 au

niveau du domaine NHR2, nous avons ensuite caractérisé les conséquences de l'expression

du peptide NC128 dans les cellules leucémiques ETO2-GLIS2. L’expression du NC128 dans

la lignée MO7e modifie la signature transcriptionnelle imposée par la fusion avec

notamment une diminution d’ERG et une surexpression de GATA1. De plus, le NC128 inhibe

la prolifération cellulaire en réduisant le cycle cellulaire des cellules et en augmentant

l’apoptose. L'expression du NC128 dans des cellules de patients ETO2-GLIS2 (transduction

83

lentivirale) inhibe également le développement leucémique dans des modèles de

xénotransplantation.

Article 2 :

Au cours de ce travail, j'ai cherché à répondre aux questions suivantes:

1-Quelle est la fréquence de la fusion ETO2-GLIS2 au sein des LAM pédiatriques ?

Afin de valider l’association de la fusion ETO2-GLIS2 avec les autres sous-types de LAM, j’ai

tout d'abord recherché sa récurrence dans une cohorte nationale de LAM pédiatriques en

collaboration avec les réseaux de la SFCE et les responsables du protocole ELAM02. La

fusion ETO2-GLIS2 a été retrouvée dans les sous-types de LAM-M0 à M5 en plus des LAM-

M7 avec une fréquence de 4,7%. De façon intéressante, nous avons pu observer que les

patients ETO2-GLIS2 LAM-M7 sont diagnostiqués très jeunes (moyenne d’âge de 1,7 ans)

par rapport aux autres sous-types (moyenne d’âge de 8,6 ans). Pour mieux caractériser les

cellules leucémiques, j’ai réalisé des xénogreffes des cellules de patients dans des souris

immunodéficientes (NSG) lorsque des cellules viables étaient disponibles. Pour un patient

diagnostiqué LAM-M2, j'ai observé un phénotype original. En effet, la majorité des blastes

leucémiques sont constitués d’une population immature (CD34+CD41-CD15-) mais une

petite fraction de cellules présente, d'une part, un phénotype mégacaryoblastique

(CD41+CD15-) et, d'autre part, un phénotype myéloïde (CD41-CD15+) suggérant une

capacité de différenciation soit myéloïde soit mégacaryocytaire. Cette hypothèse fut

confirmée par l'observation que seule la population immature est capable de développer

une leucémie dans des souris secondaires et régénère les 3 populations. Dans l'ensemble,

ces différentes observations suggèrent l’implication du stade de développement et/ou du

type de progéniteur cible sur le phénotype des leucémies ETO2-GLIS2.

2-L'expression de la fusion ETO2-GLIS2 induit-elle des leucémies dans un modèle

expérimental ?

Pour tester ces hypothèses expérimentalement, j’ai développé, en collaboration avec le

groupe de Jürg Schwaller, un modèle murin transgénique d’expression inductible de la

84

fusion ETO2-GLIS2 sous le contrôle de la doxycycline. L’induction de la fusion dans des

femelles induit des hémopathies létales avec une forte pénétrance (96,9%, 31/32 souris)

qui peuvent être classées en 3 groupes : phénotype immature (9/19), phénotype

mégacaryoblastique (expression du CD41, 4/19) ou phénotype myéloïde (expression des

marqueurs CD11b et Gr1, 6/19).

3-Quel est l'impact du stade de développement et du type de cellule hématopoïétique ciblé

pour la leucémogenèse et le phénotype des pathologies ?

Pour caractériser l'impact du stade de développement sur le phénotype, j'ai exprimé la

fusion dans des progéniteurs du foie fœtal ou de la moelle osseuse adulte. Le phénotype

mégacaryoblastique est fortement associé aux progéniteurs fœtaux et décroît au cours du

développement à l’inverse du phénotype myéloïde majoritaire dans les progéniteurs

adultes. Cette observation est valable pour d’autres oncogènes retrouvés dans différents

sous-types de LAM comme MLL-AF9 et NUP98-KDM5A, pour lesquels l'expression dans des

progéniteurs issus de foie fœtal E12.5 favorise le phénotype mégacaryoblastique.

Pour montrer que l’origine cellulaire influence également le phénotype, j'ai exprimé la

fusion dans différents types de HSC et progéniteurs purifiés. Les progéniteurs du foie fœtal

expriment exclusivement (HSC, MPP2) ou majoritairement (MPP3) un phénotype

mégacaryocytaire, alors que chez l’adulte seules les HSC présentent un potentiel

mégacaryoblastique exclusif. Les autres progéniteurs (MPP2, MPP3, MPP4) expriment de

façon graduelle les marqueurs myéloïdes. A l’état unicellulaire, j'ai montré que 48% des

progéniteurs MPP3 adultes exprimant la fusion possèdent une capacité d'engagement à la

fois de la différenciation myéloïde et mégacaryocytaire, comme observé chez le patient

LAM-M2. Ces résultats démontrent l’importance du type de progéniteur et du stade de

développement sur le phénotype des leucémies induit par un même oncogène.

Finalement, j’ai modélisé, à partir de HSC fœtales exprimant la fusion, le développement in

vivo d'une leucémie rapide (27 jours) et agressive présentant les caractéristiques des LAM-

M7 humaines. En revanche, les HSC adultes exprimant la fusion conduisent au

développement de leucémies avec une latence longue (>312 jours) et un phénotype

hétérogène. La possibilité d'éteindre l'expression de la fusion dans les cellules transformées

85

(par retrait du traitement à la doxycycline) a ensuite révélé, par greffe secondaire, qu'une

partie des cellules leucémiques ne présentant plus d'expression de la fusion conservent des

caractéristiques de reconstitution hématopoïétique à long-terme (>6 mois) attribuées

uniquement aux HSC normales.

4-Quelles sont les conséquences moléculaires de la fusion ETO2-GLIS2 dans les HSC ?

Pour cela, j'ai mené une analyse RNAseq à l’état unicellulaire des HSC en allant réaliser cette

technique, non disponible à l'institut, dans le laboratoire de Berthold Gottgens. Les analyses

bio-informatiques, réalisées en collaboration avec l'expertise de Esteve Noguera dans

l'équipe, ont montré une dérégulation transcriptionnelle importante de la fusion dans les

HSC dès 24h post-induction de la fusion. La signature obtenue corrèle avec celle des

patients EG LAM-M7 (ex: surexpression de Kit). Une prédiction de l’activité des facteurs de

transcription permet de suggérer que plusieurs facteurs sont régulés par la fusion EG,

incluant les facteurs impliqués dans la différenciation myéloïde (IRF8, GFI1b),

mégacaryocytaire (FLI1, IKZF1) ainsi que certains membres du complexe heptad (LDB1,

ERG, GATA2). Ces résultats sont compatibles avec l’observation d’un blocage précoce de la

différenciation des HSC vers la lignée mégacaryocytaire.

Fonctionnellement, j'ai pu mettre en évidence l’importance de certains facteurs de

transcription sur le phénotype myéloïde (rôle positif de CEBPA) ou mégacaryoblastique

(ex: ERG et GATA1) de la transformation par la fusion ETO2-GLIS2.

86

ARTICLE 1

ETO2-GLIS2 hijacks transcriptional complexes to drive cellular identity and self-renewal in pediatric acute megakaryoblastic

leukemia Cécile Thirant 1,2, #, Cathy Ignacimouttou 1,3, #, Cécile K. Lopez 1,4, #, M’Boyba Diop 2, Lou Le Mouël 2,4, Clarisse Thiollier 2,3, Aurélie Siret 1,2, Phillipe Dessen 1,2, Zakia Aid 1,2, Julie Rivière 1,2, Philippe Rameau 2, Céline Lefebvre2, Mehdi Khaled2, Guy Leverger 5, Paola Ballerini 5, Arnaud Petit 5, Hana Raslova1,2, Catherine L. Carmichael6, Benjamin T. Kile6, Eric Soler7, John D. Crispino8, Christian Wichmann9, Françoise Pflumio 7, Jürg Schwaller 10, William Vainchenker 1,2, Camille Lobry 1,2, Nathalie Droin 1,2,11, Olivier A. Bernard 1,2,4, Sébastien Malinge 1,2, Thomas Mercher 1,2,3,4, * #Contributed equally Cancer Cell. 2017. Mar 13;31(3):452-465. Commentaires: -Cancer Cell. 2017. ETO2-GLIS2: A Chimeric Transcription Factor Drives Leukemogenesis through a Neomorphic Transcription Network. Wheat JC, Steidl U. -Cancer Discovery. 2017. ETO2–GLIS2 Drives the Transcriptional Program Underlying AMKL. DOI: 10.1158/2159-8290

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1

SUPPLEMENTAL DATA

Figure S1: ETO2-GLIS2 effects are mediated by GLIS2 DNA binding domain and by NHR2-protein

interaction domain. Related to Figure 1.

(A) Expression of Kit, GpIIb and GpIb transcripts in GFP

+/CD41

+ megakaryocytes 4 days after transduction of

wild-type murine bone marrow progenitors with ETO2-GLIS2 (EG), ETO2 (E), GLIS2 (G) or empty (CTRL)

retroviruses. Expression is normalized to Gapdh and fold change over CTRL condition is represented. Means ±

SEM (n=4) are shown.

(B) Schematic representations of wild-type and mutants ETO2-GLIS2.

(C) Representative flow cytometry analysis of the enhanced megakaryocytic phenotype induced by ETO2-GLIS2

and ETO2dNRH2-GLIS2, but not by an ETO2-GLIS2C265G mutant in wild-type murine bone marrow cells after 4

days of culture in megakaryocytic conditions. Histogram plots showing the mean percentage of Kit+/CD41

+ and

CD41+/CD42

+ cell populations. Data are shown as mean ± SEM (n=4). p values (Student’s t-test) are indicated:

***: p<0.0005, **: p<0.005, *: p<0.05.

(D) Wild-type murine progenitors were transduced as in C. Absolute number of colonies upon serial replating of

ETO2-GLIS2 (n=6), ETO2dNRH2-GLIS2 and ETO2-GLIS2C265G as means ± SEM (n=9) transduced murine bone

marrow progenitors. Cells were replated every 7 days for 4 weeks.

104

2

Table S1: Differentially expressed genes upon expression of ETO2-GLIS2, ETO2, GLIS2 or ERG, respectively,

in HEL cells as compared to control (CTRL: empty vector). Related to Figure 2.

Provided as an Excel file.

Figure S2: ETO2-GLIS2 transcriptional signature. Related to Figure 2.

(A) Histogram representation of MSigDB pathways significantly deregulated by overlap analyses of signatures

of genes upregulated upon expression of ETO2-GLIS2 (red), or deregulated by ETO2 (blue) or GLIS2 (green). -

log(FDR) is represented. Datasets directly linked to this study are indicated in bold. (B) Wild-type murine bone marrow cells were transduced as in Figure S1C with ETO2-GLIS2, ETO2dNRH2-

GLIS2 or ETO2-GLIS2C265G mutant and cultivated 4 days in megakaryocytic conditions. Expression of ERG and

GATA1 target genes of ETO2-GLIS2. Absolute values were normalized on the empty vector and data are shown

as means ± SEM (n=4). p values (Student’s t-test) are indicated.

(C) Expression of GATA2 and GATA3 in HEL cells upon expression of ETO2-GLIS2, ETO2, GLIS2 or an

empty vector (n=4 per group). The dotted line represents their expression in CTRL cells.

(D) Expression of GATA2 and GATA3 in different subsets of human AMKL (Bourquin et al., 2006), including

Adults (n=12), ETO2-GLIS2 (EG) (n=8), Down’s syndrome (DS) (n=22), OTT-MAL (OM) (n=4) and other

pediatric (others) (n=11) AMKL. The p values were calculated by comparing expression of the indicated gene in

the ETO2-GLIS2 subgroup to its expression in all other AMKL subgroups. Center lines show the medians; box

limits indicate the 25th and 75th percentiles as determined by R software; whiskers extend 1.5 times the

interquartile range from the 25th and 75th percentiles.

105

3

Figure S3: Generation of a GFP knock-in in MO7e cells through CRISPR/Cas9 editing and ChIP-seq analyses. Related to Figure 3.

(A) Scheme of the strategy and Sanger sequencing validation of site-specific insertion of GFP into the

endogenous ETO2-GLIS2 locus by CRISPR/Cas9 methods in MO7e cells (MO7e-KI cell line).

(B) Detection of endogenously expressed ETO2-GLIS2-GFP by flow cytometry.

(C) Detection of endogenously expressed ETO2-GLIS2-GFP by confocal microscopy. Nucleus is highlighted by

Hoechst staining. Scale bar = 10µM.

106

4

(D) Expression of the ETO2-GLIS2-GFP fusion in individual clones by Western blot as compared to MO7e cells

and retrovirus-induced expression of a GFP-ETO2-GLIS2 (GFP-EG) construct in MO7e. Anti-GFP, anti-ETO2

and anti-ACTIN antibodies were used. * indicates an aspecific band.

(E) Immunoprecipitation using GFP-trap readily pull-down specifically ETO2-GLIS2-GFP but not untagged

ETO2-GLIS2.

(F) Multiparameter flow cytometer analysis of MO7e-KI clones indicating that they present a phenotype similar

to parental MO7e cells.

(G & H) Alignment of replicates of ETO2 (A) and GFP (B) ChIP-seq with Pearson’s coefficient.

(I ) Venn diagram showing the overlap between ETO2 ChIP-seq in MO7eKI cells, in AMKL patients cells and in

GFP ChIP-seq in MO7eKI cells.

(J) Venn diagram illustrating the overlap of ETO2-GLIS2 (common to GFP and ETO2 in MO7e) and ERG

peaks with ETO2 cofactors (SCL, RUNX1, FLI1, GATA1/2) peaks bound in normal megakaryocytes (MK)

previously published (GSE24674 dataset) (Tijssen et al., 2011).

107

5

Figure S4: Characterization of ETO2-GLIS2 super-enhancers genes. Related to Figure 4.

(A) Venn diagram showing the low overlap between SE-associated genes identified in MO7e and HEL cells.

(B) Investigate overlap analysis using MsigDB of 5 lists of genes (SE-associated genes identified in MO7e,

genes deregulated after ETO2-GLIS2, ETO2 and GLIS2 expression, or previously established ETO2-GLIS2

patient signature) showing a significant association with the WONG_ADULT_TISSUE_STEM_MODULE by

computing overlap of genes. FDR value (-logFDR) is represented.

(C) Venn diagram showing the overlap between the upregulated SE-associated genes upon ETO2-GLIS2, ETO2

and GLIS2 expression. Numbers of SE are indicated.

Table S2: Lists of the common super-enhancers regions of MO7e cells identified in the three replicates using the

H3K27Ac mark. Related to Figure 4.

Provided as an Excel file

Table S3: List of super-enhancers annotated genes in MO7e cells. Related to Figure 4.


108

6

Figure S5: ERG is essential for ETO2-GLIS2 leukemic cells. Related to Figure 5.

(A) Venn diagram showing the overlap between genes deregulated by ERG and ETO2-GLIS2 in HEL cells. The

numbers of genes are indicated.

(B) List of genes commonly deregulated by ERG and ETO2-GLIS2 in HEL cells and in human ETO2-GLIS2

AMKL samples.

(C) Upper panels: expression of IGFBP7, CD44 and IRF5 genes in HEL cells transduced with indicated

constructs showing that they are regulated by both ETO2-GLIS2 and ERG. Lower panels: expression of IGFBP7

(probe #: 201162_at), CD44 (probe #: 212014_x_at) and IRF5 (probe #: 205469_s_at) in different subsets of

human AMKL as follows: Adults (n=12), ETO2-GLIS2 (EG) (n=8), Down syndrome (DS) (n=22), OTT-MAL

(OM) (n=4) and other pediatric (others) (n=11). The p values (Student’s t-test) were calculated by comparing

expression of the indicated gene in ETO2-GLIS2 patients to their expression in all other AMKL patients. Center

lines show the medians; box limits indicate the 25th and 75th percentiles as determined by R software; whiskers

extend 1.5 times the interquartile range from the 25th and 75th percentiles.

(D) Scheme of the CRISPR strategy to inactivate ERG. Guide RNA (sg) sequence targets exon 5 of ERG (first

exon common to all isoforms). HEL cells were transduced with sgERG and Cas9. Single cell sorting based on

GFP expression allowed isolation of a sgERG clone 10 harboring a 2bp-insertion at Cas9 cutting site (black

triangle and bold letters), leading to premature STOP codon (red letters and star), and a wild-type clone (CTRL

clone 4) transduced with Cas9 only.

(E) T7 endonuclease assay on a 535 bp PCR on genomic DNA surrounding ERG guide sequence. No activity

can be detected from wild-type HEL DNA sequence (CTRL Clone 4) whereas two fragments of 350 bp and 185

bp appeared from sgERG clone 10. Table S4: Differentially expressed genes upon expression of NC128 in MO7e cells as compared to control

(CTRL: empty vector). FDR: False Discovery Rate. Int: Probe intensity. Related to Figure 6.


109

7

SUPPLEMENTAL EXPERIMENTAL PROCEDURES

Vectors, retroviral and lentiviral transduction For retroviral transduction experiments, we constructed murine stem cell virus (MSCV) backbone constructs

expressing GFP or mCherry and encoding human ETO2-GLIS2, ETO2, GLIS2 cDNA. The ETO2-GLIS2C265G

mutant was introduced using the Quickchange II XL site-directed mutagenesis Kit (Agilent technologies). To

this aim, a cysteine within the fourth zinc finger at a position equivalent to position 265 of wild-type GLIS2,

described as essential for GLIS2 DNA binding (Vasanth et al., 2011), was replaced by a glycine in the ETO2-

GLIS2 cDNA and validated by Sanger sequencing. Deletion of the NHR2 domain in ETO2 DNHR2-GLIS2 was

performed by fusion PCR. Retroviral supernatants production and transduction were described elsewhere

(Mercher et al., 2009). Briefly, 293T cells were transfected using Xtreme GENE transfection reagent according

to the manufacturer’s instructions (Roche). Retroviral particles were harvested 24h and 48h after transfection.

For retroviral transduction, murine bone marrow cells were spinoculated twice with retroviral particles in culture

media containing 5µg/mL Polybrene and 7.5mM HEPES buffer for 90 minutes at 2500 rpm, 33°C.

The lentiviral pSiEW-GFP and pSiEW-NC128-GFP vectors were described previously (Wichmann et al., 2010;

Wichmann et al., 2007). Lentiviral particles were produced in 293T cells which were co-transfected with

plasmids of interest, along with a packaging plasmid (pCMV 8.74) and a VSV envelope expression plasmid

(pMD2.G) using jetPRIME transfection reagent (Polyplus transfection, Ozyme). Supernatants were collected at

48h and concentrated by ultra-centrifugation.

Cell culture. Whole bone marrow cells were harvested from 8-10 weeks old mice, red cell lyzed for 5 minutes at 4°C and

washed twice in PBS 1X containing 2% FBS. Cells were then cultured overnight in RPMI1640 supplemented

with 10% FBS (Gibco), Penicillin (100U/mL)-Streptomycin (100µg/mL), 2mM L-Glutamine and containing

10ng/ml of recombinant murine Il-3, Il-6 and SCF (Peprotech). To promote megakaryocytic differentiation,

transduced bone marrow cells were cultured for 4 days in RPMI1640, Penicillin (100U/mL)-Streptomycin

(100µg/mL), 2mM L-Glutamine, 10% FBS supplemented with 50ng/ml murine(m)TPO and SCF. For serial

replating assays, transduced bone marrow cells were GFP sorted at 24h and plated at 5x104

cells/35mm2

dish in

methylcellulose M3434 (Stemcell Technologies), colonies were scored after 7 days and 1x104 cells were replated

every 7 days for at least 3 weeks to assess self-renewal capacities in vitro.

The human MO7e cell line was derived from a 6-month-old patient with AMKL (Avanzi et al., 1988). MO7e

cells were cultured in MEM-α supplemented with 20% FBS, Penicillin (100U/mL)-Streptomycin (100µg/mL)

and 2mM L-Glutamine (Gibco), and 5 ng/ml of human GM-CSF (PeproTech). MO7e-KI cells were derived from

MO7e cells through CRISPR/Cas9 mediated knock-in of the GFP at the endogeneous GLIS2 locus (Figure S2).

The human HEL 92.1.7 (HEL) cell line was derived from a 30-years-old patient with AML-M6 (Martin and

Papayannopoulou, 1982) and expresses megakaryocyte markers including CD41 and CD42 (Kieffer et al., 1986).

HEL cells do not express ETO2-GLIS2 but present the JAK2V617F

mutation also found in some cases of pediatric

AMKL (Gruber et al., 2012; Levine et al., 2005). Therefore, HEL cells represent a genetic and phenotypic

cellular context close to human AMKL cells. HEL cells are cultured in RPMI1640 supplemented with 10% FBS,

Penicillin (100U/mL)-Streptomycin (100µg/mL), 2mM L-Glutamine (Gibco). HEL cells were authenticated by

the presence of a homozygous JAK2V617F

mutation.

AMKL cells obtained directly from immunodeficient animals or following purification by flow cytometry were

cultured in RPMI1640 medium supplemented with 20% FBS, Penicillin (100U/mL)-Streptomycin (100µg/mL)

and 2mM L-Glutamine (Gibco), and 10 ng/ml each of human SCF, IL3, IL6, IL11, TPO, 10U/ml EPO and 5

ng/ml of GM-CSF (PeproTech). Cell proliferation was assessed by trypan blue exclusion.

Xenotransplantation. Xenograft of primary human AMKL patient samples was described previously (Thiollier et al., 2012). For

bioluminescent follow-up of human AMKL cells, human AMKL7 patient cells were transduced with the FUW-

Luc-mCherry-puro lentiviral construct (a kind gift from A. L. Kung, Dana Farber Cancer Institute, Boston),

sorted on mCherry expression and then used for further transduction with CRISPR vectors or NC128 constructs.

6-10 weeks-old female NSG mice (The Jackson Laboratory) intravenously injected with AMKL7Luc

blasts were

monitored every 4 weeks. For bioluminescence monitoring, mice received 150 mg/kg D-Luciferin (Beetle

luciferin, E1605; Promega, Charbonnières, France) intraperitoneally, were anesthetized with 3% isoflurane, and

imaged 1 to 5 min with an IVIS50 system (Perkin Elmer, Courtaboeuf, France). Bioluminescence intensity is

expressed as photons per second (p/s). Engraftment was monitored by BM sampling at 6-wk after injection and

performed under isoflurane anesthesia or by bioluminescence. For the in vivo NC128 assay, 7.104 AMKL7

luciferase leukemic blasts were engrafted with the empty vector or NC128 after sorted for GFP. To monitor the

development of the disease by bioluminescence, luciferase assay was performed monthly. For ERG sgRNA in

vivo assay, 25.104 AMKL7

Luc leukemic blasts transduced with ERG sgRNA or empty vector, sorted on GFP

110

8

expression were injected. Immunophenotyping of leukemic cells from diseased animals were performed by flow

cytometer.

Flow cytometry. Cells analyzed by flow cytometry were stained in PBS 1X supplemented with 2% FBS for 30 minutes at 4°C

with washing prior to FACS analysis. Antibodies were purchased from BD or eBioscience for human (h)

antibodies (hCD41: HIP8; hCD42: HIP1; hKIT: 104-D2) or BD, eBioscience or Emfret for murine (m)

antibodies (mCD41: MWReg30; mCD42: 1C2, Xia.G5; mKIT: 2B8). Whole BM and spleen cells from mice

were collected, subjected to red blood cell lysis, and stained for FACS analysis. Cells were analyzed on a

FACSCantoII or Fortessa with FACS Diva software (BD Biosciences). Apoptosis assays were performed

following manufacturer's recommendations (AnnexinV-APC Apoptosis Detection Kit, BD Pharmingen). Cell

cycle analyses were performed through bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation and flow cytometer analysis

following the provider's instructions (APC BrdU Flow Kit, BD Biosciences). Briefly, cells were incubated in the

presence of BrdU for 1 hr, stained with anti-BrdU-APC antibody, prior to staining with 7-amino- actinomycin D

(7-AAD). For ploidy analyses, bone marrow cells were cultured in RPMI1640+10%FBS+50ng/ml of mTPO and

mSCF for 4 days prior to 2 hr incubation with Hoescht 33-342 (10µg/ml) and staining for 30 minutes with an

anti-mCD41-APC antibody. Analyses were gated on CD41+GFP

+ cells.

Western Blot and Immunoprecipitation. Total cells lysates were prepared as follows in 50mM Tris-HCl, pH 8, 150mM NaCl, 1% NP40, 1mM EDTA,

0,1% SDS, and 0,5% DOC supplemented with protease inhibitors (PMSF 1X, NAF 1X, Sodium Orthovanadate

1X, complete 1X). Western blotting was then performed using standard procedures using the following

antibodies from Abcam (ab) or Santa Cruz (sc): anti-CBFA2T3 (ab33072), anti-GFP (ab290), anti-ERG

(ab133264 and sc-271048), anti-GATA1 (sc-1233), anti-flag M2 (F1804), anti-HSC70 (sc-7298), anti-actin (AC-

40). Immunoprecipitation of GFP was performed with GFP-Trap agarose beads (Chromotek) with 1 hr

incubation.

DNA/RNA extraction, Real-time RT-PCR and Micro-array analyses. DNA and RNA were isolated using the RNeasy Mini/Micro or All prep DNA/RNA Micro Kit (Qiagen) and

quantified by NanoDrop (ThermoScientific). Reverse transcription was done with SuperScript II from

Invitrogen. Q-PCR was performed using SYBR Select master mix or Taqman Gene expression master mix

(Applied Biosystems) on 7500HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) following manufacturer's

recommendations. Probes (Applied Biosystems) were used to detect ERG (Hs01554629_m1), Erg

(Mm01214246_m1), GATA1 (Hs01085823_m1), GAPDH (Hs02758991_g1) and Gapdh (Mm99999915_g1)

selected as housekeeping gene. For micro-array analyses, RNA were isolated from GFP+ cells purified by flow

cytometry 24 hr (HEL cells) or 2-7 days (MO7e) after transduction using RNeasy Micro Kit (Qiagen) with on-

column DNAse treatment. Hybridizations were performed for 3 to 4 independent biological replicates on whole-

human-genome 4x60K v2 oligonucleotide microarrays (design 039494; Agilent). The supervised analysis of the

microarray data was conducted with the Class comparison tool in BrB after multiple testing and 5.10-4

FDR.

Differentially expressed genes were identified using the following parameters: fold-change>1.8, p<10-4

(random-

variance t-test). Violin plots were obtained using BoxPlotR (http://boxplot.tyerslab.com).

Transcriptional network and transcription factor activity computation. The gene regulatory network was computed using the ARACNe algorithm (Margolin et al., 2006) on the

GSE35874 dataset, with the following parameters: mutual information was computed with adaptive partitioning

(p < 1e-9), and significant interactions were selected after 100 bootstraps (p < 7e-10).

The activity of a transcription factor (TF) in a sample was computed using the expression of its predicted targets

by ARACNe. Each set of target is separated in activated and repressed targets based on the sign of the

correlation between the expression of the TF and its predicted targets in the dataset. To infer the activity of each

TF in the HEL cells dataset, we first z-transformed the gene expression profiles to normalize the expression of

each gene across samples. We then computed the enrichment score (ES) for the set of activated and repressed

targets separately (ESpos and ESneg respectively) of each TF using this z-transformed matrix of expression, as

described in the Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) original publication (Subramanian et al., 2005). The

final ES is computed as ESpos – ESneg, with higher positive values corresponding to higher activity of the TF in

a sample among the samples belonging to the HEL cells gene expression matrix.

Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) analyses have been performed with the version 5.0 of Molecular

signature database (MisgDB) using weighted statistics (Subramanian et al., 2005).

Chromatin immunoprecipitation and sequencing. ChIP protocol was adapted from the MagnaChIP kit protocol (Millipore). Cells (AMKL and MO7e-KI) were

fixed with 1% formaldehyde, lysed with Cell Lysis and then Nuclear Lysis buffers respecting concentration of

111

9

20.106 cells per mL, and finally sonicated (30-min cycle on Covaris apparatus; KBioscience). Sheared chromatin

was immunoprecipitated overnight using the following antibodies: anti-CBFA2T3 (Abcam, ab33072), anti-ERG

(Santa Cruz, SC354), anti-H3K27ac (ActiveMotif, #39133), anti-H3K4me1 (Diagenode, #C15410037), anti-

H3K4me3 (Diagenode, #C15410003), anti-H3K27me3 (Cell Signaling, #9733S) and rabbit IgG (Upstate, #12-

370). 1/10 of the sheared chromatin was used as a reference (Input). Immune complex collection was realized

with Protein G Sepharose (Sigma-Aldrich, P3296), 1h30 at +4°C. For GFP-ChIP, GFP-Trap agarose beads were

used (Chromotek). Rinses were done according to MagnaChIP kit protocol with Low salt, High salt and LiCL

immune complex wash buffers. Finally, elution was realized according the IPure Kit protocol (Diagenode, Cat

No C03010012) following manufacturer’s instructions. Three independent ChIP-seq experiments were

conducted for GFP, ETO2, ERG, H3K27ac, H3K4me3 and two for H3K27me3.

Enriched DNA from ChIP and Input DNA fragments were end-repaired, extended with an 'A' base on the 3′end,

ligated with indexed paired-end adaptors (NEXTflex, Bioo Scientific) using the Bravo Platform (Agilent), size-

selected after 4 cycles of PCR with AMPure XP beads (Beckman Coulter) and amplified by PCR for 10 cycles

more. Fifty-cycle single-end sequencings were performed using Illumina HiSeq 2000 (Illumina, San Diego, CA).

Reads were aligned in toto to human genome hg19 with BWA aln (v0.7.5a) and peak calling assessed using

MACS 2.0 with a q-value cut-off of 10-4

for ERG, and 10-3

for GFP, ETO2 and all histone marks. Peak-calling

analyses for each ChIP-seq were realized independently and then we created one specific list of peaks for each

mark including common peaks in at least 2 replicates. Annotation and motif analyses have been done with

HOMER (v4.7.2), with a p value <10-30

. Integrative Genomics Viewer (IGV 2.3.34) was used for representation.

All regions bound by ETO2 cofactors in normal megakaryocytes presented Fig. 3C were obtained using

published ChIP-seq data (GSE24674 dataset)(Tijssen et al., 2011) by merging regions bound by GATA1,

GATA2, RUNX1, FLI1 and SCL. Figure 3D shows individual ChIP-seq for GATA1, FLI1 and RUNX1 from

this dataset. Intensity profiles of ChIPseq data were done using ngsplot version 2.61.

List of oligonucleotides List of CRISPR/Cas9 and PCR primer oligonucleotides used in this study.

LOCUS FORWARD REVERSE

CRISPR guides

GLIS2 caccGGTGAACTGAGCCCATCCTG aaacCAGGATGGGCTCAGTTCACC

ERG caccGTGGGCAGCCCAGACACCGT aaacACGGTGTCTGGGCTGCCCAC

PCR on genomic DNA

GLIS2 (5'arm) GAGGCTAGGCAGAGCTGGA CTCGACCAGGATGGGCAC

GLIS2 (3'arm) TCACTCTCGGCATGGACGAG CAACGTGTCATGGGTCCAGC

ERG GAGCTGGGGCTACATACTGC TGTCCTTTCTCCCCCAGTCT

Q-PCR

mmGAPDH TGCACCACCAACTGCTTAG GATGCAGGGATGATGTTC

mmKit GAGTTCCATAGACTCCAGCGTC AATGAGCAGCGGCGTGAACAGA

mmGpIIb ACAAGCCTATCTGCCACA CGACACGTTGAGGCTTAG

mmGpIba GACCGAGTCATAGCCTGGAA GCAGGAAGAGCAAGATGAGG

mmErg GTGCCCAAAACTGAAGACCAGC GAGCTGTCTGACAGGAGTTCGA

mmGata1 AGCACTGGCCTACTACAGAG AGGAATTCCCTCCATACTGT

HsGAPDH GAAGGTGAAGGTCGGAGT GAAGATGGTGATGGGATT

HsERG GCTGCTCAACCATCTCCTTC ACAGGAGCTCCAGGAGGAAC

112

ARTICLE 2 (En cours de soumission pour publication)

Pediatric myeloid fusion oncogenes control leukemogenesis

through rewiring of native hematopoiesis

Cécile K. Lopez1,2,3,4, Esteve Noguera1,2,4, Vaia Stavropoulou5, Zakia Aid1,2,4, Paola Ballerini6,

Chrystèle Bilhou-Nabera7, Hélène Lapillonne7, Cécile Thirant1,2,4, Alexandre Fagnan1,2,4,9, Sarah

J. Kinston11, M’Boyba Diop2, Yann Lecluse2, Erika Brunet12, Loelia Babin12, Jean-Luc Villeval1,2,

Antoine H.F.M. Peters15, Riccardo Masetti16, Franco Locatelli17, William Vainchenker1,2, Muriel

Gaudry1,2, Sébastien Malinge1,2,3,4, Isabelle Godin1,2, Olivier A. Bernard1,2,3,4, Berthold Göttgens11,

Arnaud Petit6, Françoise Pflumio10, Jürg Schwaller5,*, Thomas Mercher1,2,4,9,*

113

Pediatric myeloid fusion oncogenes control leukemogenesis

through rewiring of native hematopoiesis

Cécile K. Lopez1,2,3,4, Esteve Noguera1,2,4, Vaia Stavropoulou5, Zakia Aid1,2,4, Paola Ballerini6,

Chrystèle Bilhou-Nabera7,Hélène Lapillonne7, Cécile Thirant1,2,4, Alexandre Fagnan1,2,4,9, Sarah J.

Kinston11, M’Boyba Diop2, Yann Lecluse2, Erika Brunet12, Loélia Babin12, Jean-Luc Villeval1,2,

Antoine H.F.M. Peters14, William Vainchenker1,2, Muriel Gaudry1,2, Riccardo Masetti15, Franco

Locatelli16, Sébastien Malinge1,2,3,4, Claus Nerlov17, Isabelle Godin1,2, Olivier A. Bernard1,2,3,4,

Berthold Göttgens11, Arnaud Petit6, Françoise Pflumio10, Juerg Schwaller5,*, Thomas

Mercher1,2,4,9,*

1INSERM U1170, Gustave Roussy, 94800 Villejuif, France 2Gustave Roussy, 94800 Villejuif, France 3Université Paris-Saclay, 94800 Villejuif, France 4Equipe labellisée Ligue Nationale Contre le Cancer, 75013 Paris, France 5Department of Biomedicine, University Children’s Hospital Beider Basel (UKBB), 4056 Basel, Switzerland 6Hôpital Trousseau, AP-HP, 75012 Paris, France 7Sorbonne Université, CRSA – Unité INSERM, AP-HP, Hôpital Trousseau, F-75012 Paris, France 8Hôpital Saint Antoine, AP-HP, 75012 Paris, France 9Université Paris Diderot, 75013 Paris, France 10Unité Mixte de Recherche 967 Inserm-CEA/DRF/IBFJ/IRCM/LSHL- Université Paris-Diderot-Université Paris-Sud, Equipe labellisée Association Recherche contre le Cancer, 92265 Fontenay-aux-Roses Cedex, France 11Wellcome and MRC Cambridge Stem Cell Institute and the Cambridge Institute for Medical Research, University of Cambridge, Cambridge, UK. 12Genome Dynamics in the Immune System Laboratory, Institut Imagine, INSERM, UMR 1163, Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 75015 Paris, France. 13INSERM U1037, Team 16, Center of Research of Cancerology of Toulouse, Hematology laboratory, IUCT-Oncopole, France 14Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research (FMI), 4058 Basel, Switzerland; Faculty of Sciences, University of Basel, 4056 Basel, Switzerland. 15Department of Pediatrics, "Lalla Seràgnoli", Hematology-Oncology Unit, Sant'Orsola-Malpighi Hospital, University of Bologna, Via Massarenti 11, 40137, Bologna, Italy. 16Department of Pediatric Hematology-Oncology, IRCCS Ospedale Bambino Gesù, Rome and University of Pavia, Italy 17MRC Molecular Hematology Unit, MRC Weatherall Institute of Molecular Medicine, Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, Oxford OX3 9DS, UK

*Correspondence: Thomas Mercher Institut Gustave Roussy, INSERM U1170

114

39 rue Camille Desmoulins, 94800 Villejuif Phone: +33 1 42 11 44 83 E-mail: [email protected] or Juerg Schwaller University Children’s Hospital Basel (UKBB) Department of Biomedicine (DBM), University of Basel ZLF-Lab 202 Hebelstrasse 20 CH-4031 Basel, Switzerland Phone: +41 61 265 3504 E-mail: [email protected]

Keywords:

Leukemia, pediatric, hematopoietic stem cell, progenitor cell, cellular identity, self-renewal, transcription factor, megakaryocyte, HSC, patient-derived xenograft, PDX, childhood, transcription, AML-M7, AMKL, stemness.

115

Summary

Fusion oncogenes are frequently associated with high-risk pediatric cancers. How these genetic

alterations lead to age- and phenotype-specific cancers remains unclear. We report that

aggressive pediatric acute megakaryoblastic leukemia is associated with younger age at

diagnosis than other myeloid leukemia. Inducible transgenic murine models showed that

expression of pediatric leukemia-associated ETO2-GLIS2 and MLL-AF9 fusion oncogenes in

fetal hematopoiesis was required to induce a megakaryoblastic phenotype. Hematopoietic stem

cells, but not committed progenitor cells, presented massive rewiring of master transcription

factors activities at the single cell level. Switching off ETO2-GLIS2 expression in leukemic blasts

restored the long-term hematopoietic stem cell potential in vivo. These findings demonstrate that

age and phenotype specificities in pediatric myeloid leukemia are determined by ontogeny-

dependent differential susceptibility of hematopoietic stem and progenitor cells to transformation

by fusion oncogenes.

116

Increasing evidences support a correlation between age, driver oncogene and disease

phenotype in pediatric cancers1,2. The differences between adult and pediatric cancers may

stem from either the distinct properties of the driver oncogenes or inherent differences between

fetal and adult tissue. In acute leukemia, some fusions oncogenes are acquired in utero and are

diagnosed almost exclusively during childhood3,4,5 for which efficient leukemogenesis models are

lacking6. Childhood de novo acute megakaryoblastic leukemia (AMKL) is an aggressive subtype

of acute myeloid leukemia (AML) that harbors recurrent fusion oncogenes (e.g. ETO2-GLIS2,

OTT-MAL, NUP98-KDM5A)7–10. Intriguingly, several AMKL fusions are also detected in patients

with other AML subtypes8,11,12, although the determinants of the genotype/phenotype association

remain unknown. Similarly to other aggressive childhood cancers such as Ewing sarcoma13,

these fusions are rarely associated with additional recurrent mutations in patients9,14 and they

strongly impact the epigenome15,16, thereby suggesting that global transcriptional deregulation is

sufficient to drive the disease and a likely candidate for direct therapeutic targeting17,18.

Nevertheless, these cancers currently lack adequate animal models that precisely recapitulate

the characteristics of the disease observed in patients. Such models could provide mechanistic

insights to understand pediatric cancer specificity.

Several differences between fetal and adult normal hematopoiesis exist19,20. In adults,

hematopoietic stem cells (HSC) are at the top of a hierarchy and differentiate toward more

committed progenitors to generate the mature blood cell types. Although the precise trajectories

that govern normal hematopoiesis remain a matter of debate21–24, leukemogenic processes are

strongly influenced by the type of cell targeted by fusion oncogenes25. A recent study has

proposed that fetal liver (FL) hematopoiesis primarily involves multipotent progenitors, while

adult hematopoiesis is chiefly regulated by committed progenitors with more restricted lineage

potentials26. This view is largely supported by single cell transcriptome data showing that most

adult hematopoietic progenitors present signs of lineage commitment27–29,24,21. At the molecular

level, fetal and adult hematopoiesis present differential activity of LIN28B30–33, GATA factors-

regulated Polycomb complexes34 and CEBPA/MYCN transcription factors35.

To better understand the genotype/phenotype association in pediatric cancers, we investigated

how the fetal and adult cellular architectures22–24,36,27 impact the transformation and disease

phenotype driven by ETO2-GLIS2 (hereafter abbreviated EG). We developed an inducible

transgenic mouse model that efficiently phenocopies the human disease with striking differences

117

in latency, phenotype and molecular wiring, depending on the ontogenic stage at which the

driver fusion oncogene is activated.

AMKL is diagnosed at a younger age than AML in pediatric patients

We first screened a cohort of 276 pediatric leukemia patients for the presence of EG and

confirmed that EG occurred in AMKL patients and other AML (AML-M0 to AML-M5) subtypes12,

with an overall incidence of 4.7% (Fig. 1a,b, Supplementary Table 1). The overall survival was

poor for all patients with a trend towards a worse prognosis for those presenting with an AMKL

phenotype (Supplementary Fig. 1a). In addition to the known EG+ MO7e megakaryoblastic cell

line, we found that the CMS leukemia cell line was also EG+ and presented with a myeloid

phenotype (Supplementary Fig. 1b-e). Strikingly, EG+ AMKL patients were diagnosed at a

significantly younger age of (1.66±0.18 years [n=33]) compared with other EG+ AML patients

(8.53±1.73 years [n=15]; p<0.0001)(Fig. 1c). A similar trend was observed in AMKL patients

carrying either NUP98-KDM5A (Fig. 1d) or MLL fusions (Fig. 1e) as well as for all AMKL patients

regardless of the genetic subgroup (Fig. 1f).

We applied patient-derived xenografts (PDX)8 to expand EG+ AMKL and EG+ AML cells in

immunodeficient mice. Overall, 3/5 EG+ AMKL and 2/8 EG+ AML transplants successfully

engrafted (Supplementary Table 1). While AMKL xenografts generally expressed the

megakaryoblastic marker CD41+ but not the myeloid marker CD15- (as observed for patient

AMKL-26), AML blasts were CD15+CD41- (e.g. patient AML-17)(Fig. 1g). Interestingly, we

identified a six-year-old EG+ patient (AML-04) diagnosed as AML-M2, who presented with

immature blasts (CD34+CD15-CD41-) and two smaller cellular fractions (CD34+CD41+CD15- or

CD34+CD41-CD15+)(Fig. 1g). All cell populations presented with distinct morphologies (Fig.

1h,1i) and expressed EG (Supplementary Fig. 1f). Upon injection of the three flow-purified cell

populations into secondary recipients, only the immature CD34+CD41-CD15- cell population

successfully engrafted into recipients (Fig. 1j) and regenerated the three populations (Fig. 1k),

thereby indicating dual megakaryoblastic and myeloid differentiation.

Together, these results show that pediatric AMKL occurs at a significantly younger age than

other AML subtypes irrespective of the driver oncogene. Importantly, the dual

megakaryoblastic/myeloid phenotype in the EG+ patient indicates that AMKL-associated fusion

oncogenes can transform HSC or multipotent progenitors.

118

ETO2-GLIS2 efficiently induces leukemia in mice

To analyze the determinants of EG-driven leukemogenesis and the associated megakaryoblastic

and myeloid phenotypes, we established a doxycycline (Dox)-regulated transgenic mouse model

(Supplementary Fig. 2a). Hereby, EG expression was controlled by a reverse tetracycline-

controlled transactivator (rtTA) integrated into the Rosa26 gene locus. To assess the

consequences of EG expression, we continuously exposed double transgenic iEG:rtTA females

(hereafter abbreviated iEG) to Dox (Dox+, Fig. 2a). Although most hematological parameters

remained unchanged at six weeks post-induction (data not shown), iEG animals consistently

presented with an abnormal bone marrow (BM) Lin-CD150-Kit+CD41+ cell population

(Supplementary Fig. 2b) bearing a myeloid and megakaryoblastic clonogenic potential in

methylcellulose cultures (Supplementary Fig. 2c). Later, Dox-treated iEG animals developed

lethal hematological malignancies with a prevalence of 96.9% (31/32 mice, Supplementary Fig.

2d), which was classified into three groups based on the most abundant blast populations (Fig.

2b, Supplementary Fig. 2e). Approximately 50% of the mice (9/19, Group 1) presented with an

immature phenotype (Kit+CD41-) with a median latency of 152 days (Fig. 2c). Group 2 presented

with a megakaryoblastic phenotype (CD41+) with a median latency of 164 days (Fig. 2c), while

group 3 presented with a myeloid phenotype (CD11b+Gr1+) with a median latency of 311 days.

All diseased mice developed hepatosplenomegaly (Fig. 2d) and anemia (Fig. 2e). Group 2 was

associated with significantly higher white blood cell (WBC) counts, while group 3 was

thrombocytopenic (Fig. 2e). Histological analysis confirmed that BM and spleen from group 2

mice were infiltrated with immature von Willebrand factor (Vwf)+ megakaryoblasts (Fig. 2f,

Supplementary Fig. 2f). The cell-autonomous nature of the disease and its dependence on EG

expression was demonstrated by transplantation of BM cells into Dox+ wild-type (WT) recipients

that developed disease after a shorter mean latency (120+/- SD days), while Dox- recipients

never developed any disease (Fig. 2g-k, Supplementary Fig. 2f). Collectively, this inducible

transgenic model faithfully recapitulates EG+ leukemia development as observed in patients.

Developmental stage determines the phenotype of ETO2-GLIS2+ leukemia

To investigate the impact of the developmental stage, we induced iEG expression in Lin-

hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) obtained from fetal liver (FL) at embryonic day

(E) 12.5, newborn BM (1-2 weeks old) and adult BM (ABM, 8 weeks old) (Fig. 3a). iEG

expression increased the clonogenic activity over the course of four passages in all contexts (Fig.

3b). While iEG+ FL-derived cells homogeneously expressed CD41, iEG+ ABM-derived cells also

consistently showed a CD11b+Gr1+ myeloid phenotype (Fig. 3c, Supplementary Fig. 3a,b).

119

Newborn-derived iEG cells presented with a myelo/megakaryoblastic intermediate phenotype

between that of FL and ABM. Similar results were obtained upon retroviral expression of EG in

WT cells (Supplementary Fig. 3c). These data indicate that fetal hematopoiesis favors EG-

induced megakaryoblastic transformation in vitro.

To address the consequences of EG expression on fetal progenitors in vivo, we exposed

pregnant females with E13 embryos to Dox and analyzed the embryos 36 hours later. All EG-

expressing embryos showed gross morphological and hematological abnormalities (Fig. 3d),

with decreased erythroid and myeloid cells and increased megakaryoblastic progenitors (Fig. 3e).

To compare the capacity of FL- and ABM-derived iEG cells to develop disease, we transplanted

1x106 mononuclear iEG cells from E14.5 FL or ABM donors (carrying a ubiquitously-expressed

GFP reporter to track their progeny) donors into Dox+ WT recipients (Fig 3f). One month post-

engraftment, the recipients of FL-derived iEG cells showed a significantly higher percentage of

GFP+ cells in the BM than the recipients of ABM-derived cells (Fig. 3g), which was associated

with increased CD41+ cells and decreased myeloid cells (Fig. 3h). Importantly, iEG FL cell

recipients developed short latency leukemia (41.5 days, p=0.0008)(Fig. 3i) characterized by high

WBC, anemia, thrombocytopenia, splenomegaly, and megakaryoblast infiltration in several

organs (Fig. 3j-m and data not shown).

MLL-AF9 and NUP98-KDM5A are also found in both human AML and AMKL. However, current

murine models only displayed myeloid, but not megakaryoblastic, phenotype. To assess whether

the ontogenic stage affects the phenotype induced by these fusion oncogenes, we expressed

them in FL and ABM HSPC from WT mice. We found that the FL cells gave rise to an increased

CD41+ megakaryoblastic phenotype compared with ABM cells (Supplementary Fig. 3d,e). For

MLL-AF9, we also used a similar inducible MLL-AF9 transgenic model25 in which induction of

iMLL-AF9 in purified CD41+ FL cells resulted in long-term self-renewal and establishment of a

permanent cell line that presented striking maintenance of megakaryocytic potential

(Supplementary Fig. 3f). Taken together, these observations show that the developmental stage

determines the predominance of aggressive megakaryoblastic over myeloid leukemia induced

upon expression of pediatric fusion oncogenes.

ETO2-GLIS2-induced AMKL is an HSC-derived leukemia

To address the consequence of EG on distinct populations of the hematopoietic hierarchy, we

purified control (CTRL) and iEG long-term HSC (LT-HSC) and multipotent progenitors (MPP2,

MPP3 and MPP4)37 obtained from E14.5 FL or ABM (Supplementary Fig. 4a) and characterized

their clonogenic and phenotypic profile in Dox+ methylcellulose cultures. CTRL FL LT-HSC and

120

MPP generated both myeloid Gr1+ and megakaryoblastic CD41+ cells (Fig. 4a,b, Supplementary

Fig. 4b), thereby confirming that most normal mouse FL progenitors maintain a

megakaryoblastic potential as observed in humans26. iEG FL LT-HSC and MPP2 cells

exclusively generated CD41+ cells (Fig. 4b, Supplementary Fig. 4b), MPP3 cells yielded a large

majority of CD41+ cells and rare Gr1+ myeloid cells (Fig. 4b, Supplementary Fig. 4b), and MPP4

cells did not significantly form any colony (Supplementary Fig. 4c). iEG FL LT-HSC and MPP2/3

cells showed increased replating activity compared with CTRL (Fig. 4c). To define the

differentiation potential of iEG-transformed cells, iEG FL LT-HSC and MPP2/3 cells derived from

the fourth plating were cultured without Dox (Fig. 4a), which resulted in myeloid and

megakaryoblastic differentiation (Fig. 4d, Supplementary Fig. 4d).

CTRL ABM LT-HSC formed Gr1+ and CD41+ colonies (Fig. 4e,f), whereas MPP2/3/4 cells

generated almost exclusively Gr1+ cells (Fig. 4f, Supplementary Fig. 4b), thus indicating that the

megakaryoblastic potential is qualitatively and quantitatively lower in ABM than in FL

(Supplementary Fig. 4e). By contrast, iEG ABM LT-HSC gave rise almost exclusively to CD41+

cells, while MPP2/3/4 cells generated CD11b+Gr1+ myeloid cells with a higher proportion than

iEG FL MPP (Fig. 4b,f, Supplementary Fig. 4b). While iEG FL MPP4 cells did not generate

colonies, iEG ABM MPP4 cells showed increasing clonogenic activity upon serial replatings and

a myeloid morphology (Figure 4f-h).

We next investigated whether iEG endows single LT-HSC or MPP3 cells with dual

myeloid/megakaryoblastic phenotypic potential as observed in the AML-04 patient. The majority

(56%) of CTRL ABM LT-HSC-derived cells showed a dual phenotype, while others showed

either megakaryoblastic or myeloid phenotypes. Upon iEG induction, ABM LT-HSC formed

primarily megakaryoblastic colonies (89%) with only a few dual phenotype colonies (11%)(Fig.

4i,j, Supplementary Fig. 4f). While CTRL MPP3 cells exclusively generated myeloid cells under

these conditions, 48% of iEG MPP3 cells yielded a dual megakaryoblastic and myeloid profile,

thereby indicating that EG imposes megakaryoblastic as well as dual myeloid/megakaryocytic

potential on single MPP3 progenitors.

Collectively, these data show that differences between murine FL and ABM HSPC affect their

megakaryoblastic transformation potential. These findings also demonstrate that EG expression

in ABM LT-HSC results in an exclusively megakaryoblastic phenotype, while expression in

further committed progenitors is required for myeloid transformation.

121

ETO2-GLIS2 rewires the transcriptional network in LT-HSC

To characterise the molecular consequences of EG expression, we performed single cell

RNAseq (scRNAseq) using LT-HSC and MPP4 cells from CTRL and iEG mice and after a 24

hour Dox induction (Fig. 5a, Extended Tables 2-5). Compared with CTRL, iEG LT-HSC showed

151 differentially expressed genes (p<0.05, Supplementary Fig. 5a). Previously defined EG

signatures in AMKL patients were enriched in EG+ LT-HSC (Fig. 5b), thereby showing that iEG

expression in LT-HSC recapitulates the molecular consequences observed in EG+ AMKL

patients. By contrast, iEG MPP4 cells showed few differentially expressed genes and no

enrichment for EG+ AMKL patient signatures (Supplementary Fig. 5b-d, Table 5).

As scRNAseq is prone to so-called "drop-out" events for low-expression genes including

transcription factors (TF), we reasoned that computing the expression levels of the targets of a

given TF would provide a more robust assessment of the TF activity. Therefore, we used the

ARACNe and VIPER software programs38 to infer a network of TF targets and compute the

activity of each TF at the single-cell level (Supplementary Fig. 6a). Two networks were

computed from our iEG data to obtain TF targets in the context of EG expression ("EG network",

Extended Table 6) or published normal HSPC data39 to obtain TF targets in WT HSPC("normal

network", Extended Table 7). The capacity to correctly predict activity for several known TF was

confirmed using an independent normal HSPC dataset39 (Supplementary Fig. 6b). In our

scRNAseq data, iEG presented an expected higher expression level and activity in iEG+ cells

while ERG (a known EG target) showed significantly higher activity without difference in mRNA

expression (Fig. 5c, Supplementary Fig. 5c). Similarly, higher activity was inferred for many key

TF without significant differential mRNA expression (Fig. 5d), thus highlighting the value of TF

activity prediction in scRNAseq analysis. Regardless of the starting dataset, networks

consistently inferred higher activity levels for several human oncogenes or cofactors (e.g.

MECOM, HOXA10, MEIS1, ERG) and lower activity levels for factors of the heptad complex or

factors important for megakaryocyte maturation (e.g., LDB1, IKZF1, RBM15) (Fig. 5e,

Supplementary Fig. 7 and Tables 8-11)40–42.

Clustering of single cells using the t-SNE method revealed that TF activity profiles can be used

to better segregate populations than expression data and confirmed that iEG expression

impacted LT-HSC more than MPP4 cells (Fig. 5f,5g). Compared with WT LT-HSC or iEG MPP4

cells, iEG LT-HSC showed an enhanced stem cell signature (including higher expression and

activity of GATA2, MECOM, and higher expression of Esam), an higher expression of platelet-

biased HSC markers (e.g. Vwf and Pf4) without evidence of megakaryocytic maturation (lower

122

GATA1 activity) and a lower expression of myeloid (e.g. IRF8, CEBPA) and erythroid programs

(Fig.5f-j, Supplementary Fig. 5e,7b).

HSC lineage specification involves TF switches including a SPI1/CEBPA module directing

myeloid development43,44 and an ERG-GATA2/GATA1 balance45 regulating the megakaryocytic

fate, which is altered in human AMKL10. As these TF are also involved in hematopoietic

ontogeny34,35, we investigated TF expression and functional contribution to EG-induced

megakaryoblastic and myeloid phenotypes. Twenty-four hours after iEG induction, FL HSPC

expressed higher levels of Erg and Gata1 and lower levels of Cebpa and Spi1 compared with

ABM HSPC (Supplementary Fig. 8a). Similar results were obtained comparing FL and ABM

HSPC-derived cells from iMLL-AF9 (Supplementary Fig. 8b). We quantified these TF in iEG

ABM LT-HSC- and MPP4-transformed cells. Erg and Gata1 were more expressed in iEG LT-

HSC-derived cells than in iEG MPP4-derived cells, while Cebpa and Spi1 were highly expressed

in MPP4 cultures (Supplementary Fig. 8c). We then assessed whether increasing ERG or

GATA1 activity imposed a megakaryoblastic phenotype in iEG MPP4 cells and whether

increasing SPI1 or CEBPA activity biased iEG LT-HSC toward a myeloid phenotype

(Supplementary Fig. 8d-f). Retroviral ERG or GATA1 expression enhanced the megakaryocyte

phenotype in iEG MPP4 cells. In iEG LT-HSC, expression of CEBPA, but not SPI1, enhanced

the myeloid phenotype.

To corroborate these findings in human leukemia, we compared ERG, GATA1, SPI1 and

CEBPA expression levels in leukemic blasts from an AMKL patient (AMKL-26), in different

populations from the dual AML/AMKL phenotype patient (AML-04) and in an AML patient (AML-

02) (Supplementary Fig. 8g). AMKL blasts showed high ERG and GATA1 and low SPI1 and

CEBPA expression, while AML blasts presented an opposite pattern. Similar expression profiles

were observed in the human EG+ cell lines MO7e (AMKL) and CMS (AML) (Supplementary Fig.

1e). In the dual phenotype AML, the most immature CD34+CD41-CD15- blasts showed the

highest ERG expression compared to CD41+ and CD15+ blasts, while the CD41+ blasts showed

the highest GATA1 expression and the CD15+ blasts showed the highest SPI1 expression levels.

Notably, CD41+ blasts showed an unexpected combination of GATA1high and CEBPAhigh

expression.

Collectively, these data indicate that iEG expression in LT-HSC rapidly imposes conflicting TF

activities of multiple master regulators of myeloid and erythroid lineages, thereby supporting

early blockage of HSC differentiation in a megakaryoblastic state.

123

ETO2-GLIS2 reversibly transforms LT-HSC

As cellular and molecular observations indicate that EG hijacks of HSC properties, we assessed

in vivo disease development from purified populations and tracked the differentiation and long-

term hematopoietic potential of iEG-transformed cells after Dox removal.

GFP+ FL LT-HSC from E14.5 iEG embryos, or LT-HSC and MPP cells from iEG ABM were

transplanted into Dox-treated WT recipients (Fig. 6a). The iEG FL LT-HSC recipients developed

fully penetrant and rapid (median: 27 days) lethal leukemia (Fig. 6b). The iEG ABM LT-HSC

recipients developed disease after a strikingly longer latency (median: 312 days, p=0.017) (Fig.

6b, c). By contrast, iEG ABM MPP3 or MPP4 did not result in any disease (Fig. 6c). The FL iEG

LT-HSC recipients presented with a more severe disease than the ABM iEG LT-HSC mice as

assessed by greater degree of splenomegaly, higher white blood counts, higher percentage of

CD41+ cells and lower platelet counts, maturing myeloid populations and lymphoid cells in BM

and spleen (Fig. 6d-g). Histological analyses showed that the BM, spleen and liver were

infiltrated with GFP+ cells that were weakly vWF+. The iEG ABM LT-HSC recipients displayed

rare maturing vWF+ megakaryocytes that were all GFP-, which was not observed in the iEG FL

LT-HSC counterparts (Supplementary Fig. 9a, data not shown).

To investigate the differentiation potential of LT-HSC-derived iEG leukemic cells, we purified the

immature CD41+CD11b-Gr1- blasts from iEG FL LT-HSC diseased recipients and grew them in

cultures in absence of Dox. As compared with the immature blasts maintained with Dox, they

generated both maturing CD41+CD42+ megakaryocytes and CD11b+Gr1+ myeloid cells

(Supplementary Fig. 9b). This was associated with reduced expression of iEG and its known

target Erg, while Gata1 expression increased, consistent with broad differentiation capacities

(Supplementary Fig. 9c). To assess long-term hematopoietic potential, BM cells from the ABM

LT-HSC-engrafted diseased recipients were transferred into secondary Dox-treated recipients

(Fig. 6h). Two weeks post-transplant (=D0 time point), when recipients showed the first signs of

disease (Supplementary Fig. 9d,e), some recipients were maintained on Dox (Group A) while

Dox-treatment was ceased in group B. At three days after Dox-removal, the platelets counts

were back to normal in group B; 80% of platelets originated from iEG-transformed cells as

shown by GFP expression (Fig. 6i). GFP+ cells were also detected later in RBC and WBC (Fig. 6i,

Supplementary Fig. 9f). Analysis at six-months post Dox removal demonstrated that GFP+ cells

where still present in all analyzed hematopoietic compartments, including mature B and T cells

(Fig. 6j, Supplementary Fig. 9g). Together, these data show that EG expression in FL LT-HSC

results in a rapid and aggressive AMKL in vivo associated with maintenance of long-term HSC-

like differentiation potential once the driver oncogene is switched off.

124

DISCUSSION

In toto, our observations in patient samples and in inducible transgenic mouse models for

pediatric leukemia-associated fusion oncogenes, including ETO2-GLIS2 and MLL-AF9, provide

experimental evidence that aggressive pediatric AMKL originates in HSC and, more globally,

that age and phenotype-specific associations observed in human patients rely on changes in the

cellular architecture during hematopoietic ontogeny (Supplementary Fig. 10).

Our data show that expression of EG in HSC, but not in further committed progenitors, resulted

in AMKL development in vivo. The previous lack of in vivo transformation46,47,our unpublished data could

therefore be due to a poor targeting of HSC by retroviral transduction. This inducible model was

also instrumental in demonstrating that HSC-derived EG+ leukemic cells can maintain long-term

reconstitution and differentiation properties upon withdrawal of the driver oncogene. In adult

hematopoiesis, several cellular and gene expression studies have indicated the close proximity

between HSC and megakaryocytic states in normal and stress conditions22–24,29,48,49, thus

prompting the hypothesis that megakaryopoiesis may represent the native differentiation

pathway for HSC24. Our data indicate that EG strongly rewires master hematopoietic regulator

activities in HSC (e.g. heptad complex and HOX-related factors) toward a megakaryoblastic

state and that targeting HSC is required for pediatric AMKL pathogenesis. This hypothesis is

also supported by the role of other factors in both normal HSC and megakaryocyte biology and

their mutation in pediatric AMKL (e.g. OTT1/RBM15)50. Taken together, we propose a

conceptual framework for pediatric AMKL in which transcriptional constraints imposed by distinct

oncogenes represent molecular switches that block HSC as they engage the native

megakaryocytic differentiation pathway.

This study also demonstrates that the transforming potential of pediatric oncogenes is strongly

dependent on the ontogeny-related dynamics of the hematopoietic tissue architecture. Indeed,

EG expression in LT-HSC exclusively generated a megakaryoblastic phenotype, while the

development of a myeloid phenotype required targeting of adult MPP. Importantly, our finding

that phenotypic output of transformation by a pediatric oncogene relies on both the ontogenic

stage and the targeted cell type is consistent with recent findings that normal fetal hematopoiesis

primarily involves multipotent HSPC (endowed with megakaryocytic potential), while adult

hematopoiesis presents a higher ratio of committed progenitors (lacking megakaryocytic

potential)26. Therefore, we propose that the inherent differences between fetal and adult

hematopoiesis, including a higher proportion of multipotent versus myeloid-committed

progenitors at the fetal stage, underlies the association between AMKL and younger childhood

125

AML. As the prevalence of other megakaryocyte-related diseases decreases after birth (e.g.,

Trisomy 21 AMKL and thrombocytopenia absent radii syndrome)51–53, it is likely that the

importance of this ontogeny-related architectural change may extend to several other human

megakaryocyte/platelet-related diseases. Furthermore, multiple pediatric cancers are driven by

strong epigenetic fusion oncogenes in the context of a low mutational burden, including Ewing's

sarcoma and rhabdomyosarcoma, for which the cellular origin is poorly defined13, and

glioblastoma, for which oncogenic drivers have been recently shown to arise in stem cells54.

Therefore, a precise characterization of the changes in the cellular architecture of the relevant

tissues of origin should improve our understanding of the heterogeneous clinical presentations in

other pediatric cancers and facilitate the establishment of other disease models that may serve

as experimental platforms to develop more selective therapeutic strategies.

AUTHORS CONTRIBUTION

CKL designed, performed, analyzed experiments and drafted the manuscript.

EN and MD performed bioinformatics analyses.

VS established the iEG ES cell and mouse lines and initiated in vivo induction.

ZA and CT, performed analyses of murine models.

CBN performed FISH analyses.

YL performed flow cytometry analyses and cell sorting.

PB, HL, ED, RM, FL and AP provided patient samples and clinical information.

SJK and BG generated single RNAseq data.

EB, JLV, PDA, WV, MG, SM, IG, AHFMP, OAB, BG and FP provided major intellectual inputs

and reagents.

JS and TM conceived and supervised the project; designed, performed and analyzed

experiments and wrote the manuscript.

All authors revised and approved the final version of the manuscript.

ACKNOWLEDGMENTS

We are grateful to Michael Kyba for the generous gift of the A2Lox-Cre ES cells and to Peter D.

Aplan and Olivier Delattre for critical reading of the manuscript. We thank Clarisse Thiollier,

Olivier Bluteau, Lou Le Mouël, Claude Preudhomme, Lila Diamanti, Nassera Abermil, Julie

126

Chaumeil, Camille Lobry and Sabine Juge for their expertise and helpful discussions. We thank

the Gustave Roussy institute facilities for mouse care (Patrick Gonin and Karine Ser-Leroux),

bioinformatics support (Philippe Dessen and Daniel Gautheret), and Paul Zanardo for excellent

administrative assistance.

This work was supported by the Association Laurette Fugain (ALF-2015/13 to TM), SIRIC-

SOCRATE (INCa-DGOS-INSERM 6043 to TM), Fondation pour la Recherche Médicale (to ZA:

FRM-ING20150532273, CKL), Fondation de France (FdF-00057925 to CT and TM), Lady Tata

Foundation (R14120LL to CT), Cancéropôle Ile de France (to CKL and Emergence 2015),

Gustave Roussy Genomic Core Facility – TA2016 (to CKL), Institut National Du Cancer (PLBIO-

2014-176 and PLBIO-2018-169 to TM), PAIR-Pédiatrie/CONECT-AML (COllaborative Network

for Children and Teenagers with Acute Myeloblastic Leukemia: INCa-ARC-LIGUE_11905 and

Association Laurette Fugain), Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (to FL). AHFMP was

supported by the Novartis Research Foundation. SJK and BG were supported by a Bloodwise

Specialist Programme grant (12029) and infrastructure funding from the Wellcome to the

Wellcome & MRC Cambridge Stem Cell Institute. JS was supported by the Swiss National

Science Foundation (31003A_173224/1), the Swiss Cancer League (KFS-3487-08-2014), the

San Salvatore Foundation (Lugano, Switzerland), the Novartis Foundation for Biomedical

Research and the Gertrude von Meissner Foundation (Basel, Switzerland). TM is an Equipe

Labellisée LIGUE principal investigator.

The authors declare no competing financial interests.

DATA AVAILABILITY STATEMENT

Single cell RNAseq data were deposited into EBI - Array-Express under the accession number E-MTAB-7213.

127

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129

Fig. 1: AMKL is diagnosed at a younger age than AML in pediatric patients a) Representative fluorescent in situ hybridization with probes detecting ETO2 (Green) and

GLIS2 (Red) in leukemic cells from an EG+ AML patient. The yellow signal results from the red-green overlap, thus indicating the derivative chromosome carrying the EG fusion.

b) Frequencies of EG+ patients with AMKL (n=34), other AML subtypes ("AML M0-5", n=242) and in the entire ELAM02 cohort ("All AML", n= 276).

c) Age at diagnosis of EG+ patients obtained from pooling data from the ELAM02 cohort and published reports9,12,55–58. AMKL (n=33) vs AML (n=15), p<0.0001.

d) Age at diagnosis of NUP98-KDM5A+ patients, AMKL (n=27) vs AML (n=4), p=0.0017. e) Age at diagnosis of patients with MLL fusions, AMKL (n=18) vs AML (n=88), p=0.095. f) Age at diagnosis of patients with AMKL (n=132) vs. other AML (n=500) subtypes, p<0.0001. g) Flow cytometry analyses of primary patient-derived xenografts (PDX) obtained from AMKL

and AML patients. Analyses are gated on CD34+ human blasts. h) Experimental design of flow cytometric sorting of various leukemia cell populations analyzed

in i-k. i) Representative cell morphology of the three leukemic cell populations on cytospots. Wright-

Giemsa staining. Magnification: x100.

0

5

10

15

20

25

0

5

10

15

20

25

0

5

10

15

20

25

a

d e f

c

g

b

CD41-CD15+ CD41+CD15-

h

i

0 103 104 105

0

103

104

105 7.87 0.335

8.2983.5

7.9 0.3

8.3 83.5

ETO2-GLIS2+

Patient Population Engrafted

AMKL-26 CD34+CD41+ 6/6

AML-04

CD15-CD41- 6/6

CD15+CD41- 0/6

CD41+CD15- 0/5

CD41-CD15-

Flow sorting

CD41-CD15-

CD41+CD15-

CD41-CD15+

Morphology

2nd PDX

1st PDX

AML-04 AMKL-26 AML-17

CD

15

CD41

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 0.0 0.4

93.56.20 102 103 104 105

0

102

103

104

105 96.5 0.5

0.42.6

0.4 13.8

10 75,9

Chr16 Inv(16)

Ag

e a

t d

iag

nosis

(y

ea

rs)

MLL-fusion+

Ag

e a

t d

iag

no

sis

(y

ears

)

j k

AML

Ag

e a

t d

iag

no

sis

(y

ears

)

Red:GLIS2Green:ETO2

AML-04 2nd PDX

Phenotype EG+ Total %

AMKL 8 34 23.5%

AML M0-5 5 242 2.1%

All AML 13 276 4.7%

***

***

AMKL AML M0-5

AMKL AML M0-5 AMKL AML M0-5

0

5

10

15

20

25

Ag

e a

t d

iag

no

sis

(y

ears

)

NUP98-KDM5A+

**

AMKL AML M0-5

AML-04

CD

15

CD41

130

j) Secondary xenotransplantation of various cell populations from AML-04 indicates that only CD41-CD15- cells propagated the disease.

k) CD15 and CD41 expression on CD34+ cells obtained from recipients of 3x105 CD15-CD41- cells one-year post-transplant.

Statistical significance is indicated as p values (Student’s t test). *: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001.

131

Fig. 2: ETO2-GLIS2 efficiently induces leukemia in mice a. Experimental design: disease-inducing potential was assessed by providing doxycycline

(Dox) to naive iEG female mice (primary). Cell autonomous leukemogenesis was ascertained by transplanting 106 BM cells from iEG mice induced at eight weeks of age and for 45 days into wild-type C57BL/6 recipients with or without exposure to Dox (secondary).

b. Representative flow cytometry analysis of Kit+ and CD41+ expression (upper panels: BM) or CD11b+ and Gr1+ expression (lower panels: spleen) of primary diseased iEG mice defining three phenotypes: Group1=immature (Kit+ without lineage markers), Group2=megakaryoblastic (primarily CD41+) and Group3=myeloid (primarily CD11b+Gr1+) (CTRL n=5, iEG n=19 in total).

c. Kaplan-Meier survival plot of Dox-exposed iEG mice according to the three phenotypes described in b (CTRL n=11, iEG n=19 in total), p<0.0001.

d. Spleen and liver weights in primary iEG mice according to the three phenotypes described in b (1 = immature, 2 = CD41+ and 3 = CD11b+Gr1+). Spleen (CTRL vs. Group1 p=0.0005, CTRL vs. Group2: p=0.0002, CTRL vs. Group3: p=0.0003), liver (CTRL vs. Group1: p=0.0164, CTRL vs. Group2: p=0.0060, CTRL vs. Group3: p=0.0066).

e. Peripheral blood counts of diseased iEG mice with the different phenotypes. RBC (CTRL vs. Group1: p=0.0002, CTRL vs. Group2: p<0.0001, CTRL vs. Group3: p=0.0007), WBC (CTRL

0

1

2

3

4

5

0

10

20

30

40

50

-1

0

1

2

3

4

5

1.0

1.5

2.0

2.5

0

1

2

3

0 50 100 150 2000

50

100

0

500

1000

1500

2000

2500

0

50

100

150

200

0

6

12

18

0

1

2

3

4

5

0

1

2

3

4

5

0 200 400 6000

50

100

CTRL

Group 1

Immature

b

a

iEG

Dox + Dox + or -

BMT

(Panels b à f) (Panels g à k)

c

e

f

Kit

CD41

Gr1

CD11b

Group 3

Myeloid

i

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 4.5 0.4

4.191.00 102 103 104 105

0

102

103

104

105 15.0 1.2

3.480.50 102 103 104 105

0

102

103

104

105 6.0 3.0

28.462.60 102 103 104 105

0

102

103

104

105 5.9 0.5

0.693.1

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 3.0 2.5

4.590.00 102 103 104 105

0

102

103

104

105 2.8 15.5

4.677.10 102 103 104 105

0

102

103

104

105 0.4 2.5

1.695.50 102 103 104 105

0

102

103

104

105 4.8 33.5

4.757.0

g

h

Figure 2

RBC WBC Plt

Spleen Liver

Time(days)

Cells(x103/m

m3)

Weight(g)

Time(days)

Survival

CTRL Group 2

HE

vW

F

Spleen Liver

We

igh

t (g

)

We

igh

t (g

)

j D

ox -

D

ox +

K

it

CD41

Gr1

CD11b

Kit+

CD41+

CD11b+

Gr1+

k

d

Group 2

Megakaryoblastic

*** ***

*** ***

CTRL 1 2 3

Weight(g)

*** ***

*

** **

CTRL 1 2 3

Survival

*** ***

***

CTRL 1 2 3

Cells(x106/m

m3)

**

CTRL 1 2 3

Cells(x103/m

m3) *

CTRL 1 2 3

CTRL

Dox -

Dox + *

- +

Dox

**

- +

Dox

*

% C

ells

**

**

**

% C

ells

%

Cells

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 1.5 0.3

6.092.30 102 103 104 105

0

102

103

104

105 1.1 3.1

4.491.3

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 2.3 6.6

37.253.90 102 103 104 105

0

102

103

104

105 1.1 1.2

4.293.4

- +

Dox

- +

Dox

- +

Dox

132

vs. Group1: p=0.1348, CTRL vs. Group2: p=0.0068, CTRL vs. Group3: p=0.1660), Platelet (Plt: CTRL vs. Group1: p=0.3663, CTRL vs. Group2: p=0.3902, CTRL vs. Group3: p=0.0440).

f. Spleen histopathology of a diseased iEG mouse from Group 2 showing infiltration of mostly von Willebrand factor (vWF)+ tumour cells. Upper panels: Hematoxylin-Eosin-Safran staining, lower panels: vWF staining (brown coloration).

g. Kaplan-Meier survival plot of secondary recipients with or without Dox-exposure (Dox -: n=4, Dox +: n=6). p=0.0110 (Log rank Mantel-Cox test).

h. Representative spleen section of a secondary recipient stained with vWF (brown coloration) shows significant organ infiltration.

i. Spleen and liver weights in secondary recipients with or without Dox-exposure (Dox -: n=4, Dox +: n=6). Spleen: p=0.0025, liver: p=0.0220.

j. Representative flow cytometry analysis of spleen of secondary recipients with or without Dox (Dox -: n=4, Dox +: n=5).

k. Quantification of flow cytometry analyses described in (j). Kit+: p=0.0026, CD41+: p=0.0015, CD11b+Gr1+: p=0.1002.

Statistical significance is indicated as p values (Student’s t test except when otherwise specified). *: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001.

133

Fig. 3: Developmental stage determines the phenotype of ETO2-GLIS2+ leukemia a. Experimental design to address the impact of EG on the clonogenic potential of fetal liver (FL)

or adult bone marrow (ABM) progenitors in methylcellulose shown in b and c. b. Number of colonies upon culture of 2500 fetal liver (FL) or Lin- BM cells at two weeks

(newborn) or two months post-partum (ABM) in Dox-containing methylcellulose conditions. Serial replating was performed every seven days. P1: first plate, P2: secondary plate, P3: tertiary plate, P4: quaternary plate.

c. Representative flow cytometry analysis of CD41+ and Gr1+ expression at P3 (upper panels) and percentages of CD41+ and Gr1+ cells at P1 to P3 (lower panels).

d. Pictures of E14.5 embryos (left and middle panels) and corresponding FL (right panels) obtained from pregnant females on Dox for 36 hours.

e. Flow cytometry analyses of FL cells obtained in d (CTRL n=8, iEG n=10). CD71+Ter119+: p<0.0001, CD11b+Gr1+: p=0.0380, CD41+: p<0.0001.

f. Experimental design: 1x106 ABM or FL cells from double transgenic iEG+Ubiquitin-GFP+ (GFP+) mice into wild type Dox-treated recipients. The progeny of engrafted cells is GFP+ cells.

g. Percentages of GFP+ cells in the BM of recipients at one month post-engraftment (CTRL n=6, FL n=6 and ABM n=6). CTRL vs. FL: p=0.0701, CTRL vs. ABM: p=0.0043.

0

25

50

0

10

20

30

40

50

0.0

0.5

1.0

0

300

600

900

1200

0

6

12

18

0

20

40

60

80

0 25 50 75 1000

25

50

75

100

0

25

50

75

100

0

25

50

75

100

0

25

50

75

100

0.0

1.5

3.0

0

1

2

3

4

0

25

50

75

100

0

20

40

60

80

100

0

100

200

300

400

0

100

200

300

400

0

100

200

300

400 P1P2

P3

P4

b

c

f

d

e

Gr1

CD41

h

l

Kit

CD41

Gr1

CD11b

CT

RL

FL

-le

uk

(Panels g à m)

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 42.7 6.8

41.69.00 102 103 104 105

0

102

103

104

105 21.1 1.5

56.321.10 102 103 104 105

0

102

103

104

105 0.0 0.5

82.117.4

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 2.5 0.1

0.696.80 103 104 105

0

102

103

104

105 1.6 44.2

4.050.1

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 8.7 1.5

19.969.80 103 104 105

0

102

103

104

105 4.9 24.0

2.468.8

BM

CD41+ CD11b+Gr1+ i

Dox +

Figure 3

iEG GFP+

FL12.5 Newborn BM

P1 P4

… iEG

Dox +

a

ABM

g

Plt RBC WBC k

Spleen

CD41+ CD11b+Gr1+

% c

ells

FL12.5

ABM

FL12.5 Newborn BM ABM

CT

RL

iEG

j

m

(Panels b, c)

CD11b+Gr1+ CD41+ CD71+Ter119+

Newborn BM

# o

f co

lon

y

CTRL iEG CTRL iEG CTRL iEG

% c

ells

P1 P2 P3

% c

ells

CTRL iEG

***

CTRL iEG CTRL iEG

*** *

BMT FL12.5

ABM

% G

FP

+

CTRL FL ABM

***

Cells(x103/m

m3)

CTRL FL ABM FL-leuk

Cells(x106/m

m3)

CTRL FL ABM FL-leuk

*** * **

Cells(x103/m

m3)

CTRL

FL

ABM ***

% c

ells

CTRL FL ABM

***

***

CTRL FL ABM

***

***

WT recipients

CTRL FL-leuk

CTRL FL-leuk CTRL FL-leuk

**

*** ** ***

CTRL FL ABM FL-leuk

*** ***

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

CD41+

Gr1+

Time(days)

Survival

***

We

igh

t (g

)

P1 P2 P3 P1 P2 P3

Leukemia

134

h. Flow cytometry quantification of CD41+ and CD11b+Gr1+ in GFP+ BM cells. CD41+ (CTRL vs. FL: p<0.0001, CTRL vs. ABM: p<0.0001, FL vs. ABM: p<0.0001), CD11b+Gr1+ (CTRL vs. FL: p=0.0002, CTRL vs. ABM: p=0.1493, FL vs. ABM: p<0.0001.

i. Kaplan-Meier survival plot of recipients of ABM or FL-derived iEG cells with Dox treatment. Log rank Mantel-Cox test: p=0.0008.

j. Peripheral blood counts of recipients of ABM (CTRL and iEG) and FL at one month post-engraftment and in recipients of FL at time of leukemia and final analysis (abbreviated FL-leuk). WBC (CTRL vs. ABM: p<0.0001, CTRL vs. FL-leuk: p=0.0009), RBC (CTRL vs. FL: p=0.0004, CTRL vs. ABM: p=0.0093, CTRL vs. FL-leuk: p<0.0001), Platelets (Plt: CTRL vs. FL: p=0.0007, CTRL vs. ABM: p=0.0163, CTRL vs. FL-leuk: p=0.0044).

k. Spleen weights in CTRL and diseased FL at time of sacrifice, p=0.0003. l. Representative flow cytometry analyses of BM cells from diseased FL recipients at time of

sacrifice. m. Quantification of CD41+ (p=0.0327) and CD11b+Gr1+ (p=0.0017) in GFP+ BM cells analyzed

in l. Statistical significance is indicated as p values (Student’s t test except when otherwise specified). *: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001.

135

Fig. 4: ETO2-GLIS2-induced AMKL is an HSC-derived leukemia a. Experimental design to address the clonogenic potential of HSC and MPP from CTRL and

iEG E14.5 embryos. Serial replating was performed every seven days for four weeks (P1 to P4).

b. Representative flow cytometry analyses of cells obtained from the first plate (P1). c. Number of colonies upon serial replating. Mean+/-SEM is indicated. d. Representative flow cytometry analyses of cells grown in methylcellulose cultures with and

without Dox. e. Experimental design to address the clonogenic potential of adult (8-10 weeks-old) HSC and

MPP from iEG and CTRL mice. f. Representative flow cytometry analyses of cells obtained at P1. g. Number of colonies upon serial replating. Mean+/-SEM is indicated. h. Wright-Giemsa staining of cytospots from iEG ABM HSC- and MPP4-derived methylcellulose

cultures at P3. Magnification: x100. i. Single HSC and MPP3 ABM cells from CTRL or iEG mice were evaluated for their potential to

develop MK and/or myeloid cells in 96-wells liquid cultures with Dox treatment. A

0

100

200

500

1000

0

100

200

500

1000

0

100

200

500

1000

0

100

200

500

1000

0

100

200

500

1000

0

100

200

500

1000

0

100

200

500

1000

0

50

100

Gr1+CD41+CD41+Gr1+

n=53 n=85

0

50

100n=50 n=47

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 44.1 7.8

10.038.20 102 103 104 105

0

102

103

104

105 6.4 5.8

17.270.60 102 103 104 105

0

102

103

104

105 14.5 4.6

16.264.7

HSC

# o

f co

lon

y

CTRL iEG

HSC

# o

f co

lon

y

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 15.0 0.3

36.148.6

c

f

CT

RL

iEG

HSC MPP2 MPP3 b

Gr1

CD41

HSC MPP2 MPP3 MPP4

Do

x +

D

ox -

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 0.5 0.5

94.15.00 102 103 104 105

0

102

103

104

105 1.3 0.9

82.615.20 102 103 104 105

0

102

103

104

105 15.0 4.3

46.833.9

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 11.0 0.3

26.162.6

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 0.1 0.2

94.25.4

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 84.8 0.8

3.610.80 102 103 104 105

0

102

103

104

105 69.1 0.3

1.429.2

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 22.8 0.3

63.113.7

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 88.9 0.6

0.310.4

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 33.8 0.6

57.28.20 102 103 104 105

0

102

103

104

105 13.6 0.5

79.76.2

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 2.8 5.1

88.04.0

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 58.2 7.3

32.61.9

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 4.6 2.0

91.32.0

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 34.4 4.5

50.910.2

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 31.2 16.0

46.76.0

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 40.8 12.6

44.02.6

HSC MPP2 MPP3

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 0.0 0.0

98.81.20 102 103 104 105

0

102

103

104

105 96.2 0.5

0.62.7

g

HSC

MPP

P1 P4 …

Dox +

Dox -

(Panels b, c) (Panel d)

Figure 4

d

Gr1

CD41

i

j

Single cell culture

HSC

MPP

…

(Panels i, j)

Dox + (Panels f à h)

MPP2

CTRL iEG

MPP3

CTRL iEG

MPP2

CTRL iEG

Gr1+ CD41+ CD41+Gr1+

% C

ells

CTRL iEG

% C

ells

CTRL iEG

HSC MPP3

MPP3

CTRL iEG

MPP4

CTRL iEG

FL12.5 iEG or CTRL

ABM iEG or CTRL Dox +

Dox +

CT

RL

iEG

H

SC

M

PP

4

h

CTRL iEG

Gr1

CD41

Gr1

CD41

136

representative flow cytometry analysis of the three types of colonies obtained after eight days of culture is shown.

j. Histogram representing the percentages of CD41+, Gr1+ or mixed phenotype colonies, (HSC CTRL: n=50, HSC iEG: n=47, MPP3 CTRL: n=53 and MPP3 iEG: n=85).

Fig. 5: ETO2-GLIS2 rewires the transcriptional network in LT-HSC a. Experimental design used to obtain single cell RNAseq (scRNAseq) expression data and to

compute transcription factor (TF) activity gene regulatory networks with ARACNe and infer TF activity with VIPER. LT-HSC and MPP4 cells from both CTRL and iEG mice were purified and scRNAseq was performed 24 hours post-induction on 95 cells from each condition (total=380 cells analyzed). scRNAseq data were used to compute the mutual information (MI, which can be considered a measure of their transcriptional relationship) between a defined list of TF and their predicted targets and then establish the sense of this regulation (positive or negative regulation of target expression) using ARACNe and VIPER software tools, respectively.

CTRL

iEG

−10

0

10

−15 −10 −5 0 5 10 15t−SNE 1

t−S

NE

2

−10

−5

0

5

10

−10 0 10t−SNE 1

t−S

NE

2

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●

−5

0

5

−10 −5 0 5 10t−SNE 1

t−S

NE

2

●HSC EG − HSC EG + MPP4 EG − MPP4 EG + Mecom

●

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−5

0

5

−10 −5 0 5 10t−SNE 1

t−S

NE

2

●HSC EG − HSC EG + MPP4 EG − MPP4 EG + Gata2

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−10

0

10

−10 −5 0 5 10t−SNE 1

t−S

NE

2

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●

−10

0

10

−10 −5 0 5 10t−SNE 1

t−S

NE

2

a Infer TF activity

Dox + (24 hours)

Single cell RNAseq

Figure 5

Create network

EG-driven Gene expression

b c

MPP4

LT-HSC

MPP4

LT-HSC

g i

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−10

0

10

−10 −5 0 5 10t−SNE 1

t−S

NE

2

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−10

0

10

−10 −5 0 5 10t−SNE 1

t−S

NE

2

●

1

2

3

4

5

Ceb

pa

●●

●

0

1

2

Gata

1

●

●●●●●●●

●

●●

●●

0

4

8

12

Gata

2

●

●●

●

−5

0

5

10

Irf8

●

●●●●●●●

●

●●

●●

0

4

8

12

Gata

2

●

−4

0

4

Me

co

m

d e

f

j

*** *** ** *

GATA2 IRF8

NES: 1.69 FDR: 0.009

iEG LT-HSC

Patients’ signatures

NES: 1.82 FDR: 0.004

CTRL LT-HSC

●

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−5

0

5

−10 −5 0 5 10t−SNE 1

t−S

NE

2

2.55.07.510.0Type ●HSC EG − HSC EG + MPP4 EG −

●

●

●

●●

●

●

●●●

0

5

10

15

Vw

f

* * ***

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●

−5

0

5

−10 −5 0 5 10t−SNE 1

t−S

NE

2

●HSC EG − HSC EG + MPP4 EG − MPP4 EG + Esam

●

●

●

●

●●●●

●

●

●

0

5

10

Esa

m

***

h

●

●

−1

0

1

2

Erg

●●

0

4

8E

rg

●

●

●

−2

0

2

ET

O2−

GL

IS2

●

●

●

●

●

●

●

−4

0

4

8

12

ET

O2−

GL

IS2

CTRL iEG

***

Activity

***

ERG

CTRL iEG

*

Expression

ETO2-GLIS2

CTRL

(Panels b, d, f, h)

LT-HSC MPP4 (Panels c-e, g, i, j)

CEBPA GATA1

Gata2 Mecom Esam Vwf

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−5

0

5

−10 −5 0 5 10t−SNE 1

t−S

NE

2


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−5

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5

−10 −5 0 5 10t−SNE 1

t−S

NE

2


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−5

0

5

−10 −5 0 5 10t−SNE 1

t−S

NE

2


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0

5

−10 −5 0 5 10t−SNE 1

t−S

NE

2


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−5

0

5

−10 −5 0 5 10t−SNE 1

t−S

NE

2


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−5

0

5

−10 −5 0 5 10t−SNE 1

t−S

NE

2


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5

−10 −5 0 5 10t−SNE 1

t−S

NE

2


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5

−10 −5 0 5 10t−SNE 1

t−S

NE

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5

−10 −5 0 5 10t−SNE 1

t−S

NE

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5

−10 −5 0 5 10t−SNE 1

t−S

NE

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−5

0

5

−10 −5 0 5 10t−SNE 1

t−S

NE

2


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−5

0

5

−10 −5 0 5 10t−SNE 1

t−S

NE

2


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−5

0

5

−10 −5 0 5 10t−SNE 1

t−S

NE

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−5

0

5

−10 −5 0 5 10t−SNE 1

t−S

NE

2


t-SNE 1

t-S

NE

2

t-SNE 1

t-S

NE

2

t-SNE 1

t-S

NE

2

t-SNE 1

t-S

NE

2

iEG

Activity

Expression

Activity

Expression

−5

0

5

10

−2 −1 0 1 2 3

Expression (log2 FC)

Activity (

t−sta

tistic)

Activity (

NE

S)

ET02-GLIS2

ERG

MECOM

SPI1

MEIS1

IKZF1

IRF8

Expression (log2FC)

GATA2

Gata2

Stat3

Hoxa10

Hlf

Meis1

Mecom

Erg

Ikzf1

Rbm15

Cbfb

Ldb1

−2 0 2

NES

Network EG Normal

Higher activity in EG

Lower activity in EG

0 1 2 3 -1 -2

-5

0

5

10

137

b. GSEA on CTRL and EG+ LT-HSC scRNAseq data using published EG+ patient-derived gene expression signatures16. Violin plot of EG expression in LT-HSC. The boxplots indicate median and SD.

c. Violin plots of EG and ERG expression and activity in LT-HSC. Log2 values of the normalized read counts are represented.

d. Scatter plot of differential expression (log2FC) against activity (Normalized Enrichment Score: NES) obtained by comparing for each gene iEG+ vs. CTRL LT-HSC. Horizontal lines represent the activity threshold of NES (FDR < 0.05 corresponding to a NES of +/- 2.29) and vertical lines represent a threshold two-fold change in expression in iEG+ vs. CTRL LT-HSC. Tinted squares indicate factors for which a significant differential activity is inferred without a significant differential expression in iEG vs. CTRL LT-HSC.

e. Master Regulator Analysis (MRA package from VIPER) consistently inferred similar differential activity for key factors upon EG expression regardless of the initial scRNAseq dataset used to compute the TF targets (empty bars: network computed using wild-type HSPC scRNAseq data, full bars: network computed using our scRNAseq data). Enrichment score (NES) of indicated TF activity in EG vs. CTRL LT-HSC is indicated. Positive NES indicates higher activity in iEG vs CTRL cells. Negative NES indicates lower activity in iEG vs CTRL cells.

f. 2D representation of the cells using t-SNE analysis of expression data. Density plots for each condition was overlaid (Red: LT-HSC iEG [triangles], blue: LT-HSC CTRL [squares], Grey: MPP4 iEG [diamonds], green: MPP4 CTRL [dots]).

g. 2D representation of the cells using t-SNE analysis of activity data inferred with the EG network.

h. Expression of key genes plotted in the t-SNE space shown in f. Log2 values of the normalized read counts are represented as a gradient (orange: higher expression, light grey: lower expression). Insert: violin plot representation of the expression of the same gene in iEG LT-HSC (red) vs. iEG MPP4 (grey) cells.

i. Activity of key factors using targets inferred in the EG network and plotted in the t-SNE space shown in g. NES scores are represented as a gradient (orange: higher activity, light grey: lower activity). Insert: violin plot representation of the activity of the same factor in iEG LT-HSC (red) vs. iEG MPP4 (grey) cells.

j. Activity of key factors using targets inferred in the normal network and plotted in the t-SNE space shown in g. NES scores are represented as a gradient (orange: higher activity, light grey: lower activity). Insert: violin plot representation of the activity of the same factor in iEG LT-HSC (red) vs. iEG MPP4 (grey) cells.


138

Fig. 6: ETO2-GLIS2 reversibly transforms LT-HSC a. Experimental design: purified LT-HSC and MPP cells from wild type (WT) or iEG mice

expressing the Ubiquitin-GFP (GFP+) were transplanted into wild-type Dow-treated recipients. Note that GFP expression is not Dox-dependent and therefore engraftment of all cells can be followed using GFP regardless of the Dox treatment.

b. Kaplan-Meier survival curve of recipients of naive iEG HSC from ABM or FL, on Dox. Recipients were treated with Dox after transplantation. Log rank Mantel-Cox test iEG FL vs. ABM recipients: p=0.0171. *: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001

c. Percentages of GFP+ cells within nucleated blood cells of recipient mice. Analyses were performed at 2, 4, 6, 16, 28 weeks and 40 weeks. Mean+/-SEM (n=4) is shown.

d. Percentages of GFP+ cells in BM, spleen weights, white blood cell (WBC) counts and platelet counts (Plt) in CTRL and iEG ABM HSC recipients and iEG FL HSC recipients. Spleen (CTRL vs. FL: p<0.0001, CTRL vs. ABM: p=0.0039), WBC (CTRL vs. FL: p=0.0095, CTRL vs. ABM: p=0.0309), Plt (CTRL vs. FL: p=0.0079, CTRL vs. ABM: p=0.1536).

e. Representative flow cytometry analysis of diseased recipients at time of sacrifice.

0

30

60

90

0

10

20

30

40

50

0

20

40

60

0

20

40

60

80

0

10

20

30

40

0

25

50

75

100

0

25

50

75

100

0

2

4

6

8

10

0

500

1000

1500

0

20

40

60

80

100

0

10

20

30

40

50

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

0

200

400

600

800

1000

0

10

20

30

40

50

0.0

0.4

0.8

1.2

0

20

40

60

80

100

0

25

50

75

100

0

25

50

75

100

0

25

50

75

100

0 100 200 300 4000

50

100

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 1.6 1.0

12.385.2

Weig

ht

(g)

Kit

CD41

Gr1

CD11b

CTRL ABM

FL

d

e

f g

(Panels b à g)

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 1.5 1.1

36.261.2

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 0.9 15.3

10.972.9

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 18.4 3.3

5.073.2

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 11.9 32.3

4.151.7

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 3.9 0.5

1.793.9

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 3.5 44.4

3.049.2

CD41+ CD11b+Gr1+

Spleen

Figure 6

b

iEG GFP+

Dox +

1st HSC

MPP

HSC

MPP

a

Weeks

c

Weeks Weeks

HSC MPP3

Ce

lls (

10

3/m

m3)

% G

FP

+

Ce

lls (

10

6/m

m3)

% G

FP

+

Plt RBC

Surv

iva

l

Time (days)

HSC C

ells

(10

3/m

m3)

WBC

Cells

(10

3/m

m3)

Plt

% C

ells

% C

ells

B220+

% C

ells

T cells

% C

ells

h i

j

% C

ells

% C

ells

% C

ells

% C

ells

% C

ells

CD41+ CD11b+Gr1+ B220+CD19+

Thy

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 2.9 0.7

17.479.0

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 13.1 18.6

1.267.1

% G

FP

+

FL12.5

ABM

MPP4 CTRL

iEG Dox -

iEG Dox +

% G

FP

+

BM

*** **

** * **

#1: 30 days

*** ***

** ** *

*** **

ABM FL

*

B : Dox -

A : Dox +

#2: 315 days #3: 353 days

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 2.3 11.6

1.484.8

CD4+ CD8+ CD4+CD8+

GFP + GFP -

EG GFP+ from iEG

2nd

Group A : Dox +

Dox +

EG

EG

GFP- from recipient

Leukemia follow-up

(Panels i à j)

1st

BMT

2 weeks post-graft

Group B : Dox -

2 4 6 16 28 40 2 4 6 16 28 40 2 4 6 16 28 40 100 200 300 400

CTRL FL ABM CTRL FL ABM CTRL FL ABM CTRL FL ABM

CTRL FL ABM CTRL FL ABM CTRL FL ABM CTRL FL ABM

Days 0 3 7 Days 0 3 7

Days 0 3 7 Days 0 3 7

BM Spl Bld

0

5

10

15

20

% C

ells

CD71+Ter119+

BM Spl Bld BM Spl Bld LN

BM Spl Bld LN Thy BM Spl Bld LN Thy

0

5

10

15

% C

ells

BM Spl

139

f. Histogram of the percentages of CD41+ and CD11b+Gr1+ cells in the BM of primary diseased

recipients. CD41+ (CTRL vs. FL: p<0.0001, CTRL vs. ABM: p=0.0005), CD11b+Gr1+ (CTRL vs. FL: p=0.0016, CTRL vs. ABM: p=0.0717).

g. Histogram of the percentages of B220+, CD4+ and CD8+ cells in the spleen of primary diseased recipients. B220+ (CTRL vs. FL: p=0.012, CTRL vs. ABM: p=0.0102), T cells=CD4+ or CD8+ cells (CTRL vs. FL: p<0.0001, CTRL vs. ABM: p=0.0016).

h. Experimental design: 1x106 BM cells from the diseased primary recipients at time of analysis were transplanted into secondary sub-lethally irradiated Dox-treated recipients. After two weeks, Dox treatment was maintained for group A (GFP+ cells expressing iEG) and ceased in group B (GFP+ cells lacking iEG expression).

i. Plt and RBC counts (top panels) and respective percentages of GFP+ cells (lower panels) in secondary recipients of ABM LT-HSC-derived disease. D0: time at which Dox was maintained in group A and withdrawn in group B. Mean+/-SEM (n=6 / group) is shown.

j. Flow cytometry analyses in secondary recipients of iEG ABM LT-HSC-derived disease at six months after Dox withdrawal. Analyses were gated on GFP+ (iEG donor-derived) or GFP- (WT recipient) cells.

Statistical significance is indicated as p values (Student’s t test except when otherwise specified). *: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001.

140

Supplementary Data Fig. 1: ETO2-GLIS2 associates with megakaryoblastic and myeloid phenotypes l) Overall survival of EG+ patients diagnosed for AML (blue, n=10) and AMKL (orange, n=8).

Log rank Mantel-Cox test p-value=0.1460 m) Flow cytometry analyses on two ETO2-GLIS2+ cell lines derived from patients: MO7e

(megakaryoblastic phenotype) and CMS (myeloid). n) Fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis with ETO2 (green) and GLIS2 (red) probes

on MO7e and CMS. The arrows indicate the fusion event on the derivative chromosome 16. Note that MO7e present two derivative chromosome 16 while CMS only shows one.

o) Sequences and schematic representation of the genomic fusion point in MO7e and CMS cells. MO7e cells present an insertion of 87bp at the fusion point that is not present in CMS cells.

p) Quantitative RT-PCR analyses in EG- HEL cells, and EG+ MO7e and CMS. q) RT-PCR detection of the ETO2-GLIS2 fusion mRNA in purified leukemic populations from the

dual phenotype AML-04 patient.

0 1000 2000 3000 40000

50

100

0

200

400

600

800

1000

0

500

1000

1500

2000

2500

1

32

1024

32768

1

2

4

8

16

32

a

f

Extended Data Fig. 1

b

Overall Survival (ETO2-GLIS2)

AML

AMKL

- Tota

l BM

CD41

- CD15

-

+

EG

GAPDH

CMS MO7e c

Exon11 Exon12

Exon2 Exon3

ETO2

GLIS2

… Insertion of 87bp ETO2 GLIS2

CM

S

MO

7e

ETO2 GLIS2

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 0.0601 0.0601

37.862.1

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 44.1 1.67

4.1750.1

CD

15

CD41

MO

7e

C

MS

d e

EG

Fold

ch

ang

e / H

PR

T ERG GATA1 CEBPA

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 94.6 1.56

03.85

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 0 0.0927

99.90.0463Kit

CD34

Fold

ch

ang

e / H

PR

T

Fold

ch

ang

e / H

PR

T

Fold

ch

ang

e / H

PR

T

Time(days)

Survival

CD41

+ CD15

-

CD41

- CD15

+

HEL

M

O7e

CM

S

HEL

M

O7e

CM

S

HEL

M

O7e

CM

S

HEL

M

O7e

CM

S

141

Supplementary Data Fig. 2: A novel inducible ETO2-GLIS2 expression transgenic murine

model a. Schematic representation of the inducible ETO2-GLIS2 (iEG) mouse model. The human

ETO2-GLIS2 cDNA is introduced at the HPRT locus (Chromosome X) under the control of a Tet-responsive element (TRE). The reverse transactivator (rtTA) cDNA is inserted at the ROSA26 locus (Chromosome 6). Upper right panel: EG mRNA expression in BM cells grown in vitro with the indicated dose of Dox is normalized to HPRT mRNA. Mean +/- SEM (n=3) is shown. Lower right panel: EG and HSP70 (loading control) protein levels in the same cells.

b. Representative flow cytometry analysis and expression of CD150+ and CD41+ gated on LIN-

Kit+ BM cells from heterozygous iEG females 6-weeks post-induction (CTRL n=9, iEG n=11), p=0.0007.

c. BM LIN-CD150-Kit+CD41+ cells from (b) were flow purified and plated in methylcellulose cultures. After 7 days of culture, individual colonies were picked and analysed by flow cytometry for the expression of megakaryoblastic (CD41) and myeloid (Gr1) markers. Representative flow cytometry analysis of the three types of colonies is shown: CD41+ only colony, Gr1+ only colony and immature colony with a predominance of CD41- and Gr1- cells. Right panel: histogram representing the quantification of each type of colonies in 3 independent experiments from 3 independent animals.

d. Kaplan-Meier survival plot of heterozygous iEG females and controls continuously exposed to Dox (CTRL n=11, iEG n=32). Global median survival for iEG mice is 153 days, p<0.0001.

e. Flow cytometry analyses in BM (Kit+ and Kit+CD41+) or spleen (CD11b+Gr1+) of diseased mice showing 3 different phenotypes at time of analysis (CTRL n=5, Group 1: immature n=9,

0

20

40

60

0

2

4

6

8

0

10

20

30

40

50

0 200 400 6000

50

100

0

20

40

60

80

0

5

10

15

20

0 10 100 10001

10

100

ROSA26 rtTA

TRE ETO2 GLIS2

(Chr6)

(ChrX)

ROSA26 rtTA

TRE ETO2 GLIS2

(Chr6)

(ChrX)

No DOX

DOX

a

b

c

CTRL iEG

CD41+ Gr1+ Immature

0 10 100 1000 Baf3 M07e

EG

HSP70

CD

150

CD41

Gr1

CD41 e

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105

14.5

3.0

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105

4.9

0.5

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105

0.3

0.7

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 96.0 0.4

0.13.40 102 103 104 105

0

102

103

104

105 1.9 10.0

59.528.60 102 103 104 105

0

102

103

104

105 9.8 0.2

6.583.5

CD150-CD41+

CD150-CD41+

Kit+CD41+

iEG

Kit+ CD11b+Gr1+

Time(days)

Survival

% C

ells

f

C.

Spleen (VWF) BM (HE) BM (VWF)

CT

RL

Imm

atu

re

CD

41

+

Gr1

+C

D11

b+

S

eco

nd

ary

# o

f co

lony

% C

ells

iEG

* ***

CTRL 1 2 3 CTRL 1 2 3

** ***

CTRL 1 2 3

**

*** CTRL

iEG

***

Fold

cha

ng

e /

0n

g/m

l

ng/ml (Dox)

CTRL iEG

***

1 2 3

Immature

CD41+

Gr1+

d


142

Group 2: CD41+ n=4 and Group 3: CD11b+Gr1+ n=6). Kit+ (CTRL vs. Group 1: p=0.0308, CTRL vs. Group 2: p=0.0002, CTRL vs. Group 3: p=0.0562); Kit+CD41+ (CTRL vs. Group 1: p=0.0058, CTRL vs. Group 2: p<0.0001, CTRL vs. Group 3: p=01275); CD11b+Gr1+ (CTRL vs. Group 1: p=0.0034, CTRL vs. Group 2: p=0.4323, CTRL vs. Group 3: p<0.0001).

f. Histopathological analyses of BM and spleen sections of primary mice (CTRL and 3 groups of iEG) and secondary recipients.

Statistical significance is indicated as p values (Student’s t test with the exception of the survival curve where a log rank Mantel-Cox test is used). *: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001.

Supplementary Data Fig. 3: Fetal liver hematopoiesis favours the megakaryoblastic phenotype upon expression of various pediatric oncogenes a. Wright-Giemsa staining of cytospots from FL or ABM derived methylcellulose cultures at

passage (P)3. b. ABM cells from iEG animal were replated for 8 passages and the indicated populations were

flow purified to perform cytospots preparations that were then stained with Wright-Giemsa. c. Wild-type FL (E12.5), new-born BM and ABM progenitors were transduced with ETO2-GLIS2-

encoding retroviruses (rEG), flow sorted and replated for 3 rounds in methylcellulose cultures. Flow cytometry analysis at P3 for the in vitro analysis wild-type hematopoietic progenitors retrovirally transduced with ETO2-GLIS2. Compare to the phenotype obtained in Fig. 3c with the iEG model using the same conditions.

d. Wild-type FL (E12.5) and ABM progenitors were transduced with MLL-AF9 (rMA9) and NUP98-KDM5A (rNK)-encoding retroviruses, plated in methylcellulose for 7 days and analysed by flow cytometry for megakaryoblastic (CD41) and myeloid (Gr1) markers. A representative flow cytometry analysis at P1 is shown.

CD

41

+G

r1-

Gr1

+

b

c

Gr1

CD41

FL12.5 Newborn BM ABM

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 0.0 0.1

38.861.10 102 103 104 105

0

102

103

104

105 32.2 8.6

46.612.60 102 103 104 105

0

102

103

104

105 15.5 1.8

65.817.0

FL12

.5

AB

M

a

Gr1

CD41

FL12.5

A

BM

d rMA9 rNK

e

iMA9

FL

AB

M

Dox +

Sort CD41+

P1 P6

FL12.5

ABM

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

0

10

20

30

40

50

0

10

20

30

40

50

rMA9

f

% C

D4

1+

FL ABM

rNK

% C

D4

1+

FL ABM

FL ABM FL ABM

% G

r1+

% G

r1+

***

***

**

**

Wild-type FACS

Retroviral transduction rEG

P1 P3

FL12.5

ABM

Newborn BM


143

e. Histogram representation of the percentage of indicated markers obtain in (d) (n=3). rMA9 CD41+: p<0.0001, rMA9 Gr1+: p<0.0001, rNK CD41+: p=0.0061, rNK Gr1+: p=0.0014.

f. Experimental design for the analysis of FL and ABM progenitors from inducible MLL-AF9 transgenics (iMA9). LIN- CD41+ cells from FL or ABM were flow purified and plated in methylcellulose cultures for 6 passages. Cytospots analysis of cells obtained at P6. Right panels: Wright-Giemsa staining. Left panels: Acetylcholinesterase staining highlighting (brown coloration) megakaryoblastic features. Note the presence of important megakaryocytic features (both small immature and bigger maturing cells) in the FL-derived cultures.

Supplementary Data Fig. 4: Expression of EG in various hematopoietic progenitors a. Experimental flow cytometry sorting strategy b. Indicated populations purified according to the parameters in (a), were plated into

methylcellulose cultures with Dox and analysed 7 days later. Histogram of the percentages of CD41+ and Gr1+ cells from CTRL and iEG methylcellulose cultures at P1 are shown.

c. Number of colonies obtained at P1.

0

200

400

600

800

1000

0

50

100

0

50

100

0

60

120

0

60

120

0

60

120

0

60

120

0

60

120

c

a

HS

C

Dox + Dox -

MP

P2

M

PP

3

1 2

3

1 ABM : LIN-

Kit

Sca1

CD

13

5

CD34

HSC MPP 1

MPP 2

MPP 3

MPP 4

2 3

CD

15

0

CD48

CD

15

0

CD48

CD

15

0

CD48

1

2MPP

2

MPP 3

MPP 4

2 1 HSC MPP1

FL14.5

LIN

CD45

Kit

Sca1

CD

13

5

CD

15

0

CD48

CD

15

0

CD48

d

HSC MPP4 MPP2 MPP3 HSC MPP2 MPP3

b ABM FL

CTRL iEG

% c

ells

CTRL iEG CTRL iEG

Gr1+

CD41+

CTRL iEG CTRL iEG CTRL iEG CTRL iEG

# o

f co

lony

# o

f co

lon

y

HSC 2 3 4

MPP

HSC 2 3 4

MPP

HSC

MPP2 MPP3 MPP4

HSC

MPP2 MPP3 MPP4

FL ABM

e

f Gr1+ CD41+ CD41+Gr1+


CTRL

iEG

0

200

400

600

800

1000

ABM

FL

144

d. iEG FL HSC and MPP were plated in methylcellulose for 4 passages and replated at the 5th passage in presence or absence of Dox. The morphology of cells obtained at P5 +/- Dox is shown. Wright-Giemsa staining. Magnification: x100.

e. Schematic representation of megakaryocytic and myeloid output in cultures from normal FL or ABM progenitors. Orange filling represents a significant (>15%) megakaryoblastic potential and progenitors with myeloid potential are in blue.

f. Representative images of single cell-derived colonies presenting an exclusive myeloid (Gr1+), an exclusive megakaryoblastic (CD41+) or a mixed myeloid and megakaryoblastic (Gr1+CD41+) potential.

Supplementary Data Fig. 5: Single cell transcriptome in CTRL and EG+ LT-HSC and MPP4 a. Heatmap representation of the 50 most differentially expressed genes between CTRL and

EG+ LT-HSC. Log2 values are represented. Log2 values are represented. b. Heatmap representation of the same 50 genes as in (a) shows no significantly differential

expression between MPP4 CTRL vs. MPP4 iEG with the exception for ETO2-GLIS2. Log2 values are represented.

c. Violin plots of ETO2-GLIS2 expression in MPP4. d. GSEA for a published EG+ patients' signature (Thirant et al., 2017) on CTRL vs. EG+ MPP4

scRNAseq data. e. GSEA for an erythroid genes signature on CTRL vs. EG+ LT-HSC scRNAseq data.

a b

NES: 1.00 FDR: 0.448

EG patients signature up

iEG MPP4

CTRL MPP4

d c


iEG Smox

ETO2−GLIS2

Cox4i2

Nupr1

Robo3

Tnfsf4

Esam

Apoe

Adamtsl5

Ano1

AA467197

Tcp11l2

Ctsw

Id2

Ttc9c

Rac2

Ptprcap

Tipin

Dtymk

Hmgn1

Nasp

Ruvbl2

Mcm5

Sqstm1

Bckdk

Neurl3

Anxa5

Dkkl1

Rgs1

Nfe2

Gsn

Dnph1

Pola1

Hells

Ung

Uhrf1

Ptpn7

Umps

Pold2

Sdf2l1

Groups Groups

MPP4 EG −

MPP4 EG +

0

2

4

6

8

10

CTRL

MPP4

●●

0

5

10

CB

FA

2T

3−

GL

IS2

***

CTRL iEG

MPP4 MPP4

CTRL iEG

LT-HSC

Rgs1

Gsn

Sqstm1

Neurl3

Esam

Anxa5

Apoe

Nupr1

Robo3

Tcp11l2

Ano1

Tnfsf4

Adamtsl5

ETO2−GLIS2

AA467197

Ctsw

Smox

Id2

Dkkl1

Nfe2

Bckdk

Hmgn1

Rac2

Ruvbl2

Ptprcap

Nasp

Dtymk

Tipin

Mcm5

Pold2

Pola1

Hells

Ung

Uhrf1

Umps

Dnph1

Ttc9c

Cox4i2

Sdf2l1

Ptpn7

Groups Groups

HSC EG −

HSC EG +

0

2

4

6

8

10

ET

O2

-GL

IS2

mR

NA

e

iEG HSC

NES: -1.71 FDR: 0.012

CTRL HSC

Erythroid genes up

*

145

Supplementary Data Fig. 6: Computing transcription factor networks using scRNAseq

data a. Experimental design to infer transcription factor activity from scRNAseq expression data. b. The networks obtained using normal hematopoietic progenitors scRNAseq data (Nestorowa

et al., 2016) were used to infer transcription factor (TF) activity using an independent dataset (Cabezas-Wallscheid et al., 2014). The heatmap represent the activity of selected TF factor inferred from the normal network. Red: high activity. Blue: low activity. Arrows point at TF known to be active in erythromegakaryocytic differentiation (yellow, e.g. GATA1 and KLF1 presenting a higher activity in MPP2), in HSC (red, e.g. HOX factors showing a higher activity in HSC), in lymphoid lineages (green, e.g. NOTCH1 showing higher activity in MPP4) and in myeloid differentiation (blue, e.g. CEBPA and IRF8 showing higher activity in MPP3.

a Single cell RNAseq from normal HSC and progenitors

(Göttgens lab)

ARACNe compute network & predict targets

Expression data: -Validation dataset (Trumpp lab)

-Experimental scRNAseq data: -HSC Ctrl

-HSC iEG

-MPP4 Ctrl -MPP4 iEG

Predict TF activity HSC MPP4 MPP3 MPP2 MPP1

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

B b

Erythro- megakaryocytic

HSC

Lymphoid

Myeloid

VIPER

TF1

TF2

TF3

Nfe

2

Bckd

k

Ra

c2

Ptp

rca

p

Ru

vbl2

Fkbp

3

Rg

s1

Gs

n

Sq

stm

1

Ne

url

3

Gn

ai3

Esa

m

An

xa

5

Ap

oe

Ad

am

tsl5

Tnfs

f4

Bm

p4

AA

467

197

Du

pd

1

Tcp1

1l2

ET

O2−

GLIS

2

An

o1

Sm

ox

Id2

Dkkl1

Cts

w

Gm

665

2

Nu

pr1

Ro

bo

3

Na

sp

Dty

mk

Tip

in

Mcm

5

Pold

2

Hm

gn

1

Um

ps

Dn

ph

1

Ttc

9c

Msh

6

Dd

x27

Cox4

i2

Sd

f2l1

Ptp

n7

Cd

c45

Ga

tm

He

lls

Un

g

Uh

rf1

Pola

1

Zfp

36

7

Ty

pe

Typ

e HS

C E

G +

HS

C E

G −

0246810


146

Supplementary Data Fig. 7: Transcription factor expression and activity in EG+ or CTRL

cells a. Far left panels: violin plot representation of mRNA expression of the indicated factor. Middle

left panels: predicted activity of the indicated factor using targets inferred in the EG network and represented as violin plots. Middle right panels: predicted activity of the indicated factor using targets inferred in the EG network plotted on the activity-based 2D representation of the cells. Far right panels: predicted activity of the indicated factor using targets inferred in the normal network and represented as violin plots.

b. Pf4 expression plotted on the expression-based 2D representation of the cells. Log2 values are represented.

Statistical significance is indicated as p values (Student’s t test). * indicates p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001.

147

Supplementary Data Fig. 8: ETS/GATA/CEBPA activity functionally controls EG-induced phenotypes a. Quantitative RT-PCR analyses in LIN- iEG FL14.5 and ABM-derived cells after 24h in liquid

culture with Dox. Mean+/-SEM (n=3) is shown. Erg: p=0.0002; Gata1: p<0.0001; Spi1: p=0.0030; Cebpa: p=0.0041.

b. Quantitative RT-PCR analyses in iMLL-AF9 FL and ABM-derived cell line (Supplementary Data Fig.3f). Mean+/-SEM (n=3) is shown. Erg: p=0.0004; Gata1: p=0.0012; Spi1: p=0.6517; Cebpa: p=0.0055.

c. Quantitative RT-PCR analyses in iEG HSC and MPP4-derived cells at P1. Mean+/-SEM (n=3) is shown. Erg: p=0.0001; Gata1: p=0.0534; Spi1: p=0.0007; Cebpa: p=0.0005.

d. Experimental design to ectopically express indicated TF in iEG LT-HSC and MPP4.

AM

KL-2

6

AM

L-02

CD41

CD34

CD15

0

5

10

15

AML-04AM

KL-2

6

AM

L-02

CD41

CD34

CD15

0

10

20

30

40

AML-04

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0

1

2

3

4

0

5

10

15

20

0

1

2

3

4

0

1

2

3

4

0

1

2

3

4

5

0

5

10

15

20

0.0

0.5

1.0

0

10

20

30

40

50

0

1

2

3

4

0

5

10

15

0.00

0.01

0.02

a

CEBPA

HS

C

MP

P4

SPI1

GATA1 ERG

d

GFP only

iEG

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 54.4 1.6

18.625.4

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 78.8 0.4

1.219.7

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 0.0 0.0

98.31.70 102 103 104 105

0

102

103

104

105 46.0 1.0

44.88.2

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 56.9 1.1

21.320.80 102 103 104 105

0

102

103

104

105 18.9 3.2

75.02.9

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 0.2 0.2

89.89.7

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 2.1 1.3

77.718.9

b WT

iEG WT

- GFP-only (empty vector) - CEBPA or SPI1 (HSC)

- ERG or GATA1 (MPP4)

P1

g GATA1

Fo

ld c

ha

ng

e /

HP

RT

ERG

f

Panels d,e

e

Fo

ld c

han

ge /

HP

RT

F

old

ch

an

ge

/ H

PR

T

HSC

MPP

Dox +

ABM iEG

GFP only GFP only

GFP only

Gr1

CD41 G

r1

CD41

WT

FL ABM

***

FL ABM

***

FL ABM FL ABM

** **

Erg Gata1

Spi1 Cebpa

Fo

ld c

han

ge

/ H

PR

T

Fold

ch

an

ge

/ H

PR

T

*** ***

***

HSC MPP4 HSC MPP4

HSC MPP4 HSC MPP4

Erg Gata1

Spi1 Cebpa

FL ABM

**

Gata1

***

Erg

FL ABM

FL ABM FL ABM

** Spi1 Cebpa

Fo

ld c

ha

ng

e /

HP

RT

F

old

ch

ang

e /

HP

RT

c

iEG

iMA9

AM

KL-2

6

AM

L-02

CD41

CD34

CD15

0

6

12

AML-04 AM

KL-2

6

AM

L-02

CD41

CD34

CD15

0

1

2

3

4

AML-04

SPI1 CEBPA


148

e. Representative flow cytometry analyses of cells obtained at P1 after transduction of WT and iEG MPP4 with ERG, GATA1 or GFP-only retroviruses. Analysis was gated on GFP+ cells.

f. Representative flow cytometry analyses of cells obtained at P1 after transduction of WT and iEG LT-HSC with SPI1, CEBPA or GFP-only retroviruses. Analysis was gated on GFP+ cells.

g. Quantitative RT-PCR analyses in blasts from patients with AMKL (AMKL-26), AML (AML-02) and in the different immature, megakaryoblastic and myeloid blast populations from the dual phenotype ETO2-GLIS2+ AML patient (AML-04).


149

Supplementary Data Fig. 9: ETO2-GLIS2 target HSC to induce aggressive leukemia a. Histopathology of bone marrow from recipients engrafted with CTRL or iEG HSC from ABM

or FL. HE: Hematoxylin-Eosin staining, vWF: von Willebrand factor immunohistochemistry highlighting megakaryocytic features, GFP immunohistochemistry: highlight all donor-derived cells. For ABM, but not FL, it was possible to perform vWF and GFP stainings on consecutive sections. Note that the maturing megakaryocytes visible in ABM HSC condition are GFP- and therefore do not derive from donor iEG cells.

b. Flow purified CD41+ blasts from primary iEG HSC FL recipient mice were grown for 2 days in vitro with (Dox +) or without (Dox -) Dox to evaluate their potential to generate maturing megakaryocyte or myeloid cells. Representative flow cytometry analyses show that some recipients (e.g. #1) the leukemic blasts can differentiate toward both megakaryocytes (CD41+CD42+) and myeloid (CD11b+Gr1+) cells and other recipients generate a more predominant myeloid differentiation (e.g. #2).

0

25

50

75

100

0

5

10

0

25

50

75

100

0

5

10

15BM

WBC

RBC

PLT

0

5

10

15

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0

20

40

60

80

d

c

b

a

CT

RL

HE vWF GFP

AB

M H

SC

BM

Ce

lls (

10

3/m

m3)

% G

FP

+

WBC % GFP

0 102 103 104 105

0

50K

100K

150K

200K

250K

7.1

84.20 102 103 104 105

0

102

103

104

105

7.80 102 103 104 105

0

102

103

104

105

10.4

SS

C-A

GFP

WBC RBC Plt

e

CD

42

CD41

Gr1

CD11b

H

Dox +

Dox -

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 0.1 7.4

84.48.1

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 2.0 4.3

1.292.4

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 1.8 31.1

33.333.8

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 5.0 23.9

5.365.8

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 0.1 1.5

91.76.7

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 1.2 1.8

0.996.0

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 3.2 2.3

15.678.9

0 102 103 104 105

0

102

103

104

105 1.1 81.4

3.913.6

CD

42

CD41

Gr1

CD11b

Dox +

Dox -

#1

#2

f

g ABM HSC - IIary (6 months post transplant)

FL H

SC

+ -

Dox

Fo

ld c

han

ge /

Do

x -

+ -

Dox

+ -

Dox

iEG ERG GATA1

*** *

A B

% G

FP

+

Days : 0 3 7 0 3 7

283 284 285 286 287 288

% G

FP

+


B : Dox -

A : Dox +

150

c. Quantitative RT-PCR analysis of ETO2-GLIS2 (iEG), Erg and Gata1 expression in cells obtained in (b). Expression was normalized to HPRT mRNA level. iEG: p=0.0121, Erg: p<0.0001, Gata1: p=0.0725.

d. Representative flow cytometry result of the percentage of GFP+ cells in white blood cells (WBC), erythrocytes (RBC) and platelets (Plt) of IIary ABM recipients.

e. Percentage of GFP in the BM of IIary recipients engrafted with cells from ABM LT-HSC-derived Iary recipients. Analysis was performed at 2-weeks post-graft in Dox-exposed IIary recipients. The same day, Dox was removed in Group B and maintained in Group A (Group A n=6, Group B n=6). These results indicate that the initial percentage of GFP is the same in the two groups.

f. Follow-up of the WBC and percentage of GFP in WBC upon removal of Dox treatment. D0 represents the time at which Dox was removed in Group B and maintained in Group A. Mean+/SEM (n=6 / group) is shown.

g. IIary recipients in Group B (Dox -) were analysed 6 months post-Dox removal to assess residual long-term HSC potential of iEG+ leukemic (GFP+) cells. Histograms indicate that within a recipient the percentages of GFP+ cells were similar in the BM, WBC, RBC and Plt indicating that GFP+ cells are endowed with LT-HSC potential.


151

Supplementary Data Fig. 10: Schematic representation of the bases for the pediatric and phenotypic specificities associated with myeloid fusion oncogenes

In normal hematopoiesis, our results and others (Sanjuan-Pla et al. Nature 2013, Carrelha et al. Nature 2018, Rodriguez-Fraticelli et al Nature 2018) indicate that both fetal (FL) and adult bone marrow (ABM) HSC present a significant megakaryocytic potential (here represented as orange cells). In FL progenitors (e.g. MPP2 and MPP3) retain an important megakaryocytic potential while adults progenitors mostly loose it and primarily undergo myeloid differentiation (here represented as blue cells) (Notta et al. Science 2016). The megakaryocytic potential is associated with higher expression of ERG and GATA1 transcription factors (TF), while the myeloid phenotype is associated with higher CEBPA expression.

We propose that the dynamic changes that affect the cellular and molecular properties of HSC and progenitors during the transition from fetal to adult hematopoiesis, include an enhanced megakaryocytic potential in various multipotent FL progenitors as compared to adult progenitors presenting a skewing toward myelopoiesis underlies the strong prevalence of acute megakaryoblastic leukemia in early childhood.

Normalhematopoiesis

PediatricleukemiafusionsAMKL/AML


AMKL

AML

fetal Adult

ERG/GATA1

CEBPA

Birth

Age

No disease

HSC

Progenitors

152

METHODS

Reagents and resources Supplementary Table 13 contains a list of the relevant reagents. Patient-derived data and material Patient blood and BM samples were obtained with the informed consent of the patient or their family in accordance with national ethics law. Samples were subjected to Ficoll gradient, immunophenotyped, and used fresh or frozen in fetal bovine serum (FBS) supplemented with 10% DMSO for subsequent use. DNA and RNA were obtained from the mononuclear cell fractions using the manufacturer's recommendations (Qiagen). cDNA from 284 patients were available to detect the EG fusion via RT-PCR. The primer sequences are provided in Supplementary Table 14. Clinical data were obtained from the ELAM02 protocol. The present study focused on 385 of 438 children treated in the ELAM02 trial (Treating Patients with Childhood Acute Myeloid Leukemia with Interleukin-2; ClinicalTrials.gov NCT00149162). Patient selection was based on the availability of genomic DNA and RNA upon AML diagnosis. Children aged 0 to 18 years newly diagnosed with AML were enrolled between March 2005 and December 2011. Patients diagnosed with acute promyelocytic leukemia, therapy-related AML or Down syndromes were excluded from the ELAM02 trial. The study was approved by the Ethics Committee of Saint-Antoine Paris University Hospital (Assistance Publique-Hôpitaux de Paris) and by the Institutional Review Board of the French Regulatory Agency. The study was conducted in accordance with the declaration of Helsinki. Data concerning age at diagnosis was also collected from the ELAM02 protocol and de Rooij et al.9 including 87 AMKL patients. Patient-Derived Xenotransplantation (PDX) Patient-derived xenograft protocols have been described previously8. FISH The DNA probe set obtained from Empire genomics (CBFA2T3 and GLIS2 FISH probes, AmpliTech, Compiègne, France) hybridizes to chromosome 16p13.3 at CBFA2T3 locus (Red) and 16q24.3 at GLIS2 (green) in normal metaphase spreads or interphase nuclei. FISH analysis was performed following the manufacturer's protocol. Interphase nuclei and metaphases were scored on Imager Z2 fluorescence microscope (Zeiss, France) using Isis/Metafer/Relosys MetaSystems Software (MetaSystems, Altlussheim GmbH, Germany). In cells with the EG fusion, the overlap between the two probes generates a yellow signal indicative of the fusion oncogene. Cell lines The human AMKL MO7e cells59 (derived from a 6-month-old girl) were cultured in MEM-α supplemented with 20% FBS, Penicillin (100U/mL)-Streptomycin (100μg/mL), 2mM L-Glutamine (Gibco) and 5 ng/ml of human GM-CSF (PeproTech). The human CMS cells60 (derived from a 2-years-old girl) were cultured in RPMI1640 supplemented with 10% FBS, Penicillin (100U/mL)-Streptomycin (100μg/mL), and 2mM L-Glutamine (Gibco). The human AML-M6 HEL 92.1.7 (HEL) cells61 (derived from a 30-years-old patient) were cultured in RPMI1640 supplemented with 10% FBS, Penicillin (100U/mL)-Streptomycin (100μg/mL), and 2mM L-Glutamine (Gibco). All cell lines were karyotyped.

153

Mice To generate the iETO2-GLIS2:rtTA (iEG) model, the human EG cDNA was cloned into the p2Lox vector and electroporated into A2Lox-Cre embryonic stem (ES) cells, a generous gift from Michael Kyba62. ES cell clones were selected for the correct integration of EG at the Hprt locus on chromosome X and used to obtain germline-transmitting chimeras that were subsequently backcrossed into the C57BL/6 background. Genotyping of the reverse tetracycline-controlled transactivator (rtTA) and the EG transgene were genotyped using the primers indicated in Supplementary Table 14. To obtain GFP+-expressing iEG mice and track the iEG cells upon in vivo transplantations, we crossed iETO2-GLIS2:rtTA with UBI-GFP mice63. Note that GFP expression is not controlled by Dox and therefore engraftment of all CTRL and iEG donor cells can be followed using GFP regardless of the Dox treatment status or iEG expression. The transgenic mouse line for inducible expression of MLL-AF9 has been described previously25. The iETO2-GLIS2 and iMLL-AF9 transgenes were induced with doxycycline provided in impregnated food pellets (Dox food pellets, 545 mg/kg, Provider: SSNIF), which is predicted to correspond to an approximate dose of 2.2 mg/day. Mice were maintained at the Gustave Roussy preclinical facility and all experiments were approved by the French National Animal Care and Use Committee (CEEA 26, #2012-017). Bone Marrow Transplantation Transplantation of bone marrow (BM, 106) or sorted progenitor cells were performed through intravenous injection in lethally (9.5 Gy) or sub-lethally (5Gy) irradiated 8-week-old C57BL/6 recipient mice. Morphologic analysis of peripheral blood, BM, and spleen cells as well as histological analyses were performed according to standard procedures. Flow Cytometry Cells analyzed by flow cytometry were antibody stained in PBS 1X supplemented with 2% FBS for 30 minutes at 4°C with washing prior to FACS analysis. Whole BM and spleen cells from mice were collected, subjected to RBC lysis and stained for FACS analysis. To obtain hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC), BM cells were depleted from the mature hematopoietic cells (Lin-) with the Becton Dickinson (BD) Mouse Hematopoietic Progenitor (stem) Cell enrichment Set (558451). To obtain adult BM (ABM) precise progenitors populations were further purified by FACS according to the following phenotypes: LT-HSC (HSC) were defined as LIN-Kit+Sca1+CD135-

CD34-CD48-CD150+, MPP2 cells were defined as LIN-Kit+Sca1+CD135-CD34+CD48+CD150+, MPP3 cells were defined as LIN-Kit+Sca1+CD135-CD34+CD48+CD150-, and MPP4 cells were defined as LIN-Kit+Sca1+CD135+CD34+CD48+CD150-. To obtain fetal liver HSPC, cells were depleted with Biotin-conjugated antibodies against CD3, Ter119, B220, Gr1, NK1.1, F4/80, CD19. To obtain FL HSC and progenitor populations, cells were purified by FACS according to the following phenotypes: LT-HSC were defined as LIN-Kit+Sca1+CD135-CD48-CD150+, while MPP2, MPP3 and MPP4 cells were defined with the same markers as ABM cells. Flow cytometry analyses were performed with an ARIAII, ARIAIII, CANTO-II or CANTO-X instruments (BD), and data were analyzed using FlowJo software (version Flowjo 9.3.2). Serial replating assays Total cells and/or progenitors from ABM or FL at E12.5 or E14.5 were isolated from iEG mice and plated in 3mL methylcellulose (Methocult M3434; StemCell Technologies, Canada), supplemented with IL3, IL6, SCF, EPO and 300ng/ml DOX. Colonies were scored under the microscope after five to seven days, harvested and replated (104 cells) for four rounds.

154

Single cell cultures Single cells were seeded in 96-well plates in 100ul RPMI supplemented with 10% FBS, cytokines (mIL3, mIL6, mIL11, mSCF, mTPO, mEPO, mGM-CSF, mFLT3l) and 100ng/ml Dox. Wells were scored for clonal growth after four days of culture and frequency of megakaryoblastic and myeloid cells was assessed by surface marker analysis using a previously described method64 after five to ten days. RNA extraction & quantitative RT-PCR analysis mRNA was isolated using an RNeasy Mini/Micro kit (Qiagen) and quantified using a NanoDrop (ThermoScientific). Reverse transcription was carried out with SuperScript II (Invitrogen). Q-PCR was performed with SYBR Select Master Mix or Taqman Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) using a 7500HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) according to the manufacturer's recommendations. The primer sequences are provided in Supplementary Table 14. ETO2-GLIS2 genomic DNA fusion point DNA were isolated using an All Prep DNA/RNA Mini/Micro kit (Qiagen) and quantified using a NanoDrop (ThermoScientific). PCR was performed using a GeneAmp PCR System 9700. The primer sequences are provided in Supplementary Table 14. Immunoblotting Total cell lysates were prepared in lysate buffer containing 50 mM Tris-HCl (pH 8), 150 mM NaCl, 1% NP40, 1 mM EDTA, 0.1% SDS, 0.5% DOC, and protease inhibitors (PMSF 1X, NAF 1X, Sodium orthovanadate 1X, complete 1X). Western blotting was then performed using standard procedures using anti-CBFA2T3 (ETO2) and anti-HSC70 antibodies. Production of retroviral particles and transduction For retroviral transduction experiments, we constructed murine stem cell virus (MSCV) backbone constructs expressing GFP and encoding human ETO2-GLIS2, ERG, CEBPA, SPI1, GATA1 ORF. Briefly, 293T cells were transfected using Xtreme GENE transfection reagent according to the manufacturer’s instructions (Roche). Retroviral particles were harvested 24 and 48 hours after transfection. For retroviral transduction, murine progenitor cells were spinoculated twice with retroviral particles in culture media containing 5 μg/mL polybrene and 7.5 mM HEPES buffer for 90 minutes at 2500 rpm and 33°C. Single cell RNAseq (scRNAseq) Progenitor cells were isolated from iEG mice and cultured for 24 hours in RPMI supplemented with 10% FBS, cytokines (mIL3, mIL6, mSCF, mTPO, mFLT3l) and 100 ng/ml Dox. ScRNAseq analysis was performed as described previously28,65. Single cells were individually sorted in 96-well plates containing lysis buffer (0.2% Triton X-100 and 500U/ml Superase-In RNase Inhibitor). The Illumina Nextera XT DNA preparation kit was used to prepare libraries. Pooled libraries were sequenced using the Illumina Hisequation 4000 system (single-end 125 base pair reads). Statistical analyses Statistical analyses were performed using the GraphPad Prism software (version Prism 6-2) except otherwise mentioned. Bioinformatics analyses Reads quality control and alignment: Quality control of reads was performed using FastQC 0.11.7 and multiQC 1.5.dev0. The reads were aligned to the reference genome mm10

155

GRCm38.p4 81 with GSNAP (v 2015-09-29) with the following parameters: -A sam -B 5 -t 23 -n 1 -Q -N 1. Finally, gene expression was quantified using HTSeq 0.6.0 Counts pre-processing, quality controls and normalization: prior to data normalization, cells were filtered to remove low quality samples and to fulfil the following conditions: have at least 4000 detectable genes, have less than 20% of counts mapping to mitochondrial genes, have less than 50% of reads mapping to spike in controls and at least 25 counts that map to nuclear genes. Normalization was next performed by library size with the deconvolution of size factors method

described by Lun et al. using scran and scater R libraries66,67. Pre-clustering of cells and five

pool sizes from 20 to 100 (by an increment of 20) were used as normalization parameters. High variable genes (HVG) selection was performed as previously described68 for feature selection. Those HVG were used for t-SNE to explore possible underlying substructures in the data. Differential expression analysis and gene set enrichment analysis (GSEA): for detection of differences at the transcriptomic level between groups, differential expression analysis was performed with Wilcoxon test over the log2 counts values and p-value correction by Benjamini-Hochenberg (FDR cut-off at 0.05). GSEA was also performed to detect potential overexpressed

signatures in patients with default parameters except for –collapse false –permute phenotype69.

Gene Regulatory Network inference: ARACNe-AP software was used to infer a Gene Regulatory Network70 using iEG scRNAseq data to predicted a list of target genes of each TF in the context of cells expressing ETO2-GLIS2 (called "EG network", Supplementary Table 6). For that purpose, iEG cells with log2 counts < 1 for ETO2-GLIS2 were not taken into account. ARACNe was ran over the log2 normalized counts in bootstrap mode (100 iterations), with a p-value threshold of 1e-8 and a custom curated list of 2171 TFs. Similarly, we predicted the target genes of each TF in a normal hematopoietic context from published scRNAseq data39 obtained with the same protocol (called "normal network", Supplementary Table 7). Therefore, the activity of each TF was computed using two independent lists of target genes and consistent prediction of TF activity levels were obtained for key factors (Figure 5e). Transcription regulator activity prediction and Master Regulator Analysis: networks were used to infer activity (Normalized Enrichment Score, NES) of the transcriptomic regulator with R library viper38, as described in the package manual. NES were used to test differential activity by t-test and p-value correction by Benjamini-Hochenberg (FDR cut-off at 0.05). Master Regulator Analysis was also carried out as described in the manual, with calculation of bootstrapped null model and shadow correction (enrichment of a regulator driven by similar targets of another regulator) of top 25 regulators. Data availability Single cell RNAseq data were deposited into EBI - Array-Express under the accession number E-MTAB-7213.

156

References for the METHODS section 59. Avanzi, G. C. et al. Selective growth response to IL-3 of a human leukemic cell line with megakaryoblastic

features. Br. J. Hematol. 69, 359–366 (1988). 60. Sato, T. et al. HIV infection of megakaryocytic cell lines. Leuk. Lymphoma 36, 397–404 (2000). 61. Martin, P. & Papayannopoulou, T. HEL cells: a new human erythroleukemia cell line with spontaneous and

induced globin expression. Science 216, 1233–1235 (1982). 62. Iacovino, M. et al. Inducible cassette exchange: a rapid and efficient system enabling conditional gene

expression in embryonic stem and primary cells. Stem Cells Dayt. Ohio 29, 1580–1588 (2011). 63. Schaefer, B. C., Schaefer, M. L., Kappler, J. W., Marrack, P. & Kedl, R. M. Observation of antigen-

dependent CD8+ T-cell/ dendritic cell interactions in vivo. Cell. Immunol. 214, 110–122 (2001). 64. Månsson, R. et al. Molecular evidence for hierarchical transcriptional lineage priming in fetal and adult stem

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RNA-seq data. Brief. Bioinform. (2018). doi:10.1093/bib/bby011 67. Lun, A. T. L., Bach, K. & Marioni, J. C. Pooling across cells to normalize single-cell RNA sequencing data

with many zero counts. Genome Biol. 17, 75 (2016). 68. Brennecke, P. et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nat. Methods 10,

1093–1095 (2013). 69. Subramanian, A. et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting

genome-wide expression profiles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 15545–15550 (2005).

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157

158

DISCUSSION

159

Dans ce travail, j'ai développé un nouveau modèle expérimental d'expression inductible de

la fusion ETO2-GLIS2 chez la souris ainsi que des modèles de xénogreffes à partir

d'échantillons de patients, et contribué à décrire certaines conséquences moléculaires

imposées par cette fusion.

Dans l'ensemble, ces données expérimentales contribuent à:

1-Démontrer le rôle de dérégulateur épigénétique de la fusion ETO2-GLIS2.

2-Caractériser l'importance du contexte développemental, cellulaire et moléculaire pour la

transformation et le phénotype induit par la fusion ETO2-GLIS2.

3-Proposer de nouvelles perspectives thérapeutiques pour le traitement des LAM-M7

pédiatriques associées avec un mauvais pronostic.

Rôle de dérégulateur épigénétique de la fusion ETO2-GLIS2

L’épigénétique comprend l’ensemble des mécanismes moléculaires qui modulent

l’expression des gènes sans modifier la séquence d’ADN génomique. L’épigénome inclut des

modifications biochimiques de l’ADN et des histones, l’organisation structurale de la

chromatine, l’épissage alternatif et l’expression d’ARNs non codants. Nos observations

indiquent que la fusion ETO2-GLIS2 altère plusieurs de ces mécanismes épigénétiques.

Notamment, la fusion ETO2-GLIS2 1) implique deux facteurs transcriptionnels, 2) induit

une forte dérégulation de l'expression génique incluant des facteurs de transcription

impliqués dans la régulation hématopoïétique comme ERG et GATA1 (cf infra pour une

discussion détaillée du rôle des FT) et 3) est fréquemment retrouvée au niveau de marques

épigénétiques (ex: H3K27Ac) des super-enhancers (SE) qui contrôlent l’identité cellulaire et

est mutuellement exclusive avec la marque de répression transcriptionnelle H3K27me3.

Plusieurs questions restent en suspens pour comprendre comment les SE sont régulés par

la fusion. En particulier, est-ce que la fusion ETO2-GLIS2 joue un rôle pionnier et est

capable de créer de nouveaux SE dans des régions chromatiniennes inactives ou bien se

fixe-t-elle sur des SE ou enhancers déjà établis en interaction éventuelle avec des

partenaires protéiques présentant une activité acétyltransferase? Ces deux mécanismes

pourraient d'ailleurs coexister dans une cellule mais varier en fonction des loci.

Nous avons pu observer que la fusion se fixait à l’ADN via les partenaires d’ETO2, incluant

les facteurs de transcription ETS, GATA et RUNX ainsi que via GLIS2. Le facteur ERG

160

colocalise avec la fusion au niveau de certains SE et sa présence est associée à une

surexpression des gènes situés à proximité. De plus, des inactivations fonctionnelles

montrent le rôle essentiel de ERG sur la survie et le maintien des cellules leucémiques

ETO2-GLIS2.

Dans le cancer de la prostate, ERG a été associé à une forte expression de H3K27ac et

impliqué dans l’établissement de nouveaux SE entraînant une modification de

l’organisation chromatinienne et du profil transcriptionnel (236).

ERG pourrait donc être directement impliqué dans la génération des SE des LAM-M7 ETO2-

GLIS2. D'autre part, étant donné la différence entre les SE en fonction du contexte cellulaire,

il sera intéressant d'identifier les SE associés à la fusion dans un contexte myéloïde.

La fusion ETO2-GLIS2 semble également altérer l'épissage de certains transcrits. En effet,

chez ~40% des patients ETO2-GLIS2 LAM-M7, les cellules leucémiques expriment

également une autre fusion, DHH-RHEBL1, deux gènes contigus présentant la même

orientation sur le chromosome 12 (237). Cependant, aucune altération génomique n'a été

décrite à l'origine de cette fusion. L'hypothèse la plus probable est donc que cette fusion

DHH-RHEBL1 résulte d'un épissage aberrant survenant dans certaines cellules ETO2-GLIS2.

La formation de transcrit de fusion entre des gènes adjacents a été observée dans d’autres

cancers comme le cancer de la prostate ou le cancer du sein (238,239). Une hypothèse

concernant la formation de ces transcrits de fusion implique la diminution de la liaison de

CTCF sur les séquences « insulator » encadrant des gènes adjacents (238). CTCF est une

protéine ubiquitaire, composée de 11 domaines Zinc Finger (ZF), impliquée dans

l’organisation de la chromatine, la régulation génique, les interactions intra/inter

chromosomiques ainsi que l’épissage alternatif (240). L'expression du transcrit et de la

protéine CTCF n'est pas significativement diminuée dans les cellules ETO2-GLIS2 humaines

(nos données préliminaires). En revanche, GLIS2 présente des similitudes de motifs de

liaison à l’ADN avec CTCF. Ainsi, la formation du transcrit de fusion DHH-RHEBL1 pourrait

être due à la fixation de ETO2-GLIS2 sur certains sites CTCF engendrant une compétition

entre ces deux protéines, et une modification de l’organisation de la chromatine et de

l'épissage des transcrits DHH et RHEBL1. Une démonstration de ces hypothèses nécessitera

des analyses de capture de la conformation chromatinienne. D'autre part, il sera intéressant

161

de rechercher si la présence de cette fusion additionnelle constitue une étape épigénétique

vers le développement de leucémies plus agressives.

La réversibilité des conséquences de la fusion ETO2-GLIS2 a également pu être mise en

évidence par des approches moléculaires et cellulaires in vitro et in vivo.

Au niveau moléculaire, l’expression du peptide NC128 contenant la séquence protéique du

domaine NHR2 de ETO, inhibe l’oligomérisation de la fusion ETO2-GLIS2 et réverse

globalement l'expression des gènes associés aux SE.

Au niveau cellulaire, l’extinction de la fusion dans les blastes leucémiques murins, possible

grâce au système inductible DOX, permet de restaurer des capacités de reconstitution

hématopoïétique à long-terme ainsi qu’un potentiel de différenciation multi-lignées

attribués aux HSC normales. Ces résultats constituent une preuve de concept que l'effet

transformant de la fusion sur les HSC est réversible. Cette observation pourrait avoir des

conséquences cliniques car elle suggère qu’une inhibition spécifique de la fusion a le

potentiel de rétablir des capacités de différenciation normales et de reconstitution à long-

terme aux progéniteurs hématopoïétiques chez ces patients.

On peut noter que les fusions MLL, NUP98-KDM5A et OTT-MAL, retrouvées de façon

récurrente dans les LAM-M7, impliquent également des régulateurs transcriptionnels ayant

des conséquences épigénétiques (MLL-AF4 (241) ; OTT-MAL (242) ; MLL (243)). Il est donc

possible que certains mécanismes mis en œuvre par ETO2-GLIS2 soient communs à toutes

ces fusions.

162

Importance du contexte développemental, cellulaire et moléculaire pour la

transformation et le phénotype induit par la fusion ETO2-GLIS2.

Importance du stade de développement

Nous avons pu observer l’influence du stade de développement auquel la fusion est induite

sur le développement de leucémie in vivo chez la souris. En effet, la greffe de cellules de foie

fœtal murin à E14.5 (progéniteurs LIN- ou LT-HSC purifiés) exprimant ETO2-GLIS2 induit

des LAM-M7 agressives avec une latence faible (quelques semaines) dans des receveurs. En

revanche, une approche similaire avec des cellules de moelle osseuse adultes induit des

leucémies de façon peu efficace et seule la greffe de LT-HSC adulte conduit au

développement de leucémies avec une latence longue (plusieurs mois) et un phénotype

hétérogène.

Le stade développemental ciblé par les oncogènes pédiatriques est également relevant pour

d'autres leucémies. En effet, les LAL sont plus fréquentes chez les jeunes enfants que chez

les adultes. Certains oncogènes spécifiques des leucémies pédiatriques, dont l’origine

prénatale a été validée comme TEL-AML1 associée aux LAL-B ou MLL-AF4 dans les LAL-B,

semblent nécessiter un contexte particulier, apporté par les progéniteurs fœtaux, pour

induire une leucémie. L’analyse d’un modèle murin de la fusion MLL-AF4 suggère

l’influence d’une période particulière (E12-E14) du stade développemental ainsi que la

nécessité de cibler un progéniteur spécifique (LMPP fœtal) pour induire une pathologie

(208). Cependant, les pathologies rapportées avec ce modèle semblent se rapprocher plus

de lymphomes que de réelles leucémies aiguës suggérant que des analyses supplémentaires

seront requises pour développer un modèle fidèle de la pathologie humaine.

Dans le cas des autres oncogènes de fusion retrouvés dans les LAM-M7, nos résultats

indiquent que les propriétés des cellules fœtales ont un impact sur leur capacité à induire

une transformation présentant un phénotype mégacaryoblastique. En effet, l'expression de

MLL-AF9 et NUP98-KDM5A dans des progéniteurs fœtaux permet un phénotype

mégacaryoblastique alors que leur expression dans des progéniteurs adultes entraîne un

phénotype myéloïde. Ces résultats, obtenus in vitro, nécessitent d’être validés pour

163

confirmer la capacité de ces cellules à générer des LAM-M7 in vivo présentant les

caractéristiques retrouvées chez les patients.

Importance du type de cellule ciblée

De façon générale, la recherche de la cellule à l'origine des transformations leucémiques est

importante pour le développement de modèles récapitulant les leucémies et pour la

proposition de thérapies personnalisées. Il a été montré que certains oncogènes peuvent

transformer différents progéniteurs conduisant à des leucémies plus ou moins agressives et

sensibles aux traitements. Par exemple, la fusion MLL-AF9 peut transformer aussi bien des

cellules souches hématopoïétiques adultes que des progéniteurs GMP en leucémie

myélomonocytaire, mais son expression dans des HSC induit des leucémies plus agressives

(162).

Dans le cas des LAM-M7, au moins deux hypothèses existaient quant à leur origine cellulaire

au début de ce travail. La première était que les oncogènes arrivent dans un progéniteur

présentant une capacité de différenciation restreinte à la lignée mégacaryocytaire. La

deuxième était que les oncogènes surviennent dans les HSC ou progéniteurs multipotents et

que leurs conséquences fonctionnelles biaisent ces cellules vers un phénotype

mégacaryoblastique.

Nos résultats indiquent que les conséquences de fusion ETO2-GLIS2 sont drastiquement

différentes en fonction du progéniteur ciblé. En effet, l’expression de la fusion dans les HSC

issues de la moelle osseuse adulte engendre in vitro un phénotype exclusivement

mégacaryocytaire, tandis que les progéniteurs multipotents (MPP2 à 4) exprimant ETO2-

GLIS2 conservent aussi un phénotype myéloïde. L'implication d'un progéniteur multipotent

est également confirmé par l'existence d'un patient ETO2-GLIS2 présentant un double

phénotype et pour lequel les blastes immatures sont capables de régénérer des blastes

mégacaryoblastiques et myéloïdes dans des xénogreffes sériées.

Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que le phénotype des leucémies induites par ETO2-

GLIS2 est dépendant du type de cellule hématopoïétique ciblé. Sur la base de ces résultats,

je propose que l'expression de la fusion dans une HSC soit nécessaire pour le

développement d'une leucémie à phénotype mégacaryoblastique (LAM-M7), et que le

164

développement d'une LAM d'un autre sous-type requiert l'expression de la fusion dans un

progéniteur plus engagé ayant perdu la capacité mégacaryocytaire.

Un lien direct entre HSC et différenciation mégacaryocytaire a été mis en évidence

récemment par plusieurs équipes. Ce modèle propose que les mégacaryocytes dérivent

directement des HSC sans passer par les progéniteurs intermédiaires, et que la

mégacaryopoïèse représente une différenciation par défaut des HSC (49). Nos résultats

soulignent que ce lien étroit entre HSC et le phénotype mégacaryoblastique pourrait

constituer le point commun entre les différents sous-groupes moléculaires de LAM-M7. En

effet, malgré l'hétérogénéité génétique des LAM-M7 pédiatriques, il est possible que les

dérégulations épigénétiques induites par les fusions des LAM-M7 aient pour point commun

d'induire le phénotype mégacaryoblastique par défaut des HSC. Dans cette hypothèse, les

LAM-M7 pourraient donc être considérées comme des leucémies de la cellule souche

hématopoïétique "primitive" plutôt que des leucémies d'un progéniteur mégacaryocytaire

engagé.

Contrôle moléculaire du phénotype

Plusieurs observations indiquent que la transformation et les phénotypes induits par la

fusion ETO2-GLIS2 impliquent une altération de l'activité de plusieurs facteurs de

transcription contrôlant l'engagement des HSC vers les différentes lignées

hématopoïétiques. En effet, les cellules humaines présentent une dérégulation de la balance

entre les facteurs ERG et GATA1. De plus, les analyses transcriptionnelles réalisées 24h post-

induction de la fusion montrent une dérégulation transcriptionnelle drastique dans les HSC

adultes murines (reproduisant la signature observée chez les patients LAM-M7 ETO2-

GLIS2), alors que les progéniteurs MPP4 sont peu affectés à ce stade. Dans l'ensemble, les

résultats obtenus dans les cellules murines et humaines indiquent que la fusion induit une

inhibition de l'activité de régulateurs majeurs de lignées comme CEBPA, PU.1 et IRF8

(myéloïde), KLF1 et NF-E2 (érythroïde), IKZF1 (lymphoïde) associée à une augmentation de

l'activité de facteurs importants pour le maintien des HSC incluant ERG, GATA2, MYCN. Ces

résultats sont compatibles avec un blocage de différenciation des HSC à un stade très

précoce. L'absence de différence significative d'expression de plusieurs facteurs myéloïdes,

165

tel que CEBPA ou IRF8 dans les MPP4, indique que la fusion ne dérégule pas les mêmes

cibles dans les deux contextes.

Dans l'ensemble, nos analyses d'expression et fonctionnelles indiquent que la fusion est

associée à une plus forte expression d’ERG et GATA1 dans les cellules leucémiques

présentant un phénotype mégacaryoblastique alors qu'une activité de CEBPA est plus

importante dans les cellules leucémiques présentant un phénotype myéloïde.

Pour le phénotype myéloïde, ces résultats sont en accord avec une étude récente impliquant

directement CEBPA dans l’engagement des HSC normales vers les différentes lignées

myéloïdes (110). CEBPA est un facteur de transcription qui régule les gènes spécifiques de

ces lignées et inhibe la prolifération cellulaire (109). Il a aussi été impliqué dans le

changement de statut prolifératif à quiescent observé entre le HSC fœtales et les HSC

adultes, notamment par la régulation du facteur Mycn (45,94). La perte de CEBPA dans les

HSC adultes est associée à une réactivation du programme transcriptionnel fœtal ainsi qu’à

une augmentation de leur prolifération (45). A l’état basal, CEBPA est moins exprimé dans

les HSC que les MPP4 (58). De façon intéressante, lorsque la fusion ETO2-GLIS2 est induite,

CEBPA ne semble pas exprimé dans les HSC alors que le niveau reste inchangé dans les

MPP4. Ceci suggère que la fusion ne parvient pas à inhiber CEBPA lorsqu’il est initialement

exprimé. Dans l'ensemble, l’acquisition d'une fusion ETO2-GLIS2 dans un progéniteur

exprimant fortement CEBPA serait en faveur du développement d’une LAM avec un

phénotype myéloïde.

En revanche, le facteur PU.1 ne semble pas déterminant pour le phénotype myéloïde et son

inhibition par la fusion pourrait donc principalement contribuer à une augmentation de

l'autorenouvellement des progéniteurs (108). Cette hypothèse nécessitera d'être testée

fonctionnellement.

Pour le phénotype mégacaryoblastique, nous proposons que la fusion ETO2-GLIS2 entraîne

une dérégulation de la balance entre le facteur ERG et GATA1 impliquée dans la progression

de la différenciation mégacaryocytaire (voir revue en annexe).

Dans les cellules murines, le facteur ERG semble exprimé de façon identique entre les HSC

et dans les progéniteurs engagés normaux tels que les MPP4 (58). L'expression de la fusion

166

ETO2-GLIS2 induit la surexpression de ERG seulement dans les cellules issues de HSC.

Cependant, la surexpression de ERG est commune à plusieurs cancers et entraîne différents

phénotypes dans des modèles murins. En effet, dans des progéniteurs murins issus de la

moelle osseuse adulte, la surexpression de ERG engendre exclusivement une leucémie aiguë

lymphoïde (LAL), alors que chez les receveurs de progéniteurs fœtaux surexprimant ERG,

30% développent une LAL et 70% développent des leucémies érythro-mégacaryoblastiques

(143). La surexpression de ERG seule ne peut expliquer le phénotype mégacaryoblastique

induit par la fusion ETO2-GLIS2.

Dans le cas de GATA1, la fusion ETO2-GLIS2 inhibe son expression de façon importante à la

fois dans les cellules humaines et murines. Cependant, il est important de noter que 1)

Gata1 est plus exprimé dans les HSC que dans les progéniteurs engagés normaux tels que

les MPP4 (58), 2) la fusion ETO2-GLIS2 inhibe l'expression de Gata1 dans les HSC et les

MPP4 mais que le niveau de Gata1 reste supérieur dans les HSC en comparaison des MPP4

et 3) dans les blastes de leucémies humaines, GATA1 est plus exprimé dans les

mégacaryoblastes que dans les blastes myéloïdes. Ainsi, mon hypothèse est que le

phénotype mégacaryoblastique des LAM-M7 induites par ETO2-GLIS2, nécessite une

réduction importante de l'activité GATA1 contribuant au blocage de différenciation, mais

requiert un niveau minimal supérieur à celui observé dans les cellules myéloïdes. Le niveau

d'expression de GATA1 et de CEBPA dans la cellule dans laquelle survient la fusion pourrait

donc être un déterminant important du phénotype mégacaryoblastique ou myéloïde

résultant.

De façon intéressante, les facteurs ERG et GATA1 sont fortement exprimés dans les

progéniteurs fœtaux par rapport aux adultes. On peut également noter que les patients

LAM-M7 présentent fréquemment une trisomie 21 acquise. Une hypothèse pour expliquer

cette association est que le gène ERG, localisé sur le chromosome 21, serait surexprimé de

façon encore plus élevé par la fusion dans un contexte trisomique, dérégulant de façon

encore plus importante la balance ERG/GATA1 et renforçant ainsi le blocage de

différenciation.

Les HSC fœtales présentent des caractéristiques cellulaires et moléculaires différentes des

HSC adultes. La modification de ces caractéristiques s’opère, chez la souris, dans les 3

167

semaines après la naissance ou post-greffe dans des souris adultes (32). Cette période

pourrait correspondre aux environs des 4 ans après la naissance chez l'Homme. De plus, il a

été montré que les différents progéniteurs (HSC et MPP) fœtaux humains normaux

présentent un potentiel mégacaryoblastique plus important que les progéniteurs adultes

pour lesquels seules les HSC conservent ce potentiel ((77), nos datas).

L’ensemble de ces observations suggère que le phénotype induit par les oncogènes de

fusion des LAM pédiatriques dépend fortement des propriétés (multipotence,

différenciation, profil moléculaire) des progéniteurs cibles qui sont dynamiquement régulés

au cours de l’ontogenèse. L’acquisition des oncogènes au cours du développement (in utero)

semble ainsi favoriser le développement de LAM-M7, alors que leur apparition plus

tardivement et/ou dans un progéniteur restreint favorise les LAM myéloïdes. Cette

hypothèse permettrait d'expliquer la fréquence plus élevée des LAM-M7 chez les très

jeunes enfants (Figure 26).

Figure 26 : Influence de l’ontogenèse hématopoïétique sur le phénotype des leucémies.

Normalhematopoiesis

PediatricleukemiafusionsAMKL/AML

AMKL

AML

Fetal Adult

ERG/GATA1CEBPA

Birth

Age

No disease

HSC

Progenitors

168

Perspectives thérapeutiques pour les LAM-M7 et leucémies ETO2-GLIS2

La thérapie actuelle pour les LAM-M7 et leucémies ETO2-GLIS2 est une chimiothérapie

intensive non ciblée. De manière générale, le développement de nouveaux traitements pour

les leucémies s'est focalisé soit sur le ciblage de propriétés cellulaires générales

(prolifération, apoptose, différenciation) soit sur le ciblage des mécanismes moléculaires

spécifiques mis en œuvre par un oncogène.

Dans le cas des LAM-M7, l'équipe de John Crispino a proposé, il y a quelques années, une

nouvelle approche thérapeutique des hémopathies malignes affectant la lignée

mégacaryoblastique sur la base d'une propriété naturelle de cette lignée : la capacité à

former des cellules polyploïdes au cours de la différenciation terminale. Ainsi, une approche

de criblage de petites molécules pouvant induire une différenciation des blastes LAM-M7 en

induisant leur polyploïdisation a permis l'identification d'inhibiteurs de la kinase Aurora A,

tel que le dimethylfasudil (diMF) ou le MLN8237. Par la suite, l'utilisation de ces molécules

a montré qu’elles permettent l’induction de la ploïdie, la différenciation et l’apoptose de

leucémies mégacaryoblastiques murines et humaines in vitro indépendamment de

l’altération génétique observée. Ces molécules ont été testées avec succès in vivo sur des

modèles murins de xénogreffes de patient MLL-AF9 ou ETO2-GLIS2 (178,195). Ces données

suggèrent qu'une inhibition de la kinase Aurora A dans le contexte des LAM-M7 permet de

restaurer au moins en partie les capacités de différenciation des blastes de LAM-M7. Un

essai clinique testant cette approche est en cours pour les LAM-M7 et les myélofibroses de

l'adulte (clinicaltrials.gov: NCT02530619).

Pour obtenir une inhibition plus spécifique des mécanismes induits par la fusion ETO2-

GLIS2, nous avons au cours de ce travail utilisé un peptide contenant la séquence protéique

du domaine NHR2 de ETO, présentant une forte homologie avec ETO2. Ce peptide en

limitant l’oligomérisation de la fusion ETO2-GLIS2 inhibe la prolifération des cellules

leucémiques humaines in vitro et in vivo. Cette approche ciblant le complexe protéique

incluant les protéines ETO, développé pour la fusion AML1-ETO, démontre l’importance des

interactions protéiques au sein des complexes ETO/ETO2 pour le maintien des cellules

leucémiques de plusieurs sous-types de leucémies. Cependant, les limites probables de

169

cette approche pour un développement clinique incluent le mode d’administration aux

patients (ces peptides traversent difficilement la membrane des cellules) et l'observation

que la protéine ETO2 normale est essentielle au maintien des cellules souches

hématopoïétiques normales. Les perspectives de développement futures reposent donc

probablement sur l'identification d'un composant de ce complexe recruté plus

spécifiquement par ETO2-GLIS2 ou en commun avec d'autres oncogènes de fusions et dont

l'inhibition n'altère pas significativement l'hématopoïèse normale.

Nous avons pu voir que le facteur ERG était important pour le maintien et la prolifération

des cellules leucémiques ETO2-GLIS2 LAM-M7. ERG est impliqué dans de nombreux cancers,

associé à un mauvais pronostic. L’inhibition de ce facteur de transcription aurait un impact

sur les patients ETO2-GLIS2 mais aussi sur beaucoup d’autres cancers.

Les facteurs ETS sont fréquemment phosphorylés par les MAPK ce qui permet de réguler

leur activité. Il serait intéressant de regarder l’état de phosphorylation de ERG dans les

LAM-M7 en vue d’utiliser des inhibiteurs des MAPK. La phosphorylation d’ERG sur la serine

283 par ERK2, a été impliquée dans le processus de leucémogenèse de patients LAM et LAL-

T (244). De même, la phosphorylation d’ERG sur la serine 215 et la serine 96 induites par

ERK2 ont été impliquées dans la migration cellulaire des cancers de la prostate (245,246).

ERG présente un domaine de liaison à l’ADN qui peut être la cible de peptide, ce qui va

entraîner sa dégradation. Ces peptides ont été testés avec succès dans des modèles de

xénogreffe de cancer de la prostate (247). Une approche similaire pourrait être envisagée

pour la fusion ETO2-GLIS2.

170

LISTE DES ABREVIATIONS

A

ABL1 v-abl abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 ABM Adult Bone Marrow ADN Acide désoxyribonucléique AF9 ALL1 fused gene on chromosome 9 AGM Aorte-Gonade-Mesonephros AKT v-akt murine thymoma viral oncogen homolog ARN Acide ribonucléique

B BCR B-cell receptor BMP Bone Morphogenic Protein BRD4 Bromodomain containing

C CAR CXCL12-abundant reticular CDP Common Dendritic Progenitor CEBP CCAAT/enhancer binding protein

ChIPseq Séquençage de l'immunoprécipitation de la chromatine CLP Common Lymphoid Progenitor cMoP Common Monocyte Progenitor CMP Common Myeloid Progenitor CTCF CCCTC-binding factor CXCL Chemiokine C-X-C motif ligand CXCR Chemiokine C-X-C motif receptor

D DC Dendritic cell

DHH Desert Hedgehog

E EHT Endothelial to Hematopoietic Transition EMP Erythro-Myeloid Progenitor ERG V-ETS avian erythoblastosis virus E26 Oncogene homolog ETO2 (CBFA2T3) CBFA2/RUNX1 translocation partner 3

F FAB Franco-Américano-Britanique

FACS Fluorescence-activated cell sorting FISH Fluorescent in situ hybridization FL Fetal liver

171

FLI1 Friend leukemia integration 1 FLT3 Fms-like tyrosine kinase 3 FLT3-ITD Internal tandem duplication of FLT3 FT Facteur de transcription

G GATA Globin transcription factor G-CSF Granulocte Colony Stimulating Factor GFP Green fluorescent protein

GLIS2 Kruppel-like Zinc finger protein GM-CSF Granulocyte Monocyte Colony Stimulating Factor GMP Granulocyte-Monocyte Progenitor GpIb Glycoprotéine Ib (CD42)

H H3 Histone 3 HE Hemogenic Endothelial HEC Hematopoietic Endothelial Cell HOX Homeobox gene

HPC Hematopoietic Progenitor Cell HSC Hematopoiétique Stem Cell

I iPS induce pluripotent stem cell IL1a Interleukine 1a

L LA Leucémie Aiguë

LAM Leucémie Aiguë Myéloide

LIN- Lineage negative LMPP Lymphoid Multipotent Progenitor LSC Leukemic Stem Cell LSK Cellules LIN- Kit+ Sca1+ LT-HSC Long Term-Hematopoietic Stem Cell

M MAL (MKL1) Myelin and lymphocyte protein M-CSF Monocyte Colony Stimulating Factor MDP Monocyte and Dendritic Progenitor

MEP Megakaryocyte Erythrocyte Progenitor Mk Megacaryocyte MkP Megakaryocyte Progenitor

172

MPL Myeloproliferative Leukemia virus oncogene MPP Multipotent Progenitor MSCV Murine stem cell virus

O OMS Organisation mondiale de la santé OTT (RBM15) RNA binding motif protein 15

P PML Promyelocytic leukemia

PU.1 Purine-rich box 1

R RARA Retinoidc acid receptor alpha

RBPJ Recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa j region

RUNX1 Runt-related transcription factor 1

S SCF Stem Cell Factor

SE Super-Enhancer SHH Sonic Hedgehog SL-MkP Stem cell like Megakaryocyte Progenitor ST-HSC Short Term-Hematopoietic Stem Cell

T TMD Transcient Myeloproliferative Disorder TPO Thrombopoïétine

V

vWF Von Willebrand Factor

Z ZF Zinc finger

173

174

ANNEXES

Pediatric Acute Megakaryoblastic Leukemia : Multitasking Fusion Proteins and Oncogenic Cooperations

Trends in Cancer

Review

175

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188

Molecular pathways driven by ETO2-GLIS2 in aggressive pediatric leukemia

Molecular and cellular oncology Review

189

190

191

192

Leucémies à mégacaryoblastes de l’enfant : une affaire de complexes

Medecine / Sciences Review

(En cours de publication)

193

Leucémies à mégacaryoblastes de l'enfant : une affaire de complexes

Cécile K Lopez, Thomas Mercher

Inserm U1170, Institut Gustave Roussy, Pavillon recherche 2 - 39 rue Camille Desmoulins,

94800 Villejuif

[email protected]

Résumé

Les leucémies aiguës mégacaryoblastiques de l'enfant (LAM7) sont généralement associées

à un mauvais pronostic et à l'expression d'oncogènes de fusion impliquant des régulateurs

transcriptionnels. Des résultats récents indiquent que la fusion ETO2-GLIS2 dérégule

l'activité de régions régulatrices de l'expression génique, appelées "enhancers", et altère

l'expression des facteurs GATA et ETS essentiels au développement des cellules souches

hématopoïétiques. Une dérégulation de l'équilibre GATA/ETS est également retrouvée dans

d'autres sous-groupes de LAM7. Cette revue porte sur les bases transcriptionnelles de la

transformation dans les LAM7 de l'enfant et les perspectives thérapeutiques.

194

Hématopoïèse normale et leucémies

L’hématopoïèse normale est le processus qui permet le développement de toutes les

cellules du sang incluant les lymphocytes, les érythrocytes ou globules rouges et les

plaquettes sanguines. Toutes ces cellules se développent à partir de cellules dites cellules

souches hématopoïétiques (HSC) localisées chez l’adulte dans la moelle des os [1]. Les HSC

sont capables de se maintenir (par des propriétés de quiescence et d'autorenouvellement)

et peuvent également proliférer sous la forme de progéniteurs qui se différencient pour

donner les milliards de cellules matures qui entrent dans le sang chaque jour pour mener

leur fonction. Pour maintenir un nombre constant de cellules, ce processus est régulé

finement par des signaux de l’environnement des cellules (ex: cellules à proximité ou des

facteurs de croissance solubles) qui peuvent stimuler des voies de signalisation et par des

facteurs propres aux cellules (ex: l’organisation de l’ADN et l’expression de facteurs de

transcription) qui peuvent réguler l’expression d’autres gènes importants pour la

prolifération ou la maturation. Certains facteurs de transcription contrôlent le

développement de lignées hématopoïétiques spécifiques et d'autres sont requis pour tous

les progéniteurs hématopoïétiques. Ces facteurs de transcription semblent fréquemment

regroupés au sein de complexes contenant plusieurs régulateurs transcriptionnels et dont

la composition contrôle l'identité et le niveau d'expression des gènes cibles [2]. En effet, les

facteurs peuvent être associés à des modifications de la chromatine, comme celles des

histones ou de l'ADN, conduisant à une activation ou une répression de l'expression des

gènes alentours. Certaines de ces modifications, telle que l'acétylation de la lysine 27 de

l'histone 3 (H3K27ac) peuvent s'étendre sur de larges régions (plusieurs 100aine de kb)

appelées enhancer ou super-enhancer [3]. Ces régions sont liées par de nombreux facteurs

de transcription et facteurs généraux de la machinerie transcriptionnelle (ex: facteurs BRD

et complexe Mediator) et sont associées à une transcription importante de gènes. La

localisation de ces régions enhancers a été associée à l’identité cellulaire et une hypothèse

actuelle est que l'activité de ces régions contrôle en partie l'équilibre entre auto-

renouvellement/prolifération des cellules souches et progéniteurs et progression vers la

différenciation terminale [4].

195

Parmi les facteurs de transcription important pour l'hématopoïèse, les facteurs de la famille

GATA lient l'ADN sur un motif consensus de type 5'-(A/T)GATAA(G/A/C)-3' et sont

fréquemment associés à des complexes multiprotéiques composés d'au moins 7 facteurs de

transcription (nommé heptad), incluant également TAL1, LYL1, LMO2, RUNX1, ERG et FLI1.

Ces complexes sont actifs dans les cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques

adultes mais également dès l'apparition des premières cellules souches hématopoïétiques

au cours du développement [5]. Les facteurs GATA sont également essentiels pour le

développement des globules rouges et des mégacaryocytes qui sont à l'origine des

plaquettes sanguines [6]. Un changement d'activité des facteurs GATA est observé au cours

de la différenciation avec une activité GATA2 importante dans les cellules souches

hématopoïétiques et progéniteurs alors que l'activité GATA1 est plus importante dans les

cellules engagées dans la différenciation érythroïde ou mégacaryocytaire. Ce processus

d'échange des facteurs GATA au cours de la différenciation est appelé GATA-switch [7]. Des

approches de localisation de ces facteurs sur la chromatine (immunoprécipitation de

chromatine couplée au séquençage haut-débit : ChIPseq) confirment que GATA1 remplace

GATA2 au niveau de plusieurs gènes importants pour la différenciation mégacaryocytaire

[8] et que ce GATA-switch constitue une base moléculaire importante du remodelage des

enhancers au cours du développement érythroïde [9]. Une interaction fonctionnelle entre

les facteurs GATA et d'autres membres des complexes transcriptionnels, tels que les

facteurs ETS liant des motifs 5′-GGA(A/T)-3′ [2] est également importante pour la

différenciation mégacaryocytaire. En effet, le facteur ETS FLI1, dont l'expression est

augmentée au cours de la maturation, régule conjointement avec GATA l'expression de

gènes cibles mégacaryocytaires, tels que ITGA2b [10]. Ainsi, il a été proposé que cette

interaction fonctionnelle GATA/ETS joue un rôle important dans les HSC et dans leur

engagement vers la lignée mégacaryocytaire alors qu'une interaction fonctionnelle entre

GATA et TAL1 serait plus importante pour la différenciation érythroïde [8,9,11,12]. Au sein

de ces complexes, les cofacteurs de la famille ETO/ETO2 interagissent avec les facteurs de

transcription et des régulateurs transcriptionnels [13] et un changement de stœchiométrie

de ETO2 dans des complexes TAL1 participe également à la transition entre prolifération et

différenciation terminale au cours de l'érythropoïèse [14].

196

Les leucémies aiguës sont des altérations de l’hématopoïèse caractérisées par une

accumulation de progéniteurs associée à une altération de la différenciation terminale et

une insuffisance du système hématopoïétique. Les leucémies sont généralement classées en

fonction de la lignée hématopoïétique préférentiellement atteinte et présentent des

incidences variables en fonction de l’âge. Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) sont

caractérisées par la présence d'altérations génétiques dans les cellules souches et

progéniteurs hématopoïétiques [15]. Ces mutations affectent plusieurs fonctions

biologiques incluant la régulation de la transcription (ex: facteurs de transcription), de la

méthylation (ex: TET2, DNMT3A), de la chromatine (ex: CTCF), de l'épissage (ex: SRSF2), de

la signalisation (ex: JAK2) et du cycle cellulaire (ex: TP53). Les mutations affectant les

facteurs du complexe heptad (ex: TAL1, RUNX1) et ETO/ETO2 sont récurrentes et

généralement mutuellement exclusives dans les leucémies aiguës humaines, suggérant

qu'elles ciblent un mécanisme conservé de la biologie des cellules souches

hématopoïétiques. L'étude des leucémies représente donc une opportunité d'identifier et de

caractériser la fonction des régulateurs transcriptionnels importants contrôlant

l'hématopoïèse et la biologie des cellules souches humaines.

Génétique des leucémies mégacaryoblastiques

Les leucémies aiguës à mégacaryoblastes (LAM7) qui affectent la lignée mégacaryocytaire,

représentent un sous-type de leucémie rare mais diagnostiqué plus fréquemment chez

l’enfant que chez l'adulte [16]. Elles peuvent survenir suite à une prédisposition, telle que

les LAM7 associées à une trisomie 21 constitutionnelle (nommées ici DS-LAM7) et à un

pronostic favorable, ou diagnostiquées de novo (sans prédisposition apparente) et

généralement associées à un mauvais pronostic [17].

Les DS-LAM7 sont un groupe relativement homogène de patients et leur développement

représente un mécanisme de progression tumorale en 3 étapes, chacune associée à

l'acquisition d'altérations génétiques se cumulant et incluant: 1-une trisomie constitutive

du chromosome 21 associée à un prédisposition aux leucémies, 2-des mutations

somatiques du gène GATA1 entrainant une troncation de la partie Nt de la protéine (mutant

197

GATA1short ou GATA1s) associées à un syndrome myéloïde transitoire (SMT) diagnostiqué

à la naissance et 3-des mutations additionnelles dans des intermédiaires de voie de

signalisation (47%, ex: MPL ou JAK) et/ou des régulateurs épigénétiques (65%, ex: EZH2,

CTCF, RAD21) qui sont associées à l'étape de leucémie aiguë (DS-LAM7) diagnostiquée

généralement après l’âge de 3 ans (Pour revue voir [18]).

Dans le groupe de LAM7 de novo, les analyses cytogénétiques et génomiques globales ont

montré, dans la majorité des cas, la présence d'altérations chromosomiques conduisant à

l’expression d’oncogène de fusion (Figure 1A) [19,20]. La première anomalie récurrente

identifiée a été une translocation entre le chromosome 1 et 22, visible en cytogénétique

classique, et codant pour la fusion OTT-MAL incluant la quasi-totalité des deux protéines

[21]. Des réarrangements impliquant MLL (également nommé KMT2A) sont retrouvés dans

7-17% des cas, alors que la fusion NUP98-KDM5a dans 10-15% de LAM7 de novo. Ces 2

sous-groupes sont associés à une expression aberrante des gènes homéotiques HOX, dont le

gène HOXA9 qui a été impliqué dans le développement et la maintenance de certaines

leucémies [22]. Le rôle de ces gènes dans le développement leucémique est également

souligné par la présence de réarrangements impliquant les gènes HOX eux-mêmes associés

à leur surexpression dans 15% des LAM7 de novo [20]. La fusion ETO2-GLIS2 récemment

découverte est présente dans 18 à 27% des LAM7 de novo et résulte d’une inversion du

chromosome 16 qui code pour une protéine de fusion exprimant la quasi-totalité des

protéines ETO2 et GLIS2 normales. Ces fusions se réalisent entre les exons 10 à 12 de ETO2

et les exons 1 à 3 de GLIS2 [19]. D'autres fusions plus rares sont également observées

incluant TLS-ERG, MN1-FLI1, BCR-ABL1, MAP2K2-AF10. Un sous-groupe (nommé DS-like)

présente également les mêmes types de mutations que celles observées pour les DS-LAM7 à

ceci près que la trisomie 21 est acquise et non constitutive. D'autre part, l'importance d'une

coopération oncogénique pour la transformation est soulignée par la présence dans

plusieurs sous-groupes de mutations additionnelles incluant une trisomie 21 acquise, des

mutations GATA1 et RB1 ou des mutations des cohésines et d'intermédiaires de

signalisation (Figure 1B). Finalement, 10-15% des patients ne présentent pas de mutation

causale identifiée à ce jour.

198

Mécanismes moléculaires de la fusion ETO2-GLIS2

La fusion ETO2-GLIS2 est l’altération génétique la plus fréquemment retrouvée dans les

LAM7 de novo, et est associée à un pronostic particulièrement défavorable.

Le gène ETO2 code une protéine de la famille ETO qui est exprimée dans toutes les cellules

hématopoïétiques. ETO2 est un cofacteur transcriptionnel qui interagit avec les facteurs de

transcription du complexe heptad. Une inactivation d'ETO2 chez la souris est associée à une

absence de maintien des HSC [23]. ETO2 joue également un rôle d'inhibition de la

mégacaryopoïèse [8] en réprimant certains gènes impliqués dans la différenciation

terminale (comme GATA1 et PF4, [24]). GLIS2 est un facteur de transcription de la famille

GLI impliqué dans la voie de signalisation Hedgehog et les patients présentant ETO2-GLIS2

montrent une signature transcriptionnelle de surexpression de gènes cibles de cette voie

par rapport aux autres patients [19]. De récentes études suggèrent un rôle positif de GLIS2

dans la capacité de reconstitution des HSC [25]. La fusion implique donc deux régulateurs

transcriptionnels.

Récemment, nous avons caractérisé les contributions relatives de ETO2 et GLIS2 à la

transformation par ETO2-GLIS2 et observé que la fusion augmente l’autorenouvellement

des progéniteurs hématopoïétiques à la fois par la partie ETO2 et la partie GLIS2 [26]. De

plus, la partie GLIS2 est responsable du phénotype mégacaryocytaire. Ces résultats

indiquent que la fusion ETO2-GLIS2 est capable seule d'augmenter l'autorenouvellement

des progéniteurs présentant un phénotype mégacaryocytaire. Au niveau moléculaire, la

fusion ETO2-GLIS2 dérégule l'expression de nombreux de gènes, incluant ceux codant pour

les protéines du complexe heptad. Ainsi, l’expression de GATA1 est fortement diminuée

alors que celle de ERG est fortement augmentée. Cette dérégulation est également observée

dans les signatures transcriptionnelles des blastes de patients ETO2-GLIS2. L'identification

des régions de l’ADN sur lesquelles se fixe la fusion a ensuite montré qu'elle est localisée sur

des enhancers. L'analyse des motifs associés à ces régions suggère que cette liaison se fait

soit par l'intermédiaire des facteurs de transcription ERG, RUNX et GATA interagissant avec

ETO2 soit directement via la partie GLIS2.

Comme l’activité des régions enhancer est importante pour les cellules cancéreuses [27],

nous avons cherché comment la stabilité des complexes est régulée. Tout d'abord, nous

199

avons montré que le facteur ERG colocalise fréquemment avec la fusion et est associé à une

expression forte des gènes proches des enhancers. L’inactivation fonctionnelle de ERG par

ciblage du génome de type CRISPR/cas9 dans des cellules exprimant la fusion a finalement

montré que ERG joue un rôle essentiel dans la régulation transcriptionnelle de certains

gènes cibles de la fusion comme KIT et dans la survie des blastes leucémiques humains

ETO2-GLIS2.

Mécanismes communs aux leucémies à mégacaryoblastes

La différenciation mégacaryocytaire terminale implique un changement dynamique de la

composition/activité des complexes de facteurs de transcription avec l'acquisition d'une

forte activité GATA1 et d'une faible activité ERG dans les mégacaryocytes matures (Figure

2). Les résultats obtenus avec ETO2-GLIS2 indiquent que la fusion peut imposer seule, une

forte activité ERG et une faible activité de GATA1 qui participe au blocage de la

différenciation. Globalement, l'analyse des modèles de LAM7 obtenus jusqu'à présent

(Tableau 1) suggère que la modification de l'activité des facteurs ETS (ex : ERG) et de

GATA1 est un mécanisme commun aux LAM7 pédiatriques.

En effet, le gène ERG, localisé sur le chromosome 21, est sujet à une augmentation du

dosage génique dans les cellules trisomie 21 et sa surexpression peut transformer la lignée

érythroïde ou mégacaryocytaire [28]. La trisomie 21 est retrouvée dans tous les sous-

groupes de LAM7 avec une fréquence de 11 à 100% (Figure 1B). La présence de fusions

TLS-ERG et MN1-FLI1 (Figure 1, groupe "Autres") montre également l'implication directe

des facteurs ETS ERG et FLI1 présentant une forte homologie de séquence et de fonction

[29]. Dans le cas de MN1-FLI1, les capacités d'autorenouvellement des progéniteurs murins

in vitro et le phénotype mégacaryocytaire sont contrôlés par la partie FLI1 [30]. D’autres

mutations fréquemment retrouvées dans les différents sous-groupes de LAM7 participent à

modifier l’activité de ERG. Par exemple, les cohésines contrôlent l’organisation

chromatinienne et leur inactivation fonctionnelle favorise l’accessibilité de ERG à certaines

régions de l'ADN [31]. D'autre part, certaines mutations d'intermédiaires de voie de

signalisation (ex: MPL et JAK2) activent la voie MAPK qui régule également l’activité de ERG

[32]. Finalement, dans les DS- et DS-like LAM7, l'activité GATA1 est ciblé par les mutations

200

GATA1s qui contribuent à la transformation mégacaryoblastique et coopère avec une

surexpression de ERG [33].

Dans le cas des fusions MLL, NUP98 et HOX, les bases de leur association fréquente avec les

LAM7 de l'enfant restent à définir. En effet, ces fusions ont été initialement décrites dans

d'autres sous-types de leucémie et leur expression ectopique dans des modèles murins

induit soit une leucémie myéloïde aiguë, soit une leucémie lymphoïde dépourvue de

caractéristiques mégacaryocytaires typiques [34]. Leur association avec les LAM7 pourrait

résulter d'un rôle spécifique des partenaires de ces fusions au cours du développement des

mégacaryocytes comme pour HOXA10 [35]. Cependant, l'importance d'une dérégulation de

l'activité GATA1 et ERG par les mutations additionnelles retrouvées chez ces patients

pourrait également expliquer l'association avec un phénotype mégacaryocytaire. En effet,

les patients LAM7 avec NUP98-KDM5A ou des fusions HOX présentent une association

remarquable avec des mutations inactivatrices de RB1 et des mutations activatrices de MPL,

respectivement (Figure 1B). Comme GATA1 interagit avec RB1 et E2F2 pour réguler la

prolifération des progéniteurs érythro-mégacaryocytaires [36], il sera important de définir

si le rôle des mutations inactivatrices de RB1 dans la leucémogenèse des LAM7 est en

rapport avec l'activité GATA1. L'activité accrue des facteurs mégacaryocytaires comme

GATA ou ETS par une activation de la signalisation MPL pourrait également être à la base de

l'association entre les fusions HOX et les mutations MPL dans les LAM7. Alternativement, le

phénotype mégacaryoblastique dans les sous-groupes MLL / NUP98 / HOX pourrait

également résulter de la survenue de ces fusions dans des progéniteurs mégacaryocytaires

restreints.

Ciblage thérapeutique des complexes transcriptionnels : perspectives et difficultés

Les LAM7 de novo sont essentiellement caractérisées par la présence d’oncogène de fusion

impliquant des partenaires de complexe transcriptionnel (Figure 3A). Ces fusions

constituent des marqueurs moléculaires maintenant utilisés pour établir le diagnostic de

façon plus précise et suivre l’évolution de la maladie résiduelle au cours du traitement.

Dans le cas de la fusion ETO2-GLIS2 qui est associée à une mauvaise réponse aux

201

chimiothérapies, cela permet également d’orienter la stratégie thérapeutique vers une

greffe de moelle.

D'autre part, l'existence de fusions spécifiques affectant des complexes transcriptionnels

anormaux suggère de nouvelles stratégies thérapeutiques potentielles. Dans le cas des

fusions MLL, des inhibiteurs des partenaires du complexe comme DOT1L, BRD ou ENL sont

ainsi en cours de tests précliniques pour évaluer leur efficacité et spécificité.

Les membres de la famille ETO présentent la capacité de former des tétramères grâce à la

présence du domaine nervy homology region (NHR)2. L'expression d’un peptide identique

au domaine NHR2 d’ETO interfère dans la formation des tétramères et induit une inhibition

de la prolifération des cellules leucémiques présentant la fusion AML1-ETO [37],

représentant le sous-type cytogénétique le plus fréquent des LAM. En partant de

l’observation que le domaine NHR2 est fortement conservé entre les protéines de la famille

ETO, nous avons observé que la fusion ETO2-GLIS2 est capable de dimériser et d'interagir

avec la protéine ETO2 sauvage. L’expression du peptide correspondant au domaine NHR2

dans les cellules de patient leucémique ETO2-GLIS2 réduit l'interaction entre la fusion et

ETO2 sauvage (Figure 3B), inhibe la prolifération et augmente la différenciation des blastes

leucémiques in vitro et in vivo [26]. Ces résultats suggèrent que l’expression d'un petit

peptide NHR2 et l'interférence avec les complexes transcriptionnels anormaux impliquant

une protéine de fusion pourraient représenter une stratégie d'inhibition dans les LAM7.

Cependant, il sera nécessaire de définir si la stabilité des peptides ainsi que leur ciblage

attendu des complexes ETO endogènes représentent une stratégie thérapeutique

acceptable chez les patients ou si le développement d'autres méthodes d'interférence

transcriptionnelle avec ces complexes sera requis.

Dans l'ensemble, l'étude de la fusion ETO2-GLIS2 souligne le rôle d'une dérégulation de

complexes transcriptionnels multi-protéiques et d'une activité GLIS2 aberrante dans la

transformation des LAM7 de l'enfant. L'implication de GLIS2 dans le phénotype d'autres

leucémies (ex: MOZ-TIF2) [38] suggère un rôle plus large des facteurs GLIS dans

l'hématopoïèse normale et pathologie. D'autre part, il reste également à définir les bases

cellulaires et moléculaires de l'association spécifique de certaines fusions avec les

leucémies de l'enfant.

202

Remerciements

Ce travail est soutenu par l'Institut National du Cancer (PLBIO-2014-176), l'Association

Laurette Fugain (ALF-2015/13), la Fédération Enfants et Santé et la Société Française de

Lutte Contre les Cancers et les Leucémies de l'Enfant et l'Adolescent (SFCE: Projet

CAMELIAT), le SIRIC-SOCRATE (INCa-DGOS-INSERM 6043), la Fondation pour la Recherche

Médicale (FRM-ING20150532273), Cancéropôle Ile de France (à CL et Emergence 2015) et

le PAIR-Pédiatrie 2017 (Cancéropôle-INCA: projet CONECT-AML). L'équipe de TM est

labellisée Ligue contre le cancer.

Liens d’intérêt

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet

article.

Summary

Pediatric de novo acute megakaryoblastic leukemia: an affair of complexes

Pediatric acute megakaryoblastic leukemia (AMKL) are generally associated with poor

prognosis and the expression of fusion oncogenes involving transcriptional regulators.

Recent results indicate that the ETO2-GLIS2 fusion, associated with 25-30% of pediatric

AMKL binds and alters the activity of regulatory regions of gene expression, called

"enhancers", resulting in the deregulation of GATA and ETS factors essential for the

development of hematopoietic stem cells. An imbalance in GATA/ETS factor activity is also

found in other AMKL subgroups. This review addresses the transcriptional bases of

transformation in pediatric AMKL and therapeutic perspectives.

203

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Figures & Légendes

Figure 1 : Anomalies génétiques les plus récurrentes des LAM7 pédiatriques de novo

A. Répartition des oncogènes de fusions les plus fréquents dans les LAM7 de novo. ETO2-

GLIS2 (18-27%), Fusion HOX (9-15%, incluant EP300-HOXA7, NIPBL-HOXA9, GATA2-

HOXA9, HOXA9-ANGPT1, GATA2-HOXA10, XOXA10-BZW2, PLEK-HOXA11-AS, C8orf76-

A.

B.

0%

50%

100%

GATA1/RB1Trisomie21Cohésines

Signalisa on

%depa

entsm

utés

LAM7denovo

DS-Like

DS-LAM

7

NUP98-KDM

5a

HOX

MLL

Autres

ETO2-GLIS2

OTT-MAL

ETO2-GLIS2

Fusions MLL

Fusions HOX

NUP98-KDM5a

Trisomie 21 acquise + GATA1s (DS-Like)

OTT-MAL

Fusions rares + non déterminées (Autres)

LAM7 de novo

208

HOXA11-AS, EWSR1-HOXB8, NIPBL-HOXB9, BMP2K-HOXD10), Fusion MLL (7-17%,

incluant MLL-AF4, MLL-AF9, MLL-AF10), NUP98-KDM5a (9-15%), "Autres": fusions rares

(incluant TLS-ERG, MN1-FL1, BCR-ABL1, MAP2K2-AF10) et autres mutations non

déterminées (au total 13%), Trisomie 21 + GATA1s: "DS-like" (9-11%), OTT-MAL (5-10%).

La fréquence indiquée est sur la base des publications suivantes ((248): n=44, (249): n=87).

B. Fréquences des mutations additionnelles observées dans les différents sous-groupes de

LAM7 pédiatriques. GATA1/RB1: mutations conduisant à l’expression de la protéine GATA1

tronquée (GATA1s) ou mutations inactivatrices de RB1, Trisomie 21: trisomie acquise ou

constitutive, Cohésines: mutations inactivatrices de gènes codant pour des membres du

complexe des cohésines (incluant STAG2, RAD21, SMC3, SMC1A, NIPBL et CTCF),

Signalisation: mutations dans des gènes codant pour des intermédiaires de voie de

signalisation (incluant FLT3, RAS, MPL, JAK, KIT, STAT, MAP2K2, PTPN11, SOS1, SH2B3, CBL

et NF1).

209

Figure 2 : Mécanisme moléculaire des LAM7 pédiatriques

Panel haut: schéma de la différenciation mégacaryocytaire normale d’une cellule souche

hématopoïétique (HSC) impliquant des changements d'activité de certains facteurs de

transcription comme ERG et GATA1. L’activité de chaque facteur de transcription est

représentée par la taille du symbole.

Panel central: schéma de la coopération oncogénique retrouvée dans les patients DS-LAM7

et DS-like, incluant entre autre une dérégulation progressive de l'équilibre de l'activité des

facteurs de transcription en faveur de ERG. SMT: Syndrome Myéloïde Transitoire.

L'étoile rouge indique la conséquence fonctionnelle prédite pour l'altération génétique sur

l'équilibre de l'activité ERG/GATA1. Par exemple, la trisomie 21 induit une augmentation du

dosage génique pour ERG.

210

Panel bas: dans les LAM7 de novo, la fusion ETO2-GLIS2 semble conduire seule (seules de

rares mutations additionnelles sont décrites à ce jour, Figure 1B) à une dérégulation forte

de l'équilibre GATA1/ERG.

Figure 3 : Stratégie thérapeutique pour le ciblage des complexes transcriptionnels

anormaux

A. Pour les fusions MLL, des dépendances vis-à-vis de régulateurs chromatiniens, incluant

DOT1L, BRD et ENL ont été mises en évidence. Les LAM7 pédiatriques de novo présentent

des oncogènes de fusion impliquant des complexes transcriptionnels et de régulation

chromatinienne. Le ciblage direct de ces complexes transcriptionnels anormaux nécessitera

l'identification de nouvelles molécules.

B. Pour la fusion ETO2-GLIS2, l'utilisation d'un peptide NHR2 homologue au domaine NHR2

présent sur les protéines ETO2 et ETO2-GLIS2 réduit les interactions entre ETO2-GLIS2 et

la protéine ETO2 endogène.

211

Tableau 1 : Modèles de LAM7 pédiatriques

Les approches expérimentales de modélisation de la pathologie LAM7 utilisant les

oncogènes retrouvés dans les LAM7 pédiatriques humaines ainsi que les références

associées sont indiquées. Pour les modèles à partir de cellules humaines, seuls ceux

présentant un phénotype mégacaryoblastique clair sont indiqués. Lignées: lignées

cellulaires permanentes établies à partir d'échantillons de patient leucémique. PDX:

modèles de xénogreffes de leucémies de patients, iPS: cellules souches pluripotentes

induites, ES: cellules souches embryonnaires, CD34+: cellules souches hématopoïétiques,

CB: sang de cordon. Pour les modèles murins, noter que le phénotype des leucémies associé

à chaque oncogène est fréquemment myéloïde (LAM) autre que mégacaryoblastique

(LAM7). DS: Down Syndrome, LA: Leucémie Aiguë, LAL: Leucémie Aiguë Lymphoïde, LMC:

Leucémie Myéloïde Chronique, SMP: Syndrome Myéloprolifératif, Tri21: Trisomie 21,

GATA1s: GATA1 mutant, MPL*: mutant MPLW515L, Knock-In: insertion au locus endogène

murin, n.d.: non déterminé. [@]: Salvatore NB et al. ASH abstract 2017.

Cellules humaines Cellules murines

Altérations Lignées (250)0] PDX iPS / ES / CD34+ Type de modèle : Phénotype

DS-AMKL CMK (251)1]

CMY (252)2]

iPS: Trisomie 21 (253)3] Transgéniques trisomie 21 : absence de leucémie (254)4]

iPS: GATA1s (255)5] Rétrovirus ERG : LAL, LA érythro-mégacaryoblastique (256)8]

Transgénique Tri21 + rétrovirus GATA1s : pas de leucémie (254)4]

Transgénique (Tri21 & GATA1s) + rétrovirus MPL* : LAM7 (257)6]

OTT-MAL (258)9] iPS/ES: Lentivirus (259)7] Knock-In : LAM7 avec faible pénétrance (260)1]

ETO2-GLIS2 MO7e (261)8] (258)9] iPS: Knock-In AAVS1 [@] Rétrovirus : absence de maladie (262)4]

GATA2-HOXA9 Rétrovirus : LAM (262)4]

NIPBL-HOXB9 Rétrovirus : LAM (262)4]

NUP98-KDM5A (258)9] CD34+ CB: Lentivirus

(263)9]

Rétrovirus : LAM (262)4]

MLL-AF4 Transgénique conditionnel : Lymphome B

MLL-AF9 (258)9] Rétrovirus & Transgénique : LAM

MLL-AF10 Rétrovirus : LAM

TLS-ERG Rétrovirus : LAM

MN1-FLI1 Rétrovirus : LAM7 (264)0]

BCR-ABL1 MEG-01, K562 Rétrovirus & Transgénique : LAL-B, LMC

JAK2 T875N CHRF-288-11

(265)0]

Rétrovirus : SMP (265)0]

JAK3 A572V CMK Rétrovirus : Lymphome T (251)1]

n.d. CMS, M-MOK

212

Graphical abstract

213

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237

Etude des mécanismes cellulaires et moléculaires des leucémies à mauvais pronostic présentant

la fusion ETO2-GLIS2

Mots clés : LAM-M7, pédiatrique, facteur de transcription, contexte développemental, contexte cellulaire

Résumé : La fusion ETO2-GLIS2, récemment

découverte dans les leucémies aiguës

mégacaryoblastiques (LAM-M7) et d’autres sous-

types de leucémies aiguës myéloïdes (LAM), est

associée à un mauvais pronostic.

L’objectif de ce travail a été d’étudier les

mécanismes mis en jeu par ETO2-GLIS2 dans les

cellules leucémiques ainsi que son association

spécifique avec les leucémies pédiatriques. Par des

analyses moléculaires, nous avons montré que

ETO2-GLIS2 se fixe à l’ADN via la partie GLIS2

ainsi que via ETO2 et ses partenaires (incluant

GATA, ETS, RUNX) entrainant ainsi une forte

dérégulation de l’expression de facteurs de

transcription incluant ERG et GATA1.

J’ai développé un modèle murin inductible de la

fusion ETO2-GLIS2 qui reproduit efficacement

les différentes hémopathies observées chez

l’Homme. Ce modèle a permis d’observer

l’influence du stade développemental (hématopoïèse

fœtale vs. adulte) et du type cellulaire (cellule souche

hématopoïétique vs. Progéniteur multipotent) sur le

phénotype et l’agressivité des leucémies. De plus, la

dérégulation transcriptionnelle imposée par ETO2-

GLIS2 est différente en fonction du contexte

cellulaire. Dans l’ensemble ces résultats indiquent

que la fusion ETO2-GLIS2 est suffisante pour

induire une leucémie dont le phénotype et

l’agressivité sont dépendants du contexte cellulaire

dans lequel l’oncogène est introduit. Ils indiquent

également que les changements cellulaires et

moléculaires au cours du développement sont à

l’origine de la forte prévalence des LAM-M7 chez

les enfants.

Molecular and cellular mechanisms of ETO2-GLIS2 pediatric leukemia

Keywords : AMKL, pediatric, transcriptional factor, developmental stage, cellular context

Abstract : The ETO2-GLIS2 fusion, recently

discovered in acute megakaryoblastic leukemia

(AMKL) and other subtypes of acute myeloid

leukemia (AML), is associated with poor prognosis.

The aim of this work was to study the mechanisms

involved in ETO2-GLIS2 leukemic cells and its

specific association with pediatric leukemia.

Molecular analyses have shown that ETO2-GLIS2

binds to DNA via the GLIS2 moiety as well as via

ETO2 and its partners (including GATA, ETS,

RUNX), leading to a strong dysregulation of the

expression of transcription factors including ERG

and GATA1.

I have developed an inducible murine model of

ETO2-GLIS2 fusion that efficiently reproduces the

different hematopoietic malignancies

observed in humans. We were able to observe the

influence of developmental stage (fetal vs. Adulte

hematopoiesis) and cell type (hematopoietic stem

cell vs. Multipotant progenitor) on the phenotype

and aggressiveness of leukemia. In addition, the

transcriptional dysregulation imposed by ETO2-

GLIS2 was different according to the cellular

context.

Overall, these results indicate that ETO2-GLIS2

fusion is sufficient to induce leukemia whose

phenotype and aggressiveness are dependent on the

cellular context in which the oncogene is expressed.

They also indicate that cellular and molecular

changes during development are responsible for the

high prevalence of AMKL in children.

74005_LOPEZ_2018_archivage.pdf - TEL - Thèses

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