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Induction of apoptosis by Meretrix lusoria through reactive oxygen species production, glutathione depletion, and caspase activation in human leukemia cells
Origin ： Life Sciences 79 (2006) 1140–1152Authors ： P, M-H ， H, Y-T ， H, C-J ， C, C-I ， H, P-C ， P, B-SImpect Impact factor : 2.512 Speaker ： Ching-Sheng Hung MTDate ： 2007/11/09
IntroductionIntroduction
Meretrix lusoriaMeretrix lusoriaMeretrix lusoriaMeretrix lusoria
學名 Meretrix lusoria中文名 文蛤
中文俗名 普通文蛤、麗文蛤、粉蟯
英文俗名 Hard clam (HC)
型態特徵 貝殼呈亞三角形，黃褐色而有深褐色之斑紋，殼質堅
厚，殼面光滑，大者可長至 12公分
棲所生態 生活在低潮區及稍深的淺海細砂的海底，棲息深度可達
20 公尺
地理分布 東亞一帶皆產，台灣盛產於西海岸泥沙底，且大量被人養殖
漁業利用 肉質鮮味美，殼可供藥用或做燒石灰之原料
Morphology of apoptosisMorphology of apoptosis
Single cell
Shrinking
Chromatin condensation
Nuclear fragment protuberances
Apoptotic bodies formation
Phagocytosis
ROSROSROSROS
氧分子能夠連續接受電子形成一系列中間產物，這些反應性較強的含氧分子稱為活化氧 (activated oxygen) ，有些活化氧亦是自由基
ApoptosApoptosisisApoptosApoptosisis
FADD Pro-cas-8 cas-8
Apoptosis
Extrinsic （ Death Receptor-Initiated ） Pathway
DNA fragmentation
PARP
DNA repair↓
DFF-45CAD
CAD
FasFas L
cas-3
Nucleus
Bcl-2 Bcl-2 familyfamilyBcl-2 Bcl-2 familyfamily
Anti-apoptotic proteins
Bcl-2, Mcl-1, Bcl-XL
Bad, Bid, Bim, BaxPro-apoptotic proteins 抗凋亡蛋白存在於粒線體膜、內質網膜以及外核膜上， 但主要定位於粒線體外膜，它抵抗促凋亡蛋白的功能
促凋亡蛋白則定位於細胞質，一旦受到凋亡因子的誘導 ，它們可以向粒線體靠近，在粒線體外膜形成跨膜通道 ，或者開啟粒線體的 PT孔，而導致粒線體中的凋亡因子 釋放，活化 Caspase，導致細胞凋亡
ApoptosApoptosisisApoptosApoptosisis
Mitochondria
Cytochrome c
Mcl-1↓
Bax cleavageBcl-xL↓
cas-9
ROS↑GSH↓
Intrinsic （ Mitochondrial ） Pathway
DFF-45CAD
cas-3
Nucleus
Apoptosis
ΔΨm↓
Mcl-1↓
Bax cleavageBcl-xL↓
caspase-3
Fas
Fas L
cas-8 tBidBid Mitochondria
cas-9
Apoptosis
Purpose Purpose
Apoptosis
Hard Clam
？
Meterials and Metho
ds
Meterials and Metho
ds
MTT assayMTT assay
terazolium formazan
570 nm
黃色 紫色
dehydrogenase
hello
MorphologyMorphology
Analysis of apoptosis by cell dying Acridine orange stain
利用 Acridine orange 染劑能與核酸親和的特性，其會嵌入 DNA 與 RNA 中，使用螢光顯微技術下可清楚觀測細胞經處理後整體型態與核內染色質的改變 hell
o
look me
Flow cytometryFlow cytometry
Analysis of apoptosis by cell dying PI Stain
可以和細胞內的 DNA 結合，且結合量與 DNA 的量成正比，使用 Flow cytometer 來計算各細胞的 PI 含量，可以了解處於不同細胞週期的細胞數目多寡。
Flow cytometryFlow cytometry
Annexin V-FITC
PS
Analysis of apoptosis by cell dying Annexin V-FITC stain
Fluorescence ↑ Apoptosis cells ↑ ； Fluorescence ↓ Apoptosis cells ↓
Flow cytometryFlow cytometry
Determination of ROS generation
ROS DCF
Flow cytometry
DCFH
DCFH-DA
happy
Fluorescence ↑ ROS ↑ ； Fluorescence ↓ ROS ↓
GSH CM
F
Flow cytometry
CMF
CMF-DA
Flow cytometryFlow cytometry
Determination of GSH depletion
Fluorescence ↑ GSH ↑ ； Fluorescence ↓ GSH ↓
Cell esterase
Flow cytometryFlow cytometry
Analysis of mitochondrial transmembrane potential DiOC6
stain粒線體膜電位的存在，會使一些親脂性陽離子螢光染料：《 DiOC6 》結合到粒線體基質，然後再利用流式細胞計檢測細胞的螢光強度其螢光的增強或減弱說明粒線體膜電位的增高或降低
Fluorogenic assayFluorogenic assay
specific substrate
release (AMC)
Fluorescence spectrophotometer
產生黃綠色螢光
Caspase
caspase specific substrate-(AMC)
caspase specific substrate-(AMC)
Fluorescence ↑ active caspase ↑ ； Fluorescence ↓ active caspase ↓
激發光 360 nm
Caspase
發射光 460 nm
ResultsResults
Table 1
抑制 50% 酵素活性所需要的藥物濃度
COLO 205 ：結腸癌細胞SK-Hep 1 ：肝癌細胞HL-60 ：人類骨髓白血病細胞株AGS ：胃癌細胞THP-1 ：人類白血病單核球細胞株PMNs ：健康人類的多形核中性球
6 hrs
MTT assay
Fig. 1
dose dependent
time dependent
agarose gel electrophoresis
Fig. 1
/6 hrs
染色質皺縮
Acridine orange觀測細胞經處理後整體型態與核內染色質的改變
Fig. 1
annexin V-FITC staining and flow cytometry
Right shift
Apoptosis↑
Fig. 2
dose time
left shiftΔΨm ↓
Fig. 3
Mitochondria
ΔΨm↓ Cytochrome c cas-9 cas-3
Fig. 3
Mitochondria
ΔΨm↓ Cytochrome c cas-9 cas-3
Fig. 4
Right shift
ROS↑
left shiftGSH↓
Fig. 5
caspase 9 在 1 hr 可看到明顯的上升caspase 3,8 在 2,3 hr 看到上升
93
8
1,6
2
Fig. 5
→ caspase inhibitor
Fig. 5
a →allopurinolb →catalasec →DPId →NACe →PDTCf →SOD
, GSH
ca
f b d e
Fig. 6
dose
time
DNA repair↓cas-3 PARP
Apoptosis
Fig. 6
DFF-45 CAD
cas-3
( inhibitor of CAD )
DFF-45 CAD
DNA
fragmentation
Fig. 7
Fig. 8
FasFas L
FADD Pro-cas-8 tBid Bidcas-8
Fig. 8
FasFas Ligand
DiscussionDiscussion
Intrinsic Pathway Extrinsic Pathway
蜆精濃度 調味 ( 口味 )
零售價格
台糖蜆精 ★ ★50 元
白蘭氏蜆精 ★(多 3%)
蒜味重 60 元
綠川黃金蜆精 80 元
市售蜆精一覽表
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