Evgeniy Zavoisky

CuCl2·2H2O

1944 Universidad estatal de Kazan, Rusia

Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR)

Evgeniy Zavoisky

Premios Nobel y resonancia

• Física 1952 - for their development of new methods for nuclear magnetic precision measurements and discoveries in connection therewith - Felix Bloch y Edward Mills Purcell

• Química 1991 - for his contributions to the development of the methodology of high resolution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy - Richard R. Ernst.

• Química 2002 - for his development of nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the three-dimensional structure of biological macromolecules in solution - Kurt Wüthrich

• Fisiología o Medicina 2003 - for their discoveries concerning magnetic resonance imaging - Paul C. Lauterbur y Sir Peter Mansfield

•¿Qué se detecta?Moléculas con uno o más electrones

desapareados• ¿En qué se basa?

- Los electrones desapareados tienen momento magnético de spin

- El spin electrónico tiene dos números cuánticos que tienen la misma energía en ausencia de campo magnético

- Cuando se exponen a un campo magnético se generan dos estados energéticos y por lo tanto una transición

Resonancia paramagnética electrónica (EPR)

Meth. Enz. 246: 536

En

erg

ía

Campo magnético (B)

h

Bo

ms= ½

ms= - ½

Abso

rció

n

Campo magnético (B)

Señ

al d

e E

PR

Primera derivada

Bo

Campo magnético (B)

El experimento

E = h = g Bo β

g = cociente giromagnético (2.0023 para un electrón libre)

β = Magnetón de Bohr (momento angular del electrón; 9.2741 x 10-24 JT-1)

Bo = Campo magnético aplicado

~ 9.75 GHz para la banda X

El espectro de EPR

Desdoblamiento hiperfino

• El campo magnético experimentado por el electrón desapareado se ve afectado por los núcleos cercanos que tengan spin nuclearSpin nuclear:

1H I = ½

2H I = 1

12C I = 0

13C I = ½

14N I = 1

15N I = ½

Estados energéticos:

I = ½: + ½, -½

I = 1: -1, 0, 1

Núm. de líneas = 2n (I + ½)

n = núcleos equivalentes

½

- ½

ms mI

1 0-1

-1 0 1

-1 0 1

1 0 -1

aN aN

I = 1 : 14N

Campo magnético

E

h

Desdoblamiento hiperfino

Desdoblamiento hiperfino

10 Gauss

Sin desdoblamiento

1 núcleo I=1/2 (1H)

1 núcleo I=1 (14N)

2 núcleos idénticos I=1/2

1 núcleo I=5/2 (17O)

Desdoblamiento hiperfino

N+

OHCH3

H

N

O

O

4-POBN-CH(CH3)OH aN aN

aH aHaH

Campo magnético

El desdoblamiento hiperfino es aditivo

• (2 I + 1) líneas por cada núcleo

• (2 I1 + 1) (2 I2 + 1) …. para más de un núcleo

• (2 nI + 1) en el caso de n núcleos equivalentes

• El espectro debe ser simétrico con respecto al centro. Si no…

- Más de un radical con valores diferentes de g

- Tiempo de correlación lento• No hay una línea central intensa: número impar de núcleos equivalentes con I = ½

Consideraciones acerca de líneas e intensidades

Señales de EPR de iones metálicos de transición

• Varían mucho según:i) el ion metálico

ii) el estado de oxidación

iii) el estado de spin

iv) los ligandos

v) el número de iones metálicos asociados

• Depende mucho de interacciones spin-orbital e interacciones spin-spin cuando hay más de un electrón desapareado

• Dependen mucho de la simetría alrededor del ion metálico

• Observables en iones metálicos con spines semienteros (S = ½, 3⁄2, 5⁄2) pero no en iones con spines enteros (S =1, 2)

• A veces necesitan temperaturas bajas para ser detectables (N2 o He líquidos)

Fe3+, Mn2+3d5 S = 5/2, (alto spin)

S = 1/2, (bajo spin)

Fe2+3d6 S = 2, (alto spin)

S = 0, (bajo spin)

Cu2+ S = 1/2

S = 0

3d9

3d10 Cu+

Configuración electrónica de algunos iones metálicos de transición

JBC (1988) 263: 6074

Biochemistry (2009) 47:6637

Galactosa oxidasa

¿Quién está interesado en EPR para bioquímica?

1. Áreas relacionadas con estrés oxidativo y antioxidantes

2. Áreas relacionadas con catálisis enzimática que involucra radicales

3. Áreas relacionadas con metaloproteínas no enzimáticas

1969

Estrés oxidativo y antioxidantes

Coenzima o cofactor Enzima

Flavoproteínas Flavoproteína oxidasas

Óxido nítrico sintasa

Tetrahidropterinas Hidroxilasas de aminoácidos aromáticos

Óxido nítrico sintasa

Cu, Zn, Mn, Ni, Fe Superóxido dimutasas

Quinoproteínas Metanol deshidrogenasa

Metanol deshidrogenasa

Amino oxidasas de cobre

Hemo proteínas Citocromos P450

Peroxidases

Catalasa

Prostaglandina sintasa

Complejos di-hierro Metano monooxigenasa

Ribonucleótido reductasa (clase I)

Hierro mononuclear Lipooxigenasa

Catecol dioxigenasas

Prolil-4-hidroxilasa

Cobre mononuclear Galactosa oxidasa

Multi cobre Laccasa

Ascorbato oxidasa

Adenosilcobalamina Glutamato mutasa

Metil-malonil-CoA mutasa

Ribonucleótido reductasa (clase II)

Radical S-adenosil metionina Piruvato-formiato liasa

Ribonucleótido reductasa (clase III)

Biotina sintasa

pirofosfato de tiamina Piruvato:ferredoxina oxidorreductasa

Piruvato oxidasa (FAD)

sin cofactor Urato oxidasa

Chem. Rev. (2006) 106: 3302

Coenzima o cofactor Enzima

Ribonucleótido reductasa (RNR) clase I

Fotosistema II

YD·

YZ·

Prostaglandina H sintasa

Radicales de aminoácidos en catálisis enzimática

RNR clase II RNR clase III

piruvato formiato

liasa

citocromo peroxidasa

Radicales de aminoácidos en catálisis enzimática

Radicales de aminoácidos en catálisis enzimática

Galactosa oxidasa Amina oxidasas de plasma

Metilamina

deshidrogenasa

Detección de nitrosil Hb en sangre de ratas tratadas con LPS

g ~ 2.00

Ax = 17 G

g ~ 2.07

Az = 17 G

g ~ 1.98

g ~ 1.98

g ~ 2.02

g ~ 2.08

80 G

80 G

Sangre venosa

Sangre arterial

Kosaka et al., AJP 1994

Metaloproteínas no enzimáticas

Método Ventajas Desventajas

1. EPR directo (en solución)

Proporciona la estructura del radical

a. Estático Necesita muestras pequeñas

Aplicable a radicales de vida larga (t½ > min)

b. Flujo rápido Aplicable a radicales de vida corta

Necesita muestras grades, algunos radicales son indetectables

2. EPR directo (muestras congeladas)

Aplicable a radicales de vida corta ((t½ < 10-6 s)Necesita muestras pequeñasProporciona información estructural en caso de complejos metálicos

Uso limitado en radicales orgánicos debido a la anisotropía

3. Spin-trapping Amplias aplicaciones Información estructural limitada

Detección de radicales en biología por EPR

Plasma

Plasma+ 0.5 mM ONOO-

Vasquez-Vivar et al, Biochem. J, 1996

Espectros de EPR de plasma

Detección de radical carbonatoONOO- + CO2 CO3

.- + .NO2

CO2 + NO3-

35%

65%

9 mm/ 5 ms

Campo magnético

Celda de

mezcla

ONOO-HCO3-/

CO2

EPR con flujo continuo

ONOO- + CO2 CO3.- + .NO2

CO2 + NO3-

65%

ONOO- HCO3

-/CO2

ONOO- H13CO3

-/13CO2

Bonini et al. , JBC 1999

Detección de radical carbonato

Botti et al. , Chem. Res.

Toxicol. 2004

Detección de radical cromanilo

Botti et al. , Chem. Res.

Toxicol. 2004

Detección de radical cromanilo

• Aplicable a radicales de vida corta y metales de transición

• 77 K (nitrógeno líquido) o 4 K (helio líquido)

• Uso limitado debido a la anisotropía

EPR directo con muestras congeladas

ST + R. SA.

spin trap(diamagnétic

o)

radicaltransitori

o

aducto de spin(paramagnétic

o)

• Gran aplicación pero brinda información estructural muy limitada

• Hay dos clases principales de ST: nitronas y nitrosos

SPIN TRAPPING

• PBN (fenil-N-t-butilnitrona)

R.N

Me

Me

O

H

-

+N

Me

Me

O

H

R

.

• DMPO (5,5-dimetilpirrolina N-óxido)

C

H

N C(C H3)3

O

C

H

N C(CH3)3

R

O .

R.

-

+

+ Reaccionan con gran variedad de radicales (-RC., RO., RS.)

+ Los aductos son a menudo muy estables

+ No son demasiado tóxicos

- La asignación estructural es difícil porque los espectros son similares

Spin traps de nitrona

• DBNBS (3,5-dibromo-4-nitrosobencensulfonato)

• MNP (2-metil-2-nitrosopropano)

+ Brindan una identificaciónmás fácil del radical

- Aductos térmicamente inestables y sensibles a la luz

- Forman dímeros inertes

- Poco confiables para radicales centrados en oxígeno

NO C(CH3)3 N C(CH3)3

.OR

R.

NO

Br

Br

SO3- N

Br

Br

SO3-

R

.OR.

Spin traps de compuestos nitroso

1 mM HbO2

1 mM ONOO-

20 mM MNP

Espectros de la reacción de HbO2 con peroxinitrito en presencia de MNP: Formación de radicales en la proteína

acoplamiento superhiperfino

+ Pronasa

2 G

20 G

20 G

N C(CH3)3

.OR

MNP

Romero et al., JBC 2003

Spin trapping con proteínas