CuCl 2 ·2H 2 O 1944 Universidad estatal de Kazan, Rusia Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR) Evgeniy Zavoisky
Jan 12, 2016
CuCl2·2H2O
1944 Universidad estatal de Kazan, Rusia
Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR)
Evgeniy Zavoisky
Premios Nobel y resonancia
• Física 1952 - for their development of new methods for nuclear magnetic precision measurements and discoveries in connection therewith - Felix Bloch y Edward Mills Purcell
• Química 1991 - for his contributions to the development of the methodology of high resolution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy - Richard R. Ernst.
• Química 2002 - for his development of nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the three-dimensional structure of biological macromolecules in solution - Kurt Wüthrich
• Fisiología o Medicina 2003 - for their discoveries concerning magnetic resonance imaging - Paul C. Lauterbur y Sir Peter Mansfield
•¿Qué se detecta?Moléculas con uno o más electrones
desapareados• ¿En qué se basa?
- Los electrones desapareados tienen momento magnético de spin
- El spin electrónico tiene dos números cuánticos que tienen la misma energía en ausencia de campo magnético
- Cuando se exponen a un campo magnético se generan dos estados energéticos y por lo tanto una transición
Resonancia paramagnética electrónica (EPR)
Meth. Enz. 246: 536
En
erg
ía
Campo magnético (B)
h
Bo
ms= ½
ms= - ½
Abso
rció
n
Campo magnético (B)
Señ
al d
e E
PR
Primera derivada
Bo
Campo magnético (B)
El experimento
E = h = g Bo β
g = cociente giromagnético (2.0023 para un electrón libre)
β = Magnetón de Bohr (momento angular del electrón; 9.2741 x 10-24 JT-1)
Bo = Campo magnético aplicado
~ 9.75 GHz para la banda X
El espectro de EPR
Desdoblamiento hiperfino
• El campo magnético experimentado por el electrón desapareado se ve afectado por los núcleos cercanos que tengan spin nuclearSpin nuclear:
1H I = ½
2H I = 1
12C I = 0
13C I = ½
14N I = 1
15N I = ½
Estados energéticos:
I = ½: + ½, -½
I = 1: -1, 0, 1
Núm. de líneas = 2n (I + ½)
n = núcleos equivalentes
½
- ½
ms mI
1 0-1
-1 0 1
-1 0 1
1 0 -1
aN aN
I = 1 : 14N
Campo magnético
E
h
Desdoblamiento hiperfino
Desdoblamiento hiperfino
10 Gauss
Sin desdoblamiento
1 núcleo I=1/2 (1H)
1 núcleo I=1 (14N)
2 núcleos idénticos I=1/2
1 núcleo I=5/2 (17O)
Desdoblamiento hiperfino
N+
OHCH3
H
N
O
O
4-POBN-CH(CH3)OH aN aN
aH aHaH
Campo magnético
El desdoblamiento hiperfino es aditivo
• (2 I + 1) líneas por cada núcleo
• (2 I1 + 1) (2 I2 + 1) …. para más de un núcleo
• (2 nI + 1) en el caso de n núcleos equivalentes
• El espectro debe ser simétrico con respecto al centro. Si no…
- Más de un radical con valores diferentes de g
- Tiempo de correlación lento• No hay una línea central intensa: número impar de núcleos equivalentes con I = ½
Consideraciones acerca de líneas e intensidades
Señales de EPR de iones metálicos de transición
• Varían mucho según:i) el ion metálico
ii) el estado de oxidación
iii) el estado de spin
iv) los ligandos
v) el número de iones metálicos asociados
• Depende mucho de interacciones spin-orbital e interacciones spin-spin cuando hay más de un electrón desapareado
• Dependen mucho de la simetría alrededor del ion metálico
• Observables en iones metálicos con spines semienteros (S = ½, 3⁄2, 5⁄2) pero no en iones con spines enteros (S =1, 2)
• A veces necesitan temperaturas bajas para ser detectables (N2 o He líquidos)
Fe3+, Mn2+3d5 S = 5/2, (alto spin)
S = 1/2, (bajo spin)
Fe2+3d6 S = 2, (alto spin)
S = 0, (bajo spin)
Cu2+ S = 1/2
S = 0
3d9
3d10 Cu+
Configuración electrónica de algunos iones metálicos de transición
JBC (1988) 263: 6074
Biochemistry (2009) 47:6637
Galactosa oxidasa
¿Quién está interesado en EPR para bioquímica?
1. Áreas relacionadas con estrés oxidativo y antioxidantes
2. Áreas relacionadas con catálisis enzimática que involucra radicales
3. Áreas relacionadas con metaloproteínas no enzimáticas
1969
Estrés oxidativo y antioxidantes
Coenzima o cofactor Enzima
Flavoproteínas Flavoproteína oxidasas
Óxido nítrico sintasa
Tetrahidropterinas Hidroxilasas de aminoácidos aromáticos
Óxido nítrico sintasa
Cu, Zn, Mn, Ni, Fe Superóxido dimutasas
Quinoproteínas Metanol deshidrogenasa
Metanol deshidrogenasa
Amino oxidasas de cobre
Hemo proteínas Citocromos P450
Peroxidases
Catalasa
Prostaglandina sintasa
Complejos di-hierro Metano monooxigenasa
Ribonucleótido reductasa (clase I)
Hierro mononuclear Lipooxigenasa
Catecol dioxigenasas
Prolil-4-hidroxilasa
Cobre mononuclear Galactosa oxidasa
Multi cobre Laccasa
Ascorbato oxidasa
Adenosilcobalamina Glutamato mutasa
Metil-malonil-CoA mutasa
Ribonucleótido reductasa (clase II)
Radical S-adenosil metionina Piruvato-formiato liasa
Ribonucleótido reductasa (clase III)
Biotina sintasa
pirofosfato de tiamina Piruvato:ferredoxina oxidorreductasa
Piruvato oxidasa (FAD)
sin cofactor Urato oxidasa
Chem. Rev. (2006) 106: 3302
Coenzima o cofactor Enzima
Ribonucleótido reductasa (RNR) clase I
Fotosistema II
YD·
YZ·
Prostaglandina H sintasa
Radicales de aminoácidos en catálisis enzimática
RNR clase II RNR clase III
piruvato formiato
liasa
citocromo peroxidasa
Radicales de aminoácidos en catálisis enzimática
Radicales de aminoácidos en catálisis enzimática
Galactosa oxidasa Amina oxidasas de plasma
Metilamina
deshidrogenasa
Detección de nitrosil Hb en sangre de ratas tratadas con LPS
g ~ 2.00
Ax = 17 G
g ~ 2.07
Az = 17 G
g ~ 1.98
g ~ 1.98
g ~ 2.02
g ~ 2.08
80 G
80 G
Sangre venosa
Sangre arterial
Kosaka et al., AJP 1994
Metaloproteínas no enzimáticas
Método Ventajas Desventajas
1. EPR directo (en solución)
Proporciona la estructura del radical
a. Estático Necesita muestras pequeñas
Aplicable a radicales de vida larga (t½ > min)
b. Flujo rápido Aplicable a radicales de vida corta
Necesita muestras grades, algunos radicales son indetectables
2. EPR directo (muestras congeladas)
Aplicable a radicales de vida corta ((t½ < 10-6 s)Necesita muestras pequeñasProporciona información estructural en caso de complejos metálicos
Uso limitado en radicales orgánicos debido a la anisotropía
3. Spin-trapping Amplias aplicaciones Información estructural limitada
Detección de radicales en biología por EPR
Plasma
Plasma+ 0.5 mM ONOO-
Vasquez-Vivar et al, Biochem. J, 1996
Espectros de EPR de plasma
Detección de radical carbonatoONOO- + CO2 CO3
.- + .NO2
CO2 + NO3-
35%
65%
9 mm/ 5 ms
Campo magnético
Celda de
mezcla
ONOO-HCO3-/
CO2
EPR con flujo continuo
ONOO- + CO2 CO3.- + .NO2
CO2 + NO3-
65%
ONOO- HCO3
-/CO2
ONOO- H13CO3
-/13CO2
Bonini et al. , JBC 1999
Detección de radical carbonato
Botti et al. , Chem. Res.
Toxicol. 2004
Detección de radical cromanilo
Botti et al. , Chem. Res.
Toxicol. 2004
Detección de radical cromanilo
• Aplicable a radicales de vida corta y metales de transición
• 77 K (nitrógeno líquido) o 4 K (helio líquido)
• Uso limitado debido a la anisotropía
EPR directo con muestras congeladas
ST + R. SA.
spin trap(diamagnétic
o)
radicaltransitori
o
aducto de spin(paramagnétic
o)
• Gran aplicación pero brinda información estructural muy limitada
• Hay dos clases principales de ST: nitronas y nitrosos
SPIN TRAPPING
• PBN (fenil-N-t-butilnitrona)
R.N
Me
Me
O
H
-
+N
Me
Me
O
H
R
.
• DMPO (5,5-dimetilpirrolina N-óxido)
C
H
N C(C H3)3
O
C
H
N C(CH3)3
R
O .
R.
-
+
+ Reaccionan con gran variedad de radicales (-RC., RO., RS.)
+ Los aductos son a menudo muy estables
+ No son demasiado tóxicos
- La asignación estructural es difícil porque los espectros son similares
Spin traps de nitrona
• DBNBS (3,5-dibromo-4-nitrosobencensulfonato)
• MNP (2-metil-2-nitrosopropano)
+ Brindan una identificaciónmás fácil del radical
- Aductos térmicamente inestables y sensibles a la luz
- Forman dímeros inertes
- Poco confiables para radicales centrados en oxígeno
NO C(CH3)3 N C(CH3)3
.OR
R.
NO
Br
Br
SO3- N
Br
Br
SO3-
R
.OR.
Spin traps de compuestos nitroso
1 mM HbO2
1 mM ONOO-
20 mM MNP
Espectros de la reacción de HbO2 con peroxinitrito en presencia de MNP: Formación de radicales en la proteína
acoplamiento superhiperfino
+ Pronasa
2 G
20 G
20 G
N C(CH3)3
.OR
MNP
Romero et al., JBC 2003
Spin trapping con proteínas