Avaliação da produção de giberelina pelo fungo Moniliophthora perniciosa durante a interação com cacaueiro Alinne Batista Ambrósio Orientador: Prof. Dr.

Avaliação da produção de giberelina pelo fungo Moniliophthora perniciosa durante a interação com

cacaueiro

Alinne Batista Ambrósio

Orientador: Prof. Dr. Gonçalo Amarante Guimarães Pereira

Co-orientadora: Dra. Odalys García

SUMÁRIO

Introdução

- Doença vassoura-de-bruxa

- Hormônios vegetais

- Por que a giberelina?

• Objetivos

• Metodologia

•Resultados preliminares

• Riscos

INTRODUÇÃO

• Vassoura-de-bruxa

AIME AND PHILLIPS-MORA, 2005.

• Sintomas

- Hipertrofia

- Hiperplasia

- Superbrotamento

- Frutos partenocárpicos

Introdução

.

Introdução

auxina

giberelina

citocininas

etileno

ácido abscísico

• Hormônios vegetais

DHPatógeno

Hospedeiro

Doença

Introdução• Desbalanço hormonal

Introdução• Desbalanço hormonal

- O patógeno pode alterar diretamente o metabolismo dos fitohormôniosproduzidos pela planta

• Desbalanço hormonal

- Patógenos de plantas são capazes de eles mesmos produzirem fitohormônios

Introdução

• Desbalanço hormonalIntrodução

Introdução

Produção Alteração

• Na vassoura-de-bruxa

POR QUE GIBERELINA?

• Giberelina ativa a divisão celular

Introdução

GAs CDKs G1 >>> S

G2 >>> M

Divisão de células meristemáticas

Introdução

POR QUE GIBERELINA?

• A giberelina induz a elongação de tecidos intactos da planta mediados por proteínas, como expansinas e xiloglucano endotransglicosilase (XET)

GAs Expansinas e XETAfrouxamento

da parede celular

Aumento do tamanho da célula

POR QUE GIBERELINA?Introdução

XET

Expansinas

IntroduçãoPOR QUE GIBERELINA?

• A giberelina induz a expressão de invertases e amilases

Planta sadia

Me = medulaMu = canal de mucilagem

Me

Mu

Planta infectada

Introdução• Sintomas

Tratamento de sementes de arroz

com extrato de esporos de M. perniciosa em

comparação com tratamento com

giberelina.

Introdução

Tratamento de plântulas de cacau com extrato de esporos de M. perniciosa

• Giberelina

- GAs são diterpenóides

- Gibberella fujikuroi

- Hormônio vegetal que está envolvido na regulação do crescimento e desenvolvimento da planta, incluindo germinação de sementes, crescimento do caule, indução de floração e maturação de frutos

- 136 GAs vêm sendo identificadas em plantas, fungos e bactérias

Introdução

IntroduçãoGiberelinas ativas

Gibberellin A12 aldehyde

P450-1P450-1

Gibberellin A7

Geranylgeranyl diphosphateent-Kaurene

Gibberellin A4 Gibberellin A14 aldehyde

ent-7alpha-Hydroxy-

kauroic acid ent-Kaurenoic acid

P450-4P450-4

P450-1P450-1P450-1P450-1

P450-1 e 2P450-1 e 2

ggs2ggs2 CPS / KSCPS / KS

GA4 GA4 desaturasedesaturase

Introdução

Gene Clusterização/singlets banco M. perniciosa

BLAST NR bp total E value

GA4 desatura

se

CP02-S3-038-509-B10-E.F Gibberella fujikuroi des gene for GA4 desaturase

--- 0.0

P450-4 CP02-S2-040-354-G04-M.FCP02-S3-038-547-G02-S.FCP02-PF-096-002-E07-C.G

cytochrome P450-4 (ent-kaurene oxidase)

898770942

2e-124e-164e-13

P450-1 CP02-S2-038-269-G11-M.FCP02-S3-038-547-G02-S.F

cytochrome P450-1 (GA14-synthase 914770

2e-154e-16

ggds CP02-S2-032-338-A12-E.FCP02-S3-033-416-E10-C.G

geranylgeranyl diphosphate synthase

538909

1e-212e-17

P450-2 CP02-S3-040-626-G08-C.F P450II GA20 oxidase 1041 2e-16

GfCPS/KS CP02-S3-000-110-H11-C.F GfCPS/KS [Gibberella fujikuroi] 1019 1e-09

P450 -3 CP02-S2-000-144-G06-L.H cytochrome P450 -3 C13 oxidase) 569 3e-20

DELLA BINT-RT-001-014-B09-E.FBIEM-NT-001-006-F10-E.F

GIA/RGA-like gibberellin response modulator

657894

2e-424e-43

Cdc2 BINT-SP-001-017-A07-E.FBINT-SP-001-050-B02-E.F

putative receptor-like serine-threonine protein kinase

624527

4e-681e-53

GID1 receptor BINT-SP-001-023-C09-E.F Gibberellin receptor GID1 (Gibberellin-insensitive dwarf protein 1)

8e-14

Introdução

27642 505

952 aa

Contig8670 Contig15446

182

CPS-KS

Introdução

1

4

392 aa

333

GGPP

Contig14680

Contig7333

22

1 342 aa

278

G4 des

Contig13951 Contig2062

Introdução

Manejo de nitrogênio na lavoura de cacau - Edvaldo

Lavoura de EdvaldoLavoura do vizinho

• Regulação da síntese de giberelina.

Introdução

AREA (NIT2) GAs

Nitrogênio

Introdução

Hipótese de trabalho

M. perniciosa na fase é capaz de sintetizar giberelina que deve produzir um desbalanço hormonal no cacaueiro criando as condições favoráveis para o estabelecimento do fungo e o desenvolvimento da doença.

Testar a hipótese formulada é algo fundamental para a compreensão da doença Vassoura-de-bruxa. Se ela for verdadeira, teremos conseguido a chave para o controle do problema através

do manejo do nitrogênio na planta.

OBJETIVOS

1. Mapeamento físico

2. Quantificação da produção de giberelina durante a interação e a partir de sobrenadante do fungo (biotrofico e necrotrofico)

3. Analise de expressão dos genes em diferentes fases do ciclo de vida (esporos, micelio biotrofico e micelio necrotrofico)

4. Estudos de complementação de mutantes funcionais

METODOLOGIAS

• Pulse field e Southern blot

• Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS)

• Real -Time PCR

METODOLOGIAS

• Complementação de mutantes (Transformação dos mutantes de G. funjikuroi )

- Race – PCR

- Screening dos genes da síntese de GA em biblioteca de M. perniciosa em fago lambda EMBL3/BamH I

RACE - PRC

RACE - PRC PCR

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 81. Hind III

2. 5’ / CPS-KS (1)

3. 5’ / CPS-KS (2)

4. CPS-KS (3) / 3’

5. 5’ / G4 (1)

6. G4 (2) / 3’

7. 5’ / GGPP (1)

8. GGPP (2) / 3’

1. Hind III

2. cDNA necrotrófico

3. cDNA biotrófico

4. DNA genômico

5. Controle negativo

6. cDNA necrotrófico

7. cDNA biotrófico

8. DNA genômico

9. Controle negativo

G4-des

GGPP

1

2 3 4 65 97 8

RESULTADOS PRELIMINARES

Teste expressão

1

2 3 4 65 97 8 1. Hind III

2. cDNA necrotrófico

3. cDNA biotrófico

4. DNA genômico

5. Controle negativo

6. cDNA necrotrófico

7. cDNA biotrófico

8. DNA genômico

9. Controle negativo

G4-des

CPS-KS

RESULTADOS PRELIMINARES

Teste expressão

RESULTADOS PRELIMINARES

Screening de biblioteca de fagos com sonda CPS-KS

• Identificação e quantificação de giberelinas durante interação

- Extratos de plantas diferentes (resistente e susceptível)

- Diferentes partes da planta

- Diferentes estádios

• Identificação e quantificação de giberelinas do sobrenadante - colaboração com grupos de pesquisa da Argentina

RESULTADOS PRELIMINARES

RISCOS

• A expressão gênica não é evidencia de que o fungo produza o composto ativo

• Complexidade da caracterização de hormônios vegetais (em especial de giberelinas) devido à diversidade de precursores e de rotas biossíntéticas

• No Brasil não existem grupos estabelecidos com experiência na quantificação e identificação de giberelinas e existem poucos grupos com essa especialidade no mundo