Alessia Stell Adriana Maggi Lab 2 Dicembre 2010

Alessia StellAdriana Maggi Lab

2 Dicembre 2010

Ingegneria animale e animali transgenici

Manipolazione genetica tradizionale

Manipolazione genetica moderna – DNA RICOMBINANTE

Cosa mancava per passare dalla manipolazione genetica

tradizionale a quella moderna?

1967:Scoperta della DNA ligasi

1968:Scoperta degli enzimi di

restrizione

1972:Avanzamenti nelle tecniche di trasferimento del DNA e

nell’uso di plasmidi

Animale Transgenico:animale nel cui genoma è stato inserito uno o più frammenti di DNA esogeno

Transgene:frammento di DNA esogeno integrato

stabilmente nel patrimonio genetico di cellule animali o vegetali

Metodi di Ingegneria animale

Gene Targeting

Clonazione

Sono 3 i metodi principali di ingegneria animale

Transgenesi standard1

2

3

Transgenesi standard1

Microiniezione di DNA lineare nella cellula uovo fecondata • SCOPO: Guadagno di funzione• CARATTERISTICA: inserzione random, casuale

Introduzione di una sequenza di DNA purificata in uno dei due

pronuclei della cellula uovo fecondata

La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4

fasi distinte

1. Preparazione degli oociti fecondati

2. Preparazione dei costrutti

3. Preparazione delle femmine

“pseudogravide”

4. Screening della progenie

La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4

fasi distinte

Cocktail ormonale per la superovulazione:• PMS (pregnant mares serum)• HCG (human chorionic gonadotropin)

♀♀

♂

Accoppiamento

♀

Raccolta degli oociti fecondati

1. Preparazione degli oociti fecondati

2. Preparazione dei costrutti

3. Preparazione delle femmine

“pseudogravide”

4. Screening della progenie

La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4

fasi distinte

Costruzione del transgene Amplificazione del transgene

Purificazione del transgene

1. Preparazione degli oociti fecondati

2. Preparazione dei costrutti

3. Preparazione delle femmine

“pseudogravide”

4. Screening della progenie

La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4

fasi distinte

Accoppiamento delle femmine con maschio vasectomizzato

Trasferimento delle uova fecondate microiniettate con il gene di interesse nell’utero di femmina pseudogravida

♀ pseudogravida

♂ vasectomizzato

♀100-200X

1. Preparazione degli oociti fecondati

2. Preparazione dei costrutti

3. Preparazione delle femmine

“pseudogravide”

4. Screening della progenie

La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4

fasi distinte

Estrazione DNA dalle code della progenie

Analisi tramite PCR Analisi tramite Southern-blot

M C 1 2 3 4 5C 1 2 3 4 5

1. Preparazione degli oociti fecondati

2. Preparazione dei costrutti

3. Preparazione delle femmine

“pseudogravide”

4. Screening della progenie

L’inserzione del transgene è casuale

• RICOMBINAZIONE NON OMOLOGA• Non si sa dove si è localizzato il transgene;• Non si può regolare il numero di copie introdotte nel

pronucleo, né quante si uniranno in concatameri per l’integrazione;

• Guadagno di funzione o perdita di funzione?

“Incrociamo le dita!!”

Gene Targeting2

Ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells • SCOPO: Perdita o modifica di funzione• CARATTERISTICA: inserzione mirata

La RICOMBINAZIONE OMOLOGA è il meccanismo che permette il gene

targeting

AGGTGCCTGACT TTCAGCCGATCCA

Gene inattivoAGGTGCCTGACT TTCAGCCGATCCAX X

La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte

1. Preparazione delle ES cells pluripotenti

e trasfezione2. Selezione delle ES

3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova

blastocisti

4. Screening della progenie

Preparazione del transgene

La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte

Preparazione delle ES pluripotenti dalla blastocisti

Elettroporazione

Sequenze di ricombinazione

Omologa

Neor – resistenza alla Neomicina

Tk - thymidine kinase

Gene non attivo

1. Preparazione delle ES cells pluripotenti

e trasfezione2. Selezione delle ES

3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova

blastocisti

4. Screening della progenie

La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte

Sequenze di ricombinazione

Omologa

Neor – resistenza alla Neomicina

Tk - thymidine kinase

Gene non attivo

Trattamento con neomicina e ganciclovir

X

X

No integrazione

Integrazione sito-specifica (1/1000)

Integrazione random

1. Preparazione delle ES cells pluripotenti

e trasfezione2. Selezione delle ES

3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova

blastocisti

4. Screening della progenie

La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte

ES inserite in una blastocisti di topo nero

1. Preparazione delle ES cells pluripotenti

e trasfezione2. Selezione delle ES

3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova

blastocisti

4. Screening della progenie

La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte

Topo “chimera”

1. Preparazione delle ES cells pluripotenti

e trasfezione2. Selezione delle ES

3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova

blastocisti

4. Screening della progenie

L’inserzione del transgene è mirata

• RICOMBINAZIONE OMOLOGA• Si conosce la localizzazione genica dell’inserimento del

transgene;• Problemi: espressione tempo e spazio specifica?

“Obiettivo raggiunto!”

Trasferimento del nucleo di una cellula somatica in un oocita anucleato

• SCOPO: ottenimento di “gemelli” di un fenotipo di interesse

Clonazione3

I Cloni vengono ottenuti attraverso

Somatic Cell Nuclear Transfer

Il materiale genetico viene copiato in toto

• Nuclear Transfer• Le cellule somatiche da cui si preleva il nucleo possono essere

ingegnerizzate prima del reimpianto.

Altre tipologie di Ingegneria animale

Animali reporter

Altre tecniche, oltre a quelle classiche, sono state sviluppate in

ingegneria animale

Knockout condizionali1

2

Knockout condizionali1

Eliminare un gene in un tessuto, in un organo o in una fase particolare di sviluppo

• SCOPO: ottenere informazioni più precise sulla funzione del

gene; garantire il normale sviluppo del topo knockout.

Il sistema Cre-LoxP è uno dei sistemi più utilizzati

La CRE è una RICOMBINASI LOXP sono le sequenze riconosciute da CRE

Gene da excidere

Esempio: delezione di IGF-1 fegato-specifica:

topi LID (liver IGF1 specific deficient)

Esone 4

LoxP

CreX

Promotore dell’albumina

X

CRECRE

80% IGF-I plasmatico

Inserimento di un gene codificante una proteina facilmente identificabile e rilevabile

• SCOPO: la proteina reporter dà informazioni rapide e

dinamiche sugli eventi molecolari che si vogliono studiare

Animali reporter2

La luciferasi è uno dei geni reporter più utilizzati nei topi

Sequenze regolatorie

• Gene ESOGENO• Emivita breve• Facilmente detectabile

Esempio: il topo reporter ERE-Luc

LuciferasiTkERE X2MAR MAR

Transgene inserito nel topo ERE-Luc

Applicazioni pratiche dell’Ingegneria animale

Studio di funzione genica (ricerca di base)

1Modelli di patologia umana

Produzione di biofarmaci

Screening di farmaci

2

3

4Produzione di organi per xenotrapianti

5

Transgenesi standard

Gene targeting

Clonaggio KO condizionale

Animale reporter

Studio di funzione genica (ricerca di base)

1

Inserimento di gene (o boost dell’espressione di un gene) tramite transgenesi standard

Palmiter et al, Nature, 1982

Delezione di un gene tramite gene targeting

ESTROGEN RECEPTOR

KNOCKOUT MICE

Couse & Korach,

Endocrine Reviews, 1999

Modelli di patologia umana2

Inserimento di gene (o boost dell’espressione di un gene) tramite transgenesi standard:

• Oncogeni (c-neu, c-myc, H-ras): tumori

• Antigeni di istocompatibilità: autoimmunità

• β-globina umana: talassemia

• Recettore LDL: aterosclerosi

• APP umana: morbo di Alzheimer

Delezione di un gene tramite gene targeting:

• Apolipoproteina E: aterosclerosi

• Glucocerebrosidasi: malattia di Gaucher

• CFTR umana: fibrosi cistica

• […]

Esempio: modelli di overespressione di APP umana per

lo studio della malattia di Alzheimer

Lord A, Neurobiol Aging, 2006

Produzione di biofarmaci3

+ In

sulin

a

+ Em

oglo

bina

+ tP

A

+ G

HProduzione di proteine ricombinanti

biologicamente attive nella ghiandola mammaria di animali transgenici

• Abbondanza: 5–10g/L al giorno paragonato ad 1 g/L delle cellule.

• Costo

• Adattabilità alle richieste

• Funzionalità: le proteine sono folded in maniera naturale

• Raccolta: facile purificazione dal latte

Pro/contro del “biopharming”

• Tempistiche: lunghi tempi per messa a punto e valudazione di animali transgenici

• Attesa della lattazione

• Inserzione casuale: può causare problemi all’animale

Screening di farmaci4

REPORTERPromotore

attivato

• L’attività del promotore è osservata in tempo reale e nel contesto fisiologico dell’intero organismo

Che caratteristiche deve avere un animale reporter per permettere

lo screening di farmaci?

• Permettere di localizzare le aree dove il composto è attivo

• Permettere di valutare la risposta del farmaco dopo ripetute somministrazioni

• Permettere la misurazione della minima dose efficace

• Permettere di identificare siti di accumulo in caso di somministrazioni croniche

Il modello ERE-Luc per lo screening di farmaci – in acuto

Nelle aree del corpo dell’animale Nelle aree del cervello dell’animale

Il modello ERE-Luc per lo screening di farmaci – in cronico

Produzione di organi per xenotrapianti

5

XRigetto dovuto alla reattività degli anticorpi umani verso le proteine

endoteliali esogene (che mancano di uno zucchero, il fucosio)

Inserimento in animali transgenici della fucosio-transferasi

Un maiale ci salverà??