PROTEINE DI DIFESA – Ig ed MHC
ANTICORPI
(Immunoglobuline)
B-CELLS, T-CELLS
(LINFOCITI con recettori MHC)
PEPTIDI ANTIMICROBICI
PROTEINE DEL COMPLEMENTO
NATURAL KILLER (CELLULE NK)
SISTEMA IMMUNITARIO
MONOCITI (MACROFAGI)
(NEUTROFILI, EOSINOFILI & BASOFILI) GRANULOCITI
IMMUNITA’ ACQUISITA O ADATTATIVA
IMMUNITA’ INNATA
RISPOSTA UMORALE
RISPOSTA MEDIATA DA CELLULE
• Proteine prodotte dalle plasmacellule (LINFOCITI B attivati)
• Produzione stimolata da molecole estranee all’organismo (NON-SELF) che possono
essere polipeptidi/proteine, polisaccaridi, acidi nucleici o altre molecole (ANTIGENE)
• Le Ig riconoscono parti di queste molecole noti come DETERMINANTI ANTIGENICI
• Ogni cellula B produce un solo tipo di Ig con una particolare specificità per un dato
determinante antigenico – il repertorio di diversi Ig disponibili nell’uomo è > 1011.
Questa specificità deriva da una parte della sequenza primaria della molecola Ig (sito
recettoriale).
• Gli anticorpi (Ig) si formano per SELEZIONE (dei prodotti di singoli geni) piuttosto che
per ISTRUZIONE (adattamento di Ig all’antigene). Ma abbiamo un numero limitato di
geni (<30000). Non ereditiamo quindi geni per ogni Ig (Teoria germinale), ma piuttosto
essi sono generati per ricombinazione somatica di un N° limitato di componenti (Teoria
della diversificazione somatica)
• Le cellule B esprimono 105 molecole analoghe alle Ig che producono sulla loro
superficie, come recettori cellulari per antigeni. Quelle che esprimono Ig per le
molecole del SELF sono soppresse nelle fasi precoci dello sviluppo.
• Quando una cellula B incontra un determinante antigenico complementare al sito di
legame della sua Ig recettoriale scattano una serie di eventi che portano alla
riproduzione rapida della cellula (selezione clonale)
IMMUNOGLOBULINE (Ig) / ANTICORPI
• Il clone di cellule B attivate produce e rilascia Ig solubili in quantità, che possono
riconoscere e legare lo stesso determinante antigenico riconosciuto dalla Ig
recettoriale, nei microbi o tessuti non-self che lo esprimono.
• Le plasma cellule producono inizialmente un tipo di immunoglobulina noto come
IgM, poi avviene la commutazione di classe, e sono espresse IgG, IgA, IgD o IgE,
con specificità per lo stesso determinante antigenico ma diversi ruoli nell’immunità.
• Dopo l’eliminazione dell’infezione, le plasmacellule muoiono, ma un certo numero di
cellule B corrispondente a quel clone persiste in circolazione (MEMORIA). Questo
fornisce una risposta più rapida in futuro verso lo stesso agente infettante)
• I LINFOCITI T sono attivati in maniera analoga ai linfociti B, ma forniscono una
RISPOSTA CELLULARE
• Linfociti B Ig : risposta umorale efficace contro batteri, tossine batteriche e
virus in circolo
• Linfociti T : efficaci contro cellule infette
Caratteristiche comuni dei linfociti B e T : SELETTIVITA’ e MEMORIA
Immunoglobuline e linfociti
IMMUNOGLOBULINE -
H HEAVY CHAIN = CATENA PESANTE
L LIGHT CHAIN = CATENA LEGGERA
C dominio CONSERVATO
V dominio VARIABILE
Strutture 1a e 4a
s s ponti disolfuro
L L
H H
C-term C-term
N
N
N
N-term
C C
V H V H
V L V L
C L C L
s
s
s
s
s
s
s
s
s
s
s s
s s
s s
s s
s s
s
s s
s
s s
s s s s
C 2 H
C 3 H
C 1 H C 1 H
C 2 H
C 3 H
A
L
H N
N
C
V H
V L
C L
C 1 H CDR
CDR
C
CDR = COMPLEMENTARITY
DETERMINING REGION
(Regione ipervariabile)
A = ANTIGENE
s s
Papaina
Porzione
Fab
Porzione
Fc
oligosaccaride
Strutture 2a e 3° (esempio di domini strutturali)
Dominio conservato
1 2 5 7 4 6
3
3b 3c
CDR1 CDR3
CDR2
1
2 6 5 3 4 7
Dominio variabile
La diversità nel repertorio di Ig (> 1010 diverse molecole) è dovuta a:
i) ricombinazione somatica di diversi frammenti genici che codificano per VCL e VCH
con numerose varianti per ciascun frammento genico ( 3x106 combinazioni)
ii) ‘alternative splicing’ nelle catene VCL e VCH ( >108)
iii) diverse combinazioni di VCL con le VCH
iv) ipermutazione somatica delle regioni V (affinità per antigene aumenta di 1000 volte)
L = leader seq.; V = variable (~100 res.); D = diversity; J = joining (~13 res.) ; C = constant; MC = membrane coding; SC = Secretion coding
VL CL
VH CH1 CH
2 CH3
(k o l)
Il numero di segmenti è pertinente ad un individuo, e varia in diversi individui (polimorfismo genetico)
1 1
Struttura molecolare
Fab
Fab legame
antigene
Fab
Fc funzioni
effettrici
oligosaccaride
Sito di legame per l’antigene
Sito di legame per l’antigene
• I diversi tipi di immunoglubuline che differiscono nella composizione delle CH
(5 diversi isotipi, G,M,A,D e E e 4 subclassi per le IgG)
• Gli isotipi variano per tipo di CH e numero di catene, ponti disolfuro e glicosidazione
• I linfociti B esprimono inizialmente le IgM e successivamente, per un processo noto come
‘isotype switching’ (commutazione di classe) esprimono uno degli altri isotipi
• La composizione dei domini CH conferisce specializzazione funzionale alle Ig
Diversi tipi di Ig
g
IgG (monomeriche)
Siero
~ 80%
m
IgM (pentameriche)
precoci
~ 10%
IgA (mono/di/
trimeriche)
secrezioni
esterne
~ 10%
(lacrime, saliva,
mucose)
a
e
IgE (monomeriche)
antiparassitarie
< 0.02%
(reaz. allergiche)
= oligosaccaride
d
IgD (monomeriche)
(?) recettore
< 0.2%
poiché le molecole di IgG hanno 2 siti
di legame per l’antigene, possono
formare legami crociati unendo
assieme antigeni polivalenti
Gli Ig formano legami multipli con antigeni polivalenti
attivazione linfocita B
I recettori sui linfociti B sono molecole tipo IgM modificate
con un dominio di ancoraggio per la membrana. Un
antigene polivalente causa l’oligomerizzazione di recettori
sulla superficie che innesca il segnale di attivazione
produzione IgM
Isotype swithcing
MHC (complesso maggiore d’istocompatibilità)
Le MHC di classe I presentano frammenti di proteine citoplasmatiche sulla superficie
delle cellule (meccanismo “taglia ed esponi”), incluso frammenti di eventuali patogeni
intracellulari
CELLULA T
KILLER
(recettore
cellula T) TCR
CD8
1) perforine
2) granzimi
3) apoptosi
Struttura Delle MHC
• Le MHC sono formate da quattro domini extracellulari, uno
transmembrana ed uno intracellulare
• Il sito di legame per l’antigene è una piattaforma recintata, formata
da un -foglietto e 2 a-eliche
• Peptidi di 8-10 residui si legano in forma estesa, ancorati da due
residui alle estremità (possono presentare milioni di frammenti
diversi)
MHC di classe II e le cellule presentanti l’antigene (antigen presenting, APC)
• Le MHC di classe 2 presentano
antigene sulla superficie di cellule
fagocitanti (APC)
CELLULA T
HELPER
CD4
citochine
altri linfociti
13-18 residui
endocitosi
fagocitosi
Una particella estranea è fagocitata da macrofagi e cellule dendritiche
Una proteina estranea legata al recettore sulla superficie di linfociti-B
KNGDSGGPGTNEDK
SNEDGKKKSGNPGNVD
determinanti
antigenici
epitopo
continuo
epitopo
discontinuo
Anticorpi come strumenti di ricerca
idrofobico polare
Indovina il determinante antigenico
MVRGITVLAAVALMVGANNIPKLVPDDHYVNRVVGGQEAEE
GSAPYQVSLQVALWGHNQGGSILSERWVLTAAHCLVGTDAE
ELEVLVGTNSLKEGGQRYKADKLLYHSRYNSPQFHNDIGLV
RLATPIKFSSTVKSIEYSENVVPVNATVRLTGWGRTSAGGS
VPTKLQTIDLRTLSNEDGKKKSGNPGNVDIGHVVTLTRTGE
GAKNGDSGGPGTNEDKVIGVVNFGVPCALGYPDGFARVSYY
HDWIRTTIRNN
MVRGITVLAAVALMVGANNIPKLVPDDHYVNRVVGGQEAEE GSAPYQVSLQVALWGHNQGGSILSERWVLTAAHCLVGTDAE ELEVLVGTNSLKEGGQRYKADKLLYHSRYNSPQFHNDIGLV RLATPIKFSSTVKSIEYSENVVPVNATVRLTGWGRTSAGGS VPTKLQTIDLRTLSNEDGKKKSGNPGNVDIGHVVTLTRTGE GAKNGDSGGPGTNEDKVIGVVNFGVPCALGYPDGFARVSYY HDWIRTTIRNN
Produzione di anticorpi
Antigen prediction
SPPS
Link to carrier (e.g. albumin) (inject with
adjuvant)
Affinity Cromatography
With Immobilized
antigen
immunoassay
with antigen
Elettro blot
Utilizzo di anticorpi come strumenti per la ricerca - WESTERN BLOT
elettrodo
elettrodo
blot a capillarità
anticorpo specifico
di coniglio
anticorpo anti Fc
di coniglio legato a
un enzima
substrato prodotto colorato
Tipi di blotting
Northern
Southern
We
ste
rn
Southern: identifica un filamento di DNA
blot utilizzando DNA complementare
(es. identificare/isolare geni da DNA
genomico)
Northern: identifica un filamento di RNA
blot utilizzando DNA complementare
(es. determinare il livello di trascrizione
di un gene)
Western: identifica una proteina utilizzando un
blot anticorpo specifico
(es. determinare il livello di espressione
di una proteina).
Anticorpi come strumenti di ricerca
Western blot
(SDS-PAGE)
saggi ELISA
Epitopo + Ig elevata affinità e selettività
interazione
separazione
identificazione
diagnostica
Identificazione dell’antigene
sperimentale
Dot blot
(cromatografia)
t
I
controllo positivo
colonne di affinità
Glossario
Antigene: macromolecola capace di reagire con i prodotti del sistema
immunitario
Determinante antigenico: Piccola parte di antigene che lega un anticorpo specifico.
(detto anche epitopo). Una singola molecola di antigene può contenere diversi epitopi
riconosciuti da anticorpi differenti.
Antigenicità: Capacità dell'antigene di combinarsi specificamente con un
(specificità antigenica) anticorpo
Immunogenicità Capacità dell'antigene di indurre una risposta immunitaria
(potere "immunogeno“):
Aptene: piccola molecola (<10 kDa) antigenica ma non immunogena.
Diventa immunogena se legata a macromolecola carrier
Adiuvante: sostanza in grado di stimolare e aumentare la risposta ad un
antigene, senza manifestare essa stessa proprietà antigeniche.
Anticorpi policlonali: miscela di anticorpi diversi fra loro ottenuti dall’ immunizzazione
di un animale con un antigene che contiene diversi epitopi. Ogni
anticorpo deriva da un diverso clone di cellule B.
Anticorpi monoclonali: anticorpi identici fra loro prodotti da linee cellulari provenienti da
(mAb) un solo clone di cellule B (isolate specificatamente). I linfociti B
sono immortalizzati fondendoli con cellule trasformate (ibridomi)