Pengaruh Variasi Konsentrasi Enzim dan Substrat Terhadap
Sakarifikasi Limbah Pengolahan Kertas Menggunakan
Enzim Selulase dari Bacillus sp. BPPT CC RK2
Skripsi
Diajukan untuk memenuhi syarat gelar sarjana farmasi (S.Far)
AAM AMELIA
NIM : 108102000061
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
1433 H/ 2012
1
LEMBAR PERNYATAAN
DENGAN INI SAYA MENYATAKAN BAHWA SKRIPSI INI BENAR -
BENAR KARYA SENDIRI DAN BELUM PERNAH DIAJUKAN SEBAGAI
SKRIPSI ATAU KARYA ILMIAH PADA PERGURUAN TINGGI ATAU
PADA LEMBAGA MANAPUN.
Jakarta, 25 November 2012
Aam Amelia
2
KATA PENGANTAR
Puji syukur kepada Allah Azza wa Jalla, yang oleh karena pertolongan
dan kasih sayang-Nya penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi ini. Makalah
skripsi yang berjudul ―Pengaruh Variasi Konsentrasi Enzim dan Substrat
Terhadap Sakarifikasi Limbah Pengolahan Kertas Menggunakan Enzim Selulase
dari Bacillus sp. BPPT CC RK2” dibuat untuk memenuhi tugas mata kuliah
Skripsi, salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
Pada penulisan ini, penulis juga ingin mengucapkan penghargaan dan
terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:
(1) Ofa Suzanti Betha Msi, Apt dan Dr. Siswa Setyahadi, M.Sc selaku dosen
pembimbing yang telah menyediakan waktu, tenaga, dan pikiran dalam
menuntun penulis dalam penyusunan skripsi ini.
(2) Zilhadia M.Si, Apt selaku dosen pembimbing akademik selama pendidikan.
(3) Drs. Umar Mansur M.Sc selaku kaprodi Farmasi UIN Syarif Hidayatullah
Jakarta.
(4) Para dosen Farmasi UIN yang telah memberikan ilmu, pengalaman dan
wawasannya.
(5) Kak Ruby, Kak Wina, seluruh karyawan dan staf LAPTIAB BPPT
PUSPIPTEK Serpong yang telah memberikan bantuan, ilmu, dan pengalaman
selama penelitian kepada penulis. Juga teman satu leb Bioseparasi Oki dan
Sarah.
(6) Kementrian Agama dan CSS Mora yang telah memberikan dukungan moril
dan materil selama pendidikan. Ucapan beribu terimakasih, semoga ilmu
yang saya terima dapat bermanfaat.
(7) Orangtua, Uu, Aa, Atatan, Aenyang, Aujang, Ababang, Dede, Abi, teteh-
teteh, dan keluarga besar yang selalu memberi dukungan, semangat dan doa .
Love you all.
(8) Rekan penelitian Siti Mardiyanti Said yang telah bersama dalam suka dan
duka. Sahabat-sahabat Emak, Memyu, Zikri, Endah, yang telah memberikan
3
dukungan dan keceriaan sehingga saya bersemangat dan bisa menyelesaikan
tugas akhir ini.
(9) Teman-teman Matriks 2008 khususnya teman farmasi Imam, Roni, Pei,
Doni, Labib, Jidin, Ukon, Fafa, Fani, Eva, dan Teguh. Asiknya rame rame.
(10) Teman-teman seangkatan Farmasi 2008 yang telah menempuh pendidikan
bersama selama empat tahun, Semoga semangat dan kesuksesan bersama-
sama dengan kita semua.
(11) Semua pihak yang tak bisa disebutkan satu persatu yang telah membantu
kelancaran pembuatan skripsi, Saya ucapkan terimakasih.
Saya menyadari bahwa dalam makalah skripsi ini masih terdapat banyak
kekurangan. Oleh karena itu, saya mengharapkan kritik dan saran yang
membangun sehingga dapat menyempurnakan skripsi ini dan melaksanakan
perbaikan di masa yang akan datang. Semoga tulisan ini dapat bermanfaat bagi
para pembaca dan bagi dunia pendidikan dan ilmu pengetahuan.
Ciputat, 10 Oktober 2012
Aam Amelia
4
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL
LEMBAR PERSETUJUAN
LEMBAR PENGESAHAN
LEMBAR PERNYATAAN ............................................................................................... i
KATA PENGANTAR ........................................................................................................ ii
DAFTAR ISI ........................................................................................................................ iv
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................................... vi
DAFTAR TABEL ............................................................................................................... viii
DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................................... ix
ABSTRAK .......................................................................................................................... x
ABSTRACT ........................................................................................................................ xi
BAB I PENDAHULUAN .................................................................................................. 1
1.1 Latar Belakang .................................................................................................... 1
1.2 Pembatasan Masalah ........................................................................................... 3
1.3 Perumusan Masalah ........................................................................................... 3
1.4 Hipotesa .............................................................................................................. 4
1.5 Tujuan Penelitian ................................................................................................ 4
1.6 Manfaat Penelitian .............................................................................................. 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................................... 5
2.1 Selulosa ............................................................................................................... 5
2.2 Enzim Selulase .................................................................................................... 7
2.3 Bacillus sp ........................................................................................................... 10
2.4 Fermentasi ........................................................................................................... 11
2.5 Glukosa ............................................................................................................... 13
2.6 Analisa Sakarifikasi Limbah Kertas.................................................................... 15
2.6.1 Kromatografi Lapis Tipis ................................................................................. 15
BAB III KERANGKA KONSEP ....................................................................................... 16
BAB IV METODOLOGI PENELITIAN ......................................................................... 17
4.1 Tempat dan Waktu Penelitian ............................................................................. 17
4.2 Bahan .................................................................................................................. 17
4.3 Alat ...................................................................................................................... 17
4.4 Metoda ................................................................................................................ 18
5
4.4.1 Produksi Enzim Selulase dari Bacillus sp BPPT CC RK2 .............................. 18
4.4.2 Proses Sakarifikasi Limbah Pengolahan Kertas ............................................... 18
4.4.2.1 Variasi Perlakuan Awal Substrat Limbah Pengolahan
Kertas dan Waktu Inkubasi ....................................................................................... 18
4.4.2.2 Uji Sakarifikasi Limbah pengolahan Kertas dengan Variasi
Konsentrasi Enzim .................................................................................................... 19
4.4.2.3 Uji Sakarifikasi Limbah pengolahan Kertas dengan Variasi
Konsentrasi Substrat ................................................................................................. 19
4.4.2.4 Uji Sakarifikasi Pembanding......................................................................... 20
4.4.2.5 Analisa Produk Akhir Sakarifikasi ............................................................... 20
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................................................. 21
BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN
6.1 Kesimpulan ......................................................................................................... 30
6.2 Saran ................................................................................................................... 30
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................................... 31
LAMPIRAN ......................................................................................................................... 37
GAMBAR ........................................................................................................................... 58
6
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur Selulosa ................................................................................................ 5
Gambar 2. Jalur Reaksi Selulosa Menjadi Glukosa .............................................................. 8
Gambar 3. Bacillus sp .......................................................................................................... 10
Gambar 4. Struktur Glukosa ................................................................................................. 13
Gambar 5. Reaksi antara Gula Reduksi dengan Reagen DNS .............................................. 14
Gambar 6. Kurva hubungan waktu inkubasi dan perlakuan awal substrat
terhadap persen sakarifikasi .................................................................................................. 22
Gambar 7. Kurva hubungan konsentrasi substrat terhadap persen
sakarifikasi ............................................................................................................................ 24
Gambar 8. Kurva hubungan antara konsentrasi enzim terhadap persen
sakarifikasi ............................................................................................................................ 24
Gambar 9. Analisa produk akhir sakarifikasi dengan KLT ................................................. 28
Gambar 10. Autoklaf ............................................................................................................. 59
Gambar 11. Refrigerated Sentrifuge ..................................................................................... 59
Gambar 12. Termomixer ....................................................................................................... 59
Gambar 13. pHmeter ............................................................................................................. 59
Gambar 14. Timbangan Analitik .......................................................................................... 59
Gambar 15. Spektrofotometer UV VIS ................................................................................. 59
Gambar 16. Substrat limbah pengolahan kertas awal ........................................................... 60
Gambar 17. Perendaman Substrat dengan NaOH ................................................................. 60
Gambar 18. Substrat limbah pengolahan kertas hasil pretreatment ...................................... 60
Gambar 19. Enzim selulase Bacillus sp BPPT CC RK2 ....................................................... 60
7
Gambar 20. Analit berwarna kecoklatan hasil uji aktivitas selulase dengan
larutan DNS ........................................................................................................................... 61
Gambar 21. Analit berwarna biru hasil analisa kadar protein ............................................... 61
Gambar 22. Substrat limbah pengolahan kertas+enzim selulase Bacillus sp
BPPT CC RK2 ...................................................................................................................... 61
Gambar 23. Pengembangan sampel dan pembanding pada kromatografi lapis
tipis.............61
8
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Kandungan selulosa, hemiselulosa, lignin dalam berbagai
lignoselulosa .......................................................................................................................... 7
Tabel 2. Persen (%) sakarifikasi berbagai waktu inkubasi dan perlakuan
awal substrat .......................................................................................................................... 22
Tabel 3. Perbandingan kadar gula reduksi dan persen sakarifikasi
keseluruhan ........................................................................................................................... 26
9
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Cara pembuatan reagen .................................................................................... 40
Lampiran 2. Pembuatan medium .......................................................................................... 41
Lampiran 3. Pembuatan kurva standar glukosa dan kurva standar BSA .............................. 43
Lampiran 4. Kurva standar Glukosa ..................................................................................... 44
Lampiran 5. Kurva standar BSA ........................................................................................... 45
Lampiran 6. Metoda pengujian aktivitas enzim selulase dan kadar protein ......................... 46
Lampiran 7. Perhitungan uji aktivitas selulase ..................................................................... 48
Lampiran 8. Perhitungan kadar protein ................................................................................. 49
Lampiran 9. Aktivitas enzim selulase yang digunakan ......................................................... 50
Lampiran 10. Penentuan persen sakarifikasi limbah pengolahan kertas............................... 51
Lampiran 11. Metoda perlakuan awal substrat limbah pengolahan kertas ........................... 52
Lampiran 12. Hasil uji pendahuluan perlakuan awal substrat .............................................. 53
Lampiran 13. Perhitungan uji variasi konsentrasi substrat ................................................... 55
Lampiran 14. Perhitungan uji variasi konsentrasi enzim ...................................................... 57
Lampiran 15. Analisa produk akhir sakarifikasi dengan kromatografi lapis
tipis ........................................................................................................................................ 58
Lampiran 16. Data pembanding ............................................................................................ 59
10
ABSTRAK
Judul : Pengaruh Variasi Konsentrasi Enzim dan Substrat Terhadap Sakarifikasi
Limbah Pengolahan Kertas Menggunakan Enzim Selulase dari Bacillus sp. BPPT
CC RK
Selulosa merupakan polimer yang paling banyak ditemukan di alam dan
dapat dilakukan proses sakarifikasi dengan cara enzimatis. Penelitian ini bertujuan
untuk melihat pengaruh konsentrasi enzim dan substrat terhadap sakarifikasi
limbah pengolahan kertas menggunakan enzim selulase dari Bacillus sp BPPT CC
RK2. Nilai aktivitas spesifik enzim selulase adalah 15,04 U/mg. Proses
sakarifikasi substrat limbah pengolahan kertas dilakukan dengan variasi
konsentrasi enzim dengan aktivitas 6,12,18 Unit serta dilakukan variasi
konsentrasi substrat 25,50,100, 150 dan 200 mg. Hasil terbaik didapat dari
konsentrasi enzim dengan aktivitas 12 unit dengan nilai persen (%) sakarifikasi
sebanyak 1,80% dan substrat 100 mg dengan persen (%) sakarifikasi sebanyak
1,01%. Analisa produk akhir sakarifikasi diidentifikasi dengan kromatografi lapis
tipis. Kromatogram dan nilai Rf menunjukkan produk akhir sakarifikasi adalah
Maltosa.
Kata kunci:
Sakarifikasi, Selulase, Bacillus sp. BPPT CC RK2, KLT
11
ABSTRACT
Title : Effect of Concentration Enzymes and Substrates Variation for Paper Sludge
Saccharification Using Cellulase Enzyme From Bacillus sp. BPPT CC RK2
Cellulose is the most abundant polymer in nature and can be converted
into sugar molecules with enzymatic reaction. The aim of this study is to know
about effect of variation concentration of enzymes and substrates on
saccharification of paper sludge uses cellulase enzymes from Bacillus sp BPPT
CC RK2. The result of spesific enzyme activity is 15,04 U/mg. Yhe process of
paper sludge saccharification is done by variation of the concentration of the
enzyme with activity unit 6,12,18 unit and variation of the concentration of
substrate 25,50,100,150 and 200 mg. The best results were obtained from the
concentration of the enzyme activity 12 unit with 1.80% saccharification and
substrate as 100 mg with 1.01% saccharification. Analysis of the final product
saccharification identified by thin layer chromatography. Rf value indicates the
end product of sacharification is Maltose.
Keyword:
Saccharification, Cellulase, Bacillus sp. BPPT CC RK2, TLC
12
BAB I.
PENDAHULUAN
1.1 LATAR BELAKANG
Produksi biomassa lignoselulosa dari tanaman di dunia mencapai jumlah
sekitar 200 x 109
ton per tahun. Sebanyak 8-20 x 109
ton dari biomassa tersebut
berpotensi untuk diolah lebih lanjut (Lin dan Tanaka, 2006). Indonesia merupakan
negara penghasil biomassa yang cukup melimpah, baik yang berasal dari bahan
kayu, jerami, rumput-rumputan, limbah pertanian, hutan, limbah industri (kayu,
kertas) dan bahan berserat lainnya, sehingga sangat memungkinkan untuk
pemanfaatan biomassa lignoselulosa yang sampai saat ini belum dikembangkan
secara optimal (Octavia et al, 2011).
Limbah kertas dilaporkan memiliki kandungan selulosa sebanyak 60-
70%, hemiselulosa 10-20 %, dan lignin 5-10% (Sun dan Cheng 2002). Dalam
penelitian ini material lignoselulosa yang digunakan adalah limbah kertas yang
merupakan residu pengolahan pabrik kertas.
Lignoselulosa adalah komponen organik di alam yang berlimpah dan
terdiri dari tiga tipe polimer, yaitu selulosa, hemiselulosa dan lignin. Komponen
ini merupakan sumber penting untuk menghasilkan produk bermanfaat seperti
glukosa dari proses fermentasi, bahan kimia dan bahan bakar cair (Anindyawati,
2009).
Selulosa merupakan polimer yang paling banyak ditemukan pada
tumbuhan dan merupakan target utama biokonversi ( D.J Mukesh Kumar et al,
2012). Proses biokonversi polisakarida menjadi komponen gula dinamakan
13
Sakarifikasi (Karmakar dan Ray, 2011). Glukosa merupakan produk utama dari
proses pemecahan selulosa (Kristensen, 2009). Pada penelitian ini yang menjadi
fokus perhatian adalah sakarifikasi selulosa menjadi glukosa.
Proses sakarifikasi dapat dilakukan dengan cara fisika, kimia dan biologi
(Laser et al, 1996 dalam Thakur dan Nakagoshi, 2011). Metoda fisika dilakukan
dengan penggilingan dan radiasi untuk menurunkan ukuran partikel, luas
permukaan dan derajat polimerasi. Metoda kimia melibatkan reagen asam, basa,
amoniak, tekanan uap, dan hipoklorit untuk memisahkan lignin. Namun, kedua
metoda diatas menghasilkan kualitas produk yang rendah karena terjadi degradasi
molekul glukosa. Metoda biologi atau secara enzimatik memiliki keuntungan
yaitu menghasilkan produk dengan kualitas yang baik karena reaksi spesifik dari
enzim-substrat. Struktur kristal dan porositas selulosa pun tidak mengalami
degradasi sehingga produk biokonversi yang dihasilkan berkualitas lebih baik
(Thakur dan Nakagoshi, 2011). Metode yang digunakan untuk menghidrolisis
selulosa adalah dengan menggunakan enzim, contohnya selulase(Galbe dan
Zacchi, 2002).
Enzim selulase dapat dihasilkan oleh jamur, bakteri dan actinomycetes.
Bakteri Bacillus sp. diketahui merupakan salah satu mikroorganisme yang dapat
menghasilkan enzim selulase. Meskipun produksi enzim selulase oleh bakteri ini
tidak sebanyak produksi enzim selulase oleh jamur (con. Trichoderma reesei),
namun produksi enzim selulase menggunakan bakteri mendatangkan beberapa
keuntungan, antara lain yaitu bakteri memiliki laju pertumbuhan yang lebih tinggi
dibandingkan jamur dan lebih mudah beradaptasi pada lingkungan yang ekstrim
(Maki, 2009), bakteri lebih mudah direkayasa genetika, enzim selulase yang
14
dihasilkan merupakan katalis yang lebih efektif dan kurang terinhibisi oleh
material yang telah terhidrolisis (Ariffin et al, 2006). Pada penelitian ini bakteri
yang digunakan adalah Bacillus sp. BPPT CC RK2 yang merupakan koleksi
BPPT. Enzim selulase yang dihasilkan oleh Bacillus sp. BPPT CC RK2 mencapai
kondisi optimum pada pH 7,0 dan temperatur 37° C dengan menggunakan media
produksi dedak padi 40 % dan air kelapa 20 % (Bakti, 2011; Marssada, 2011).
Menurut Thakur dan Nakagoshi (2011), terdapat beberapa faktor yang
mempengaruhi hasil dan laju hidrolisis enzim yaitu konsentrasi substrat, aktivitas
selulase, dan kondisi reaksi seperti pH dan temperatur. Pada penelitian ini akan
dilakukan pengamatan terhadap kemampuan enzim selulase yang dihasilkan dari
fermentasi Bacillus sp. BPPT CC RK2 dalam mengkonversi selulosa dari limbah
pengolahan kertas menjadi glukosa. Selanjutnya juga akan diamati pengaruh
jumlah enzim dan substrat terhadap konsentrasi glukosa yang dihasilkan.
1.2 PEMBATASAN MASALAH
Penelitian ini dibatasi pada analisa produksi glukosa dari limbah
pengolahan kertas secara enzimatis menggunakan enzim selulase yang dihasilkan
Bacillus sp. BPPT CC RK2 dengan variasi konsentrasi enzim dan substrat.
1.3 PERUMUSAN MASALAH
1. Apakah limbah pengolahan kertas dapat dikonversi menjadi glukosa melalui
proses sakarifikasi dengan menggunakan enzim selulase yang dihasilkan bakteri
Bacillus sp. BPPT CC ?
15
2. Bagaimana pengaruh variasi konsentrasi enzim selulase dan substrat terhadap
proses sakarifikasi?
1.4 HIPOTESA
Limbah pengolahan kertas merupakan limbah akhir pabrik kertas yang
mengandung selulosa. Enzim selulase dari Bacillus sp BPPT CC RK2 dapat
menghidrolisis selulosa dan menghasilkan glukosa. Konsentrasi glukosa yang
dihasilkan akan mencapai optimum pada jumlah enzim dan substrat tertentu.
1.5 TUJUAN PENELITIAN.
1. Mengetahui potensi limbah pengolahan kertas untuk menghasilkan molekul
glukosa melalui proses sakarifikasi dengan menggunakan enzim selulase dari
Bacillus sp. BPPT CC RK2
2. Mengetahui pengaruh konsentrasi enzim selulase dan substrat terhadap proses
sakarifikasi.
1.6 MANFAAT PENELITIAN
1. Memanfaatkan limbah pengolahan kertas untuk dapat menghasilkan molekul
glukosa.
2. Menjaga kelestarian lingkungan dengan memanfaatkan limbah pengolahan
kertas.
16
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Selulosa
Selulosa merupakan molekul sederhana dengan unit selubiosa yang
berulang yang tersusun atas unit-unit glukosa-1,4 anhidrat yang dihubungkan oleh
ikatan β 1,4-glikosidik. Ikatan rantai saling berinteraksi melalui ikatan hidrogen
intramolekul dan intermolekul; dan ikatan van der walls (O'Sullivan, 1997 dikutip
dari Saxena dan Brown, 2007).
Gambar 1. Struktur Selulosa (P. Singh nee’ Nigam et al, 2009)
Selulosa merupakan polimorfisme, dan perbedaan bentuk biasanya
terdefinisi oleh bentuk kristal dan amorf. Bentuk kristal merupakan bentuk
selulosa terbanyak, sedangkan bentuk amorf memiliki persentase yang sedikit
(Kondo, 2004 dikutip dari Saxena dan Brown, 2007).
Selulosa berasal dari biopolimer yang disintesis oleh tumbuhan, alga,
beberapa jenis bakteri termasuk golongan sianobakteri, dan jamur ( Brown, 1996).
Selulosa merupakan bagian dari lignoselulosa. Lignoselulosa terdiri dari
tiga komponen utama yaitu: Selulosa, Hemiselulosa dan Lignin. Ketiganya
membentuk suatu ikatan kimia kompleks yang menjadi bahan dasar dinding sel
tumbuhan. Selulosa berjumlah sekitar 30-60% dari total keseluruhan
lignoselulosa.
17
Hemiselulosa merupakan istilah umum bagi polisakarida yang larut dalam
alkali. Hemiselulosa berjumlah sekitar 20-40% dari total keseluruhan
lignoselulosa. Hemiselulosa sangat dekat asosiasinya dengan selulosa dalam
dinding sel tanaman (Fengel dan Wegener, 1984 dalam Hermiati et al, 2010).
Lima gula netral, yaitu glukosa, mannosa, dan galaktosa (heksosan) serta xilosa
dan arabinosa (pentosan) merupakan konstituen utama hemiselulosa (Fengel dan
Wegener, 1984 dalam Hermiati et al, 2010). Berbeda dari selulosa yang
merupakan homopolisakarida dengan monomer glukosa dan derajat polimerisasi
yang tinggi (10.000– 14.000 unit), rantai utama hemiselulosa dapat terdiri atas
hanya satu jenis monomer (homopolimer), seperti xilan, atau terdiri atas dua jenis
atau lebih monomer (heteropolimer), seperti glukomannan. Rantai molekul
hemiselulosa pun lebih pendek daripada selulosa.
Lignin mempunyai struktur molekul yang sangat berbeda dengan
polisakarida karena terdiri atas sistem aromatik yang tersusun atas unit-unit fenil
propana. Lignin berjumlah sekitar 15-25% dari total keseluruhan lignoselulosa
(Fengel dan Wegener, 1984 dalam Hermiati et al, 2010).
Peran ketiga komponen kimia ini dalam dinding sel dapat dianalogkan
seperti bahan konstruksi yang terbuat dari reinforced concrete, di mana selulosa,
hemiselulosa,dan lignin berperan sebagai rangka besi, semen, dan bahan penguat
yang memperbaiki ikatan di antara mereka.
18
Tabel 1. Kandungan selulosa, hemiselulosa, lignin dalam berbagai lignoselulosa
( Kumar et al, 2009)
Material Lignoselulosa Selulosa (%) Hemiselulosa (%) Lignin (%)
Batang Kayu ( keras) 40 – 55 24 – 40 18 – 25
Batang Kayu ( lunak) 45 – 50 25 – 35 25 – 35
Kulit Kacang 25 – 30 25 – 30 30 – 40
Tongkol Jagung 45 35 15
Rumput 25 – 40 35 – 50 10 – 30
Kertas 85 – 99 0 0 – 15
Jerami Gandum 30 50 15
Sampah (sortiran) 60 20 20
Daun 15 – 20 80 – 85 0
Kapas 80 – 95 5 – 20 0
Koran 40 – 55 25 – 40 18 – 30
Limbah Kertas (Residu Pabrik) 60 – 70 10 – 20 5 – 10
Limbah air (padatan) 8 – 15 Tdk diketahui Tdk diketahui
Pupuk Hasil Ternak 1,6 – 4,7 1,4 – 3,3 2,7 -5,7
Kotoran Babi 6,0 28 Tdk diketahui
Kandungan utama limbah kertas adalah selulosa yang merupakan
homopolisakarida terdiri dari β –D- glukosa. Limbah kertas dapat digunakan
untuk produksi glukosa setelah hidrolisis selulosa dengan enzim selulase (Vynios
et al, 2009).
Adapun karakteristik limbah pengolahan kertas yang dipakai dalam
penelitian ini adalah limbah akhir sisa pembuangan pabrik kertas yang didapatkan
dari sebuah pabrik pembuatan kertas di wilayah Tangerang.
2.2 Enzim Selulase
Enzim merupakan suatu protein yang bersifat sebagai katalis, yang
meningkatkan kecepatan reaksi perubahan substrat menjadi produk sementara
enzim itu sendiri tidak mengalami perubahan (Adhiyanto, 2006). Enzim selulase
merupakan enzim yang mengkatalis proses selulolisis (hidrolisis selulosa) dan
menghasilkan glukosa, selobiosa dan selooligosakarida (Sukumaran et al, 2005).
19
Untuk dapat menghidrolisis selulosa menjadi glukosa , enzim selulase
dibagi menjadi tiga tipe, yaitu exoglucanase, endoglucanase, dan β-glucosidase.
Endoglucanase (1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase, EC 3.2.1.4) bersifat lebih
aktif memecah daerah dengan sifat kekristalan yang rendah dan menciptakan
ujung rantai yang bebas. Exoglucanase (1,4-β-D-glucancellobiohydrolase, EC
3.2.1.91) biasanya aktif pada bentuk kristal selulosa dan memecah bagian selulosa
yang tidak tereduksi menjadi unit selobiosa. β-Glucosidase (EC 3.2.1.21)
memecah selobiosa menjadi glukosa (Mussatto dan Teixeira, 2010).
Gambar 2. Jalur reaksi selulosa menjadi glukosa (Demers, 2009).
Produksi enzim selulase dilaporkan berasal dari berbagai jenis bakteri dan
jamur. Enzim selulase yang dihasilkan oleh jamur seperti Aspergillus dan
Trichoderma spp lebih banyak digunakan karena menghasilkan produk enzim
selulase yang lebih tinggi dibandingkan jenis bakteri dan yeast (Mrudula dan
Murugamal, 2011). Pada saat ini, enzim selulase yang berasal dari bakteri mulai
dikembangkan karena laju pertumbuhan bakteri yang lebih cepat dibandingkan
jamur, bakteri lebih mudah direkayasa genetika , kurang terinhibisi oleh material
20
yang telah terhidrolisis dan dapat beradaptasi dalam lingkungan yang ekstrim
(Ariffin et al, 2006; Maki et al, 2009 ).
Enzim selulase memiliki aplikasi yang luas di bidang pangan, detergen,
tekstil, bahan bakar, kimia, dan pengolahan limbah. Terlepas dari aplikasi umum
selulase tersebut, kini mulai dikembangkan aplikasi enzim selulase dalam
pengembangan protoplast, antibakteri chitooligosakarida, immunomodulator, dan
agen antitumor (Begum et al, 2012).
Penentuan konsentrasi enzim adalah dengan cara menentukan aktivitas
katalitiknya. Pada tahun 1961, komisi enzim menetapkan Unit Enzim (U), yang
dikenal dengan International Unit (IU), sebagai jumlah enzim yang digunakan
untuk mengubah 1mol substrat permenit dibawah kondisi ideal (Adhiyanto et al,
2006).
Pengujian aktivitas selulase dilakukan dengan dua pendekatan, yaitu
mengukur selulase individu (endoglukanase, eksoglukanase, dan β-glukosidase)
dan aktivitas total selulase (Zhang et al, 2006). Aktivitas endoglukanase atau
CMCase dapat diukur berdasarkan reduksi viskositas substrat dan peningkatan
ujung akhir rantai yang direduksi berdasarkan pengujian gula reduksi. Aktivitas
eksoglukanase diukur menggunakan substrat Avicel, dan aktivitas β-glukosidase
diukur menggunakan selobiosa yang tidak dihidrolisis oleh endoglukanase dan
eksoglukanase dan menggunakan siklodekstrin rantai panjang yang dihidrolisis
oleh endoglukanase dan eksoglukanase (Ghose, 1987).
Aktivitas total selulase terdiri dari endoglukanase, eksoglukanase, dan β-
glukosidase yang keseluruhannya bekerja secara sinergis menghidrolisis kristal
selulosa. Pada umumnya, pengujian aktivitas total selulase dilakukan dengan
21
menggunakan filter paper assay (FPA) menggunakan kertas saring whatman no.1
sebagai substrat sebagaimana dipublikasikan oleh IUPAC (The International
Union of Pure and Applied Chemistry) ( Ghose, 1987).
2.3 Bacillus sp
Gambar 3. Bakteri Bacillus sp
(Sumber : www. Invivo.flocruz.br/cell/oficina.htm)
Klasifikasi bakteri Bacillus sp adalah sebagai berikut: (cohn, dikutip dari wikipedia.com)
Kingdom : Bacteria
Phylum : Firmicutes
Kelas : Bacilli
Ordo : Bacillales
Famili : Bacilaceae
Genus : Bacillus
Species : Bacillus sp.
Golongan Bacillus merupakan bakteri Gram positif, berbentuk batang,
bersifat aerob dan merupakan bakteri endospora. Pada umumnya, golongan
Bacillus bersifat mesofil yang dapat hidup pada temperatur 30-45˚ C
(Oppenheimer dan Zobell, 1952 dalam Kalimutho et al, 2011). Namun dilaporkan
beberapa spesies memiliki kemampuan bertahan di lingkungan yang ekstrim,
seperti padang pasir, kedalaman bawah laut dan mata air panas Arctic. Bakteri ini
22
termasuk golongan thermofilik, asidofilik, alkalifilik, halotoleran, dan halofilik
yang memiliki kemampuan tumbuh pada temperatur, pH dan konsentrasi garam
yang ekstrim (Turnbull,1996).
Bacillus banyak ditemukan di alam seperti pada tanah, air, debu, beberapa
spesies bahkan ditemukan sebagai flora normal pada usus manusia. Ketika
ditumbuhkan pada media agar darah, Bacillus membentuk pola yang besar,
tersebar, berwarna putih keabu-abuan dengan tepi yang tidak beraturan.
Karakteristik unik dari bakteri ini adalah kemampuannya untuk membentuk
endospora pada kondisi lingkungan yang ekstrim ( El safey, 2006).
Bacillus banyak digunakan dalam mikrobiologi industri karena laju
pertumbuhannya yang cepat pada proses fermentasi, kemampuan mengsekresikan
protein ke medium ekstraselular dan status keamanannya yang GRAS ( generally
regarded as safe), seperti B. subtilis dan B. licheniformis (Schallmey et al, 2004).
Pada umumnya, Bacillus alkalifilik mampu memproduksi berbagai enzim
yaitu protease, amilase, xilanase, pullulase dan selulase (Schallmey et al, 2004).
Beberapa Bacillus yang telah diteliti menghasilkan enzim selulase adalah Bacillus
subtilis (Yin et al, 2010), Bacillus pumilus (Ariffin et al, 2006), Bacillus
licheniformis (Aygan et al, 2011), Bacillus sp (Aygan dan Arikan, 2008).
Pada penelitian ini, diamati kemampuan Bacillus sp BPPT CC RK 2 dalam
menghasilkan enzim selulase untuk selanjutnya diamati kemampuan sakarifikasi
limbah kertas.
2.4 Fermentasi
Istilah fermentasi berasal dari bahasa latin yaitu fervere yang berarti
mendidih. Istilah ini pertama kali digunakan untuk menerangkan terjadinya
23
penggelembungan atau pendidihan pada ekstrak buah karena adanya gas CO2 saat
ditumbuhi mikroba atau yeast. Dalam mikrobiologi, fermentasi mengarah pada
segala proses yang melibatkan produksi biomassa/bioproduk dengan
menggunakan mikroba (Tewari, 2007). Dalam mikrobiologi industri, fermentasi
dapat didefinisikan sebagai perubahan gradual oleh enzim beberapa bakteri,
khamir, dan kapang. Beberapa contoh perubahan kimia dari fermentasi meliputi
pengasaman susu, dekomposisi pati dan gula menjadi alkohol dan karbon
dioksida, dan oksidasi senyawa nitrogen organik (Hidayat dan Suhartini, 2010).
Fermentasi dalam arti luas adalah proses perubahan kimia dari senyawa-senyawa
organik (karbohidrat, protein, lemak dan bahan organik lain) melalui kerja enzim
yang dihasilkan mikroba (Gandjar, 1977 dikutip Abun 2006).
Mikroorganisme yang umum digunakan dalam fermentasi adalah bakteri,
jamur dan khamir (Yeast). Kelompok bakteri yaitu Acetobacter, Streptococcus,
Lactococcus,Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus, Propionibacterium,
Brevibacterium, Bacillus, Micrococcus, dan Staphylococcus. Kelompok yeast
yaitu Saccharomyces, Candida, Torulopsis, dan Hansenula. Kelompok jamur
yaitu Aspergillus, Penicillum, Rhizopus, Mucor, Monascus, dan Actinomucor
(Chojnacka, 2004).
Menurut jenis mediumnya, proses fermentasi dibagi menjadi dua yaitu
fermentasi substrat padat dan fermentasi substrat cair. Pada fermentasi substrat
padat, mikrooorganisme tumbuh pada media substrat yang sedikit atau sama
sekali bebas kandungan air , walaupun kapiler air tetap masih ada. Keuntungan
fermentasi substrat padat antara lain prosesnya sangat sederhana, tidak diperlukan
24
alat yang rumit, berkurangnya persoalan kontaminasi oleh mikroorganisme lain
(Chisti, 1999).
Fermentasi substrat cair adalah proses fermentasi yang substratnya larut
atau tersuspensi dalam fase cair. Keuntungannya antara lain jumlah inokulum
yang digunakan lebih sedikit, penanganan suhu dan kelembaban selama
fermentasi lebih mudah untuk dikontrol (Chisti, 1999).
Proses fermentasi dipengaruhi beberapa faktor, yaitu temperatur, pH,
lingkungan dan komposisi medium,kandungan O2 dan CO2 , dan kondisi
operasional fermentor (Chisti, 1999).
2.5 Glukosa
Gambar 4. Struktur Glukosa ( Sumber: Handbook of Pharmaceutical Exipients)
Glukosa atau dikenal dengan dekstrosa (karena mempunyai sifat dapat
memutar cahaya terpolarisasi kearah kanan), merupakan molekul
pentahidroksihexana dan termasuk golongan aldoheksosa (Vollhard dan Schore,
2009). Pemerian glukosa yaitu tak berbau, rasanya manis, berbentuk kristal atau
serbuk putih halus (Handbook of Pharmaceutical Exipients ed 5th).
Glukosa memiliki banyak manfaat dalam bidang farmasi, pangan, industri
permen dan bahan kimia. Dalam bidang farmasi, glukosa digunakan sebagai
pemanis, pengisi tablet dan kapsul, agen tonisitas, dan nutrisi dalam sediaan
parenteral (Handbook of Pharmaceutical Exipients ed 5th).
25
Analisa glukosa dari enzim selulase dapat dilakukan dengan menghitung
kadar gula reduksi menggunakan metoda DNS (Miller, 1959) dan Nelson
Somogyi dikarenakan kemampuan metoda diatas yang tinggi dalam mendeteksi
kadar gula yang tidak memerlukan pengenceran sampel dan interfensi yang
rendah dari selulase karena tidak memerlukan adanya pemindahan protein (Zhang
et al, 2006). Metoda DNS sepuluh kali lebih sensitif dibanding metode Nelson
Somogyi (Gusakov et al, 2011).
Metoda DNS digunakan untuk mengukur gula pereduksi dengan teknik
kolorimetri (Dashtban et al, 2010). Analisis ini dilakukan dengan menggunakan
asam 3,5-dinitrosalisilat atau 3,5-Dinitrosalicylic acid (DNS) yang merupakan
senyawa aromatik yang bereaksi dengan cara mengurangi kadar glukosa
membentuk asam 3-amino-5-nitrosalisilat, yang menyerap gelombang cahaya 540
nm (Miller, 1959)
(Toledo et al, 2012)
Gambar 5. Reaksi antara gula reduksi dengan reagen DNS
26
2.6 Analisa Sakarifikasi Limbah Kertas
2.6.1 Kromatografi Lapis Tipis ( KLT)
Kromatografi lapis tipis adalah metoda pemisahan fisikokimia, dimana
lapisan pemisah yaitu fase diam ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas,
logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisahkan berupa larutan
ditotolkan berupa bercak atau pita. Setelah pelat atau lapisan ditaruh didalam
bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak),
pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan). Selanjutnya
senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan.
Fase diam yang biasa digunakan yaitu silika gel, alumunium oksida,
kieselgur, selulosa dan turunannya, poliamida dan lain-lain. Fase gerak adalah
medium pembawa dan terdiri dari satu atau beberapa pelarut. Fase gerak bergerak
dalam fasa diam dengan adanya gaya kapiler.
Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan
dengan angka Rf atau hRf, yaitu :
Rf = Jarak titik pusat bercak dari titik awal
Jarak garis depan dari titik awal
Deteksi senyawa yang dipisahkan dapat dilakukan dengan berbagai cara,
yaitu deteksi dengan lampu UV; deteksi dengan pelarut semprot; dan deteksi
biologi (Stahl, 1985).
27
BAB III
KERANGKA KONSEP
Bacillus sp BPPT CC RK 2
Pembuatan stok kultur Pembuatan media
Pembuatan Starter Bakteri
Produksi enzim selulase
Analisa kadar enzim selulase
Sakarifikasi
Analisa kadar protein
Variasi Konsentrasi Enzim
Analisa kandungan glukosa secara
kualitatif dengan Kromatografi Lapis
Tipis ( KLT )
Variasi Konsentrasi Substrat
Analisa Persen (%) Sakarifikasi dengan
Spektrofotometer UV Visible
Analisa Produk Sakarifikasi
Pembanding
Enzim Komersil Primafast 200 Limbah Pengolahan
Kertas+ Buffer
Sakarifikasi Enzim selulase + Limbah Pengolahan
Kertas
Variasi Perlakuan Awal
Limbah Pengolahan Kertas
Pretreatment Limbah
Pengolahan Kertas
Untreatment Limbah
Pengolahan Kertas
28
BAB IV
METODOLOGI PENELITIAN
4.1 TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Teknologi Bioindustri,
LAPTIAB – BPPT PUSPIPTEK, Serpong, Tangerang, Banten dengan waktu
penelitian selama lima bulan dari Mei- September 2012.
4.2 BAHAN
Limbah pengolahan kertas, Bacillus sp. BPPT CC RK2. Bahan kimia yang
digunakan antara lain : medium Luria Bertani (LB), dedak padi, air kelapa,
ekstrak khamir (Scharlau), pepton (Pronadisa), NaCl (Merck), pereaksi
Dinitrosalisilat acid (DNS), Bouvine Serum Albumin (Sigma-Aldrich), pereaksi
Bradford, agar Bacto, CMC (Pronadisa), Na2HPO4.2H2O (Merck), NaHPO4
(Merck), NaOH (Merck), H2SO4 , metanol, butanol, asam asetat, glukosa (Sigma),
maltosa (Sigma), sukrosa (Sigma), galaktosa (Sigma), arabinosa (Sigma), ddH2O
(Milipore), akuades, enzim selulase komersil Primafast 200 (Genencor).
4.3 ALAT
Spektrofotometer UV Vis (Genesis), Lempeng KLT, Shaker Inkubator
(Kuhner), Shaker Inkubator GLF, Static Incubator (Memmert), Laminar Air
Flow (Babcock BF), Refrigerated Centrifuge (Gyrozen), Sentrifuge (Sigma),
pHmeter (Inolab), Waterbath, Termomixer (Eppendorf), Timbangan analitik
(Radwag), Autoklaf (Hitachi) , Hot plate magnetic stirrer (Heindolph) , Oven,
29
Pipet mikro (Thermo), Mikrotube (Eppendorf), cawan petri, dan alat-alat gelas
(Pyrex).
4.4 METODA
4.4 .1 Produksi Enzim Selulase dari Bacillus sp. BPPT CC RK2
Media starter dibuat dengan menginokulasikan sebanyak 1-2 ose isolat
Bacillus sp. BPPT CC RK2 ke dalam media LB steril (10% media produksi),
kemudian diinkubasi pada suhu 37oC , agitasi 150 rpm selama 6 jam. Produksi
enzim dilakukan dengan menginokulasikan media starter ke dalam media
produksi, dan diinkubasi pada suhu 37oC , agitasi 150 rpm selama 24 jam.
Setelah 24 jam, enzim dipanen dengan cara sentrifugasi dengan agitasi 6000 rpm
menggunakan Refrigerated Centrifuge (Zyrogen) selama 15 menit pada suhu
4oC, kemudian supernatannya diambil sebagai fraksi enzim kasar, kemudian
enzim kasar tersebut dianalisis aktivitas enzim dan kadar protein.
4.4.2. Proses Sakarifikasi Limbah Pengolahan Kertas
4.4.2.1 Variasi Perlakuan Awal Substrat Limbah Pengolahan Kertas dan
Waktu Inkubasi
a. Pretreatment substrat
Sebanyak 5 gram substrat limbah pengolahan kertas ditambah 100 ml
NaOH 1N dalam erlenmeyer dibiarkan selama 6, 12, dan 24 jam. Kemudian
larutan disaring menggunakan kain nilon dan dicuci dengan air yang mengalir
hingga pH netral, setelah itu substrat hasil pretreatment dikeringkan semalaman
dalam oven suhu 80˚ C. Dari hasil perlakuan, diambil sebanyak 100 mg substrat
limbah pengolahan kertas kemudian dicampur dengan 1 ml larutan buffer phosfat
0,05 M pH 7 lalu ditambahkan enzim selulase kasar dengan variasi konsentrasi
30
enzim dengan aktivitas 6,12,18 unit kemudian diinkubasi selama 24,48,72,96, dan
120 jam pada suhu 50˚ C. Kadar gula reduksi dihitung dengan menggunakan
metoda DNS (Miller, 1959) dan persen (%) sakarifikasi (Begum dan Alimon
2011).
b. Perlakuan substrat tanpa pretreatment
Sebanyak 5 gram substrat limbah pengolahan kertas basah dikeringkan 12
jam dalam oven suhu 80˚C. Dari hasil perlakuan, diambil sebanyak 100 mg
substrat limbah kertas kemudian dicampur dengan 1 ml larutan buffer phosfat
0,05 M pH 7 lalu ditambahkan enzim selulase kasar dengan variasi konsentrasi
enzim dengan aktivitas 6,12,18 unit kemudian diinkubasi selama 24,48,72,96, dan
120 jam pada suhu 50˚ C. Dihitung kadar gula reduksi dengan metoda DNS
(Miller, 1959) dan persen (%) sakarifikasi (Begum dan Alimon 2011).
4.4.2.2 Uji Sakarifikasi Limbah pengolahan Kertas dengan Variasi
Konsentrasi Enzim
Sebanyak 100 mg substrat limbah pengolahan kertas dicampur dengan 1
ml larutan buffer phosfat 0,05 M pH 5,5 lalu ditambahkan enzim selulase kasar
dengan variasi konsentrasi enzim dengan aktivitas 6,12,18 Unit kemudian
diinkubasi selama 96 jam pada suhu 37˚ C. Kadar gula reduksi dihitung dengan
menggunakan metoda DNS (Miller, 1959) dan persen (%) sakarifikasi (Begum
dan Alimon 2011).
4.4.2.3 Uji Sakarifikasi Limbah pengolahan Kertas dengan Variasi Substrat
Seperti prosedur 4.4.2.1 diatas dengan variasi substrat sebanyak 25 ,50,
100, 150, 200 mg ditambah enzim selulase kasar sebanyak 12 unit.
31
4.4.2.4 Uji Sakarifikasi Pembanding
a. Sakarifikasi limbah pengolahan kertas dengan Enzim Selulase Komersial
Enzim komersil yang digunakan yaitu enzim Primafast 200, dengan
kondisi optimum sakarifikasi pada pH 5,5 dengan temperatur inkubasi 60° C.
Sakarifikasi dilakukan selama 96 jam, dan setiap 24 jam supernatan diambil untuk
dihitung kadar gula reduksi dan persen (%) sakarifikasi.
b. Blangko
Blangko yaitu sebanyak 100 mg substrat hasil pretreatment 24 jam
ditambah buffer sitrat pH 5,5 kemudian diinkubasi pada suhu 37°C. Kadar gula
reduksi dan persen (%) sakarifikasi diukur setiap 24 jam. Sebagai kontrol yaitu
larutan buffer sitrat pH 5,5 diinkubasi pada suhu 37°C.
4.4.2.4 Analisa Produk Akhir Sakarifikasi
a) Analisa Produk Dengan Menggunakan Kromatografi Lapis Tipis
Analisa glukosa dilakukan secara kualitatif menggunakan kromatografi
lapis tipis dengan larutan pengembang butanol: asam asetat:air ( 3:3:1). Sampel
ditotolkan dalam pelat silika gel, dan dibiarkan hingga pelarut bergerak menuju
keatas dari pelat. Visualisasi kromatogram dilakukan dengan penampak bercak
H2SO4 10 % dalam metanol kemudian dikeringkan dalam oven suhu 110 ˚C
selama 5 menit (Karmakar dan Ray, 2011). Sebagai pembanding digunakan
berbagai standar gula, yaitu glukosa, xylosa, arabinosa, galaktosa, sukrosa dan
maltosa dengan konsentrasi 5 mg/ml.
32
BAB V
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini dilakukan untuk melihat pengaruh variasi konsentrasi enzim
dan substrat limbah pengolahan kertas untuk mencapai hasil sakarifikasi optimum
dengan menggunakan enzim selulase dari Bacillus sp. BPPT CC RK2. Media
produksi enzim yang digunakan adalah media Luria Bertani ditambah dengan
dedak beras 40 % sebagai sumber karbon dan air kelapa 20 % sebagai sumber
nitrogen. Enzim selulase yang dihasilkan memiliki aktivitas spesifik 15,04
unit/mg dengan data terlampir.
Konsentrasi enzim dan substrat berpengaruh terhadap produk yang
dihasilkan dari proses sakarifikasi. Analisa produk ditinjau dari besarnya persen
(%) sakarifikasi dan jenis gula yang dihasilkan.
Untuk mengetahui nilai persen sakarifikasi, terlebih dahulu harus
diketahui kadar gula reduksi sampel. Pengukuran kadar gula reduksi dilakukan
dengan metoda DNS (Miller, 1959). 3,5- asam dinitrosalisilat (DNS) merupakan
senyawa aromatik yang bereaksi dengan gula reduksi sampel yang memiliki
gugus aldehid atau keton bebas membentuk kompleks warna 3-amino-5 dinitro
asam salisilat yang dapat dideteksi dengan spektrometer UV vis pada panjang
gelombang 540 nm (Toledo et al, 2012).
Pada uji variasi perlakuan awal substrat dilakukan perbandingan antara
substrat yang diberi perlakuan (pretreatment) dan substrat tanpa perlakuan
(untreatment). Proses pretreatment dilakukan untuk mengkondisikan bahan-bahan
lignoselulosa baik dari segi struktur dan ukuran dengan memecah dan
menghilangkan kandungan lignin dan hemisellulosa, merusak struktur kristal dari
33
selulosa serta meningkatkan porositas bahan (Sun dan Cheng, 2002). Rusaknya
struktur kristal selulosa akan mempermudah terurainya selulosa menjadi glukosa.
Selain itu, hemiselulosa akan turut terurai menjadi senyawa gula sederhana:
glukosa, galaktosa, manosa, heksosa, pentosa, xilosa dan arabinosa (Mosier et al,
2005). Proses pretreatment dilakukan dengan cara basa menggunakan NaOH.
Tabel 2. Persen (%) sakarifikasi berbagai waktu inkubasi dan perlakuan awal substrat
WaktuInkubasi
24 jam
48 jam 72 jam 96 jam 120 jam
Sample
% Sakarifikasi
Untreatment 0 0,8154 0,6762 0,2138 0
Pretreatment 6 jam 0,358 0,4325 0,5817 1,1783 1,1783
Pretreatment 12 jam 0,6265 0,7458 0,8353 1,1932 0,9546
Pretreatment 24 jam 1,1485 1,2678 1,417 1,76 1,3722
Pretreatment 36 jam 1,0292 1,1783 1,2976 1,6258 1,3126
Gambar 6 .
Kurva hubungan waktu inkubasi dan perlakuan awal substrat terhadap persen sakarifikasi
Dari hasil dapat terihat nilai persen (%) sakarifikasi lebih tinggi pada
substrat dengan pretreatment dibandingkan substrat tanpa proses pretreatment.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
24 48 72 96 120
% S
akar
ifik
asi
Waktu Inkubasi (jam)
Persen Sakarifikasi Pada Perlakuan Awal Substrat Limbah Pengolahan
Kertas dan Waktu Inkubasi
Untreatment
Pre treatment 6 jam
Pre treatment 12 jam
Pre treatment 24 jam
Pre treatment 36 jam
34
Hal ini dikarenakan penggunaan reagen basa seperti NaOH dapat
menyebabkan pemutusan ikatan ester dan glikosidik dan pemecahan lignin dan
meningkatkan daya tembus enzim masuk ke selulosa dan hemiselulosa (Brodeur
et al, 2011). Sehingga mempermudah reaksi antara enzim dan substrat yang
mengakibatkan persen sakarifikasi yang dihasilkan lebih besar. Persentase
sakarifikasi terbesar didapatkan pada sampel yang dilakukan pretreatment selama
24 jam yaitu sebanyak 1,79 % dengan waktu inkubasi 96 jam.
Dari kurva diatas terlihat penambahan waktu inkubasi mengakibatkan
penurunan nilai persen sakarifikasi, hal ini disebabkan karena kemungkinan gula
yang dihasilkan bisa berubah menjadi produk lain dikarenakan enzim selulase
yang digunakan dalam proses sakarifikasi belum murni, sehingga dapat terjadi
reaksi lain yang tidak diketahui. Salah satu produk lanjutan yang bisa terbentuk
adalah etanol (Prasetyo et al, 2010).
Pada tahap penelitian dilakukan proses sakarifikasi dengan variasi
konsentrasi substrat sebesar 25, 50, 100, 150, dan 200 mg dan variasi konsentrasi
enzim dengan volume 2,4, dan 6 ml dengan inkubasi pada kondisi optimum yang
telah didapat dari tahapan uji pendahuluan yaitu menggunakan substrat hasil
pretreatment 24 jam, waktu inkubasi 96 jam dan suhu 37˚ C, pH 5,5.
Pada uji pengaruh variasi konsentrasi substrat didapatkan hasil persen
sakarifikasi tertinggi sebesar 1,01 %. Dari hasil dapat terlihat bahwa persen
sakarifikasi meningkat mulai dari konsentrasi substrat terendah 25 mg dan
mencapai nilai tertinggi pada konsentrasi 100 mg. Setelah titik optimum, nilai
persen sakarifikasi mengalami penurunan. Hal ini karena jika konsentrasi substrat
divariasikan, reaksi pada awal meningkat hingga mencapai maksimum dan
35
akhirnya mengalami penurunan (Haldane, 1930). Dengan semakin bertambahnya
konsentrasi substrat dapat terlihat penurunan pada grafik sakarifikasi, hal ini
karena jumlah enzim yang semakin terbatas (Ghose dan Ray, 2010).
Gambar 7.
Kurva hubungan antara variasi konsentrasi substrat terhadap persen sakarifikasi
Pada uji pengaruh variasi konsentrasi enzim, didapatkan hasil persen
sakarifikasi tertinggi sebesar 1,80 % pada aktivitas enzim12 Unit.
Gambar 8.
Kurva hubungan antara variasi konsentrasi enzim terhadap persen sakarifikasi
0,13920,2486
1,0143
0,5701
0,2660
0,0000
0,2000
0,4000
0,6000
0,8000
1,0000
1,2000
25 50 75 100 125 150 175 200
Sak
arif
ikas
i(%
)
Substrat (mg)
Hubungan konsentrasi substrat terhadap persen sakarifikasi
0,7637
1,8097
1,5104
0,0000
0,5000
1,0000
1,5000
2,0000
6 12 18
sakar
ifik
asi
(%)
enzim (U)
Hubungan variasi konsentrasi enzim terhadap persen sakarifikasi
36
Enzim merupakan katalisator yang dapat mempercepat laju reaksi tanpa
ikut serta dalam reaksi tersebut. Laju reaksi enzim dipengaruh berbagai faktor
seperti konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, temperatur, dan inhibitor.
Konsentrasi substrat mempengaruhi laju reaksi, karena semakin banyak substrat
yang ada maka semakin banyak pula ikatan yang terjadi antara enzim dan substrat
(Chen dan Ramos, 2010).
Produk yang dihasilkan dari reaksi antara substrat dan enzim dipengaruhi
oleh kondisi dari konsentrasi enzim maupun substrat. Pada keadaan konsentrasi
enzim meningkat sedangkan konsentrasi substrat tetap, konsentrasi atau jumlah
molekul enzim lebih rendah dibandingkan jumlah molekul substrat yang akan
dikatalisis, maka produk yang dihasilkan akan sebanding dengan jumlah substrat
yang diubah oleh enzim menjadi produk. Bila jumlah enzim ditingkatkan makin
banyak substrat yang ada akan diubah menjadi produk hingga suatu ketika jumlah
enzim berlebih namun substrat habis. Akibatnya penambahan jumlah enzim tidak
akan mengubah grafik kecepatan reaksi vs konsentrasi enzim (Adhiyanto et al,
2006).
Hubungan antara konsentrasi enzim dan produk yang dihasilkan dapat
menghasilkan kurva yang tidak linear, hal ini dikarenakan bisa jadi enzim tidak
dalam keadaan murni sehingga masih terdapat senyawa-senyawa penghambat
reaksi dalam jumlah yang sangat kecil (Sadikin, 2002).
Proses sakarifikasi limbah pengolahan kertas juga menggunakan enzim
komersial Primafast 200 dan blangko ( substrat limbah pengolahan kertas tanpa
penambahan enzim selulase Bacillus sp BPPT CC RK2).
37
Enzim komersil Primafast 200 memiliki kondisi optimum pada pH 4,5
hingga 5,5, dan temperatur 55 hingga 60° C. Proses sakarifikasi mengikuti kondisi
optimum dari enzim tersebut, yaitu pH 5,5 dan suhu 60° C. Substrat yang
digunakan adalah sebanyak 100 mg limbah hasil pretreatment dengan NaOH
selama 24 jam, dan konsentrasi enzim yang digunakan sebanyak 15,04 Unit/mg.
Pada proses sakarifikasi blangko, sebanyak 100 mg substrat hasil pretreatment
dengan NaOH selama 24 jam ditambah buffer sitrat pH 5,5 kemudian diinkubasi
pada suhu 37° C.
Dari hasil terlihat bahwa kadar gula reduksi dan persen sakarifikasi
tertinggi didapatkan dari proses sakarifikasi limbah pengolahan kertas
menggunakan enzim selulase Bacillus sp BPPT CC RK2 . Hal ini menunjukan
bahwa nilai persen sakarifikasi dengan menggunakan enzim selulase yang
diproduksi dari Bacillus sp. BPPT CC RK2 jauh lebih tinggi dibandingkan enzim
komersil dan blangko.
Kadar Gula Reduksi (mg/ml) Sakarifikasi (%)
Enzim selulase Bacillus sp
BPPT CC RK2
0,4022 1,80
Enzim Komersil Primafast 200 0,0033 0,0033
Blangko 0 0
Tabel 3. Perbandingan kadar gula reduksi dan persen sakarifikasi keseluruhan
Nilai persen sakarifikasi nol pada blangko menunjukkan bahwa tanpa ada
bantuan hidrolisis dari enzim selulase maka proses sakarifikasi tidak terjadi.
38
Setelah mengetahui nilai persen sakarifikasi, selanjutnya dilakukan
identifikasi jenis gula menggunakan kromatografi lapis tipis dengan standar gula
pembanding menggunakan Glukosa, Xylosa, Arabinosa, Galaktosa, Maltosa, dan
Sukrosa dengan konsentrasi 5 mg/ml. Karena jenis gula dari proses sakarifikasi
awalnya tidak diketahui, maka ditotolkan berbagai standar gula pembanding untuk
mengidentifikasi jenis gula yang dihasilkan dari proses sakarifikasi.
Bercak pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang tidak
berwarna. Pada penelitian ini, untuk menampakkan bercak maka lempeng KLT
disemprot dengan reagen campuran asam sulfat dan metanol lalu dipanaskan
untuk mengoksidasi solut-solut organik yang nampak sebagai bercak hitam atau
kecoklatan (Gandjar dan Rohman, 2007).
KLT dapat digunakan untuk uji identifikasi senyawa baku. Parameter pada
KLT yang digunakan untuk identifikasi adalah Rf. Dua senyawa dikatakan identik
jika mempunyai nilai Rf yang sama jika diukur pada kondisi KLT yang sama.
Penotolan nomor satu sampai enam pada lempeng kromatografi lapis tipis
menunjukkan jenis gula standar sebagai baku pembanding. Penotolan nomor tujuh
menunjukkan sampel produk sakarifikasi limbah pengolahan kertas menggunakan
enzim selulase dari Bacillus sp BPPT CC RK2. Penotolan nomor delapan
menunjukkan blangko, yaitu substrat limbah pengolahan kertas ditambah buffer
sitrat pH 5,5 tanpa penambahan enzim selulase.
Dari perbandingan nilai Rf antara sampel dan baku pembanding gula yang
ditotolkan terlihat bahwa nilai Rf sampel adalah 0,32 cm, mendekati nilai Rf
39
maltosa yaitu 0,33 cm, sehingga berdasarkan analisa kromatografi lapis tipis,
produk akhir sakarifikasi diperkirakan mengandung Maltosa.
( Ket: 1= Sukrosa; 2= Arabinosa; 3= Galaktosa; 4= Xilosa; 5= Maltosa;
6=Glukosa; 7= Sampel; 8= Blangko {limbah pengolahan kertas + buffer, tanpa
enzim selulase} )
Gambar 9. Analisa produk akhir sakarifikasi dengan KLT
Namun, berdasarkan literatur, seharusnya jenis gula terbanyak yang
dihasilkan dari proses sakarifikasi selulosa adalah glukosa (Sukumaran et al,
2005). Maltosa (C12H22O11) merupakan gabungan 2 unit glukosa yang terhubung
dengan ikatan 1,4 glikosidik. Hal ini menunjukkan bahwa proses sakarifikasi yang
terjadi belum sempurna, sehingga masih diperlukan hidrolisis kembali untuk
memecah maltosa menjadi glukosa.Ini dapat disebabkan karena aktivitas enzim
yang dihasilkan sangatlah kecil, sehingga hidrolisis selulosa menjadi glukosa
belum sempurna.
Jarak rambat
pelarut 8 cm
Rf Glukosa
3,5/8 = 0,43 cm
Rf Sampel
2,6/8 = 0,32 cm
Rf Maltosa
2,7/8 = 0,33 cm
Rf Arabinosa
3,9/8 = 0,48 cm
Rf Sukrosa
3,1/8 = 0,38 cm
Rf Galaktosa
3,5/8 = 0,43cm
Rf Xilosa 3,5/8
= 0,56 cm
1 2 3 4 5 6 7 8
40
Pada penotolan blangko dapat terlihat tidak ditemukan bercak, hal ini
menunjukkan bahwa pada limbah pengolahan kertas tanpa penambahan enzim
selulase tidak terjadi proses sakarifikasi menjadi molekul gula dikarenakan tidak
adanya interaksi antara enzim dan substrat untuk menghasilkan produk.
41
BAB VI
KESIMPULAN DAN SARAN
6.1 Kesimpulan
1. Enzim selulase yang dihasillkan Bacillus sp. BPPT CC RK2 dapat
melakukan sakarifikasi limbah pengolahan kertas. Konsentrasi enzim dan
substrat mempengaruhi persen sakarifikasi. Persen sakarifikasi tidak
berbanding lurus dengan peningkatan konsentrasi enzim dan substrat.
2. Berdasarkan analisa dengan kromatografi lapis tipis, jenis gula yang
dihasilkan dari proses sakarifikasi limbah pengolahan kertas dengan
menggunakan enzim selulase dari Bacillus sp BPPT CC RK2 diperkirakan
adalah maltosa.
6.2 Saran
1. Perlu dilakukan optimasi konsentrasi enzim dan substrat untuk
menghasilkan persen sakarifikasi yang maksimum.
2. Perlu dilakukan optimasi waktu sakarifikasi untuk menghasilkan persen
sakarifikasi yang maksimum.
3. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengkarakterisasi produk
yang dihasilkan.
42
DAFTAR PUSTAKA
Abun. 2006. Bioproses Limbah Udang Windu Melalui Tahapan Deproteinasi Dan
Demineralisasi Terhadap Protein Dan Mineral Terlarut. Fakultas Peternakan
Universitas Padjajaran: Bandung
Adhiyanto,C. 2006. Pemanfaatan Tentang Enzim dan Manfaatnya dalam Bidang
Biomedik. UIN Jakarta Press : Jakarta hal 1, hal 115-120.
Anindyawati, Trisanti. 2010. Potensi selulase dalam Mendegradasi Lignoselulosa
Limbah Pertanian untuk Pupuk Organik. Berita Selulosa, Vol. 45, No. 2,
Desember : 70 – 77
Ariffin, H., Abdullah, N., Kalsom, M.S., Shirai,Y and Hassan, M.A. 2006.
Production and Characterisation of Cellulase by Bacillus Pumilus Eb3.
International Journal of Engineering, 3(1), pp.47-53.
Bakti, C. P. 2011. Optimasi Produksi Enzim Selulase Dari Bacillus sp. BPPT CC RK2
dengan Variasi pH dan Suhu Menggunakan Response Surface Methodology.
Universitas Indonesia: Depok
Begum S.F., Savitha, C., Jaison, J.P. 2012. Utilization of Banana Waste for
Effective Production of Cellulase by Rhizopus Sp. Research Journal of
Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. Volume 3 issue 1.p 674-
683
Bradford, M. 1976. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of
Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye
Binding. Analytical Biochemistry (72), p 248-254
Brodeur, G., Yau, E., Badal, K., Collier, J., Ramachandran, K.B and
Ramakhrisnan, S. 2011. Chemical and Physicochemical Pretreatment of
Lignocellulosic Biomass: A Review. SAGE - Hindawi Access to Research
Enzyme Research. p 1-17
Brown, R.M. Jr. 1996. The biosynthesis of cellulose. J. Macromol. Sci. Pure Appl.
Chem. A33. P 1345-1373. In Saxena, I.M and Brown, R.M.Jr. 2008.
Biochemistry and Molecular Biology of Cellulose Biosynthesis in Plants:
Prospects for Genetic Engineering. Advances in Plant Biochemistry and
molecular Biology, Volume 1. Elsevier
Chen, T and Ramos, J. 2010. Enzyme Kinetics [application of uv-vis
spectrometry].
Cheng, C. Sung, C. Hsieh, P.H. 2010. On-line desalting and carbohydrate
analysis for immobilized enzyme hydrolysis of waste cellulosic biomass by
43
column-switching high-performance liquid chromatography. Journal of
Chromatography A, 1217 (2010) P. 2104–2110
Chisti, Y. 1999. Fermentation (Industrial) Basic Consideration.p 663-674 dalam
Encyclopedia of Food Microbiology, Robinson, R, Batt dan Patal, P.
Academic Press: London
Chojnacka, K. 2006. Fermentation Product. Chemical Engineering and Chemical
Process Technology Vol V dalam Encyclopedia of Life Support Systems
(EOLSS).
Dashtban, M., Maki, M., Leung, Kam Tin., Mao, C., Qin, W.2010. Cellulase
Activities in Biomass Convertion: Measurement Methods and Comparison.
Critical Reviews in Biotechnology.Informa Health Care. P 1-8
Demers, A., Doane, R., Guzman, S., Pagano, R. 2009. Enzymatic Hydrolysis of
Cellulosic Biomass for the Production of Second Generation
Biofuels.Worcester Polytechnic Institute. P 1-29
Bai, S. Kumar, M.R. Kumar, D.J. Mukesh. Balashanmugam, P. Balakumaran,
M.D. Kalaichelvan, P.T. 2012. Cellulase Production by Bacillus subtilis
isolated from Cow Dung. Archives of Applied Science Research, 2012, 4
(1):269-279
El-Safey. M. 2006. Introduction to Bacterial taxonomy.
Fengel, D. and G. Wegener. 1984. Wood: Chemistry, Ultrastructure, Reactions.
Walter de Gruyter & Co., Berlin dalam Hermiati, E. 2010. Pemanfaatan
biomassa lignoselulosa ampas tebu untuk produksi bioetanol. Jurnal Litbang
Pertanian, 29(4), Hal 121-130
Galbe, M and Zacchi, G. 2002. A Review of the Production of Ethanol from
Softwood. Appl Microbiol Biotechnol (2002) 59:618–628
Ghose, T.K. 1987. Measurement of Cellulase Activities. Pure & Appl. Chem.,
Vol. 59, No. 2, P. 257—268
Ghosh, B and Ray, R.R. 2010. Saccharification of Raw Native Starches by
Extracellular Isoamylase of Rhyzopus Oryzae. Biotechnology:9 (2) P 224-
228.
Gusakov, A.V., Kondratyeva, E.G., Sinitsyn, A.P. 2011. Comparison of Two
Methods for Assaying Reducing Sugars in the Determination of
Carbohydrase Activities. Hindawi Publishing Corporation International
Journal of Analytical Chemistry. Volume 2011
Haldane, J.B.S. 1930. Enzymes. University College: London
44
Handbook of Pharmaceutical Excipients.–5th ed. 2006. edited by Raymond C.
Rowe, Paul J. Sheskey, Siaˆn C. Owen. Pharmaceutical Press. American
Pharmacists Association. P 744
Hidayat, N dan Suhartini S. 2010. Mikrobiologi Industri. Jurusan Teknologi
Industri Pertanian. Universitas Brawijaya Malang
Gandjar, I.G dan Rohman, A . 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta:
Pustaka Pelajar. Hal 378-388
Karmakar, M and Ray, R.R. 2011. Saccharification of agro wastes by the
Endoglucanase of Rhizopus oryzae. Annals of Biological Research, 2011, 2
(1) : P 201-208
Kondo T., Kasai, W., and Brown, R. M. Jr. 2004. Formation of Nematic Ordered
Cellulose and Chitin. Cellulose (11), P 463- 474 in Saxena, I.M and Brown,
R.M.Jr. 2008. Biochemistry and Molecular Biology of Cellulose Biosynthesis
in Plants: Prospects for Genetic Engineering. Advances in Plant
Biochemistry and molecular Biology, Volume 1. Elsevier
Kristensen, JB. 2009. Enzymatic hydrolysis of lignocellulose Substrate
interactions and high solids loadings. Forest and Landscape Research
Kumar, P., Barret, D.M., Delwiche, M.J and Stroeve,P. 2009. Methods for
Pretreatment of Lignocellulosic Biomass for Efficient Hydrolysis and Biofuel
Production. Ind. Eng. Chem. Res., Vol. xxx, No. xx, XXXX
Laser, M., Schulman, D., Allen, S., Lichwa, J., Antal, M., and Lynd, L. 2002. A
Comparison of Liquid Hot Water and Steam Pretreatment of Sugarcane
Bagasse for Bioconversion to Ethanol. Bioresource Technology, 81. 33-44. In
Thakur, I,S. and Nakagoshi, N. 2011. Production of Biofuels from
Lignocellulosic Biomass in Pulp and Paper Mill Effluent for Low Carbon
Society. Journal of International Development and Cooperation, Vol 18,No.
I.P 1-12
Lin,Y and Tanaka, S. 2006. Ethanol fermentation from biomass resources:
current state and prospects. Applied Microbiology and Biotechnology.
69(6):627-642 in Abdel-Rahman, M.A. Tashiro, Y. Sonomoto, K. 2011.
Lactic acid production from lignocellulose-derived sugars using lactic acid
bacteria: Overview and limits. Journal of Biotechnology 156 (2011) pp 286–
301
Lo, Yun-Chung., Saratale, G.D., Chen, Wen-Ming., Bai, Ming-Der., Chang, Jo-
Shu. 2009. Isolation of cellulose-hydrolytic bacteria and applications of the
cellulolytic enzymes for cellulosic biohydrogen production. Enzyme and
Microbial Technology 44 (2009) 417–425
45
Maki,M., Leung K,T., Qin, W. 2009. The prospects of cellulase-producing
bacteria for the bioconversion of lignocellulosic biomass. International
Journal of Biological Sciences 2009; 5(5):500-516
Marssada, Agung. 2011. Optimasi Produksi Selulase Dari Bacillus sp. Bppt CC RK 2
Menggunakan Metode Respon Permukaan dengan Variasi Rasio C/N Dan Waktu
Fermentasi. Universitas Indonesia.
Miller, G.L., 1959. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of
Reducing Sugar. Analytical Chemistry, 31(3), pp.426-428.
Mosier, N., Wyman, C., Dale, B., Elander, R., Lee, Y.Y., Holtzapple and Ladisch,
M. 2005. Features of promising technologies for pretreatment of
lignocellulosic biomass. Bioresource Technology 96 (2005) P 673–686
Mrudula, S and Murugammal, R. 2011. Production of cellulase by Aspergillus
niger under submerged and solid state fermentation using coir waste as a
substrate. Brazilian Journal of Microbiology.2011. 42. P 1119-1127
Mussatto, S.I. and Teixeira, J.A., 2010. Lignocellulose as raw material in
fermentation processes. Applied Microbiology and Microbial Biotechnology,
P.897-907.
Nigam,P.S., Gupta, N., Anthwal, A. 2009. Pre-treatment of Agro-Industrial
Residues in Biotechnology for Agro-Industrial Residues Utilisation. Springer.
P.16
Octavia, S. Soerawidjaja, T.H., Purwadi, R., Putrawan, I.D.G Arsa. 2011.
Pengolahan Awal Lignoselulosa Menggunakan Amoniak untuk Meningkatkan
Perolehan Gula Fermentasi. Prosiding Seminar Nasional Teknik Kimia,
“Pengembangan Teknologi Kimia untuk Pengolahan Sumber Daya Alam
Indonesia”. Yogyakarta. ISSN 1693-4393
O'Sullivan, A. C. 1997. Cellulose: The Structure Slowly Unravels. Cellulose ,4.
173-207. In Saxena, I.M and Brown, R.M. Jr. 2008. Biochemistry and
Molecular Biology of Cellulose Biosynthesis in Plants: Prospects for Genetic
Engineering. Advances in Plant Biochemistry and molecular Biology,
Volume 1. Elsevier
Prasetyo, J., Kato, T., and Park Enoch.Y. 2010 Efficient Cellulase-Catalyzed
Saccharification of Untreated Paper Sludge Targeting for Biorefinery.
Biomass and Bioenergy 34 (2010). P 1906-1913
Ramanathan, T., Ahmad, A., Ahmad, A.S., Kalimutho, M. 2011. Taxonomical
Identity and Polysaccharide Produced by Bacillus Species Isolated From Old
Aged Medicinal Decoctions. Journal of Sustainability Science and
Management Volume 6 Number 1, June 2011: P 2-9
46
Sadikin, Mohamad. 2002. Biokimia Enzim. Widya Medika: Jakarta
Schallmey, M., Singh, A., Ward.O,P. 2004. Development in the Use of Bacillus
spesies for Industrial Production. Can. J. Microbiol. Vol 50 p 1-17
Scopes, Robert. 2002. Enzyme Activity and Assays. Encyclopedia of Life Sciences
Stahl, Egon. 1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopis.
Terjemahan dari :Drug Analysis by Chromatography and Microscopy : a
Practical Supplement to Pharmacopoias. Kosasih Padmawinata dan Iwang
Sudiro. Penerbit ITB Bandung
Sukumaran, R.K., Singhania, R.R. and Pandey, A. 2005. Microbial Cellulases -
Production, Applications and Challenges. Journal Scientific & Industrial
Research, 64 (November), pp.832-844.
Sun,Ye and Cheng, Jiayang. 2002. Hydrolysis of Lignocellulosic Materials for
Ethanol Production : a Review. Bioresource Technology (83) p 1-11
Tewari, Rupinder. 2007. Food and Industrial Microbiology. Department of
Biotechnology Panjab University
Thakur, I.S. and Nakagoshi, N. 2011. Production of Biofuels from Lignocellulosic
Biomass in Pulp and Paper Mill Effluent for Low Carbon Society. Journal of
International Development and Cooperation, Vol 18,No. I.P 1-12
Toledo,V.D.A.A.D., Takasusuki, M.C.C.R., Oliveira, A.J.B.D., Chambo, E.D and
Lopes, S.M.S. 2012. Spectrophotometry as a Tool for Dosage Sugars in
Nectar of Crops Pollinated by Honeybees. Dalam Macro To Nano
Spectroscopy Edited by Dr. Jamal Uddin. Intech. p 269-290
Vollhardt, P and Schore, N. 2009. Organic chemistry : structure and function ,6th
ed. W. H. Freeman and Company: USA. P 1117
Vynios, D.H., Papaioannon, D.A., Filos,G., Karigiannis, G., Tziala, T., Lagios, G.
2009. Enzymatic Production of Glucose From Waste Paper. Bioresources 4
(2) p 509-521
Yin, L.-J. et al., 2010. Purification and Characterization of a Cellulase from
Bacillus subtilis YJ1. Journal of Marine Science and Technology, Vol. 18,
No. 3, pp. 466-471 (2010)
Zhang , P.Y.H., Himmel M.E., and Mielenz J.R. 2006. Outlook for cellulase
improvement: Screening and selection strategies. Biotechnology Advances
24 (2006) 452–481
http:// invivo.flocruz.br/cell/oficina.htm . Gambar bakteri Bacillus sp. Diunduh
pada tanggal 15 September 2012
47
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK7699/bacillus. Turnbull, Peter CB. 1996.
Medical Microbiology. 4th edition. Editor Baron S, Galveston (TX):
University of Texas Medical Branch at Galveston diunduh pada tanggal 15
September 2012
48
LAMPIRAN
49
Lampiran 1
Cara pembuatan reagen
No. Nama Reagen dan buffer Cara pembuatan
1. Natrium Hidroksida 1 N Sebanyak 4 gram natrium hidroksida
dilarutkan dalam aquades hingga tepat 100 mL
2. Natrium Hidroksida 5 N Sebanyak 20 gram natrium hidroksida
dilarutkan dalam aquades hingga tepat 100
mL.
3. Buffer Phosfat 0,1 M pH 7 Larutan A= Sebanyak 2,78 gram NaHPO4
dilarutkan dalam aquades hingga tepat 100
mL.
Larutan B = Sebanyak 3,56 gram
Na2HPO4.2H2O dilarutkan dalam aquades
hingga tepat 100 mL.
19,5 ml Larutan A dicampurkan dengan 30,5
ml larutan B dilarutkan dalam aquades hingga
tepat 100 mL. pH 7
4. Buffer Phosfat 0,05 M pH
7
Sebanyak 50 ml Buffer Phosfat 0,1 M dipipet
kemudian ditambahkan aquadest hingga tepat
100 ml
5. CMC 1% dalam Buffer
Phosfat 0,05 M pH 7
Sebanyak 1 gram CMC dilarutkan dalam 10
ml Buffer Phosfat 0,05 M pH 7
6. Pereaksi DNS Larutan A = Sebanyak 10 gram dinitrosalisilat
acid ditambah 10 gram natrium hidroksida dan
2 gram fenol kemudian dilarutkan dalam
MiliQ hingga tepat 250 mL.
Larutan B= Sebanyak 200 g Natrium Kalium
Tartrat ditambahkan 0,5 gram natrium sulfit
kemudian dilarutkan dalam MiliQ hingga
tepat 250 mL.
Larutan A dicampurkan dengan larutan B
kemudian ditambahkan miliQ hingga tepat
1000 ml
7. Asam sulfat 0,005 N Sebanyak 0,140 mL asam sulfat dicampurkan
dalam aquades hingga tepat 1000 mL.
8. Asam sulfat 10% dalam
metanol
Sebanyak 2 ml asam sulfat ditambahkan 18 ml
metanol hingga tepat 20 ml
9. Pereaksi Bradford Sebanyak 100 mg Coomassie Blue G-250
dilarutkan dalam 50 ml ethanol 95%. Larutan
ini kemudian dicampurkan dengan 100 ml
asam fosfat 85% dan diencerkan sampai
volume 1 L dengan aquadest. Konsentrasi
akhir reagent ini 0.01% Coomassie Brilliant
Blue G-250, 4.7% ethanol, dan 8.5% asam
fosfat
50
Lampiran 2.
Pembuatan medium
No. Nama medium Cara Pembuatan
1. Medium Luria Bertani Sebanyak 0,5 gram natrium klorida, 0,5
yeast extract dan 1 gram pepton dilarutkan
dalam volume tertentu aquades, diatur pH
sampai 7,0, lalu dicukupkan hingga tepat
100 mL.
2. Medium Luria Bertani
agar
Sebanyak 0,5 gram natrium klorida, 0,5
yeast extract dan 1 gram pepton dilarutkan
dalam volume tertentu aquades, diatur pH
sampai 7,0,ditambahkan 2 gram agar,
diaduk hingga homogen, lalu dicukupkan
hingga tepat 100 mL.
3. Medium Luria
Bertani+Dedak Padi 40 %
+ Air kelapa 20 %
Sebanyak 2,5 gram natrium klorida, 100 ml
air kelapa, 5 gram pepton, dan 200 gram
dedak padi dilarutkan dalam volume
tertentu aquades, diatur pH sampai 7,0,
diaduk hingga homogen, lalu dicukupkan
hingga tepat 500 mL
Pembuatan Media
Pembuatan Media Kultivasi Bakteri
Media kultivasi yang digunakan adalah Luria Bertani (LB) cair dengan
komposisi per liter yaitu, 10g pepton, 5g ekstrak khamir, dan 5g NaCl. LB
ditambahkan dengan 1% Selulosa. Media dilarutkan dengan akuades. Kemudian
media disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121oC dan tekanan 1,2 atm selama
15 menit.
Proses Penyiapan Stok Kultur
Isolat Bacillus sp. BPPT CC RK2 diinokulasikan sebanyak 1-2 ose ke
dalam media LB agar dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Isolat ini
digunakan sebagai stok kultur penelitian.
51
Pembuatan Media Produksi Enzim
Media produksi dibuat sebanyak 500 ml. Media produksi mengandung
40% dedak beras sebagai sumber karbon dan air kelapa 20 % sebagai sumber
nitrogen. Media dilarutkan dengan volum tertentu akuades, diatur pH sampai 7,0.
Ditambahkan hingga volume akuades tepat 500 mL. Kemudian media disterilisasi
dalam autoklaf pada suhu 121°C dan tekanan 1,2 atm selama 15 menit
(Marsadda, 2011).
Pembuatan Starter
Media starter dibuat dengan menginokulasikan sebanyak 1-2 ose isolat
Bacillus sp.ke dalam media LB standar (10% media produksi), kemudian
diinkubasi pada suhu 37oC selama 6 jam dengan agitasi 150 rpm.
Produksi Enzim Selulase
Produksi enzim selulase dilakukan dengan menginokulasikan media starter
ke dalam media produksi, dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam dengan
agitasi 150 rpm. Setelah 24 jam, enzim disentrifugasi pada agitasi 6000 rpm
selama 15 menit pada suhu 4oC. Kemudian diambil supernatannya sebagai fraksi
enzim selulase kasar. Enzim selulase kasar tersebut kemudian dianalisis kadar
protein dan aktivitas enzimnya
52
Lampiran 3
Pembuatan Kurva Standar Glukosa dan Kurva Standar BSA
Pembuatan Kurva Standar Glukosa
Pembuatan kurva standar glukosa dilakukan dengan membuat variasi
konsentrasi standar glukosa sebagai berikut: 0; 0,04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,20; 0,20;
0,24; 0,28; 0,32 mg/ml
Glukosa tersebut dilarutkan dalam larutan buffer fosfat 0,05 M, pH 7.0.
Kandungan glukosa dalam larutan tersebut diuji dengan metode DNS
(Miller,1959). Kurva standar glukosa adalah grafik hubungan konsentrasi glukosa
dengan nilai absorbansi pada panjang gelombang 540 nm.
Pembuatan Kurva Standar BSA
Pembuatan kurva standar BSA dilakukan dengan membuat variasi
konsentrasi standar BSA sebagai berikut : 0; 0,03; 0,06; 0,09; 0,12; 0,15; 0,18;
0,21; 0,24 mg/ml.
BSA dilarutkan dalam mili-Q-water (ddH2O). Kandungan protein pada
larutan yang dibuat diuji dengan metode Bradford. .Konsentrasi analit berfungsi
sebagai sumbu X pada grafik dan absorbansi sebagai sumbu Y, sehingga akan
diperoleh suatu garis linear dengan gradien tertentu.
Bouvine Serum Albumin (BSA) mengandung 1mg/mL protein dalam
buffer phosfat 0,05 M pH 7.0.
53
Lampiran 4
Kurva Standar Glukosa
C(mg/ml) Absorbansi
0 0
0,04 0,1465
0,08 0,297
0,12 0,4475
0,16 0,4965
0,2 0,6455
0,24 0,6775
0,28 0,808
0,32 0,951
y = 3,0178xR² = 0,9782
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3
ab
sorb
an
si
konsentrasi (mg/ml)
Kurva Standar Glukosa
54
Lampiran 5
Kurva Standar BSA
C(mg/ml) Absorbansi
0 0
0,03 0,156
0,06 0,3185
0,09 0,37
0,12 0,5415
0,15 0,6505
0,18 0,728
0,21 0,8865
0,24 0,965
y = 4,1855xR² = 0,9886
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,05 0,1 0,15 0,2
Ab
sorb
an
si
Kadar protein (mg/ml)
Kurva Standar BSA
55
Lampiran 6
Metoda Pengujian Aktivitas Enzim Selulase dan Kadar Protein
a. Pengujian Aktivitas Selulase
Pengujian aktivitas selulase yang dilakukan pada percobaan ini adalah
melakukan pengujian terhadap endo β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) atau yang biasa
disebut sebagai CMCase. Aktivitas CMCase diukur dengan menggunakan metode
yang dilakukan oleh Yin et al (2010), yaitu dengan mereaksikan sampel dalam
larutan 1 mL CMC 1%, buffer fosfat 0,05 M (pH 7.0) di mana volume sampel
enzim 100 μl, dan volume pelarut 900 μl. Reaksi berlangsung selama 30 menit
dan diinkubasi pada suhu 500C. Gula turunan yang dihasilkan dari reaksi tersebut
ditentukan dengan metode DNS (Miller, 1959) yaitu dilakukan penambahan
larutan DNS sebanyak 3 mL pada tabung reaksi. Tabung reaksi berisi larutan
dipanaskan didalam waterbath selama 5 menit agar terjadi reaksi antara glukosa
dengan DNS. Tabung reaksi didinginkan kemudian dikocok agar bercampur.
Sebagai kontrol yaitu 900 μl CMC 1%, buffer fosfat 0,05 M (pH 7.0) diinkubasi
pada suhu 500C selama 30 menit baru kemudian ditambahkan 100 μl enzim lalu
ditambahkan 3ml DNS dan dipanaskan didalam waterbath selama 5 menit .
Perlakuan sampel dan kontrol dilakukan dalam waktu yang bersamaan.
Absorbansi diukur pada panjang gelombang 540 nm menggunakan
spektrofotometer UV Visible.
Harga absorbansi yang diperoleh dari sampel dan kontrol, diplotkan pada
kurva standar glukosa untuk mengetahui konsentrasi gula reduksi. Konsentrasi
gula reduksi diperoleh dari selisih plot absorbansi (sampel- kontrol) pada kurva
standar glukosa.
56
Aktivitas selulase dihitung menurut persamaan
Aktivitas ( U ml)= mg glukosa ×1000
Mr glukosa ×30 menit ×0.1 ml
b. Penentuan Kadar Protein
Kadar protein diukur menggunakan metode yang dilakukan oleh Y.C Lo et
al 2009 dengan metoda Bradford. Pengukuran kadar protein dilakukan dengan
modifikasi, yaitu sebanyak 30 µl sample dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu
ditambahkan 1,5 ml pereaksi Bradford. Kemudian larutan diaduk dengan vortex
perlahan untuk mencegah terbentuknya busa, analit diinkubasi selama 20 menit
pada suhu ruang. Blangko menggunakan ddH2O sebanyak 30µl. Absorbansi
diukur pada panjang gelombang 595 nm menggunakan spektrofotometer UV
Visible.
57
Lampiran 7
a. Perhitungan Uji Aktivitas Selulase
Nama zat Absorbansi Rata-rata absorbansi
Sampel 0,674 0,691 0,690 0,685
Kontrol 0,129 0,179 0,099 0,136
Faktor pengenceran (Fp) = 10
Kadar gula reduksi sample => y = 3,017 x
0,685 = 3,017 x
x = 0,2270 mg
Kadar gula reduksi kontrol => y = 3,017 x
0,136 = 2,9576 x
x = 0,0450 mg
Konsentrasi gula reduksi = 0,2270 – 0,0450 = 0,1821 mg
Aktivitas ( U ml) = mg glukosa ×1000
Mr glukosa ×30 menit ×0.1 ml x Fp
= 0,1821 ×1000
180 ×30 menit ×0.1 ml x 10 = 0,337 x 10
= 3,37 U/ml
58
Lampiran 8
Perhitungan Uji Kadar Protein
Nama zat Absorbansi Rata-rata absorbansi
Sampel 0,934 1,284 1,038 1,161
Kontrol 0,221 0,220 0,219 0,220
Y = 4,185 x
( 1,161 – 0,220 ) = 4,185 x
0,941 = 4,185 x
X = 0,2248 mg/ml
59
Lampiran 9
Aktivitas Enzim Selulase yang Digunakan:
Aktivitas Enzim (U/ml) Volume
Enzim (ml)
Aktivitas Total
(aktivitas enzim x volume )
3,37 U/ml
2 6 Unit (pembulatan)
4 12 Unit (pembulatan)
6 18 Unit (pembulatan)
Aktivitas Spesifik
Aktivitas spesifik (U/mg) = Aktivitas Selulase
Kadar Protein
= 3,37/0,224
= 15,04 U/mg
60
Lampiran 10
Penentuan Persen Sakarifikasi Limbah Pengolahan Kertas
Untuk menentukan persen sakarifikasi , harus terlebih dahulu diketahui
kadar gula reduksi (dari kurva standar). Pengukuran kadar gula reduksi ditentukan
berdasarkan metode DNS, yaitu dengan mengambil 1 ml sampel (dari total
volume 5 ml) dari campuran 100 mg limbah pengolahan kertas ,12 U enzim
selulase (4 ml) dan 1 ml buffer sitrat 5,5 yang kemudian ditambahkan ke dalam 3
ml DNS, selanjutnya dipanaskan didalam waterbath selama 5 menit. Setelah itu
didinginkan pada suhu ruangan, Sebagai kontrol yaitu buffer sitrat pH 5,5
ditambah 12 U enzim selulase ( 4 ml) lalu ditambahkan 3ml DNS dan dipanaskan
didalam waterbath selama 5 menit . Perlakuan sampel dan kontrol dilakukan
dalam waktu yang bersamaan. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 540
nm menggunakan spektrofotometer UV Visible (Miller, 1959).
Harga absorbansi yang diperoleh dari sampel dan kontrol, diplotkan pada
kurva standar glukosa untuk mengetahui konsentrasi gula reduksi. Konsentrasi
gula reduksi diperoleh dari selisih plot absorbansi (sampel- kontrol) pada kurva
standar glukosa.
Untuk menentukan persen sakarifikasi dapat dihitung dengan rumus
(Begum& Alimon, 2011) :
Sakarifikasi (%) = Jumlah gula reduksi (mg/ml) x 0,9 x 100
Substrat (mg/ml)
61
Lampiran 11
Metoda Perlakuan Awal Substrat Limbah Pengolahan Kertas
a. Pretreatment substrat
Sebanyak 5 gram substrat limbah pengolahan kertas ditambah 100 ml
NaOH 1N dalam erlenmeyer dibiarkan selama 6, 12, dan 24 jam. Kemudian
larutan disaring menggunakan kain nilon dan dicuci dengan air yang mengalir
hingga pH netral, setelah itu substrat hasil pretreatment dikeringkan selama 12
jam dalam oven suhu 80˚ C. Dari hasil perlakuan, diambil sebanyak 100 mg
substrat limbah pengolahan kertas kemudian dicampur dengan 1 ml larutan buffer
phosfat 0,05 M pH 7 lalu ditambahkan enzim selulase kasar dengan variasi
konsentrasi enzim dengan aktivitas 6,12,18 unit kemudian diinkubasi selama 96
jam pada suhu 50˚ C. Kadar gula reduksi dihitung dengan menggunakan metoda
DNS (Miller, 1959) dan persen (%) sakarifikasi (Begum dan Alimon 2011).
b. Perlakuan substrat tanpa pretreatment
Sebanyak 5 gram substrat limbah pengolahan kertas basah dikeringkan 12
jam dalam oven suhu 80˚C. Dari hasil perlakuan, diambil sebanyak 100 mg
substrat limbah kertas kemudian dicampur dengan 1 ml larutan buffer phosfat
0,05 M pH 7 lalu ditambahkan enzim selulase kasar dengan variasi konsentrasi
enzim dengan aktivitas 6,12,18 unit kemudian diinkubasi selama 96 jam pada
suhu 50˚ C. Kadar gula reduksi dihitung dengan metoda DNS (Miller, 1959) dan
persen (%) sakarifikasi (Begum dan Alimon 2011).
62
Lampiran 12
Hasil uji pendahuluan perlakuan awal subtrat (waktu inkubasi 96 jam, pH 7 suhu
50˚ C):
Substrat ∑ Abs
sampel
∑ Abs
kontrol
Konsentrasi
sampel
Konsentrasi
kontrol
Kadar gula reduksi
(sampel –kontrol)
A 0,685 0,670 0,2269 0,2222 0,0475
B 0,671 0,592 0,2224 0,1962 0,2618
C 0,712 0,632 0,2360 0,2095 0,2652
D 0,79 0,672 0,2618 0,2227 0,3911
E 0,801 0,692 0,2655 0,2294 0,3613
Ket :
A= Untreatment (tanpa penambahan NaOH);
B= Pretreatment 6 jam dengan NaOH;
C= Pretreatment 12 jam dengan NaOH;
D= Pretreatment 24 jam dengan NaOH;
E= Pretreatment 36 jam dengan NaOH
Perlakuan Substrat Persen Sakarifikasi (%)
Untreatment (tanpa penambahan NaOH) 0,2138
Pretreatment 6 jam dengan NaOH 1,1783
Pretreatment 12 jam dengan NaOH 1,1932
Pretreatment 24 jam dengan NaOH 1,76
Pretreatment 36 jam dengan NaOH 1,6258
63
Lampiran 13
Perhitungan Uji Variasi Konsentrasi Substrat
Tabel kadar gula reduksi dan persen (%) sakarifikasi pada uji variasi konsentrasi
substrat (waktu inkubasi 96 jam, pH 5,5 suhu 37˚ C dengan jumlah 4 ml enzim
ditambah 1 ml buffer (Begum dan Alimon, 2011 dengan modifikasi ):
Substrat (mg) ∑ Abs
sampel
∑ Abs
kontrol
Konsentrasi
Sampel
Konsentrasi
Kontrol
Kadar gula reduksi
(sampel –kontrol)
25 0,682 0,680 0,2262 0,2254 0,0077
50 0,687 0,678 0,2276 0,2248 0,0276
100 0,726 0,658 0,2406 0,2181 0,2254
150 0,717 0,659 0,2375 0,2185 0,1900
200 0,696 0,660 0,2306 0,2188 0,1182
Substrat
(mg)
Kadar Gula Reduksi % Sakarifikasi
25 0,0077 0,1392
50 0,0276 0,2486
100 0,2254 1,0143
150 0,1900 0,5701
200 0,1182 0,2660
64
Gambar .Kurva hubungan antara variasi konsentrasi substrat terhadap persen sakarifikasi
0,13920,2486
1,0143
0,5701
0,2660
0,0000
0,2000
0,4000
0,6000
0,8000
1,0000
1,2000
25 50 75 100 125 150 175 200
% S
ak
ari
fik
asi
Substrat (mg)
Hubungan Konsentrasi substrat terhadap % Sakarifikasi
65
Lampiran 14
Perhitungan Uji Variasi Konsentrasi Enzim
Tabel kadar gula reduksi dan persen (%) sakarifikasi pada uji variasi konsentrasi
enzim dengan waktu inkubasi 96 jam, pH 5,5 suhu 37˚ C, substrat 100 mg
(Begum dan Alimon, 2011 dengan modifikasi ):
Enzim (ml) ∑ Abs
sampel
∑ Abs
kontrol
Konsentrasi
Sampel
Konsentrasi
kontrol
Kadar gula reduksi
(sampel –kontrol)
2 0,746 0,661 0,2474 0,2191 0,2828
4 0,795 0,673 0,2634 0,2232 0,4022
6 0,700 0,627 0,2319 0,2079 0,2398
Enzim (ml) Kadar Gula
Reduksi
% Sakarifikasi
2 0,2828 0,7637
4 0,4022 1,8097
6 0,2398 1,5104
Gambar. Kurva hubungan antara variasi konsentrasi enzim terhadap persen sakarifikasi
0,7637
1,8097
1,5104
0,0000
0,5000
1,0000
1,5000
2,0000
6 12 18
sakar
ifik
asi
(%)
enzim (U)
Hubungan variasi konsentrasi enzim terhadap persen
sakarifikasi
66
Lampiran 15
Analisa produk akhir sakarifikasi dengan kromatografi lapis tipis
Perhitungan :
Rf = Jarak titik pusat bercak dari titik awal
Jarak garis depan dari titik awal
Hasil :
Rf Galaktosa = 3,5/8
= 0,43
Rf Sukrosa = 3,1/8
= 0,38
Rf Arabinosa = 3,9/8
= 0,48
Rf Xilosa = 3,5/8
= 0,56
Rf Glukosa = 3,7/8
= 0,46
Rf Maltosa = 2,7/8
= 0,33
Rf Sampel = 2,6/8
= 0,32
67
Lampiran 16
Data Pembanding
1. Sakarifikasi Limbah Pengolahan Kertas dengan Enzim Komersial
Nama : Primafast 200
Aktivitas enzim : 6200 U/ml
Kondisi optimum : pH 4,5-5,5 Temperatur 55-60° C
Waktu
(jam)
∑ Abs
sampel
∑ Abs
kontrol
Konsentrasi
sampel
Konsentrasi
kontrol
Kadar gula reduksi
(sampel –kontrol)
0 jam 0,730 0,7 0,242 0,232 0,0983
24 jam 0,706 0,643 0,234 0,213 0,2088
48 jam 0,732 0,704 0,243 0,233 0,0934
72 jam 0,704 0,684 0,233 0,227 0,0679
96 jam 0,705 0,704 0,234 0,233 0,0033
Waktu
(jam)
Kadar Gula Reduksi (mg/ml) % Sakarifikasi
0 0,0983 0,0973
24 0,2088 0,2067
48 0,0934 0,0924
72 0,0679 0,0673
96 0,0033 0,0033
68
2. Blangko (Substrat + Buffer sitrat pH 5,5)
Waktu (jam) Kadar Gula Reduksi (mg/ml) % Sakarifikasi
0 0 0
24 0 0
0,097
0,207
0,0920,067
0,0030,0
0,1
0,1
0,2
0,2
0,3
0 24 48 72 96
% S
ak
ari
fik
asi
Waktu (Jam)
% Sakarifikasi Enzim Komersil Primafast 200
69
GAMBAR
70
Gambar 10. Autoklaf
Gambar 11. Refrigerated Centrifuge
Gambar 12. Termomixer
Gambar 13. pHmeter
Gambar 14. Timbangan Analitik
Gambar 15. Spektrofotometer UV
Vis
71
Gambar 16.
Substrat limbah pengolahan kertas awal
Gambar 17.
perendaman substrat dengan NaOH
Gambar 18.
Substrat limbah pengolahan kertas hasil
pretreatment
Gambar 19.
Enzim selulase Bacillus sp.BPPT CC
RK2
72
Gambar 20.
Analit berwarna kecoklatan hasil uji
aktivitas selulase dengan larutan DNS
Gambar 21.
Analit berwarna biru hasil analisa
kadar protein
Gambar 22.
Substrat limbah pengolahan kertas+Enzim
selulase Bacillus sp.BPPT
Gambar 23.
Pengembangan sampel dan
pembanding pada kromatografi lapis
tipis