8/8/2019 MBK 1 ders1 giri
1/21
MOLEKLER BYOLOJDEMOLEKLER BYOLOJDEKULLANILAN YNTEMLER IKULLANILAN YNTEMLER I
DERS 1DERS 1
Prof. Dr. Dr. ule ARIProf. Dr. Dr. ule ARIMolekler Biyoloji ve GenetikMolekler Biyoloji ve Genetik
BlmBlm
20052005--20062006
8/8/2019 MBK 1 ders1 giri
2/21
Molekler biyolojiMolekler biyolojiMolekler dzeyde biyolojik olaylar,Molekler dzeyde biyolojik olaylar,
eitli hcresel sistemler arasndakieitli hcresel sistemler arasndakietkileimleri inceleretkileimleri inceler DNA, RNA, proteinlerDNA, RNA, proteinler
Arasndaki ilikiler Arasndaki ilikiler
EtkileimlerEtkileimler Etkileimlerin nasl dzenlendiiEtkileimlerin nasl dzenlendii
alma konulardralma konulardr
8/8/2019 MBK 1 ders1 giri
3/21
Molekler biyologlarMolekler biyologlarGenetikGenetik
BiyokimyaBiyokimyaBiyofizikBiyofizik
tekniklerini kullanrlartekniklerini kullanrlar
Bu farkl disiplinler i iedirBu farkl disiplinler i iedir
8/8/2019 MBK 1 ders1 giri
4/21
Molekler biyolojiMolekler biyoloji -- dierdier
biyolojik bilimler ilikisibiyolojik bilimler ilikisi
genlerproteinler
ilev
Biyokimya
Molekler
biyoloji
Genetik
8/8/2019 MBK 1 ders1 giri
5/21
19501950--1960lar1960larMolekler hcre bileenlerininMolekler hcre bileenlerininTanmlanmasTanmlanmas
zolasyonuzolasyonu
KullanmlarKullanmlar
olas hale gelmitir.olas hale gelmitir.
8/8/2019 MBK 1 ders1 giri
6/21
Molekler hcre bileenleri;Molekler hcre bileenleri;DNADNA genetik bilgi deposugenetik bilgi deposu
RNARNA transkripsiyon, translasyontranskripsiyon, translasyonProteinlerProteinler yapsal ve enzimatikyapsal ve enzimatikbileenlerbileenler
8/8/2019 MBK 1 ders1 giri
7/21
Molekler hcre bileenleriMolekler hcre bileenleri
(DNA,RNA ve Proteinler)(DNA,RNA ve Proteinler) ileilemolekler almalarmolekler almalar
Biyolojik olaylarn mekanizmalarnnBiyolojik olaylarn mekanizmalarnn
anlalmasanlalmasBiyoteknolojiBiyoteknoloji -- TpTp
-- Tarm & HayvanclkTarm & Hayvanclk
-- GdaGda-- evre & Enerjievre & Enerji
8/8/2019 MBK 1 ders1 giri
8/21
Nkleik Asitlerin zolasyonuNkleik Asitlerin zolasyonuYap ve ilevlerinin aydnlatlmasYap ve ilevlerinin aydnlatlmas
Gen anlatmGen anlatm
Gen anlatmnn dzenlenmesiGen anlatmnn dzenlenmesi Genetik mhendisliiGenetik mhendislii
Genomik ve proteomik almalarGenomik ve proteomik almalar
Bu amalar iin ncelikle nkleik asitlerin yksekBu amalar iin ncelikle nkleik asitlerin ykseksaflkta izole edilmeleri gerekirsaflkta izole edilmeleri gerekir
8/8/2019 MBK 1 ders1 giri
9/21
DNA zolasyonuDNA zolasyonu DNA hcrede proteinler, katyonlar yardmylaDNA hcrede proteinler, katyonlar yardmyla
younlam durumda bulunuryounlam durumda bulunur
Proteinlerle ilikisi ilevleri gereidirProteinlerle ilikisi ilevleri gereidir R:R: gen anlatmgen anlatm -- dzenleyici proteinlerdzenleyici proteinler
transkripsiyontranskripsiyon -- RNA polimerazlarRNA polimerazlar
hasar onarmhasar onarm -- DNA polimeraz, DNADNA polimeraz, DNAligazligazbakteriyofajbakteriyofaj -- protein klfprotein klf
8/8/2019 MBK 1 ders1 giri
10/21
DNA saflatrlmasnn temelDNA saflatrlmasnn temel
aamalaraamalar1)1) Hcre eperi ve membranlarnn paralanarak yksekHcre eperi ve membranlarnn paralanarak yksek
molekl arlkl DNAnn serbestletirilmesimolekl arlkl DNAnn serbestletirilmesi2)2) Denatrasyon veya proteoliz yoluyla DNADenatrasyon veya proteoliz yoluyla DNA--proteinprotein
kompleksinin zlmesikompleksinin zlmesi3)3) DNAnn dier molekllerden ayrlmasDNAnn dier molekllerden ayrlmas
alma amacna (klonlama, dizi analizi vb.) balalma amacna (klonlama, dizi analizi vb.) bal
olarakolarak ileri saflatrma yntemlerininileri saflatrma yntemlerinin uygulanmasuygulanmasFarkl DNA molekllerinin (Farkl DNA molekllerinin (kromatografik,kromatografik,spektrofotometrik yntemlerlespektrofotometrik yntemlerle) fraksiyonlandrlmas) fraksiyonlandrlmas
8/8/2019 MBK 1 ders1 giri
11/21
Prokaryotik DNA zolasyonuProkaryotik DNA zolasyonu
Bakteri DNAs asal (Bakteri DNAs asal (kromozomalkromozomal) ya da) ya daekstrakromozomalekstrakromozomal (plazmit,bakteriyofaj)(plazmit,bakteriyofaj)oluuna bal olarak farkl yntemlerleoluuna bal olarak farkl yntemlerleizole edilirizole edilir
8/8/2019 MBK 1 ders1 giri
12/21
Prokaryotik kromozomal DNAProkaryotik kromozomal DNA
zolasyonuzolasyonuAAMA 1AAMA 1Hcre duvarnn zayflatlmas:Hcre duvarnn zayflatlmas:
Fiziksel yntem: dondurupFiziksel yntem: dondurup--zmezmeKimyasal yntem: lizozim uygulamasKimyasal yntem: lizozim uygulamaskelatr (kelatr (EDTAEDTA))kullanmkullanm
Lizozim:Lizozim: Kelatr:Kelatr: metalmetaliyonlarnniyonlarnnbalanmasn artrarakbalanmasn artrarakkelmeyi hzlandrankelmeyi hzlandrankimyasal ajanlarkimyasal ajanlar
8/8/2019 MBK 1 ders1 giri
13/21
Prokaryotik kromozomal DNAProkaryotik kromozomal DNA
zolasyonuzolasyonuAAMA 2AAMA 2
Hcre zarnn paralanmas:Hcre zarnn paralanmas:
1.1. Fiziksel yntemler:Fiziksel yntemler: HomojenizasyonHomojenizasyon
UltrasonikasyonUltrasonikasyon
Ozmotik okOzmotik ok
8/8/2019 MBK 1 ders1 giri
14/21
Prokaryotik kromozomal DNAProkaryotik kromozomal DNA
zolasyonuzolasyonuAAMA 3AAMA 3
Hcre zarnn paralanmas:Hcre zarnn paralanmas:
2.2. Kimyasal yntemler:Kimyasal yntemler: Deterjan kullanmDeterjan kullanm SDSSDS (sodyum dodesil(sodyum dodesil
slfat)slfat) SDS pH ve uygun iyonSDS pH ve uygun iyonkonsantrasyonunda lipoproteinlerle birleir,konsantrasyonunda lipoproteinlerle birleir,
membranlarn lipoprotein ksmlarn sudamembranlarn lipoprotein ksmlarn sudaznr hale getirirznr hale getirirHCRE PARALANIR (HCRE PARALANIR (LZZLZZ))
8/8/2019 MBK 1 ders1 giri
15/21
Prokaryotik kromozomal DNAProkaryotik kromozomal DNA
zolasyonuzolasyonuAAMA 4AAMA 4
RNAnn paralanmas iinRNAnn paralanmas iin RNAazRNAaz
Proteinlerin paralanmas iinProteinlerin paralanmas iin ProteazlarProteazlarKalan proteinler ve oligopeptitler iinKalan proteinler ve oligopeptitler iin fenolfenol--
kloroform ekstraksiyonukloroform ekstraksiyonu
8/8/2019 MBK 1 ders1 giri
16/21
Prokaryotik kromozomal DNAProkaryotik kromozomal DNA
zolasyonuzolasyonuAAMA 5AAMA 5
DNA ieren fazn alkolle (Etanol) ktrlmesiDNA ieren fazn alkolle (Etanol) ktrlmesi
DNA gzle grlebilir, camDNA gzle grlebilir, cam
ubua sarlr !!!ubua sarlr !!!
8/8/2019 MBK 1 ders1 giri
17/21
Prokaryotik kromozomal DNAProkaryotik kromozomal DNA
zolasyonuzolasyonuleri saflatrmalarleri saflatrmalar
Diyaliz ile kalntlarn uzaklatrlmasDiyaliz ile kalntlarn uzaklatrlmas
CsClCsCl22 derecelenme santrifgasyonuderecelenme santrifgasyonu
Kromatografik ayrmKromatografik ayrm
8/8/2019 MBK 1 ders1 giri
18/21
Ekstrakromozomal DNAEkstrakromozomal DNA
zolasyonuzolasyonuKromozomal DNA uzaklatrlr !!!Kromozomal DNA uzaklatrlr !!!
Bakteriyofaj DNAs izolasyonu:Bakteriyofaj DNAs izolasyonu:
1.1. nfekte olmu bakteriden fajnfekte olmu bakteriden fajpartikllerinin izolasyonu ilepartikllerinin izolasyonu ilekromozomal DNAnn eliminasyonukromozomal DNAnn eliminasyonu
2.2. Proteaz ve/veya fenol uygulamasProteaz ve/veya fenol uygulamas3.3. leri saflatrmalarleri saflatrmalar
8/8/2019 MBK 1 ders1 giri
19/21
Ekstrakromozomal DNAEkstrakromozomal DNA
zolasyonuzolasyonuPlazmit DNAs izolasyonu:Plazmit DNAs izolasyonu:Kromozomal DNA izolasyonuna benzer !Kromozomal DNA izolasyonuna benzer !
1.1. ((Hcre eperi ve membranlarnnHcre eperi ve membranlarnnparalanarak yksek molekl arlklparalanarak yksek molekl arlklDNAnn serbestletirilmesiDNAnn serbestletirilmesi)) veve
2.2. ((Denatrasyon veya proteoliz yoluylaDenatrasyon veya proteoliz yoluylaDNADNA--protein kompleksinin zlmesiprotein kompleksinin zlmesi))aamalaraamalar ayndr.ayndr.
8/8/2019 MBK 1 ders1 giri
20/21
Ekstrakromozomal DNAEkstrakromozomal DNA
zolasyonuzolasyonuPlazmit DNAs izolasyonu:Plazmit DNAs izolasyonu:FARK;FARK; kromozomal ve plazmit DNAskromozomal ve plazmit DNAs
konfigrasyonlarnn fark nedeniyledir.konfigrasyonlarnn fark nedeniyledir.Plazmit DNAs:Plazmit DNAs: halkasal ve sper dnmldr.halkasal ve sper dnmldr.
Kromozomal ve plazmit DNAlarnnKromozomal ve plazmit DNAlarnndenatrasyonlarn (yksek scaklk, pH gibi)denatrasyonlarn (yksek scaklk, pH gibi)
takiben renatrasyon srelerinin farklartakiben renatrasyon srelerinin farklarayrma iin kullanlr.ayrma iin kullanlr.R:R: pH 12pH 12--12.5 plazmit DNAs denatre olmaz12.5 plazmit DNAs denatre olmaz
8/8/2019 MBK 1 ders1 giri
21/21
Plazmit DNAsPlazmit DNAs