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Estudio de las actividades analgésica e inhibitoria de los efectos tóxicos
del veneno de Bothrops asper por extractos y compuestos aislados de
Renealmia alpinia silvestre.
Isabel Cristina Gómez Betancur
Tesis presentada para optar al título de Doctorado en Ciencias Farmacéuticas y
Alimentarias
Tutora
Dora María Benjumea Gutiérrez. PhD
Profesora Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias
Universidad de Antioquia
Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias
Medellín, 2015
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Agradecimientos
A Dios, por su infinito amor, por fortalecer mi corazón e iluminar mi mente y por haber puesto en
mi camino a aquellas personas que han sido mi soporte y compañía durante todo el período de estudio.
A mis padres Duván y Amanda y mis hermanos Lina, Martha y Duván, por su amor y su compañía
siempre tan oportuna. A mi abuela y madrina Ofelia quien se marchó mientras realizaba mi
pasantía. A mi esposo Mauricio, por apoyarme y animarme siempre, por su comprensión y su amor y por no desfallecer a pesar del tiempo y la distancia, a nuestro hijo Emmanuel por ser el tesoro y
la luz al final de todo este proceso.
A COLCIENCIAS, por la beca recibida durante el período 2012-2015, para la realización de la
presente Tesis Doctoral.
Al CODI (Proyecto CIQF-139), por los fondos destinados a financiar esta tesis y a la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias de la Universidad de Antioquia, por apoyarme durante este
período de formación.
Al comité tutorial, encabezado por la Doctora Dora María Benjumea, por sus buenos consejos y la
confianza depositada en mí, a la Doctora Vitelbina Núñez, por su ejemplo, por sus enseñanzas y
por creer en mí, al doctor Edison Osorio por su disposición y paciencia, a la Doctora Katalina
Muñoz por sus valiosas orientaciones.
Al Serpentario, Programa de Ofidismo/Escorpionismo de la Universidad de Antioquia, por su
invaluable apoyo durante mi formación. A los Profesores del Programa de
Ofidismo/Escorpionismo, y a los compañeros del laboratorio por su ayuda, sus consejos, pero en
especial por su amistad.
A los Doctores Isabel Bazzochi y Antonio Jiménez del Instituto Universitario de Bio-Orgánica Antonio González (IUBO), de la Universidad de La Laguna (España) y a los Doctores Stephen
Cutler y Francisco León del Departamento de Ciencias Biomoleculares de la Universidad de
Mississippi -Olemiss- (Estados Unidos de América), por haberme acogido en sus laboratorios
durante mi pasantía.
A la Doctora Nora Jiménez y Natalie Charlotte del laboratorio de Investigación en Sustancias Bioactivas (GISB), por su colaboración en el desarrollo del estudio Fitoquímico, de corazón
gracias por los buenos momentos compartidos durante mi permanencia en el laboratorio.
¡Mi sentimiento de eterna gratitud a todos aquellos que hicieron posible la realización del
presente trabajo!
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Tabla de Contenido Páginas
Índice de tablas………………………………………………………..……………… 5
Índice de figuras ……………………………………………………………………... 6
1. Introducción ………………………………………………………………… 10
1.1 Accidente ofídico ………………………………………………………….11
1.2 Uso de plantas medicinales para el tratamiento del accidente ofídico…….15
1.3 Renealmia alpinia y su uso en medicina tradicional……………………....17
2. Hipótesis y Objetivos ………………………………………………….……. 22
3. Estudio dirigido a la búsqueda de compuestos fenólicos de Renealmia alpinia 25
3.1 Materiales y Métodos…………………………………………………...…26
3.2 Técnicas cromatográficas ……………………………………………..…..26
3.3 Técnicas experimentales ………………………………………………….30
3.4 Metabolitos aislados de Renealmia alpinia ………..……………………..31
3.5 Resultados y discusión …………………………………………………....34
4. Estudio Farmacológico …………………………………………………….. 46
4.1 Animales de experimentación …………………………………………….47
4.2 Venenos …………………………………………………………………..48
4.3 Evaluación de la actividad Citotóxica de compuestos aislados de Renealmia
alpinia…………………………………………………………………….49
4.4 Evaluación de la Toxicidad aguda de compuestos aislados de Renealmia
alpinia…………………………………………………………………….52
4.5 Inhibición de los efectos tóxicos del veneno de Bothrops asper por el extracto y
compuestos aislados de Renealmia alpinia………………………………..60
4
4.6 Estudio de Fluorescencia intrínseca y ultravioleta (UV)…………..……..79
4.7 Estudios de acoplamiento molecular (Docking molecular)……………....80
4.8 Ensayos de analgesia …………………………………………………….83
4.9 Análisis estadístico ……………………………………………………….92
Conclusiones ………………………………………………………………………. 93
Perspectivas….…………………………………………………………………….. 95
Referencias bibliográficas …………………………………………………………96
Anexos ……………………………………………………………………………. 108
Anexo A: Espectros de los compuestos aislados de Renealmia alpinia ………...109
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Índice de tablas Página
Tabla N°1 Nombres comunes de R. alpinia ……………………………………………… 17
Tabla N°2 Otros usos populares de R. alpinia según diferentes países …………………… 19
Tabla N°3 Rendimiento de las fracciones obtenidas de Renealmia alpinia ……………….. 33
Tabla N°4 Datos de RMN-1H, RMN-13C, HSQC y HMBC (300 MHz) de F-1 ………....…35
Tabla N°5 Datos de RMN-1H, RMN-13C, HSQC y HMBC (300 MHz) de F-2 ………….…36
Tabla N°6 Datos de RMN-1H, RMN-13C, HSQC y HMBC (300 MHz) de F-3 ………….…37
Tabla N°7 Datos de RMN-1H, RMN-13C, HSQC y HMBC (300 MHz) de F-4 ..…………..38
Tabla N°8 Datos de RMN-1H, RMN-13C, HSQC y HMBC (500 MHz) de F-5 ……………40
Tabla N°9 Datos de RMN-1H, RMN-13C, HSQC y HMBC (300 MHz) de D-1 ....................41
Tabla N°10 Datos de RMN-1H, RMN-13C, HSQC y HMBC (500 MHz) de D-2 …………..42
Tabla N°11 Datos de RMN-1H, RMN-13C, HSQC y HMBC (500 MHz) de K-1………….. 43
Tabla N°12 Datos de RMN-1H, RMN-13C, HSQC y HMBC (400 MHz) de 3,5- β-Sitosteryl β-D-
glucoside…………………………………………………………………………………….….44
Tabla N°13 Algunas características de los compuestos en estudio, aislados de R. alpinia .…52
Tabla N°14 Toxicidad aguda. Respuesta a la muestra administrada ……………………. 55
Tabla N°15 Toxicidad aguda. Determinación de las condiciones generales ……………….56
Tabla N°16 Registro del peso corporal de los animales de experimentación ……………….57
Tabla N°17 Porcentaje de inhibición del efecto hemorrágico …………………………….. 68
Tabla N°18 Ensayo. Receptores de canabinoides (CB1 y CB2) y opioides (δ, κ, y μ)…… 85
Tabla N°19 Actividad analgésica …………………………………………..………..89
Tabla N°20 Actividad analgésica ……………………..…………………………….90
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Índice de figuras Página
Figura N° 1 Distribución de algunas especies de serpientes del género Bothrops ………… 13
Figura N° 2 Actividad catalítica de las PLA2……………………………………………… 14
Figura N° 3 Cromatografía en columna preparativa………………………………………... 28
Figura N° 4 Cromatografía circular preparativa (Cromatotrón) …………………………… 29
Figura N° 5 Equipo para Cromatografía en Capa Delgada de Alta Definición (HPTLC) ….30
Figura N° 6 (F-1), 5-hydroxy-7-methoxyflavanone (Pinostrobin) ………………………… 34
Figura N° 7 (F-2) 2',6'-Dihydroxy-4'-methoxychalcone (Pinostrobin-Chalcona) ………… 36
Figura N° 8 (F-3) Sakuranetin (Naringenin 7-methyl ether) ……………………………….37
Figura N° 9 (F-4) Naringenin 7,4'-dimethylether (Sakuranetin 4'-methyleter) …………… 38
Figura N° 10 (F-5) 3'4',5-Trihydroxy-7-methoxyflavanone (Sterubin) ……………………39
Figura N° 11 (D-1) 5-Heptanediol, 1,7-diphenyl (Yashabushidiol) ……………………… 41
Figura N° 12 (D-2) 1-(4-Hydroxyphenyl)-7-phenyl-(4E)-4-hepten-3-one …………….…..42
Figura N° 13 4-methoxy-6-[(E)-2-phenylethenyl]-2H-pyran-2-one (Desmethoxyyangonin) 43
Figura N° 14 3,5- β-Sitosteryl β-D- glucoside ……..………………………………………. 44
Figura N° 15 Citotoxicidad en células C2C12 de 6 compuestos aislados ……..…………..50
Figura N° 16 Citotoxicidad en células J-774 de 6 compuestos aislados ……………………. 51
Figura N° 17 Ganancia de peso corporal de los animales de experimentación tratados ….…58
Figura N° 18 Observaciones macroscópicas realizadas después del sacrifico de los animales. 59
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Índice de figuras Página
Figura N° 19 Inhibición del efecto proteolítico inducido por el veneno de B. asper ………..62
Figura N° 20 Inhibición del efecto de coagulación inducida por el veneno de B. asper ……..64
Figura N° 21 Inhibición del efecto hemolítico indirecto inducido por el veneno de B. asper ..66
Figura N° 22 Inhibición de la actividad enzimática de la PLA2. …………………………….. 71
Figura N° 23 Inhibición de la miotoxicidad inducida por PLA2 ……………………………… 74
Figura N° 24 Inhibición de la formación de edema de la PLA2 por pinostrobin. …......……… 76
Figura N° 25 Inhibición de la actividad anticoagulante de la PLA2 por pinostrobin. …..78
Figura N° 26 Estudios de fluorescencia intrinseca y UV ……………………………………… 80
Figura N° 27 Resultados del docking molecular ………………………………………………. 82
Figura N° 28 Porcentaje de inhibición del dolor inducido por fenilquinona ………………….. 91
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RESUMEN
Históricamente los productos naturales han jugado un papel fundamental en el desarrollo de
nuevos fármacos (Cordell & Colvard, 2012). Esto se hace evidente en la cantidad de
fármacos de origen natural y derivados sintéticos que actualmente se usan en la práctica
clínica, tales como ciclosporina1 (Kingston, 2011).
Los recursos naturales empleados tradicionalmente por el hombre, constituyen una fuente
inagotable de conocimiento que nos invita a la búsqueda de moléculas con actividad
biológica para el tratamiento de diversos problemas de salud. Principalmente en países en
vía de desarrollo, donde existen diversas enfermedades tropicales desatendidas por los
gobiernos, entre las cuales, se encuentra el accidente ofídico.
Las mordeduras causadas por serpientes representan un gran problema para la salud pública
en áreas tropicales y subtropicales del mundo (Mebs, 2002) e incluso, superan en algunos
casos el número de muertes ocasionadas por enfermedades como fiebre hemorrágica del
dengue, cólera, leishmaniosis y enfermedad de Chagas (Williams et al, 2010).
En Colombia, anualmente se producen cerca de 4000 mordeduras por serpientes con altas
tasas de morbimortalidad. Resulta interesante saber que un gran porcentaje de dichas
mordeduras son inicialmente tratadas empleando la medicina tradicional, situación que no
es solo característica de nuestro país, sino de otros, donde las plantas medicinales han sido
utilizadas para tratar este tipo de envenenamientos; lo cual ha sido demostrado en 700
plantas de diferentes familias con pruebas básicas de laboratorio, donde se manifiesta la
capacidad inhibitoria sobre el veneno completo o toxinas aisladas de algunas serpientes
(Reyes-Chilpa et al, 1994; Borges et al, 2001; Núñez et al, 2005)
El propósito de esta tesis es contribuir al conocimiento fitoquímico y farmacológico de la
especie vegetal Renealmia alpinia (“matandrea”), como posible coadyuvante en el
1 Péptido producido por el hongo Tolypocladium inflatum, usado en trasplantes, Artemisina, lactona sesquiterpénica usada en el tratamiento de la malaria; Paclitaxel, compuesto antitumoral aislado de Taxus brevifolia.
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tratamiento del accidente ofídico, para ello se realizó la evaluación de la actividad
analgésica y la inhibición de los efectos tóxicos del veneno de Bothrops asper (“mapaná”)
por los extractos y compuestos aislados de hojas de R. alpinia, obtenida de la flora silvestre
en Antioquia, Colombia.
La tesis comienza con una introducción donde se describe la problemática del accidente
ofídico, el uso de las plantas medicinales en el tratamiento del dolor y las mordeduras por
serpientes, continuando con una descripción de los componentes del veneno de B. asper.
Posteriormente se describen los objetivos de la tesis. Los siguientes capítulos contienen el
estudio fitoquímico de R alpinia, los estudios de seguridad de los compuestos aislados.
Posterior a esto se encuentra el capítulo de evaluación de las actividades inhibitorias del
veneno de B. asper y finalmente la evaluación de la actividad analgésica; para terminar con
las conclusiones, perspectivas y las referencias bibliográficas.
10
Introducción
Bothrops asper
Renealmia alpinia
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1. INTRODUCCIÓN
1.1 Accidente ofídico
El accidente ofídico es una intoxicación producida por la inoculación de veneno a través de
la mordedura de una serpiente; éste es un grave problema de salud pública en áreas
tropicales y subtropicales del mundo (Mebs, 2002), pues se producen aproximadamente
5’500.000 accidentes/año, con síntomas de envenenamiento en más de la mitad de las
mordeduras y una tasa de letalidad que puede ser superior al 2% (Pineda & Rengifo, 2002;
Stock et al., 2007); de estos, ocurren en Latinoamérica cerca de 150.000
envenenamientos/año, con una letalidad superior al 3%. En Colombia, se presentaron de
4.400 mordeduras/año, la incidencia de accidente ofídico en el país es de 9,01 casos por
100.000 habitantes; (INS, 2014).
El tratamiento efectivo, aceptado y conocido desde hace más de 120 años, es la administración
del antiveneno, la cual es prioritaria, pues el retraso en la atención inicial puede disminuir
las oportunidades de supervivencia. Sin embargo, la poca producción y distribución de
antivenenos eficaces y a la vez asequibles por la comunidad en cualquier centro de salud, no
evita las secuelas físicas o psicológicas permanentes.
En los países del trópico, la cultura ancestral promueve la realización de otro tipo de
prácticas no médicas, como la utilización de hierbas, incisiones, succión o ligadura que en
ocasiones pueden resultar en alteraciones del cuadro clínico, infección, gangrena o edema,
lo que puede empeorar el pronóstico (Phillips et al 1988; Warrell 1995).
En años anteriores, en Colombia, el suero antiofídico polivalente se adicionó al listado de
Medicamentos Vitales No Disponibles, del Instituto Nacional de Vigilancia de
Medicamentos y Alimentos –INVIMA– (INVIMA, 2011); pero solo permanecen en el
listado los sueros antielapídicos (corales (Micrurus) y la serpiente marina (Pelamis
12
platurus)) (INVIMA, 2013) y se producen y comercializan el suero polivalente y el suero
monovalente antibotrópico (INS, 2011).
La importancia del accidente ofídico para el sistema de vigilancia en salud pública es alta,
porque las características socioculturales y demográficas de Colombia hacen que la
susceptibilidad de la población aumente, tanto en la presentación de eventos mórbidos
como mortales, las cuales, pueden ser evitables con la instauración de tratamiento oportuno
y eficaz. En Colombia, el suministro del antiveneno y la atención de los pacientes con
ofidiotoxicosis son obligatorios, por lo que se debe garantizar el personal técnico necesario
para realizar las actividades de prevención y control desde el nivel municipal al
departamental y la consecución de suero antiofídico.
Los principales géneros de serpientes que afectan a los humanos en Colombia son Bothrops
y Portidium, además se incluyen géneros como Bothriechis y Lachesis, las manifestaciones
clínicas de los accidentes son similares, causando efectos, incluyendo edema, hemorragia
local, formación de ampollas, dermonecrosis, y mionecrosis, coagulopatia y diátesis
hemorrágicas, entre otras (Pereira et al, 2004).
Los envenenamientos por la serpiente Bothrops asper se caracterizan por presentar
alteraciones locales conspicuas en el lugar donde el veneno es inyectado, incluyendo
edema, hemorragia local, formación de ampollas, dermonecrosis y mionecrosis. En casos
severos, signos y síntomas de envenenamiento sistémico incluyen desfibrinogenación,
hipoagregación plaquetaria, trombocitopenia, hemorragia sistémica, coagulación
intravascular diseminada, shock cardiovascular e insuficiencia renal aguda. La muerte
puede ser el resultado de la hipotensión secundaria a hipovolemia, insuficiencia renal, o de
la hemorragia intracraneal (Saborıo et al 1998).
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Figura 1: Distribución de algunas especies de serpientes del género Bothrops (asper y atrox) en
América Central y del Sur. Mapa físico de Centroamérica y el norte, América del Sur destaca la
distribución geográfica de B. asper (puntos), B. atrox (gris), y B. colombiensis (blanco y amarillo).
(Campbell y Lamar, 2004)
B. asper se distribuye ampliamente en las tierras bajas húmedas. Se encuentra en la isla de
Trinidad; en México y América Central, en altitudes de hasta 1500 m, mientras que en
América del Sur se encuentra hasta 2500 m (Campbell y Lamar, 2004). La distribución de
B. asper en el Caribe se extiende continuamente a lo largo de la costa del Golfo de México,
la Península de Yucatán, Centroamérica, Panamá, la costa del Caribe, a través de los valles
interandinos de Colombia, y desde allí hacia el este a través del norte y centro de
Venezuela. En el Pacífico, la distribución de de B. asper incluye la región central y sur de
Costa Rica, a través de Panamá, continuando por el oeste de Colombia, el norte de Ecuador
y el extremo nororiental de Perú. En la figura 1 se observa la distribución de especies del
género Bothrops (asper y atrox).
Los venenos de serpiente son secreciones producidas por las glándulas exocrinas
especializadas que contienen una mezcla compleja de proteínas tóxicas que contribuyen a
someter, matar y/o digerir la presa (Fry et al., 2006; Vonk et al., 2008). Las toxinas del
veneno probablemente evolucionaron a partir de un conjunto reducido de proteínas con
funciones fisiológicas normales que fueron reclutadas en el proteoma del veneno antes de
que se diera la diversificación de las serpientes avanzadas (Fry and Wüster, 2004; Fry,
2005). Las toxinas de la familia Viperidae se pueden agrupar en unas pocas familias de
14
proteínas, incluyendo enzimas (serin proteasas, metaloproteinasas, L-amino acido oxidasas,
Fosfolipasas del grupo II) y proteínas sin actividad enzimática (desintegrinas, moléculas de
tipo C-lectina, péptidos potenciadores de bradiquinina, miotoxinas, proteínas secretoras
ricas en cisteína) (Calvete et al., 2007). Las fosfolipasas A2, son las toxinas más abundantes
en el veneno de B. asper, por lo tanto son las responsables de muchos de los efectos de
mayor relevancia.
Las fosfolipasas A2 son enzimas, que catalizan la hidrolisis de glicerofosfolípidos en la
posición sn-2 (Kini, 2003) (Figura 2). Son enzimas de amplia distribución en la naturaleza,
su clasificación se ha basado en su secuencia, masa molecular, patrones de puentes
disulfuro y requerimiento de Ca 2+
.
Figura 2. Actividad catalítica de las PLA2. Los glicerofosfolípidos (izquierda) son hidrolizados en
la posición sn-2 para producir un ácido graso libre y un lisofosfolípido (tomado de Fernandez
Maritza, Aislamiento de una fosfolipasa A2 homóloga del veneno de la serpiente Bothrops asper:
caracterización bioquímica y biológica, tesis de Maestria, Universidad de Antioquia, 2013).
Las acciones de las fosfolipasas A2 incluyen la desestabilización de la membrana, produce
pérdida del control de la permeabilidad, produciéndose un influjo de calcio, y en
consecuencia hay un daño en el gradiente electroquímico que existe en dicha membrana.
Además, conlleva a la salida del contenido citoplasmático, como las enzimas
PLA2
+ R2COOH
Lisofosfolípido Ácido graso
15
deshidrogenasa láctica (LDH) y creatina kinasa (CK) (Gutiérrez y Ownby, 2003). El
incremento del calcio citosólico pone en marcha una serie de procesos degenerativos tales
como: hipercontracción de miofilamentos, alteraciones mitocondriales, activación de
calpaínas (proteínas intracelulares dependientes de calcio) y de fosfolipasas A2
intracelulares, así como desregulación de diversas vías metabólicas. Como consecuencia de
estos procesos, las células se lesionan irreversiblemente en un proceso de muerte celular
necrótica (Lomonte et al., 1994, Kini., et al, 2003).
1.2 Uso de plantas medicinales para el tratamiento del accidente ofídico.
El gran número de accidentes ofídicos en zonas rurales, en las que es habitual el uso de
técnicas de medicina tradicional, ha promovido la utilización de éstas, como elección
inicial, en el tratamiento de los envenenamientos por serpientes, estas medidas tradicionales
se emplean aproximadamente en el 80% de la población mundial (Alam & Gomes, 2003;
Chopra et al., 1956; Kirtikar & Basu, 1975; Lewis & Elvin-Lewis, 1977; Nadkarni, 1976;
Oliveira et al., 2005). En Colombia se ha reportado que cerca del 30% de las víctimas de
mordedura de serpiente utilizan algún tipo de práctica no médica en el momento del
accidente, siendo frecuente el empleo de plantas medicinales (Abadía, 1977; Fonnegra &
Roldan, 1994; INS, 2012; Otero et al, 2001). En un estudio realizado por Otero et al. (2000
a), con diferentes comunidades rurales de los departamentos de Antioquia y Chocó en
Colombia, se colectaron un total de 75 plantas utilizadas por los chamanes de cada región
para el tratamiento de los envenenamientos causados por serpientes, se prepararon extractos
acuosos o etanólicos, y de éstas, cerca del 50% mostraron neutralización (moderada o alta)
del efecto hemorrágico inducido por el veneno de B. asper, y un 16% de ellas, inhibieron el
efecto letal del veneno (Otero et al, 2000b, c).
Estudios etnobotánicos del uso de plantas para el tratamiento de la mordedura de serpiente,
han mostrado interesantes resultados y en consecuencia, es posible contar con un número
16
importante de plantas de diferentes familias, potencialmente inhibidoras de los efectos
tóxicos del veneno de B. asper (Castro et al,. 1999; Melo et al., 1994; Mors et al., 1989;
Núñez et al., 2005; Reyes-Chilpa et al., 1994); actividad que puede ser atribuida a la
presencia de principios activos propios de algunas plantas como 4-nerolidylcatechol y
Edunol (Núñez et al., 2005; Reyes-Chilpa et al., 1994), así como también los flavonoides,
que pueden quelar los átomos de zinc, requeridos por las metaloproteinasas del veneno de
las serpientes y que son las responsables de la actividad hemorrágica del veneno (Castro et
al., 1999).
De igual manera, diversas investigaciones han reportado la presencia de actividad anti-
hemorrágica, anti-letal, anti-desfibrinante y anti-miotóxica de los extractos de Eclipta
prostrata y el componente cumestano wedelolactona, que inhibe en pruebas in vitro el
efecto hemorrágico del veneno de Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu y Lachesis
muta (Melo & Ownby, 1999), e inhibe los efectos letal y miotóxico de la especie Crotalus
durissus terrificus (Melo et al., 1994; Mors et al., 1989).
Renealmia alpinia (Rottb.) Maas, ha sido usada tradicionalmente para el tratamiento de la
mordedura de serpiente por los indígenas de las tribus Emberá-Katíos, pertenecientes a las
regiones de Antioquia y Chocó, en Colombia (Otero et al., 2000a).
Por lo anterior, el Programa Ofidismo/Escorpionismo de la Universidad de Antioquia se ha
interesado en profundizar en el estudio de esta especie botánica, con el fin de buscar una
alternativa terapéutica para el tratamiento por la mordedura de serpiente. En el año 2001 se
confirmó que R. alpinia tiene efectos anti-edematizantes, anti-hemorrágicos y
neutralizantes del veneno de Bothrops asper (mapaná, equis), tanto en modelos in vitro
como in vivo, constituyéndose en una potencial fuente de moléculas con importancia
farmacéutica (Otero, et al, 2000b, c; Núñez, et al, 2004).
Posteriormente, por fraccionamiento cromatográfico se estudiaron diferentes extractos
obtenidos con solventes de polaridad creciente, con el objeto de encontrar la fracción
responsable de la inhibición de los efectos tóxicos del veneno; además se logró comprobar,
17
en animales de experimentación, que R. alpinia posee actividad analgésica, lo cual podría
contribuir con el alivio del dolor que se produce durante una mordedura (Patiño A, et al.,
2012).
1.3 Renealmia alpinia (Rottb.) Maas, 1975: Pertenece a la familia Zingiberaceae,
caracterizada por tener especies botánicas de gran importancia farmacológica y alimenticia,
como el jengibre (Zingiber officinale) y el cardamomo (Elettaria cardamomum) que hacen
pensar en la riqueza que puede tener esta especie botánica; sin mencionar su gran belleza
que la destaca entre muchas, para usos ornamentales.
1.3.1 Nombres comunes y sinónimos
Sinónimos: Amomum alpinia Rottb. (Catálogo plantas vasculares de Antioquia)
Nombre comunes: Renealmia alpinia es conocida popularmente en Colombia con los
nombres de “guaiporé”, “matandrea”, “achira de monte”. Otros nombres comunes en
diferentes latitudes, según el idioma o la lengua, son: “huevos de sapo”, “sarandango”,
“abebe” (español), “haimonor” (huitoto), “conoba” (miraña), “mubai-kurugameku”
(muiname) (López, et al, 2007). En la tabla 1 se relacionan nombres comunes de Renealmia
alpinia usados en el Neotrópico.
Tabla Nº 1: Nombres comunes de R. alpinia según lengua o idioma, usados en el neotrópico
(Macía, 2003)
Nombre común País Referencia
Cardamomo Puebla (México) Villalobos y Contreras (1994)
Guaiporé (Curripaco) Colombia Acero (1979)
Ixquihit (nahua) Puebla (México) Martínez, Alfaro & al. (1995)
Mardigra Trinidad y Tobago Lans and Brown (1998)
Jazmín de monte Guatemala Standley & Steyermark (1952)
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Naiku (tikuna) Colombia Acero (1979)
Pintura negra Colombia Acero (1979)
Sictia (tukano) Colombia Acero (1979)
Sieunka (puinave) Colombia Acero (1979)
X'quijit (totonaco) Puebla (México) Villalobos y Contreras (1994)
Mususi Venezuela Gomez, 2002
1.3.2 Distribución geográfica y altitudinal
R. alpinia, es típica de bosques tropicales húmedos de tierras bajas (Villalobos C.G, 1994,
Standley and Steyermark, 1952, Acero, L.E.1979). Se distribuye desde México hasta Perú y
Brasil pasando por las Antillas, Guyana Francesa, Guyana, Surinam y Venezuela. Se
encuentra desde 50m hasta 900 m de altitud (Maas y Maas, 2007).
En Colombia, se encuentra en los departamentos de Antioquia y Chocó. Específicamente en
Antioquia, se ha encontrado en la región oriental, en los municipios de San Luis, San
Carlos y San Rafael. También ha sido reportada hacia el sur de país en Caquetá, Putumayo,
Guaviare y Amazonas, así como en los llanos Orientales.
1.3.3 Taxonomía y Descripción botánica
Planta herbácea de unos 2-6 m de alto, gregaria, de hojas simples, alternas, sin estipulas,
largo-lanceoladas, hasta 110 cm de longitud y 11 cm de ancho, nervadura paralela, vaina de
la hoja abierta, con lígula. Con inflorescencia racemosa, basal, 20-50 cm de longitud;
brácteas de la inflorescencia rosado-rojizas, raquis pardo-rojizo; flor tubular, amarilla o
rojiza. Fruto en cápsula, rojo cuando está inmaduro, negro al madurar, ovoide, 3-4 cm de
largo y 1.5-2 cm de diámetro, con numerosas semillas embebidas en una pulpa amarilla
(López, et al, 2007).
19
1.3.4 Usos populares
R. alpinia ha sido usada por los indígenas del Chocó contra la mordedura de serpiente del
genero Bothrops (Otero, et al, 2000a); así mismo, en medicina tradicional R. alpinia ha sido
apreciablemente utilizada como febrífugo (antifebril, antipirético) y antiemético, para tratar
heridas y úlceras malignas (Martínez, 1995); además en Surinam es usada para la epilepsia
(Ruysschaert S. et al, 2009).
También es utilizada tradicionalmente para infecciones fúngicas (Ficker, C.E, 2003), para
la preparación de aceites a partir de semillas, como comestible (arilo de las semillas), contra
náuseas y vómitos (Ruysschaert S. et al, 2009); incluso algunas de sus partes, como los
trozos de las vainas foliares, son agregadas a los huecos de siembra de algunos cultivos
como el maíz, para evitar que sean comidas por roedores y aves (Macía, 2003). Así mismo,
la decocción de sus tallos, sus raíces o bien de la planta completa, es empleada para el
tratamiento de infecciones vaginales y para aliviar afecciones digestivas como la
indigestión (acción carminativa), la acidez y el dolor estomacal (COE, F.G, 2008).
Es una especie ornamental apreciada por sus inflorescencias rojo amarillentas y sus frutos
rojo-escarlata muy llamativos; la planta macerada y mezclada con agua se frota sobre el
cuerpo de los perros para mejorar su habilidad en la caza (López C et al.,2006) ,
igualmente, entre los usos etno-veterinarios, se encuentra que R. alpinia es usada en
Trinidad y Tobago para el tratamiento de los parásitos de gallinas y patos (Lans and
Browm, 1998) y contra la mordedura de serpiente en perros (Lans et al, 2001). La tabla N°2
muestra otros usos populares dados a esta especie botánica:
Tabla Nº 2. Otros usos populares de R. alpinia según diferentes países (Gómez-Betancur I &
Benjumea D, 2014)
País Parte usada Forma de uso y aplicación Referencias
Colombia Hojas y tallo Infusión, para el dolor de estómago Milliken W, Albert, B, 1996
Honduras Hojas y tallo Decocción, para limpiar la piel Lentz et al. 1998
20
Brasil Hojas y tallo Infusión, para el dolor de cabeza Milliken W, Albert, B, 1996
Surinam Hojas secas Infusión oral, utilizada como febrífugo Zhou et al, 1997
Honduras Fruto fresco Utilizado como alimento Lentz, D. 1993
Colombia Rizomas Decocción oral, para la mordedura de
serpiente Otero et al, 2000
Colombia Rizomas secos Infusión, para la mordedura de serpiente Otero et al, 2000
1.3.5 Actividades farmacológicas
R. alpinia ha sido escasamente estudiada desde el punto de vista farmacológico. Se ha
demostrado que tiene propiedades tales como: antiedematizante, antihemorrágica y
neutralizante del veneno de Bothrops atrox-asper (mapaná equis) (Otero, et al, 2000c);
igualmente, posee actividad antimalárica y leishmanicida (Valadeau C, 2009). Se ha
comprobado mediante estudios de citotoxicidad que los rizomas de R. alpinia causan un
sustancial efecto antiproliferativo de células tumorales, convirtiéndose en una planta de
gran interés farmacéutico contra el cáncer (De Mesquita, M.L., 2009).
1.3.6 Principios activos
Según la revisión realizada por Gómez-Betancur & Benjumea (2014), R. alpinia se
caracteriza por su rico contenido de flavonoides, entre los cuales se han aislado
especialmente flavanonas y chalconas, compuestos derivados de la ruta del ácido
shikímico, que han demostrado ser biológicamente muy activos. En un estudio para evaluar
el efecto del extracto de etanol y las fracciones obtenidas a partir de R. alpinia en el veneno
de serpiente B. asper, las fracciones muestran una presencia predominante de cumarinas.
Los esteroides, carotenoides, monoterpenos, diterpenos (diterpenos labdano) y
sesquiterpenos se han encontrado en las hojas de R. alpinia, muchas de las cuales aún no se
han dilucidado o caracterizado (Lognay et al, 1991; Yang et al, 1999). En cuanto a los
21
aceites esenciales, un gran número de componentes en las hojas, tallos y frutos de R.
alpinia han sido identificados.
La composición fitoquímica de R. alpinia cuenta con la presencia de flavonoides,
diarilheptanoides, y kavalactonas (Gómez-Betancur et al, 2015).
22
Hipótesis y Objetivos
23
2.A HIPÓTESIS
Renealmia alpinia tiene compuestos con actividades analgésica e inhibitoria de los efectos
tóxicos producidos por el veneno de la serpiente Bothrops asper (“mapanà”)
2.B OBJETIVOS
Con los antecedentes mencionados, se considera que la búsqueda de metabolitos
secundarios de la especie Renealmia alpinia utilizada en la medicina tradicional de
Colombia, para el tratamiento de la mordedura de serpiente, se exhibe como una excelente
estrategia para disminuir los efectos tóxicos del veneno de la serpiente Bothrops asper y
aportar nuevo conocimiento en torno a nuevos coadyuvantes para el tratamiento del dolor y
del accidente ofídico.
Objetivo general
Evaluar la actividad analgésica y la inhibición de los efectos tóxicos del veneno de
Bothrops asper por los extractos y compuestos aislados de hojas de Renealmia
alpinia, obtenida de forma silvestre.
Objetivos específicos
Aislar y purificar algunos metabolitos secundarios de hojas de R. alpinia, con el fin
de realizar una identificación estructural de los mismos.
Determinar la seguridad de los compuestos aislados de R. alpinia, mediante pruebas
de toxicidad in vivo e in vitro.
24
Comprobar las propiedades inhibitorias de los efectos tóxicos del veneno de B.
asper, por los extractos y compuestos aislados de R. alpinia, al ser capaces de
inhibir las actividades coagulante, hemolítica y proteolítica in vitro del veneno de
Bothrops asper.
Determinar la actividad analgésica de extractos y compuestos aislados de R. alpinia,
en modelos de experimentación in-vitro e in-vivo.
25
Estudio Estudio dirigido a la
búsqueda de compuestos fenólicos
de Renealmia alpinia
Hojas de Renealmia alpinia
26
3. ESTUDIO DIRIGIDO A LA BÚSQUEDA DE COMPUESTOS FENÓLICOS
DE Renealmia alpinia
3.1 Materiales y Métodos
3.1.1 Identificación y recolección de la especie Renealmia alpinia
El material vegetal utilizado en este estudio (hojas) se colectó durante febrero de 2011en la
vereda Dantas, municipio de San Rafael, Oriente de Antioquia - Colombia, ubicada a 1000
m.s.n.m. Fue identificado por el Profesor Francisco Roldan, del Instituto de Biología de la
Universidad de Antioquia; un espécimen fue depositado en el Herbario de la Universidad
de Antioquia (número de voucher 176395).
3.1.2 Preparación del Material vegetal y Extracto
Las hojas de Renealmia alpinia frescas fueron troceadas y secadas en estufa con circulación
forzada de aire a 37ºC durante 48 horas. Posteriormente se procedió a la pulverización
mecánica del material vegetal seco en un molino. El material vegetal seco y molido, se
depositó en recipientes herméticos hasta su uso.
Para el estudio fitoquimico y los ensayos farmacológicos, se preparó un extracto de
diclorometano a partir de 1500 g de material vegetal, mediante una extracción continua con
diclorometano CH2Cl2 (3 x 3 L) a temperatura ambiente. Posteriormente, el solvente fue
eliminado usando un rotaevaporador Laborota-4000 efficient Heidolph, y el extracto se
almacenó a 4 °C hasta su uso. El rendimiento fue de 74,0 g, correspondiente a 4,93%.
3.2 Técnicas cromatográficas:
3.2.1 Cromatografía en capa fina (CCF / TLC):
27
Se usaron cromatofolios TLC Silica gel 60 F254 de la casa MERCK, de 0.25 mm de espesor,
con indicador de luminiscencia a 254 nm. Se utilizaron como eluyentes n-hexano,
diclorometano, acetato de etilo, cloroformo, metanol, y mezclas de éstos en diferentes
proporciones. Para el revelado de las placas, se utilizó: oleum (solución formada por 4% de
H2SO4, 80% de CH3COOH, 16% de H2O) y posteriormente calentados a 110ºC durante
algunos minutos, solución de anisaldehido, solución de vainillina.
3.2.2 Cromatografía en capa fina preparativa (CPCF):
Se usaron placas de (20 x 20 cm) de 2 mm de espesor de Silica gel 60 F254 de la casa
MERCK, sembrándose entre 40 y 50 mg de producto en cada una de ellas usándose para la
elución diferentes mezclas de disolventes. La detección de los productos sobre las placas se
realizó por fluorescencia con luz ultravioleta a 254 y/o 360 nm, o bien aplicando óleum
sobre el borde, después de proteger convenientemente el resto de la placa con una lámina
de vidrio y posterior calentamiento de la zona tratada.
3.2.3 Cromatografía en columna preparativa (Flash):
La cromatografía “Flash” es un método rápido y económico para la separación de mezclas
que no requieren alta resolución y se prepara de igual forma que la columna seca. Para las
columnas secas y húmedas se empleó gel de sílice 0.063-.0200 mm de diámetro de la casa
MERCK. Para las columnas húmedas se usó SEPHADEX LH-20 de la casa PHARMACÍA
FINE CHEMICALS. Las columnas cromatográficas secas se montaron introduciendo
lentamente gel de sílice por el extremo superior de la columna y aplicando posteriormente
vacío por el extremo inferior. Una vez preparada la columna se fue añadiendo el eluyente
elegido, que se encontraba en un balón acoplado a la columna y al vacío. Se aplicó la
presión conectando el vacío a la llave. Se procedió a recoger las fracciones, cuyo volumen
dependía de la cantidad y de las características de la muestra adsorbida.
28
Figura 3. Cromatografía en columna preparativa de una fracción del extracto de diclorometano de
hojas de Renealmia alpinia. (Laboratorio 14 Instituto Universitario de Bioorgánica – IUBO, La
Laguna, Tenerife, España).
3.2.4 Cromatografía líquida al vacío (CLV / VLC):
En la realización de las columnas cromatográficas se empleó gel de sílice fina (0.063–0.200
nm de diámetro) de la empresa Macherey-Nagel. Las columnas se montaron aplicando
vacío, mientras se cargaba lentamente con gel de sílice. La mezcla a resolver se colocó en
la parte superior de la columna, adsorbida en gel de sílice gruesa (0.2–0.5 nm de diámetro)
de la empresa Merck. Se aplicó vacío, para proporcionar un aumento en la velocidad del
flujo de la fase móvil y las fracciones se recogieron en un matraz de fondo redondo.
3.2.5 Cromatografía circular preparativa (Cromatotrón):
Cromatografía circular preparativa, funciona por efecto centrífugo. La muestra a separar se
aplica o inyecta cerca del centro de un disco giratorio recubierto con una fina capa de sílice
29
gel. La elución por disolvente forma bandas circulares de los componentes que se separan
del borde del rotor junto con el disolvente.
Figura 4. Cromatografía circular preparativa (Cromatotrón) de una fracción del extracto de
diclorometano de hojas de Renealmia alpinia (Laboratorio 14 Instituto Universitario de Bioorganica
– IUBO, La Laguna, Tenerife, España).
3.2.6 Cromatografía en Capa Delgada de Alta Definición (HPTLC):
Los extractos se prepararon pesando 300 mg de material seco y molido (R. alpinia) y
extrayendo con 3mL de metanol por 5 min en baño de agua caliente a 60°C. Se recuperaron
3 mL de extracto para el análisis. Se usaron placas de silica gel 60 F-254 pre-recubiertas
con soporte en aluminio (10x10cm, 250 µm de espesor; Merck, Alemania). Las muestras
fueron aplicadas con una microjeringa de 100µL (Hamilton-Bonaduz Schweiz, Camag,
Suiza), usando un sistema Linomat V (Camag, Suiza). Se aplicaron 20 µL de muestra en
bandas de 10 mm en las pistas de las placas. Posteriormente, las placas fueron desarrolladas
en una cámara de vidrio vertical (20x10 cm; Camag, Muttenz, Suiza) (figura 6), usando dos
fases móviles diferentes: (1) Tolueno:Eter 1:1 y saturada con 10% ácido acético. (2)
30
Acetato etilo-acido fórmico- ácido acético glacial - agua: 100:11:11:26. (3) Hexano-
Acetato de etilo: 8:2.
Se aplicaron diferentes tiempos de optimización para la saturación de la cámara a
temperatura ambiente (25±2°C). La distancia cubierta por el frente de solvente fue de 9 cm.
Después del desarrollo, las placas fueron secadas y los componentes se visualizaron por
irradiación de energía a diferentes longitudes de onda UV.
Todas las mediciones fueron operadas por el software winCATS versión 1.4.4.6337
(Camag, Muttenz, Suiza). Luego, las placas fueron derivatizadas con los siguientes
reveladores para permitir la visualización de los componentes: (1) Hidróxido de Potasio
etanólico al 10%, (2) NP Metanólico al 1% y PEG etanólico al 5%. Los análisis fueron
llevados a cabo por duplicado.
Figura 5. Equipo para Cromatografía en Capa Delgada de Alta Definición (HPTLC) del Grupo de
Investigación en sustancias Bioactivas (GISB) de la Universidad de Antioquia.
3.3 Técnicas experimentales:
3.3.1 Espectroscopia: Resonancia Magnética Nuclear (RMN)
31
Espectros de RMN 1H,
13C y bidimensionales se realizaron en el espectrómetro BRUKER
AMX 300 (300 MHz) y en BRUKER AVANCE 400, 500 y 600 (MHz) utilizando
preferiblemente cloroformo deuterado CDCl3 como disolvente si los productos son solubles
en este, también se empleó Acetona y Metanol deuterados y con TMS como referencia
interna. Se realizaron experimentos homonucleares (COSY) y heteronucleares (HMQC y
HMBC) para la asignación absoluta de las moléculas. Los valores de desplazamiento
químico (δ) se expresan en ppm y los de las constantes de acoplamiento (J) se expresan en
Hz.
3.4 Aislamiento y purificación de metabolitos de Renealmia alpinia
3.4.1 Fraccionamiento cromatográfico del extracto de diclorometano
Con el extracto de diclorometano previamente obtenido (20 g), se realizó una
Cromatografía Líquida de Vacío (VLC) , eluyendo secuencialmente con mezclas de
solventes de polaridad creciente (3:1, 1:1, 1:3) así: n-hexano:diclorometano,
diclorometano:acetona y acetona:metanol, con gradientes de 1 L cada uno, sucesivamente,
para obtener fracciones 1 a 13, estas fracciones se combinaron con base en monitoreo
realizado por TLC para resultar ocho fracciones principales: 1 (0,125 g), 2 (0,471 g), 3 (1,9
g), 4 (3,0 g), 5 (1,0 g), 6 (7,0 g), 7 (1,6 g), 8 (1,6 g).
A continuación se exponen los resultados obtenidos del estudio fitoquímico de Renealmia
alpinia. Después de realizar la VLC y agrupar las fracciones en ocho, se llevó a cabo lo
siguiente:
La fracción 4 (3,0 g) se aplicó a una columna de gel de sílice, eluyendo con n-
hexano: diclorometano (6:4) para obtener las subfracciones 4-1 a 4-4. La
subfracción 4-3 (1,8 g) se recristalizó usando acetato de etilo-metanol
proporcionando cristales incoloros del compuesto F-1 (1,3 g).
La fracción 5 (1,0 g) se sometió a una columna de gel de sílice, eluyendo con n-
hexano: diclorometano (6: 4) para obtener subfracciones 5-1 a 5-9. La subfracción
32
5-2 (0,075 g) se aplicó a una columna de Sephadex LH-20 se eluyó con una mezcla
cloroformo: metanol 1:1, y el compuesto F-2, (0,008 g) se separó en forma de
cristales incoloros.
La fracción 6 (6 g) se recristalizó usando metanol para dar cristales de color
naranja del compuesto F-3 (0,5 g). La parte líquida de la fracción 6 se re-fraccionó
por cromatografía líquida de vacío (VLC) utilizando diferentes mezclas de
disolventes, eluyendo secuencialmente con n-hexano: diclorometano (3: 1,1: 1,1: 3),
diclorometano: acetato de etilo (3: 1, 1: 1, 1: 3), y acetato de etilo: metanol (3: 1, 1:
1, 1: 3) con gradientes cada uno de 0,5 L, sucesivamente, para obtener
subfracciones 6.1 a 6.10. La subfracción 6.6 (5,0 g) se aplicó a una columna de gel
de sílice, eluyendo con n-hexano: acetona (8:2) para obtener subfracciones de 6.6.1
a 6.6.20. La subfracción 6.6.10 (0,720 g) se aplicó a una columna de gel de sílice,
eluyendo con n-hexano: acetato de etilo (6: 4) para obtener fracciones de 6.6.10-1 a
6.6.10-5. La subfracción 6.6.10.4 (0,5 g) se aplicó a una columna de Sephadex LH-
20, eluyendo con cloroformo: metanol (1: 1) para obtener el compuesto F-4 (0,021
g). La subfracción 6.6.13 se aplicó a una columna de gel de sílice y resultaron
cristales incoloros del compuesto D-1 (0,7 g).
La fracción 7 (1,5 g) se aplicó a una columna de gel de sílice, eluyendo con n-
hexano: acetona (7: 3) para obtener subfracciones 7.1 a 7.4. Desde 7-3 y después de
la evaporación del disolvente, se aislaron 12 mg del compuesto K-1.
Posteriormente se obtuvo el compuesto D-2 (1,5 mg) a partir del residuo de la
subfracción 6.6.10.4 (0,04 g) se sometió a una Cromatografía en placa preparativa
usando como fase móvil n-hexano:acetato de etilo 6:4.
El F-5 (1,0 mg) se obtuvo a partir de la fracción 6, subfracción 6.8 mediante
Cromatotrón (cromatografía preparativa circular) utilizando como fase móvil
diclorometano: metanol 9,5:0,5.
33
A partir de la fracción 8, subfracción 8.9, se obtuvo el compuesto S-1 (5,0 mg). Se
sometió a una columna en gel de sílice con una mezcla de diclorometano: metanol
9:1 y posteriormente se termina de fraccionar mediante Cromatotrón (cromatografía
preparativa circular) utilizando como fase móvil diclorometano: metanol 9,5:0,5.
Las estructuras de los nueve (9) productos aislados de R. alpinia fueron elucidadas
mediante técnicas espectroscópicas de RMN 1H y
13C (Resonancia Magnética Nuclear de
protón y carbono), incluyendo experimentos homonucleares, COSY (Correlated
Spectroscopy) y ROESY (Rotating Frame Overhauser Effect) y heteronucleares, HSQC
(Heteronuclear Single Quantum coherente) y HMBC (Heteronuclear Multiple Bond
Correlation), así como mediante espectrometría de masas de baja (EM) y alta resolución
(EMAR).
Por otra parte, y debido a que todas las estructuras de los compuestos eran conocidas, estas
fueron establecidas con base en sus datos físicos y espectroscópicos y se compararon los
mismos con los existentes en la bibliografía química.
Los nueve (9) metabolitos aislados, han sido agrupados y denominados de acuerdo a la
similitud de sus estructuras químicas, para facilitar su estudio y discusión de la siguiente
manera:
D: Diarylheptanoides
F: Flavonoides
K: Kavalactonas
S: Saponinas
Tabla Nº3. Rendimiento de las fracciones obtenidas de Renealmia alpinia
Nº fracción Peso (gr) Porcentaje de rendimiento
34
1 0,13 0,63
2 0,47 2,36
3 1,90 9,50
4 3,00 15,00
5 1,00 5,00
6 7,00 35,00
7 1,60 8,00
8 1,60 8,00
3.5 Resultados y discusión
3.5.1 Flavonoides
Tras repetidas cromatografías del extracto de diclorometano de las hojas de R. alpinia,
como se indica en el numeral 3.1.3, se aislaron cinco flavonoides, que se denominaron de
F-1 a F-5, todos compuestos conocidos reportados en la bibliografía química. Los
flavonoides aislados se agruparon en función del grado de oxidación del anillo C de benzo-
γ-pirona.
Teniendo en cuenta dicha consideración, el producto que se denominó 2',6'-Dihydroxy-4'-
methoxychalcone (Hu et al, 2006) (F-2), se caracteriza por poseer un esqueleto de
chalcona; los productos denominados 5-hydroxy-7-methoxyflavanone (González et al,
1989) (F-1), naringenin 7-methyl ether (Agrawal et al, 1989) (F-3), naringenin 7,4'-
dimethyl ether (Iwu and Chiori, 1984) (F-4) y 3'4',5-Trihydroxy-7-methoxyflavanone
(Abdel et al 2003) (F-5), tienen un esqueleto de flavanona.
5-hydroxy-7-methoxyflavanone (Pinostrobin) (F-1): El compuesto fue aislado como
cristales blancos, corresponde a la formula molecular C16H14O4 y fue corroborada su
identificación con base en los datos espectroscópicos reportados en la literatura (González
et al, 1989). La estereoquímica absoluta para la flavanona F-1, se encontró que era 2S
35
comparando el valor de rotación específica de muestra aislado (-48,7 °; c 0,41, CHCl3) con
el valor reportado por Kinghorn (-57,5 °; c 0,80, CHCl3) (Su et al, 2003).
Figura 6. (F-1), 5-hydroxy-7-methoxyflavanone (Pinostrobin)
Tabla Nº 4. Datos de RMN-1H, RMN-
13C, HSQC y HMBC (300 MHz) de F-1
Protón 1H (δ) m (J Hz) HSQC,
13C(δ) HMBC (principales)
H-2 5.49 dd (3.0, 12.9) 79.27 d C-2
H-3a 3.14 dd (12.9, 17.1) 43.42 t C-3
H-3b 2.86 dd (3.3, 17.1) 195.81 s C=O
164.19 s C-5
H-6 6.13 d (2.1) 95.19 s C-6
168.03 s C-7
H-8 6.11 d (2.1) 94.31 d C-8
162.83 s C-9
H-2` 7.48 M 103.19 s C-10
H-3` 7.48 M 138.42 s C-1’
H-4` 7.48 M 126.18 d C-2’
H-5` 7.48 M 128.92 d C3’
H-6` 7.48 M 128.92 d C4’
Me-7
OH-5
3.86
12.07
s
s
128.92 d
126.18 d
55.73 c
C5’
C6’
C-7 (OCH3)
[
C
a
p
t
e
l
a
a
t
e
n
c
i
ó
n
d
e
l
o
s
l
e
c
t
o
r
e
s
36
2',6'-Dihydroxy-4'-methoxychalcone (Pinostrobin-Chalcona) (F-2): el compuesto fue
aislado como cristales color naranja, corresponde a la formula molecular C16H14O4 y fue
corroborada su identificación con base en los datos espectroscópicos reportados en la
literatura (Hu et al, 2006). La estereoquímica relativa del doble enlace en el compuestos F-2
se determinó como E basado en el acoplamiento de valores constantes y la comparación
con los valores publicados (Hu et al, 2006).
Figura 7. (F-2) 2',6'-Dihydroxy-4'-methoxychalcone (Pinostrobin-Chalcona)
Tabla Nº 5. Datos de RMN-1H, RMN-
13C, HSQC y HMBC (300 MHz) de F-2
Protón 1H (δ) m (J Hz) HSQC,
13C(δ) HMBC (principales)
H-2 7.44 dd (2.1, 4.95) 138.97 s
105.31 s
C-1
C-2
H-3 7.46 dd (1.8, 4.95) 164.59 s
127.47 s
C-3
C-4
H-4 7.46 dd (1.8, 4.95) 192.59 s C=O
H-5 7.72 dd (1.8, 6.3) 130.15 s C-5
H-6 7.72 dd (2.4, 6.3) 128.32 s C-6
37
135.57 s C- α
H-α
H-β
8.27
7.81
d (15.9)
d (15.6)
142.10 d C- β
162.83 s C-1’
H-3’ 6.05 s 105.31 s C-2’
H-5’ 6.05 S 93.73 d C-3’
Me-7 3.83 S 166.41 s C-4’
OH-5 12.08 S 93.73 d C-5’
166.41 s C6’
54.99 c C-4 (OCH3)
Naringenin 7-methyl ether (Sakuranetin) (F-3): El compuesto fue aislado como cristales
blanquecinos, corresponde a la formula molecular C16H14O5 y fue corroborada su
identificación con base en los datos espectroscópicos reportados en la literatura (Agrawal et
al, 1989). El compuesto F-3 se aisló en forma de una mezcla racémica. Una búsqueda en la
literatura demostró que la mayoría de las flavanonas aisladas de fuentes naturales tienen la
configuración absoluta 2S, que está de acuerdo con los resultados presentados (Su et al,
2003; Yoshikawa et al, 1998).
Figura 8. (F-3) Sakuranetin (Naringenin 7-methyl ether)
Tabla Nº 6. Datos de RMN-1H, RMN-
13C, HSQC y HMBC (300 MHz) de F-3
[
C
a
p
t
e
l
a
a
t
e
n
38
Protón 1H (δ) m (J Hz) HSQC,
13C(δ) HMBC (principales)
H-2 5.48 dd (2.7, 12.9) 79.15 d C-2
H-3a 2.76 dd (3.0, 17.1) 42.59 t C-3
H-3b 3.21 dd (12.9, 17.1) 196.76 s C-4 C=O
H-6 6.04 d (2.1) 164.10 s C-5
H-8 6.05 d (2.1) 93.67 s C-6
H-2’ 6.90 d (8.7) 167.96 s C-7
H-3’ 7.39 d (8.4) 94.57 d C-8
H-5’
H-6’
7.42
6.93
d (8.4)
d (8.7)
163.30 s C-9
Me-7
OH-5
OH-4
3.85
12.15
8.64
s
s
s
102.84 s
129.74 s
128.16 d
115.30 d
C-10
C-1’
C-3’, C5’
C2`, C6`
157.87 d
55.73 c
C4’
C7(OCH3)
Naringenin 7,4'-dimethyl ether (F-4): el compuesto fue aislado como cristales color
blanco, correspondió a la formula molecular C17H16O5 y fue corroborada su identificación
con base en los datos espectroscópicos reportados en la literatura (Iwu and Chiori, 1984).
La estereoquímica de la flavanona F-4 se supone que es S por las consideraciones
biogenéticas.
39
Figura 9. (F-4) Naringenin 7,4'-dimethylether (Sakuranetin 4'-methyleter)
Tabla Nº 7. Datos de RMN-1H, RMN-
13C, HSQC y HMBC (300 MHz) de F-4
Protón 1H (δ) m (J Hz) HSQC,
13C(δ) HMBC (principales)
H-2 5.41 dd (3.0, 15.0) 79.05 d C-2
H-3a 2.81 dd (3.0, 17.1) 43.24 t C-3
H-3b 2.86 dd (12.9, 16.8) 196.08 s C=O
H-6 6.09 d (2.4) 164.17 s C-5
H-8 6.12 d (2.4) 94.26 d C-6
H-2’ 7.0 d (9.0) 168.0 s C-7
H-3’ 7.43 d (9.0) 95.12 d C-8
H-5’
H-6’
7.0
7.43
d (9.0)
d (9.0)
162.93 s
103.18 s
C-9
C-10
Me-7
Me-4’
OH-5
3.85
3.88
12.07
S
s
s
130.41 s
114.26 d
127.77 d
128.16 d
C-1’
C-2’
C-3’
C-5’
114.26 d
55.71
C6’
C-4’ (OCH3)
55.71
160.08
C-7 (OCH3)
C4`
[
C
a
p
t
e
l
a
a
t
e
n
c
i
ó
n
d
e
l
o
s
l
e
c
t
o
r
e
s
m
e
d
i
a
n
t
e
40
3'4',5-Trihydroxy-7-methoxyflavanone (F-5): corresponde a la formula molecular
C16H14O6 y su identificación fue corroborada con base en los datos espectroscópicos
reportados en la literatura (Abdel et al 2003).
Figura 10. (F-5) 3'4',5-Trihydroxy-7-methoxyflavanone (Sterubin)
Tabla Nº 8. Datos de RMN-1H, RMN-
13C, HSQC y HMBC (500 MHz) de F-5
Protón 1H (δ) m (J Hz) HSQC,
13C(δ) HMBC (principales)
H-2 5.43 dd (3.7, 12.0) 78.09 d C-2
H-3a 3.17 dd (15.2, 18.0) 41.54 t C-3
H-3b 3.20 dd (15.2, 18.0) 195.66 s C=O
H-6 6.04 d (2.8) 162.95 s C-5
H-8 6.07 d (2.8) 92.52 d C-6
H-2’ 7.04 d (1.7) 166.82 s C-7
H-5’ 6.90 d (8.0) 93.38 d C-8
H-6’ 6.90 dd(8.0) 162.16 s
101.72 s
C-9
C-10
Me-7
OH-5
3.87
12.07
S
s
129.33 s
112.75 d
C-1’
C-2’
41
OH-3’
OH-4’
s
s
144.52 d
144.12 d
114.03 d
C-3’ (OH)
C-5’
C-6’
117.17 d C-4’ (OH)
166.82 d C-7 (OCH3)
3.5.2 Diarylheptanoides
Se aislaron dos Diarylheptanoides, que se denominaron D-1 y D-2, ambos compuestos
conocidos reportados en la bibliografía química. El producto que se denominó 5-
Heptanediol, 1,7-diphenyl (Kuroyanagi, et al, 1983) (D-1), y el compuesto 1-(4-
Hydroxyphenyl)-7-phenyl-(4E)-4-hepten-3-one (Suksamrarna et al, 2008) (D-2), ambos se
caracterizan por poseer esqueleto de Diarylheptanoide lineal.
5-Heptanediol, 1,7-diphenyl (D-1): correspondió a la fórmula molecular C19H24O2 y su
identificación fue corroborada con base en los datos espectroscópicos reportados en la
literatura (Kuroyanagi, et al, 1983).
Figura 11. (D-1) 5-Heptanediol, 1,7-diphenyl (Yashabushidiol)
Tabla Nº 9. Datos de RMN-1H, RMN-
13C, HSQC y HMBC (300 MHz) de D-1
Protón 1H (δ) m (J Hz) HSQC,
13C(δ) HMBC (principales)
1
2 3
4 5
6
7 2´
3´
4´ 5´
3´´
4´´ 5´´
42
H-4 1.57 t (12.6) 33.05 t C-1, C-7
H-2, H-6 1.75 dd (7.8, 15) 41.20 t C-2, C-6
H-1, H-7 2.70 m 45.70 t C-4
H-3, H-5 3.84 t (12.3) 68.68 d C-3, C-5
Arom protons 7.19 M 126.70 d Arom
129.70 d Arom
129.46 d Arom
143.70 s
C-1’, C-1’’
1-(4-Hydroxyphenyl)-7-phenyl-(4E)-4-hepten-3-one (D-2): corresponde a la fórmula
molecular C19H20O2 y su identificación fue corroborada con base en los datos
espectroscópicos reportados en la literatura (Suksamrarna et al, 2008).
Figura 12. (D-2) 1-(4-Hydroxyphenyl)-7-phenyl-(4E)-4-hepten-3-one (D-2)
Tabla Nº 10. Datos de RMN-1H, RMN-
13C, HSQC y HMBC (500 MHz) de D-2
Protón 1H (δ) m (J Hz) HSQC,
13C(δ) HMBC (principales)
43
H-1 2.87 d (7.6) 29.24 t C-1
H-2 2.83 d (6.7) 34.15 t C-6
H-4 6.12 d (15.9) 34.41 t C-7
H-5 6.84 dd (15.9) 41.98 t C-2
H-6 2.55 dd (7.0) 115.27 2xd C-3’, C-5’
H-7 2.80 t (7.4) 126.24 d C-4’’
H-2’, H-6’ 7.07 d (8.5) 128.34 2xd C-2’’, C-6’’
H-3’, H-5’
H-2’’, H-6’’
H-3’’, H-5’’
H-4’’
6.77
7.20
7.28
7.23
d (8.5)
d (7.4)
d (7.4)
d (7.4)
128.53 2xd
129.50 2xd
130.73 d
133.41 s
C-3’’, C-5’’
C-2’, C-6’
C-4
C-1’
OH
4.73
S
140.68 s
146.35 d
153.80 s
199.70 s
C-1’’
C-5
C-4’
C-3
3.5.3 Kavalactonas
Tras repetidas cromatografías del extracto de diclorometano de hojas de R. alpinia, se aisló
una kavalactona, compuesto conocido y reportado en la literatura (Orapin Ch et al, 2005),
identificado como: 4-methoxy-6-[(E)-2-phenylethenyl]-2H-pyran-2-one. Se denominó
como K-1. La estereoquímica relativa del doble enlace en el compuesto K-1 se determinó
como E basado en el acoplamiento de valores constantes y la comparación con los valores
publicados (Orapin et al, 2005).
44
Figura 13 (K-1): 4-methoxy-6-[(E)-2-phenylethenyl]-2H-pyran-2-one (Desmethoxyyangonin).
Tabla Nº 11. Datos de RMN-1H, RMN-
13C, HSQC y HMBC (500 MHz) de K-1
Protón 1H (δ) m (J Hz) HSQC,
13C(δ) HMBC (principales)
OCH3 3.83 s 164.05 s C-2
H-3 5.50 d (2.2) 88.87 t C-3
H-5 5.95 d (2.2) 171.09 s C-4
H-7 6.58 d (16) 101.37 d C-5
H-11, H-12, H-13 7.37-7.34 m 158.64 s C-6
H-8 7.38 d (14.4) 118.63 d C-7
H-10, H-14 7.50 d (14) 135.82 s C-8
135.23 d
137.46 2xd
C-9
C-10, C-14
128.92 2xd
129.47 d
C-11, C-13
C-12
3.5.4 Saponinas
Se aisló el compuesto S-1 que corresponde a una Saponina de nombre: 3,5- β-Sitosteryl β-
D-glucoside (β-D-Glucopyranoside, (3β)-stigmast-5-en-3-yl), de fórmula molecular:
C35 H60 O6. Los datos espectroscópicos de RMN del compuesto están de acuerdo a los
reportados por Chadwick, et al,
2004).
45
Figura 14. 3,5- β-Sitosteryl β-D- glucoside.
Tabla Nº 12. Datos de RMN-1H, RMN-
13C, HSQC y HMBC (400 MHz) de 3,5- β-Sitosteryl β-D-
glucoside. C35H60O6
Protón 1H (δ) m (J Hz) HSQC,
13C(δ) HMBC (principales)
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
H11a
H1a, H2a
H28a, H15a, H12a
H23
H16a
H22
Me-21
H9
H15b
H28b
Me-29, 29
H3, H2a, H1b
H16b
H6, H7b
H12b, H11a, H11b
0.63
0.77
0.79
0.81
0.82
0.89
0.94
1.06
1.11
1.25
1.26
1.40
1.45
1.55
1.57
1.62
1.75
1.85
1.93
1.99
s
d (10)
d (10)
t (7.5)
s
m
m
m
m
m
m
m
m
m
m
m
m
m
m
dd (12.8, 3.0)
12.12
12.23
19.07
19.39
19.55
20.16
21.05
23.06
25.88
28.25
29.16
31.87
33.79
35.92
36.66
37.28
38.75
42.30
45.59
50.05
55.87
C18
C29
C21
C19
C26
C27
C11
C28
C15
C23
C16
C2, C25
C8
C7
C22
C20
C10, C1
C13
C24
C9
C17
H3, H1a, H1b 2.16 m 56.63 C14
46
H6, 3, 4a, 7b 2.49 ddm 61.53
70.54
C6’
C4’
H2a, H3, H4b 2.75 dd (13.1, 3.3) 73.90 C2’
-
3.97 M 77.15
77.18
77.40
C5’
C3
C3’
H4’, H6a’, H6b’ 4.20 dd (9.0, 5.4) 101.21 C1’
H1’, H3’ 4,22 dd (7.7, 9.2) 121.65 C6
H3’, H5’ 4.43 dd (9.0, 8.5) 140.88 C5
H-2’, H4’ 4.45 dd (9.2, 8.9)
H5’, H6’b
H5’, H6’a
4.46
4.87
dd (11.8, 5.4)
dd (11.8, 2.1)
H2’
H4b, 7a, 7b
4.90
5.32
d (7.7)
m
47
Estudio farmacológico
48
4. ESTUDIO FARMACOLÓGICO
El estudio farmacológico del extracto de diclorometano y de los compuestos aislados de
Renealmia alpinia abarcó inicialmente diferentes estudios de toxicidad (citotoxicidad y
toxicidad aguda); en segundo lugar comprendió el estudio de la inhibición de los efectos
tóxicos del veneno de Bothrops asper y de una toxina aislada del mismo, por extractos y
compuestos aislados de R. alpinia. Por ultimo incluyo el estudio de la actividad analgésica
de R. alpinia, como posible valor agregado a los efectos tóxicos, como es el dolor que se
produce en el sitio de la mordedura.
Todos los compuestos no fueron ensayados en modelos in vivo por razones de cantidad
disponible de cada uno.
4.1 Animales de experimentación
Los animales utilizados para los estudios in vivo de este trabajo fueron obtenidos del
Bioterio de la Sede de Investigación de la Universidad de Antioquia (SIU) y mantenidos de
acuerdo con las Directrices del Consejo Canadiense para el cuidado de los animales de
experimentación (Consejo Canadiense 1998) y en la Guía para el Cuidado y Uso de
Animales de Laboratorio del Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos (National
Research Council, 2011). Acta de aprobación del Comité de ética para animales de
experimentación No 76.
Ratones de la cepa Swiss, machos y hembras (nulíparas y no grávidas), entre 8 y 12
semanas de edad, con un peso de 20-25 g fueron utilizados después de un período de
adaptación de 3 días. La temperatura de las jaulas se mantuvo en 22°C (± 3°C). La
humedad relativa fue de al menos 30% y no superior a 70%, salvo durante la limpieza de la
jaula, la cual fue de 50-60%. La iluminación fue artificial, con fotoperiodo de 12 horas de
luz y 12 horas de oscuridad. Los animales se mantuvieron alojados en pequeños grupos del
mismo sexo hasta el momento de los experimentos.
49
Se empleó una dieta convencional de laboratorio combinada con un aporte ilimitado de
agua potable y estéril, los animales fueron alimentados con LabDiet 5010®. La dieta
administrada cubrió todas las necesidades nutricionales de la especie sometida a
experimentación.
Los indicadores de dolor en ratones se evaluaron como lo describe Morton y Griffiths
(1985) y Carstens y Moberg (2000). Si un animal presentó pérdida del 15% del peso
corporal, postura encorvada, pelaje áspero, y / o si no podia comer o beber, fué sacrificado
antes de la terminación del experimento planificado con una sobre exposición a vapores de
isoflurano. Cada parámetro tuvo una escala de 0 a 5. Luego, la puntuación total fué
determinada y la severidad del dolor se clasificó de la siguiente manera: 0-5: normal; 6-10:
se vigiló cuidadosamente, se consideraron analgésicos; 11-15: sufrimiento, se proporcionó
alivio, y observación con regularidad; y 16-20 Dolor severo, se consideró el sacrificio de
animales. Para todos los procedimientos de inyección, de medición y de recogida de sangre,
los animales fueron anestesiados con isoflurano.
4.2 Venenos
A partir de especímenes mantenidos en el Serpentario de la Universidad de Antioquia
(Medellín, Colombia) e incluidos en la colección COLBIOFAR 149, registrada ante el
Instituto de Investigaciones de Recursos Biológicos Alexander Von Humboldt, se obtuvo el
veneno por extracción manual de 40 ejemplares adultos sanos de la serpiente Bothrops
asper procedentes de diferentes regiones de Colombia. La mezcla se constituyó de esta
manera para disminuir el impacto que tiene la alta variabilidad. Esta mezcla homogénea,
una vez centrifugada a 2500 rpm durante 10 minutos a 4 °C es liofilizada y congelada a -
20 °C hasta su utilización.
50
4.3 Estudio de la Citotoxicidad sobre Células Murinas C2C12 (Mioblastos) y Células J-
774 (Macrófagos)
4.3.1 Método
En este estudio se evaluó la toxicidad sobre Células Murinas C2C12 (Mioblastos) y Células
J-774 (Macrófagos) de acuerdo al método descrito por Lomonte et al. 1999. Seis (6) de los
compuestos aislados de R. alpinia: F-1, F-2, F-3, F-4, D-1 y K-1, fueron empleados en dos
concentraciones de (100 µg/150 µl y 300 µg/150 µl). Los compuestos corresponden a tres
flavanonas, una chalcona, un diarylheptanoide y una kavalactona. El extracto de R. alpinia
ya había sido evaluado previamente sin presentar signos de citotoxicidad y por lo tanto no
se evaluó en esta oportunidad (Patiño et al, 2012).
Para ello, las células se crecieron en frascos de cultivo con el medio Dulbecco- Eagle
suplementado con suero fetal bovino al 10%, antibióticos y antimicóticos; en una atmósfera
humidificada, 5% de CO2 y a 37oC. Cuando se obtuvo un crecimiento confluente, las
células fueron colectadas y resuspendidas en el mismo medio de crecimiento y transferidas
a microplacas de 96 pozos. Una vez alcanzado el 90-100% de confluencia en cada uno de
los pozos (5-6 días para células C2C12 y 2-3 días para células J-774), se adicionaron
concentraciones variables de la muestra (0,02 a 10mg/100µl/pozo) diluidas en el medio con
suero fetal al 1% a cada pozo y se utilizó como controles el medio de cultivo sólo o
suplementado con 0,1% de Triton X-100 (para 0 y 100% de citotoxicidad,
respectivamente).
Después de 3 horas de incubación a 37ºC se verificó el estado general de las células y el
cultivo con microscopía de luz (microscopio invertido MOTIC) y se tomó una alícuota del
sobrenadante para determinar la liberación de la enzima Lactato Deshidrogenasa (LDH) en
las células dañadas, empleando un ensayo cinético (Wiener LDH-P UV). Los experimentos
se llevaron a cabo con tres replicas y tres repeticiones.
51
4.3.2 Resultados
Figura 15. Citotoxicidad en células C2C12 de 6 compuestos aislados: 5-hydroxy-7-
methoxyflavanone (F-1); 2',6'-Dihydroxy-4'-methoxychalcone (F-2); naringenin 7-methyl ether (F-
3), Naringenin 7,4'-dimethylether (Sakuranetin 4'-methyleter) (F-4), 5-Heptanediol, 1,7-diphenyl
(Yashabushidiol)(D-1),4-methoxy-6-[(E)-2-phenylethenyl]-2H-pyran-2-one (Desmethoxyyangonin)
(K-1).
Trito
n
Med
io/D
MSO
F-1
100
ug
F-1
300
ug
F-2
100
ug
F-2
300
ug
F-3
100
ug
F-3
300
ug
F-4
100
ug
F-4
300
ug
D-1
100
ug
D-1
300
ug
K-1
100
ug
K-1
300
ug
0
200
400
600
800
1000
***
*
F-1: Pinostrobin
F-2: Pinostrobin-chalcone
F-3: Sakuranetine
F-4: Sakuranetin 4'-methyleter
D-1: Yashabushidiol
K-1: Desmethoxyyangonin
Citotoxicidad celulas C2C12
Acti
vid
ad
(U
/L)
52
Figura 16. Citotoxicidad en células J-774 de 6 compuestos aislados: 5-hydroxy-7-
methoxyflavanone (F-1); 2',6'-Dihydroxy-4'-methoxychalcone (F-2); naringenin 7-methyl ether (F-
3), Naringenin 7,4'-dimethylether (Sakuranetin 4'-methyleter) (F-4), 5-Heptanediol, 1,7-diphenyl
(Yashabushidiol)(D-1),4-methoxy-6-[(E)-2-phenylethenyl]-2H-pyran-2-one (Desmethoxyyangonin)
(K-1).
4.3.3. Discusión
Las lecturas en las diferentes concentraciones para ambas líneas celulares, resultaron
similares a las del control negativo (medio/DMSO), lo cual indica que los compuestos
evaluados no causan daño a la membrana de las células sin importar las dosis evaluadas; es
decir el empleo de cualquiera de las dosis en la mayoría de los compuestos no impide la
viabilidad celular, ni la integración de la misma y por esta razón se debe descartar eventual
toxicidad a nivel celular. La figura 15, muestra lo descrito anteriormente, únicamente para
el compuesto F-3, a la mayor concentración (300 ug/150 ul), se observa cierto nivel de
toxicidad.
Trito
n
Med
io/D
MSO
F-1
100
ug
F-1
300
ug
F-2
100
ug
F-2
300
ug
F-3
100
ug
F-3
300
ug
F-4
100
ug
F-4
300
ug
D-1
100
ug
D-1
300
ug
K-1
100
ug
K-1
300
ug
0
200
400
600
800
1000 ***
F-1: Pinostrobin
F-2: Pinostrobin-chalcone
F-3: Sakuranetine
F-4: Sakuranetin 4'-methyleter
D-1: Yashabushidiol
K-1: Desmethoxyyangonin
Citotoxicidad células J774
Acti
vid
ad
(U
/L)
53
4.4. Evaluación de la Toxicidad aguda de compuestos aislados de Renealmia alpinia.
4.4.1 Método:
El ensayo de la toxicidad aguda se define como la evaluación de un síndrome tóxico
producido por la administración de una o de varias dosis (dos o tres veces, o en infusión
continua), en el transcurso de un día con un período de observación de hasta 14 días
(OECD Guideline for Testing of Chemicals, 1995). Esta evaluación determina la letalidad e
identifica los signos y síntomas producidos por sobredosis, fija las dosis adecuadas para los
estudios de toxicidad a largo plazo (Vogel, 2006), establece el tiempo en el que aparecen
los efectos tóxicos aditivos y brinda una información de la cinética toxicológica del
producto.
Los principales objetivos de este ensayo fueron, la detección de los niveles de tolerancia
aguda a los compuestos testeados y el establecimiento de la naturaleza de los síntomas de
toxicidad aguda.
La evaluación de la toxicidad aguda de dos compuestos aislados (Pinostrobin-chalcona y
Sakuranetina) de Renealmia alpinia se realizó siguiendo la Norma 423 de la Organización
para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE Guía N°423, 2001). Los datos
generales de las sustancias suministradas se presentan en la tabla 13.
Tabla Nº 13. Algunas características de los compuestos en estudio, aislados de R. alpinia
(Pinostrobin-chalcona y Sakuranetin).
Muestra A
Nombre
Pinostrobin-Chalcona
Masa molar 270 g/mol
Características organolépticas Cristales sueltos, color naranja
Muestra B
Nombre
Sakuranetina
Masa molar 286 g/mol
Características organolépticas Cristales sueltos, color blanco
54
4.4.1.1 Preparación de la dosis
Para el ensayo se utilizaron cuatro ratones por grupo, tres para evaluar los productos a
ensayar (tratamientos) y uno adicional al que se administró el vehículo en el cual fueron
diluidas (buffer de fosfatos, PBS) las muestras y sirvió como control negativo para realizar
las comparaciones estadísticas. A los grupos de tratamiento, se les administró la dosis
empleada en el ensayo (300 mg/Kg) de manera independiente y consecutiva con
verificación de la toxicidad en cada uno de ellos. En todos los casos, y de acuerdo a la
siguiente formula, se administró por vía oral, 1 ml de muestra por 40 g de peso del ratón
(ver tabla 14).
𝑋 = 1 𝑚𝑙 𝑣𝑒ℎí𝑐𝑢𝑙𝑜
40 𝑔 𝑟𝑎𝑡ó𝑛𝑥
12 𝑚𝑔 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎
1 𝑚𝑙 𝑣𝑒ℎí𝑐𝑢𝑙𝑜𝑥
1000 𝑔 𝑟𝑎𝑡ó𝑛
𝐾𝑔 𝑟𝑎𝑡ó𝑛= 300
𝑚𝑔
𝐾𝑔
Los ratones se sometieron a un período de ayuno de seis horas previas al experimento, con
libre acceso al agua. Pasado este tiempo se administró por vía oral y con una sonda
orogástrica la dosis (tratamiento) correspondiente a su peso corporal; mientras que el grupo
control recibió únicamente el vehículo en el cual fue diluida la muestra (PBS). Una vez
administrada la muestra, se continuó con el ayuno durante una hora más, con el fin de
observar su respuesta y transcurrido este tiempo, se suministró a los ratones la dieta normal.
En las primeras 24 horas posteriores a la administración, los ratones fueron observados
cada 30 minutos durante la primera hora, luego cada 60 minutos hasta completar la cuarta
hora y posteriormente cada 240 minutos hasta finalizar el día. En los días subsiguientes, los
ratones se mantuvieron en observación durante un periodo de 14 días (por si ocurre retraso
en la muerte), evaluando diariamente el peso corporal, las respuestas por parte de los
animales frente a cada una de las dosis usadas, es decir, los signos de toxicidad, el tiempo
55
de aparición de éstos, la naturaleza, gravedad y duración de los efectos; así como también
la mortalidad.
4.4.1.2 Registros de toxicidad y mortalidad
Cada uno de los días del período de ensayo (14 días) se evaluaron los signos de toxicidad
macroscópicos relacionados con sistemas: nervioso central y somatomotor, autónomo,
respiratorio, cardiovascular, gastrointestinal, genitourinario, piel y pelaje,
membranas/mucosas y ojos. Estas observaciones realizadas, fuera de la cama de
alojamiento, en un ambiente normal y siempre a la misma hora, fueron complementadas
con una evaluación final de reactividad sensorial frente a estímulos tales como: visual,
propiocepción, presión con fuerza y actividad motora (IPCS, 1986; Tupper and Wallace
1980; Gad, 1982; Moser, et al, 1991).
4.4.1.3 Seguimiento del peso corporal
La determinación del peso corporal es un parámetro importante, pues se constituye en uno
de los indicadores más sensibles de perturbación de la homeóstasis. En esta evaluación se
registró el peso corporal diariamente como medida adicional de la toxicidad a nivel
sistémico.
4.4.1.4 Determinaciones en orina
Diariamente se evaluaron variables tales como: aspecto, color, cambios observables en el
volumen de excreción y presencia de sangre en ella.
4.4.1.5 Determinaciones macroscópicas de órganos en ratones.
56
Pasados los 14 días de observación, los animales fueron sacrificados en cámara con CO2. Y
se les realizó necropsia para determinar por inspección visual si habia signos de toxicidad
en órganos como la cavidad abdominal, hígado, riñones, estómago, glándulas suprarrenales,
testículos, epidídimo, útero, ovarios, timo, bazo, cerebro y corazón, según protocolo.
4.4.2 Resultados
No se presentó muerte o signos evidentes de toxicidad en ninguno de los animales en
estudio tratados con Pinostrobin-chalcona y Sakuranetin (F-2, F-3) (Tablas 14 y 15), hecho
que se corrobora con la ganancia de peso corporal (tabla 16 y figura 18) que si bien no es
estadísticamente significativo, sí es reflejo de la inocuidad de los compuestos analizados
(F-2 y F-3), pues una de las principales características de toxicidad es la pérdida en el peso
corporal.
Tabla Nº 14. Respuesta a la muestra administrada a cada grupo de animales a la dosis
administrada.
Grupos Toxicidad Evolución Muerte Día de la
muerte
Controles 0 N/A 0 N/A
C2H1 0 N/A 0 N/A
C2H2 0 N/A 0 N/A
C2H3 0 N/A 0 N/A
C2M1 0 N/A 0 N/A
C2M2 0 N/A 0 N/A
C2M3 0 N/A 0 N/A
C3H1 0 N/A 0 N/A
C3H2 0 N/A 0 N/A
C3H3 0 N/A 0 N/A
C3M1 0 N/A 0 N/A
C3M2 0 N/A 0 N/A
57
C3M3 0 N/A 0 N/A
Toxicidad = Número de animales que presenten signos de toxicidad
Evolución = Evolución temporal de los efectos tóxicos y la reversibilidad
Muerte: Número de animales muertos o sacrificados por razones compasivas
N/A = No aplica.
C2H: Pinostrobin-chalcona Hembra. C2M: Pinostrobin-chalcona Macho
C3H: Sakuranetin Hembra C3M: Sakuranetin Macho.
Tabla Nº 15. Determinación de las condiciones generales en cada uno de los sistemas orgánicos de
los animales de experimentación tratados con la muestra.
Sistema
orgánico Observación y examen
Signos comunes de
toxicidad Resultado*
Nervioso Central
y Somatomotor
Comportamiento Agresividad inusual, pesadez
y sedación. 0
Movimientos Temblor, ataxia, catatonia,
parálisis, convulsión. 0
Reactividad a varios
estímulos
Irritabilidad, pasividad,
anestesia, hiperestesia 0
Reflejos cerebrales y
espinales Ausencia de reflejo 0
Tono Muscular Rigidez o flacidez 0
Nervioso
Autónomo Medida de la pupila Miosis, midriasis 0
Respiratorio Ventanas de la nariz
Descarga (coloreado y no
coloreado) 0
Carácter y rata Bradipnea, disnea 0
Cardiovascular Palpación de la región
cardiaca
Latido o pulsación,
bradicardia, taquicardia,
arritmia
0
Gastrointestinal
Eventos Diarrea, constipación 0
Forma abdominal Flatulencia, contracción 0
Consistencia de las heces y Sin forma, negro o color 0
58
color arcilloso
Genitourinario
Vulva, glándulas mamarias Hinchazón 0
Pene Prolapso 0
Región del perineo Sucia 0
Piel y pelaje Color, turgencia e
integridad
Enrojecimiento, flacidez,
erupciones, piloerección 0
Membranas y
mucosas Boca y conjuntiva
Congestión, hemorragia,
cianosis, 0
Ojos
Párpados Ptosis 0
Globo ocular Exostalmus, nistagmus, 0
Transparencia Opacidad 0
Otros
Temperatura rectal o de la
piel Anormal, incrementada 0
Sitio de inyección Hinchazón N/A
Condiciones generales Postura anormal,
emancipación 0
N/A = No aplica
*Grados de severidad: Sin lesión = 0, leve = 1, moderado = 2 y grave = 3
Tabla Nº 16. Registro del peso corporal de los animales de experimentación, tratados con la dosis
de 300 mg/Kg de cada compuesto bajo estudio, durante 14 días.
Grupo/Dia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 X±ES
Control 20,9 20,9 21,0 21,1 21,5 21,6 21,7 21,9 22,1 22,5 22,9 23,0 23,4 23,4 2,5
C2H1 20,6 20,6 21,0 21,0 21,0 21,1 21,4 21,4 22,7 22,6 23,4 23,6 24,7 24,7 4,1
C2H2 22,0 22,5 22,9 22,9 23,0 23,6 23,8 24,4 24,9 25,2 25,7 25,8 27,7 27,8 5,8
C2H3 19,9 20,1 20,0 20,1 20,1 20,1 20,4 21,0 21,2 22,0 22,2 22,5 23,3 23,3 3,4
Control 20,7 20,8 21,0 21,0 21,3 21,5 21,8 22,0 22,1 22,5 22,8 23,0 23,4 23,4 2,7
C2M1 19,1 19,7 21,4 21,7 22,9 24,8 25,4 27,1 28,0 29,4 29,4 29,5 29,9 29,9 10,8
C2M2 18,0 18,4 20,8 21,2 22,4 24,8 25,9 26,4 28,4 28,4 28,6 28,8 28,8 29,0 11
C2M3 21,7 21,9 22,9 22,9 23,6 25,1 25,3 26,3 26,6 28,3 28,4 28,4 28,6 28,6 6,9
59
Control 21,9 21,9 22,1 22,5 22,6 22,8 22,9 23,1 23,5 23,6 23,9 24,1 24,1 24,2 2,3
C3H1 18,0 18,4 19,9 20,7 21,7 22,3 22,7 24,0 24,0 24,7 24,7 25,1 25,6 25,6 7,6
C3H2 20,4 20,4 20,7 20,7 20,9 21,0 21,1 22,3 22,5 22,7 22,7 23,3 24,9 24,9 4,5
C3H3 21,3 21,4 21,7 21,9 22,0 22,7 22,7 22,9 23,0 23,5 24,0 24,1 24,3 24,4 3,1
Control 20,4 20,5 20,7 20,7 20,8 20,9 21,0 21,0 21,3 21,5 21,7 21,8 22,0 22,0 1,6
C3M1 19,1 19,8 21,3 22,3 24,6 25,9 27,1 28,0 28,8 30,3 29,7 30,0 29,9 30,1 11
C3M2 20,0 21,8 23,9 24,7 25,3 27,1 27,2 27,9 28,2 28,5 28,6 28,9 28,6 28,6 8,6
C3M3 21,0 21,4 23,1 23,9 25,9 26,5 27,4 27,8 28,1 28,8 28,9 29,0 29,1 29,1 8,1
Los valores representan el error estándar (X±ES) de cada uno de los grupos de ratones tratados con la muestra bajo estudio, a dosis de 300 mg/kg.
C2H: Pinostrobin-chalcona Hembra. C2M: Pinostrobin-chalcona Macho
C3H: Sakuranetin Hembra C3M: Sakuranetin Macho.
Figura 17. Ganancia de peso corporal de los animales de experimentación tratados con la dosis de
300 mg/Kg de cada compuesto bajo estudio, desde el inicio al final de la observación.
El aspecto y el color en la orina de cada uno de los animales empleados tanto en el grupo
control como en los tratamientos fue normal y no se encontraron cambios en el volumen de
excreción, ni presencia de hematuria en alguno de los grupos.
CONTR
OL
C2H
1
C2H
2
C2H
3
CONTR
OL
C2M
1
C2M
2
C2M
3
CONTR
OL
C3H
1
C3H
2
C3H
3
CONTR
OL
C3M
1
C3M
2
C3M
3
0
5
10
15
Difere
ncia
de p
eso
60
Las observaciones macroscópicas realizadas durante el sacrifico de los animales: parte
externa del cuerpo, incluyendo cavidad abdominal y su contenido: hígado, riñones,
glándulas suprarrenales, testículos, útero, ovarios, bazo, cerebro y corazón, no mostraron
daño visible o aparente en los órganos.
Figura 18: Observaciones macroscópicas realizadas después del sacrifico de los animales.
4.4.3 Discusión
La administración de una única dosis (300 mg/Kg) de Pinostrobin-chalcona y de
Sakuratenina, valorada durante 14 días de ensayo, no causó la muerte de ninguno de los
animales de experimentación empleados en los tratamientos o el control, ni se produjeron
signos aparentes de toxicidad que condujeran al sacrificio o el retiro de alguno de los
animales del estudio.
En cuanto al peso corporal no se presentaron cambios estadísticamente significativos con
relación al co