Almarza Castillo Jorge Luis
Comparación de los efectos inhibitorios de la urea y cloruro de guanidina sobre la actividad de la
ribonucleasa A
Universidad de Los Andes-Facultad de Ciencias-Postgrado en Química Aplicada. 2005. p. 49
Venezuela
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UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE CIENCIAS
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POSTGRADO INTERDISCIPLINARIO EN QUIMICA APLICADA
MENCIÓN ESTUDIO DE MATERIALES
Comparación de los Efectos lnhibitorios de la Urea y
Cloruro de Guanidina Sobre la Actividad de la
Ribonucleasa A
Lic. Jorge Luis Almarza Castillo Tutor: Francisco Brito, Ph. D.
Mérida -Venezuela Julio- 2005
D~GnTt\l~ZADO http://tesis. u la .ve
1 SERBIU'LA
1 Tullo Febree Cordero ¡ ________ -- ·-----... ·····--·
Comparación de los Efectos lnhibitorios de la Urea y
Cloruro de Guanidina Sobre la Actividad de la
Ribonucleasa A
Trabajo de grado realizado por el Lic. Jorge Luis Almarza
Castillo en el Laboratorio de Genética y Química Celular
bajo la tutoría del Profesor Francisco Brito y con la
colaboración del Profesor Luis Rincón (Grupo de Química
Teórica)
Mérida, Julio 2005
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
(]'ostgraáo Interáiscipllnario en Q]tímica )Ipticadá MENCIONES
MATERIALES/ ORGÁNICA/ POLÍMEROS
Voto Salvado y Razonado Dr. Gustavo A. Fermín M.
"3.1 Se menciona repetidamente en la monografía que es el primer, o tal vez único método basado en urea para la extracción de ARN total. La bibliografía en este sentido indica lo contrario, y yo mismo suministré artículos al respecto. Se omiten numerosas referencias y se evita así la discusión formal de este aspecto y el reconocimiento de quienes ya han brindado aportes en este campo.
"3.2 Al intentar validar el método que proponen, que sin duda debe tener algún valor para el tejido de interés, fuente del ARN analizado, se brindan muy pobres datos sobre la eficiencia del mismo y sobre la ausencia de contaminación por ADN que podría brindar resultados espurios.
"3.3 Por otro lado, parte fundamental del trabajo presentado en esta monografía (aparte de los cálculos teóricos) se refiere al efecto inhibidor de la urea sobre la actividad de la RNAsa A. Dada la importancia de las aseveraciones hechas en la monografía recomendé una discusión de antecedentes sobre el mismo efecto en otras enzimas y la enzima bajo estudio (existen referencias de las cuales también suministré algunas), que nunca fue atendida incurriéndose en lo que considero son las mismas faltas señaladas en el punto 3.1.
lel.-
Gustavo A. Fermin M. Profesor Agregado UlA
Postgrado lnterdisciplinario en Quimica Aplicada (PIQA). Facultad de Ciencias. Departamento de Quimica Universidad de Los Andes. Núcleo La Hechicera. Edificio "A". Mérida, Estado Mérida. Venezuela
Telefax: +58 274 240 e-mail: [email protected]
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UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
CJ>ostgraáo Interáisciplinario en Q!límica.Jlpficaáa MENCIONES
MATERIALES/ ORGÁNICA/ POLÍMEROS
Observaciones al Voto Salvado y Razonado del profesor Gustavo Fermín
3.1 En la introducción entre las páginas 6-8 se hizo una revisión exhaustiva (referencias 15-28) sobre los métodos de purificación del ARN y el impacto de diversos desnaturalizantes sobre la RNasa, así que, en ningún momento, se evitó la discusión formal de ese aspecto y mucho menos el reconocimiento a los autores con aporte en ese campo. Las referencias aportadas por el profesor Fermín fueron la 23, 25 y 26. Para cada uno de esos trabajos se hizo un análisis: la 23 utilizó el detergente Catrimox 14 para limpiar la muestra de otros componentes macromoleculares que contaminaron al ARN por el uso de LiCI, es decir el producto de la purificación antes del uso del detergente resulta contaminado. El método propuesto por el Lic. Almarza muestra un ARN libre de impurezas y realizado con menos pasos de purificación. La 25 confirmó lo que se sostuvo sobre la purificación de Auffray y Rugeon (27) que utilizaron combinaciones de 8M urea 4M LiCI y 6M urea 3M LiCI respectivamente (en el buffer de extracción), y que era una contaminación constante con proteínas, ya que concentraciones tan altas de LiCI en combinación con la urea terminaban precipitando proteínas, como lo sostiene Ahmad (16) en estudios de cálculos termodinámicos del flG de inactivación de la RNasa con LiCI como agente inactivante de proteínas, y no como agente precipitante de RNA. La referencia 26 es esencialmente el método de Auffray (27) al que se le introdujo la modificación de agregarle el detergente SOS, es decir agregándole un tercer reactivo desnaturalizante a la purificación lo que hace más compleja la explicación sobre quien es el agente que precipita a las proteínas en conjunto con el ARN. El insistir repetidamente en la monografía sobre la originalidad del método de la urea se basó en que este es el primer reporte de la utilización de la urea exclusivamente (en el buffer de extracción) y en ausencia de otro agente desnaturalizante para inhibir e inactivar la RNasa en diferentes tejidos.
3.2 En materiales y métodos, en la página 16, la segunda nota explica de manera clara y diáfana la no contaminación con ADN, además de citar a la referencia 22 que utilizó el mismo criterio para descartar contaminación con ADN. La referencia 26 sugerida por el profesor Fermín, utiliza también, un criterio idéntico al que se usó en esta monografía para descartar contaminación con ADN. Además la ausencia de ADN genómico fue descartada de igual forma por la no amplificación de bandas de ADNc, de 13-actina, proveniente de dianas de ADN (página 16 y página 31 Fig. 12) En resultados y discusión, en las páginas 27 y 28 (tabla V) se muestran los rendimientos obtenidos con la utilización de los métodos estándar y mundialmente aceptados para la purificación de ARN (18· 28), así que decir que los datos son pobres es contradecir lo que miles de autores usan como criterio cotidiano, a nivel mundial, en la purificación de ARN. Es necesario hacer notar que el método
31 Figs. 11 y 12 respectivamente) y no es exclusivo para cotiledones de cacao. . también funcionó en hojas de lechosa y células de hígado de rata (página 29 tabla VI, páginas 30 y . ~
3.3 En las páginas 4 y 5 de la introducción y la página 31 de resultados y discusión se discute~ I.J V: ampliamente sobre los efectos desnaturalizantes de la urea sobre la estructura terciaria de la~ '{í.í' proteínas y en especial sobre la RNasa (desde Anfinsen en 1957 hasta Wu y Wang en 2003, rw· referencias 12-17, 31-40, 46-51). Nuevamente, se puede decir que no se evitó la discusión formal del asunto y mucho menos que no se le dan créditos a los que contribuyeron con anterioridad al desarrollo de ese conocimiento. En lo que respecta a la referencias sugeridas por el profesor Fermín se puede decir que recomendó (1.- Properties of a partially purified RNase from cow pea cotyledons, lel.- 3/4
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(J>ostgraáo 1 nteráisciptinario en Q!límica )fpticaáa MENCIONES
MATERIALES/ ORGÁNICA/ POLÍMEROS
Gomes Filho et al., R. Sras. Fisiol. Veg. 6: 27-31, 1994. Y 2.- 31 P and 1H NMR studies of the effect of the counteracting osmolyte trimethylamine-N-oxide on interactions of urea with RNase A, Palmer et al., JBC 275:27708-27711, 2000). Ambas referencias no fueron tomadas en cuenta ya que una (1) encuentra inhibición de la actividad de la RNasa con urea después de tratar la enzima por media hora en 6M de urea a 30 °C. En el caso de la monografía se encuentra inhibición de la cinética de la RNasa a 0.5M de urea sin ningún pretratamiento previo con urea, es decir se analiza la urea como inhibidor y no como desnaturalizante. En la referencia 2 se estudia el efecto de la urea sobre la RNasa dentro del criterio de la desnaturalización de la proteína que tiene un efecto sobre la cinética de la enzima y no dentro de la propuesta de la monografía que tiene que ver con la inhibición de la actividad enzimática de la RNasa. El trabajo de Palmer et al. cita a Holland et al. Evolution of Lactate dehydrogenase-A homologs of barracuda fishes (Genus Sphyraena) from different thermal enviroments: Differences in kinetic properties and thermal stability are due to amino acid substitutions outside the acive site. Biochem. 36: 3207-3215, 1997 como la que da la explicación del efecto de un cambio estructural en secuencias de la proteína situadas fuera del centro activo que inciden en la cinética de la enzima. Sin embargo, el trabajo de Holland et al. se limita a dar una explicación por cambios térmicos en el medio ambiente en que se encuentra la proteína y que tendrían un efecto en la cinética de la enzima y no por el efecto inhibitorio de la urea, que es lo que propone la monografía.
Dadas las aclaratorias anteriores, el resto del jurado constituido por los profesores Francisco Brito (Tutor y presidente del Jurado) y Bernardo Fontal (Jurado principal) hemos considerado no poner objeciones ni de forma ni de fondo al contenido de la monografía, después de los señalamientos hechos por el profesor Fermín en su voto salvado y razonado.
lel.-
Profesor Francisco Brito, Ph.D (Jurado Principal)
~o~ (Jurado Principal)
Postgrado lnterdisciplinario en Química Aplicada {PIQA). Facultad de Ciencias. Departamento de Química Universidad de Los Andes. Núcleo La Hechicera. Edificio "A". Mérida, Estado Mérida. Venezuela
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4/4
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad de Los Andes
Al laboratorio de Genética y Química Celular (GeQuimCel)
Al FONACIT (proyecto No. 2000001576)
Al los Profesores:
• Francisco Brito, Ph.D por todo el apoyo y su confianza brindada
• Bernardo Fontal, Ph.D por enseñarme otra perspectiva de la naturaleza
• Dr. Luis Rincón por la realización de los cálculos teóricos y por su contribución
durante la interpretación de los mismos
• Pedro Jiménez, Ph.D por su cooperación durante la escritura de este manuscrito
• Gustavo Fermín por mostrar hasta donde puede llegar un investigador cuando le
da la espalda a la objetividad, ética profesional y sobre todo a la racionalidad.
A mis amigos de la universidad: Armando Briceño, Carlos Romero (Rigo ), Juan Parada,
Carie V alecillos, David Quintero, Carmelo Rosquete y a todas aquellas personas que me
brindaron su amistad sincera ... gracias
Al personal del laboratorio de Genética y Química Celular (GeQuimCel), Lic. María
Theresa Hoyer, Sonia Morales, Oliva.
La unión de la química cuántica con la bioquímica origina las herramientas que permitirán descubrir muchos de los secretos ocultos en la naturaleza, además de entenderlos mejor ...
Resumen
Compuestos como la urea y el cloruro de guanidina son muy efectivos, a
concentraciones de 8M, para destruir las interacciones no covalentes de las proteínas
aunque sus mecanismos de acción no están claros. El amplio uso de estos
desnaturalizantes sobre las proteínas ha permitido la obtención de datos cuantitativos de
las energías libres de desnaturalización de la ARNasa con urea y guanidina,
detenninándose el valor de 4.7 kcallmol para ambos compuestos. En la actualidad no se
sabe si la urea, por su capacidad de enlazarse favorablemente con electrófilos, puede
interaccionar con aminoácidos específicos de la ribonucleasa presentes tanto en el sitio
de reconocimiento del sustrato como en el centro activo, pudiendo así generar una
posible inhibición de la enzima. En el presente trabajo se llevaron a cabo comparaciones
de los valores teóricos calculados de dureza-blandura de Pearson y las energías
HOMO/LUMO, de aa protonados (presentes en el centro catalítico y de reconocimiento)
con agentes desnaturalizantes (urea y cloruro de guanidina). Los cálculos mostraron que
la interacción HOMO/LUMO y de dureza/blandura de los aa H y K (ambos protonados)
con la urea, es más favorable que la interacción de estos aa con el cloruro de guanidina.
Estos resultados fueron concordantes con la cinética de degradación del ARN por la
RNasa A en presencia de estos compuestos, donde se pudo observar que la inhibición de
la enzima fue absoluta a 0.5 M de urea en comparación con el control (sin urea ni
guanidina). Sin embargo, la velocidad de degradación del ARN en presencia de
guanidina fue ligeramente más baja que en el control; por lo tanto, la guanidina ejerce
una inhibición párcial sobre la catálisis de la RNasa A. Este trabajo es probablemente el
primer reporte que propone una explicación desde el punto de vista catalítico y cuántico
de la acción de la urea sobre la ribonucleasa, la cual usualmente se limita, solamente, a
los efectos caotrópicos del compuesto sobre el plegamiento de la enzima. Este trabajo'
tiene aplicaciones inmediatas en las extracciones de ácido ribonucleico para estudios
gcnómicos, de expresión y regulación génica. Además, el desarrollo de métodos basados
en el uso de urea tienen un beneficio adicional, por resultar en sistemas de purificación
económicos al compararlos con el método basado en el uso de cloruro de guanidina.
Abstract
Compounds as urea and guanidine chloride are very effective for disturbing non coval'ent
interactions inside protein structure when they are used at high concentrations (8M). Their
action mechanisms remain no clearly and need to be established. Using these denaturant
agents on proteins allowed to gain quantitative data on free energy for RNase denaturation
by urea and guanidine chloride, these values were determined as the same for both
compounds ( 4. 7 Kcallmol). Currently it is not clear if urea is able to inhibit the enzyme by
interacting with specific amino acids present in either in the recognizing or in the active
si te, as a consequence of its ability of binding electrophilics. In this work, Pearson 's hard
and softness theoretical values and HOMO/LUMO energies for the protonated amino acids
(present in both the catalytic and the recognition sites) and for denaturant agents (urea and
guanidine chloride) were compared. The results obtained above support the idea that
interactions between amino acids H and K (both being protonated) with urea are more
favorable than interactions with guanidine chloride. These theoretical calculations were
coJToborated by results ofRNA degradation kinetics using RNase A with urea or guanidine
chloride, when urea at 0.5 M completely inhibited the enzyme. Besides that RNA
degradation rate was lower than controls when guanidine chloride was assayed, then
guanidine chloride seems to be a partial inhibitor of RNase A. This work propases an
explanation from the catalytic and quantic points ofview for the action ofurea on RNase A
which is different to the usual explanation based on chaotropic effect on the enzyme
folding. Results of this· work have immediate applications on ribonucleic acids purification
protocols for genoriüc, gene expression, and genetic regulation research because of the
using ofurea into them render a cleaner product ata lower price ..
Lista de abreviaturas
aa: Aminoácido
ADN: Ácido desoxiribonucleíco
AIM: Atoms In Molecules (átomos en la molécula)
ARN: Ácido ribonucleico
DEPC: Dietilpirocarbonato
dNTP: Desoxirribonucleótido trifosfato
EDTA: Ethylene-Diamine-Tetraacetic A cid (ácido etilen-diaminotetraacético)
H: Histidina
HOMO: Highest Occupied Molecular Orbital (orbital molecular más alto ocupado)
K: Lisina
LUMO: Lowest Unoccupied Molecular Orbital (orbital molecular más bajo no
ocupado)
MES: [2-(N-Morpholino )-Ethane-Sulfonic Acid] (ácido morfolino-etanosulfónico)
MOPS: [3-(N-Morpholino)-Propane-Sulfonic Acid] (ácido morfolino
propanosulfonico)
OM: Orbital Molecular
PCR: Polymerase Chain Reaction (reacción en cadena de la polimerasa)
R: Arginina
RT: Reverse Transcription (transcripción reversa)
TCA: Tricloroacetic acid (ácido tricloroacético)
Índice de contenido
Introducción
Estructura de la ribonucleasa A .................................................................................. 1
Presencia de subsitios de la ribonucleasa A y su impmiancia en el mecanismo
catalítico ..................................................................................................................... 2
Urea y guanidina como agentes desnaturalizantes ..................................................... 4
Objetivos, justificación e hipótesis ............................................................................. 9
Materiales y métodos
Material biológico ..................................................................................................... 1 O
l. Cálculos teóricos ................................................................................................... 1 O
II. Cinética de la ribonucleasa A y ribonucleasa I ................................................... 1 O
II.A.l Cinética de la ribonucleasa A ........................................................................ 11
II.A.2 Detenninación de la absorbancia óptima de nucleótidos fosforilados ........... 12
II.B Cinética de la RNasa I .................................................................................... 13
liLA Metodología de extracción de ARN con urea ................................................. 14
III.B Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) ................................................... 15
Resultados y discusión
l. Teoría química y bioquímica ............................................................................... 17
ll. Cinética enzimátlca (RNasa A y RNasa J) ........................................................... 22
II.A.l Cinética de la RNasa A .................................................................................. 22
II.A.2 Determinación de Absorbancia óptima de nucleótidos fosforilados .............. 25
IJ.B Cinética de la RNasa I ....................................................................................... 26
III.A Sistema de purificación de ARN en base a urea .............................................. 27
III.B RT_PCR a partir de muestras de ARN total .................................................. 30
Conclusiones ............................................................................................................. 32
Bibliografía ............................................................................................................... 33
lndice de figuras
Figura l. Modelo esquemático tridimensional del complejo RNasa y d(pA)4
mostrando las interacciones electrostáticas que enlazan al polinucleótido en
la superficie de la proteína .......................................................................................... 1
Figura 2. Diagrama esquemático del sitio activo de la RNasa y los subsitios
cercanos ...................................................................................................................... 2
Figura 3. Estructura tridimensional del complejo ribonucleasa-d(ATAAG)
donde se indican los subsidios P-1, PO, P 1, P2 ........................................................... 3
Figura 4. Mecanismo de tranfosforilación (arriba) e hidrólisis (abajo) del
ARN por la RNasa A .................................................................................................. 4
Figura 5. Velocidad de liberación de oligonucleótidos: controles (abajo) y
8M de urea (an-iba) en presencia de la RNasa ............................................................ 5
Figura 6. Representación esquemática de la interacción de orbitales fronteras
entre urea y/o guanidina protonada con H y/o L (ambas protonadas) ...................... 19
Figura 7. Cinética de inhibición de la RNasa medida como incremento de la
absorción a 290 ntn .................................................................................................. 22
Figura 8. Cinética de inhibición de la RNasa medida como incremento de la
absorción a y 280 nm ................................................................................................ 23
Figura 9. Cinética de inhibición de la RNasa medida como incremento de la
absorción a 260 nm· ................................................................................................... 24
Figura 1 O. Cinétíca de inhibición de la RNasa I seguida por incremento de la
absorción a 290 nn1 ................................................................................................... 26
Figura 11. Electroforesis en gel de agarosa del ARN total aislado por dos
n1étodos diferentes .................................................................................................... 30
Figura 12. Productos amplificados por RT-PCR del gen de ¡3-actina, a partir
de ARN total aislado por el método de urea de diferentes tejidos ............................ 31
11
Índice de tablas
Tabla I. Composición de las soluciones utilizadas para la determinación de las
absorbancias óptimas de los nucleótidos libres fosforilados en buffer MOPS
Para el cálculo del factor GQ . ................................................................................... 12
Tabla II. Energías calculadas de orbitales fronteras, cargas AIM y momentos
dipolares para la urea, guanidina protonada, histidina protonada y lisina
protonada a nivel RHF/6-31G(d) .............................................................................. 18
Tabla III. Variación del pH en función de concentraciones crecientes de urea
en buffer acetato y buffer MOPS .............................................................................. 21
Tabla IV. Valores de GQ y absorbancias de los dNTPs a longitudes de ondas
distintas en buffer MOPS en presencia y ausencia de TCA ..................................... 25
Tabla V. Rendimiento de ARN total extraído a partir de embriones de cacao
usando dos métodos de aislamiento ....................................................................... 28
Tabla VI. Rendimiento y relación de absorbancia de muestras de ARN total
purificado a partir de hojas de lechosa e hígado de rata por el método de urea ....... 29
Ill
Introducdón
El ácido ribonucleico (ARN), es un biopolímero implicado en la transferencia de
información biológica y su tiempo de vida media in vivo está a menudo determinado por
la velocidad de su degradación enzimática por parte de las ribonucleasas (1). Por esta
razón la inhibición de las ribonucleasas (RNasas) es un paso clave en la purificación del
ARN de cualquier tejido.
La RNasa que ha sido objeto de mayor estudio es la ribonucleasa A, obtenida del
páncreas bovino. Al igual que muchas ribonucleasas de mamíferos, ésta es secretada al
intestino delgado donde hidroliza ciertos enlaces de los ácidos ribonucleicos presentes
en la ingesta. La RNasa A bovina tiene un peso molecular de 13.7 kDa y su estabilidad
tridimensional es proporcionada principalmente por cuatro puentes disulfuro (2).
Estructura de la RNasa A
Por estudios de complejos cristalinos de la RNasa A con tetra-desoxi-fosfoadenosinas
como análogo del sustrato [d(pA)4] y resueltos por difracción de rayos-X (3), se
determinó la presencia de un canal o multisitio extendido de aa cargados en la superficie
de la proteína (K7, K41 , K66, R85, R39, K91, K98, R33 y K31). El canal donde están
situados estos aa ejerce una interacción electrostática con los grupos fosfatos del sustrato
(figuras 1 y 2). Además, estos investigadores sugieren, la existencia de motivos para el
reconocimiento de las ribosas y bases nitrogenadas en la proteína, jugando estos un
papel mayor en la especificidad enzimática (3).
Figura l . Modelo esquemático tridimensional del complejo RNasa y d(pA)4, mostrando las interacciones electrostáticas que enlazan al polinucleótido en la superficie de la proteína [tomado de (3)]
1
Presencia de subsitios en la ribonucleasa A y su importancia en el mecanismo
catalítico
Existe evidencia de la presencia de algunos subsitios distintos al sitio catalítico que están
involucrados en la formación del complejo enzima-sustrato (figura 2). Se ha propuesto la
existencia de de tres subsitios en la RNasa A (B 1, B2 y B3) que interaccionan
específicamente con las bases nitrogenadas del ARN (4, 5). El subsitio B 1 se enlaza
aparentemente sólo a nucleótidos de pirimidinas y se ha demostrado que tiene una
mayor afinidad (~ 30 veces mayor) para citidinas que para uridinas. Las evidencias
sugieren que la especificidad de la enzima por las pirimidinas, se debe a la exclusión de
las bases de purinas por este subsitio, mientras que los subsitios B2 y B3 se unen tanto a
pirimidinas como a purinas aunque muestran tener preferencia por las últimas (6-8).
Se ha mostrado evidencia de la presencia en la enzima de otros tres subsitios (Po, P1 y
P2) que interaccionan con los grupos fosfatos del sustrato. El subsitio P 1 está constituido
principalmente por los residuos involucrados en la función catalítica (H12, H119 y
K41 ), mientras que los residuos de aa de los subsitios Po (Lys66) y P2 (L 7 y R 1 O)
incrementan la afinidad de unión por el sustrato y participan indirectamente en la
catálisis (9).
Thr-45 Phe-120
·s, Ser-123
~ \Jl c~o B,
/-o-c~,0 ~Ó- :CNH1
p,"' N j N
lys-66 : l o, OH¡_ < ) ~.-, ''1 N N B,
1 -o-c~0 ~ Ó· NH1 p,~ \. 1'1 N0N
LYI·4l Á' 0\0~ < A .. ) Hos-1l9 1/ N N
H•s-12 ¡-o-c~0 ~,{. ~ p,-~
Lys-7 R, O OH Atg-10 \
Figura 2. Diagrama esquemático del sitio activo de la RNasa y los subsitios cercanos (5)
2
Algunos datos apoyan la existencia de un sitio de unión adicional a los comentados con
anterioridad. Con la ayuda de ensayos cinéticos y termodinámicos, se encontró que en
el extremo de la cadena polipeptídica, el residuo R85 interacciona con un grupo fosforil
del sustrato unido (9), por lo que estos autores concluyen que este residuo forma parte de
un nuevo subsitio denominado P (-1) (figura 3)
Figura 3. Estructura tridimensional del complejo ribonucleasa-d(A T AAG) donde se indican los subsidios P-1(amarillo), PO(verde), Pl(azul), P2(rojo). Modificado a partir del modelo presentado por Fisher et al. (9) 2005.
En 1994 se propuso un mecanismo catalítico de transfosforilación (paso 1) e hidrólisis
(paso 2) para la RNasa (10) en donde están involucrados los resíduos H12 y H119
(figura 4). La RNasa A se une a las bases del ARN en los tres subsitios B y cataliza la
ruptura del enlace P-05' unido específicamente sobre el extremo 3' de los nucleótidos
que están enlazados al subsitio B1 (ver figuras 2 y 4) quedando el fosfato unido al
enlace en posición 3' del nucleótido que está inmediatamente enlazado al sustrato y el
nucleótido escindido queda hidroxilado en la posición 5' terminal.
3
A: +
H-0
\NA,.
Figura 4. Mecanismo de tranfosforilación (arriba) e hidrólisis (abajo) del ARN por la RNasa A. En la figura, A conesponde a la H12 y 8 a la H119 (11).
Urea y Guanidina como agentes desnaturalizantes
Compuestos como la urea y el cloruro de guanidina son muy efectivos para destruir las
interacciones no covalentes de las proteínas aunque sus mecanismos de acción no están
claros. Las cadenas polipeptídicas en presencia de estos agentes (urea 8M y guanidina
6M) adoptan estructuras al azar como lo muestran sus propiedades físicas estudiadas por
dicroísmo circular (12).
La urea ejerce un iinpacto significativo no solo a nivel de la ribonucleasa sino también
sobre su sustrato· (13, 14). Con base en sus resultados, estos investigadores llegan a las
siguientes conclusiones:
• La urea interrumpe las estructuras secundarias y los agregados del ARN que se
forman en solución acuosa, pem1itiendo la relajación de las cadenas
polinucleotídicas incrementando su concentración disponible.
• Bajo las condiciones experimentales usadas (buffer acético/acetato pH 5 y buffer
fosfato pH 7 ambos en 8M de urea), la formación de oligonucleótidos es
incrementada cuando la RNasa actúa sobre el ácido ribonucleico en presencia de
urea (Figura 5).
4
Absorbancia ARN + UREA (buffer pH 5.0) 1.2
9 ARN +UREA (buffer pH 7.0)
.6
.3 ARN (pH 7)
LL~~~====:===r ARN (pH 5) 4
Tiempo (minutos)
Figura 5. Velocidad de liberación de oligonucleótidos: controles (abajo) y 8M de urea (an·iba) en presencia de la RNasa. Los bufferes usados fueron O.lM acetato pH 5 y 0.1 M fosfato pH 7 (13)
Estos trabajos sobre la cinética de la actividad de la RNasa (13,14), probablemente,
fueron importantes a la hora de diseñar sistemas de purificación de ARN, descartando la
posibilidad del uso de la urea como agente caotrópico y tomando más en consideración
el uso de cloruro de guanidina.
En 1986, Pace (citado en 15) propone la desnaturalización con urea y cloruro de
guanidina a altas concentraciones, como una de las primeras vías para medir la
estabilidad conformacional de las proteínas. El amplio uso de estos desnaturalizantes
sobre las proteínas, ha pennitido la obtención de datos cuantitativos de las energías
libres de desnaturalización para el caso de urea y guanidina; el valor para la RNasa en
estos casos fue determinado en 4.7 kcal/mol para ambos compuestos (16). Sin embargo,
la naturaleza exacta de la interacción molecular de estos desnaturalizantes con la
proteína no está· bien entendida. No está claro aún si ellos actúan directamente
enlazándose a la proteína o indirectamente por su efecto sobre el solvente (15).
Se han propuesto muchos modelos para tratar de explicar la interacción directa de la
urea con la proteína, pero estos no explican como las proteínas superan la barrera
energética para llevar a cabo el desplegamiento. Se considera que la urea pudiera
enlazarse a la proteína y competir con las interacciones nativas que estabilizan las
proteínas y de éste modo participar activamente en procesos de desplegamiento.
Alternativamente, se ha propuesto que la urea actúa indirectamente alterando el medio
5
ambiente del solvente, debilitando así el efecto hidrofóbico y facilitando la exposición
de los residuos del interior de la proteína (17).
Todos los métodos de purificación de ARN incluyen el uso de algún agente precipitante
o inactivador de enzimas, con el fin de desnaturalizar, por desplegamiento, la estructura
tridimensional de las proteínas presentes en los extractos celulares de los tejidos en los
cuales se quiere aislar el ARN. El énfasis de todos estos métodos siempre ha estado
centrado en la desnaturalización de la RNasa para evitar la hidrólisis del RNA y de esta
manera aumentar los rendimientos de purificación en ARN. En el pasado se utilizaba
comúnmente el fenol (18) o la mezcla fenal cloroformo (19) como agentes
desproteínizantes. En los últimos veinte años el uso de desnaturalízantes orgánicos como
son el cloruro de guanidina (20) y el tiocianato de guanidina (21,22) se han impuesto
como los desnaturalizantes usualmente utilizados en los protocolos de purificación de
ARN. También ha sido frecuente el uso de detergentes como coadyuvantes en la
inactivación de la RNasa y otras proteínas, en los búferes de extracción de ARN y entre
éstos podemos mencionar al SDS, el bromuro de cetryltrimetilamonio, catrímox -14 y el
N-lam·il sarcosinato de sodio (20, 21, 23). Una variante de estos métodos es la
utilización de un método fisico para el aislamiento del ARN: en vez de precipitaciones
con agentes químicos se usa la ultra centrifugación con cloruro de cesio. El extracto
celular es tratado con agentes desnaturalizantes de proteínas como son el tiocianato de
guanidina (21) o el detergente N-lauril sarcosinato de sodio (24) para la inactivación de
la RNasa. Luego el extracto es sometido a ultra centrifugación, en un gradiente de
cloruro de cesio, hasta que se establece un equilibrio de sedimentación por densidad
entre el ARN y una cierta concentración del CsCl (24). Este método tiene la desventaja
de tener que utilizar ultra centrifugación por tiempos largos (16-18 horas), lo que lo hace
inoperante para múltiples muestras además de ser inadecuado para grandes cantidades de
tejido (19, 25). El rendimiento de este método es reducido por el bloqueo que establecen
las proteínas y el ADN en la interfase entre el gradiente de CsCI y el buffer de
extracción-CsCl, el cual atrapa al ARN y tennina contaminando al precipitado de ARN
(25). Actualmente se están utilizando combinaciones de agentes caotrópicos como son
las mezclas de urea y cloruro de litio a altas concentraciones entre 3.0 y 8.0 M; estos
6
métodos incluyen además el uso de detergentes como el SDS, otro reactivo
desnaturalizante de las RNasas (23, 26). Los métodos, con base a mezclas, fueron
desarrollados a partir de una metodología diseñada por Auffray y Rougeon en 1980 (27)
donde utilizaron las propiedades caotrópicas de la urea y el cloruro de litio (agentes
desnaturalizantes a concentraciones de 3.0 M) para producir la desnaturalización de la
RNasa, sin embargo el ARN purificado por este método siempre muestra contaminación
con proteínas (25). Es probable que la mezcla de urea y cloruro de litio, en el buffer de
homogenización, actúe combinando las acciones del agente desnaturalizante orgánico y
la alta concentración de la sal de litio (también actuando como agente caotrópico) en la
precipitación masiva de proteínas presentes en el extracto, esta precipitación no selectiva
incluiría a la RNasa y también al RNA. Esto último de alguna manera fue confirmado
por Scott et al. (23) quienes usaron catrimox-14 para separar al RNA de otros
componentes macromoleculares; muy a pesar de usar el LiC]z separadamente de la urea.
Las sales de litio han sido estudiadas como agentes desnaturalizantes de la RNasa y el
cloruro de litio presenta un L'lG de inactivacion 2. 7 más grande que el cloruro de
guanidina y la urea para esta enzima (16). Con base a lo anterior no se puede discernir si
el efecto inactivador de la mezcla es por efecto de la urea o del cloruro de litio. Es muy
probable que una concentración de cloruro de litio de 8.0 M como la que utiliza Scott et
al. (23) precipite no solo a las proteínas sino también a otros componentes
macromoleculares, como podría deducirse de los resultados de Bugos et al. (28) quienes
infructuosamente utilizaron diversas precipitaciones con cloruro de litio para tratar
incrementar la relación A2 6o/A2so en ARN purificado de material vegetal. Bugos et al.
(28) sugieren que el ARN purificado, de algunos de los tejidos que ellos utilizaron,
podría estar contaminado con polisacáridos y polifenoles y el cloruro de litio les
coprecipitó el ARN junto con estos componentes. Cuando variaron su metodología para
eliminar, previamente, al uso del cloruro de litio, los polisacáridos y polifenoles
encontraron una mejora en la relación A26o!A28o, confirmando así que el cloruro de litio
no solo precipita al ARN de alto peso molecular, sino que también es capaz de precipitar
otros componentes del extracto (28). La relación A260/A 280 la incrementaron desde 1.7
7
hasta 1.9 utilizando LiCh después de varios pasos de separación para eliminar los
contaminantes (28).
Probablemente la urea por su capacidad donadora intrínseca pueda unirse con mayor
afinidad a los aminoácidos cargados presentes tanto en el sitio de reconocimiento como
en el sitio catalítico de la RNasa, pudiendo así disminuir la velocidad de reacción de la
enzima. Este tipo de interacción de la urea con aa específicos de la proteína puede ser
estudiada de manera detallada con la ayuda de teorías químicas, como la teoría de
orbitales moleculares fronteras y la teoría de dureza-blandura de Pearson (29-32). A
través de comparaciones de los valores de sus orbitales moleculares más altos ocupados
(HOMO) y sus orbitales moleculares más bajos desocupados (LUMO), se puede conocer
la posibilidad que tienen dos moléculas para fonnar interacciones favorables.
En la actualidad no se conocen métodos eficientes de purificación de ARN total basados
solamente en urea como agente inactivador de la RNasa, por el uso tan generalizado y de
f01ma casi universal que tienen los procedimientos con base al cloruro de guanidina. La
única mención a la urea como agente desnaturalizante en una purificación de ARN la
hicieron Auffray y Rougeon (27) en 1980 (otros autores esencialmente siguen la
metodología de Auffray y Rougeon). Sin embargo, Auffray y Rougeon (27) no
mencionan su método como exclusivo de la urea, sino que ellos utilizaron una
combinación de urea y cloruro de litio y defienden esta combinación corno la mas
eficiente para purificar ARN. Al trabajo de Auffray y Rougeon se le han hecho críticas
que indican que el método no es eficiente por presentar contaminación con proteínas
(25). La alta reactividad de ·la urea, mencionada anteri01mente, ha sido utilizada
intensamente en estudios de plegamiento/desplegamiento de proteínas pero no se ha
tomado en cuenta para estudios de inhibición enzimática de la RNasa. Wu y Wang (15)
llevaron a cabo experimentos cinéticos con la RNasa y la papaína en presencia de urea.
Ellos sugieren que el efecto de la urea en estas enzimas puede ser descrito por el modelo
de unión desnaturalizante en contraposición al modelo del efecto de la urea sobre el
solvente con el concomitante desplegamiento de la enzima.
Tomando en cuenta el potencial de la urea para interaccionar con los aminoácidos del
centro activo y de reconocimiento de la RNasa es posible usar sus propiedades
8
(comentadas anteriom1ente) para desarrollar nuevos sistemas de purificación de ácido
ribonucleico basados en la utilización de la urea. En el presente trabajo, con la ayuda de
programas computacionales de química teórica (33), y con la ayuda de estudios
cinéticos de la enzima ribonucleasa, se tratará de inferir el efecto de la urea sobre la
actividad catalítica de la RNasa A y la ribonucleasa I de Escherichia coli, con miras a
desarrollar un sistema de aislamiento de ARN total tan eficiente como el sistema basado
en cloruro de guanidina y posiblemente más económico.
Objetivos
>- Realizar estudios teóricos comparativos de la reactividad de la urea y guanidina
frente a aminoácidos involucrados en los sitios de reconocimiento y catalítico de
la enzima ribonucleasa
>- Estudiar los efectos de la urea y el cloruro de guanidina sobre la actividad de la
RNasa mediante ensayos de cinética enzimática
>- Proponer un sistema de purificación de ARN total utilizando urea.
Justificación
Los sistemas de purificación de ARN con la ayuda de cloruro de guanidina y tiocianato
de guanidina son efectivos pero costosos y de bajo rendimiento (19-21, 25, 28). Esto
hace importante tratar de conocer el mecanismo de interacción de la urea y el cloruro de
guanidina con la ribonucleasa, pues permitirá el diseño de sistemas de purificación de
ARN total con rendimiento y calidad adecuados para estudios de expresión genética, los
cuales darán beneficios sustanciales para los laboratorios que trabajan con bioquímica y
biología molecular de ARN.
Hipótesis de trabajo
Si los valores teóricos calculados, de HOMO-LUMO y dureza-blandura para la
molécula de urea y para los aa cargados del sitio de reconocimiento y catalítico de la
RNasa, pem1iten predecir interacciones termodinámicamente mas favorables que los
valores calculados para el cloruro de guanidina, entonces, la urea puede ser considerada
una molécula con mayor potencial para inhibir la ribonucleasa por la fom1ación de
aductos con aa fundamentales para la actividad catalítica de la enzima.
9
Materiales y métodos
Material biológico
I. Enzimas:
Ribonucleasa A de páncreas bovino de SIGMA_ tipo IA-S
Ribonucleasa l (RNase ONETM) de E. coli de Promega
II. Sustrato: Ácido Ribonucléico de levadura para análisis bioquímico (Merck)
III. Las extracciones de ARN total de plantas fueron hechas a partir de:
• Hojas de lechosa: un cultivar propagado in vitro aclimatado en invernadero
(cultivar I) y otro silvestre (cultivar II)
• Embriones inmaduros ( ~ 3 meses de edad) de cultivares de cacao criollo (cultivar
l) y cacao forastero (cultivar II).
• Además, se usó como fuente de tejido animal hígado de rata.
Metodología
l. Cálculos teóricos
II. Cinética de la ribonucleasa
III. Método de extracción de ARN total
l. Cálculos teóricos
Los cálculos de orbitales moleculares (OM), la optimización de geometrías a nivel
RHF/6-31 G( d) fueron hechos usando el programa Gaussian 98 (33). Las cargas atómicas
en las moléculas y los momentos dipolares fueron hechos también con el mismo
programa.
II. Cinética de la ribonucleasa A y ribonucleasa 1:
Se optimizaron las condiciones para realizar la cinética de ambas enzimas. La actividad
de la RNasa se midió con base en la liberación de oligonucleótidos solubles en función
del tiempo. Para hacer una medición mas confiable se precipitó todo el ARN de alto
peso molecular con la ayuda de 50% TCA (34) se incubó en frío y se centrifugó 3 mina
máxima velocidad en una microcentrífuga.
10
II.A.l Cinética de la RNasa A
A partir de los procedimientos propuestos por Kalnitsky (13), Kunitz (35) y Shultz (36),
se optimizaron las condiciones para obtener una metodología que permitió medir la
actividad de la enzima RNasa A en estudio:
l. En un tubo de 1.5 mL se agregaron 125 f'vL de RNasa A (16 ng//)vL en 0.1 M buffer
MOPS pH 7.5) y se incubó a 37 °C por 5 min.
2. Se añadieron 125 /)vL de 1% ARN de levadura (en 0.1 M buffer MOPS pH 7.5) para
comenzar la reacción
3. Se incubó a 37 oc a distintos tiempos: O, 1, 2, 3 y 4 minutos.
4. La reacción se detuvo con 125 fJvL de TCA al 50%
5. Se incubó por 5 minutos a O °C
6. Se centrifugó por 3 minutos a 14.500 rpm en una microcentrífuga y se midieron las
absorbancias a 260, 280 y 290 nm.
Notas:
- EL stock de la ribonucleasa se preparó a una concentración de 1 O /)vgl fJvL,
resuspendiendo los cristales (50-1 00 unidades Kunits/mg de proteína) en 0.1 M de
acetato de sodio pH 5.2. A partir de este stock se prepararon las cantidades adecuadas
en los tratamientos utilizados para medir la actividad de la enzima.
-Para determinar la actividad de la ribonucleasa se utilizaron los siguientes tratamientos:
0.5 M urea en O. 1 M buffer MOPS, pH 7.5 + 5 mM MgCh + ARNasa + ARN
0.5 M clomro de guanidina en 0.1 M buffer MOPS, pH 7.5 + 5 mM MgClz +
ARNasa+ARN
0.1 M buffer MOPS, pH 7.5 + 5 mM MgCh + ARNasa + ARN (tratamiento
control)
* Los blancos se prepararon con: 250 fJvL de 0.1 M buffer MOPS, pH 7.5 + 5 mM
MgCh + (con o sin urea y guanidina dependiendo del tratamiento que corresponda) +
125 flvL de 50% TCA + incubación por 5 min a O °C + centrifugación por 3 min a
14.500 rpm en una microcentrífuga.
11
II.A.2 Determinación de la absorbancia óptima de nucleótidos fosforilados
Para determinar la longitud de onda óptima de absorción para los nucleótidos liberados
durante la cinética de la enzima, en primer lugar se procedió a realizar un análisis con
estándares en buffer MOPS en presencia y ausencia de TCA.
Las longitudes de onda utilizadas fueron 260, 280 y 290 nm, sugeridas en la bibliografía
para la cuantificación de los nucleótidos libres (13, 35, 36). Para las condiciones
experimentales empleadas en este trabajo, fue necesario llevar a cabo ensayos
preliminares de espectrometría para detem1inar el efecto del solvente sobre la absorción
de los analitos y así garantizar una máxima sensibilidad del método que permitiera
cuantificar eficientemente los nucleótidos liberados durante la cinética.
Tabla l. Composición de las soluciones utilizadas para la determinación
de las absorbancias óptimas de los nucleótidos libres fosforilados en buffer
MOPS para el cálculo del factor GQ.
Componentes Solución inicial Solución Final
dNTPs (10 mM) 3. 75 f.LL 3. 75 f.LL
MOPS (100 mM) 496.25 f.LL 371.25 f.LL
TCA (50%) - 125 f.LL
Una vez realizadas las mediciones se procedió a calcular un factor relativo llamado GQ
(GeQuimCel), que permite predecir la absorbancia óptima de un analito en solventes
modificados para la cinética de una enzima y que además, pem1ite calcular la obtención
de diferencias significativas en las pendientes obtenidas durante una cinética, evitando la
obtención de resultados poco representativos desde el punto de vista estadístico.
12
Este factor se puede fommlar mediante la siguiente expresión:
GQ = A*t..r- At..i
At..i: Absorbancia inicial a una longitud de onda (A) en un solvente A
A *t..r: Absorbancia final a una longitud de onda (A) en un solvente A modificado
Nota: Con el factor GQ, además se pueden observar diferencias significativas entre
las pendientes resultantes cuando se realice una cinética de inhibición donde se tenga
que modificar químicamente el solvente para detener la reacción, teniendo en cuenta
que:
1) Sí el factor GQ ::;O (negativo pero cercano a cero) => m 1 ':/; m 2 (A es adecuada
para el análisis cinético)
II) Sí el factor GQ >O => m 1 = m2 (A es no adecuada para el análisis cinético)
III) Sí el factor GQ =O => m 1 ~ m2 (A es poco adecuada para el análisis cinético)
).> Donde m¡ y m2 corresponden a dos pendientes obtenidas de una cinética de
inhibición.
Mientras más negativo sea el valor de GQ, la A será más adecuada para usarse en
ensayos de tipo cinético.
II.B Cinética de la RNasa 1:
l. En un tubo de 1.5 mL, se agregaron 80 ,uL del ARN de levadura (0.7 %) y se incubó
a 37 oc por 5 nrin
2. Se agregaron 20 ,uL de RNasa I (0.025U/,uL en 20 mM buffer Tris-HCI pH 7.5) para
comenzar la reacción.
3. Se incubó a 37 oc durante O, 1, 2, 3, y 4 min.
4. Se detuvo la reacción con 100 ,uL de TCA al 50 %
5. Se incubó a Ü°C por 5 min.
6. Se centrifugó a 14.000 rpm en una microcentrífuga por 4 min.
7. Se midió a una absorbancia de 290 nm.
13
Notas:
EL stock de la ribonucleasa se preparó para cada tratamiento a una concentración de
0.025 U/p,L resuspendiendo el stock comercial (7 U/t-tL) en 200mM de buffer Tris-HCl
(pH 7.5) + 5mM EDTA + 200mM de acetato de sodio y 0.05% Triton X-100.
Para medir la actividad de la ribonucleasa se utilizaron los siguientes tratamientos:
0.5M urea en 200mM de buffer Tris-HCI (pH 7.5) + 5mM EDTA + 200mM de
acetato de sodio y 0.05% Tri ton X-1 OO.
0.5M de cloruro de guanidina en 200mM de buffer Tris-HCl (pH 7.5) + 5mM
EDTA + 200mM de acetato de sodio y 0,05% de Triton X-1 OO.
200mM de buffer Tris-HCI (pH 7.5) + 5mM EDTA + 200mM de acetato de
sodio y 0,05% de Triton X-100 (tratamiento control).
Los blancos se prepararon bajo las mismas condiciones para cada tratamiento,
pero deteniendo inmediatamente el progreso de la reacción con TCA para evitar
la degradación del sustrato.
III.A Metodología de extracción de ARN con urea
Para la purificación del ARN total de todas las muestras se procedió de la siguiente
manera:
a. Se maceró la muestra (un gramo de embriones) con nitrógeno líquido
b. Se agregaron 4 mi de buffer de extracción (8 M urea; 20 mM MES, pH 7.0; 20 mM
EDTA)
c. Se agregó ¡3-mercaptoetanol hasta una concentración final 0.35 M y se homogenizó la
mezcla.
d. Se adicionó un volumen igual de una mezcla fenol:cloroformo:isoamilalcohol en una
proporción 25:24:1 respectivamente y luego se incubó por 5 minutos con agitación
El fenol fue previamente equilibrado con 0.1 M de buffer citrato, pH 4.4.
e. Se centrifugó (60min a 6500xg) a 4 oc y se extrajo la fase acuosa, a la cual se le
agregó 1 vol de clorofom1o; se agitó vigorosamente por 2 min. y fue centrifugada bajo
las condiciones anteriores.
f. Se repitió el paso anterior y se transfirió la fase acuosa a un tubo estéril.
14
g. Se agregó 0.4 vol (con respecto a la fase acuosa recuperada) de ácido acético 1 M y
una mezcla de etanol:isopropanol (1: 1) y se incubó a -20 oc durante toda la noche.
h. Se centrifugó (30min a 6500xg) a 4 oc. Se descartó el sobrenadante y el precipitado
fue disuelto por agitación vigorosa en presencia de acetato de sodio (3.0 M, pH 5.2)
calentado en un baño termostatizado.
i. Se repitió el paso anterior tres veces y se descartó el sobrenadante y luego el
precipitado fue disuelto con 70% etanol en agua tratada con DEPC.
j. Se centrifugó a 14.500 rpm en una microcentrífuga; luego se descartó la fase acuosa y
los tubos se colocaron 5 minen la estufa a 60 °C.
k. Se resuspendió con 20 J.LL de agua tratada con DEPC.
Notas:
- Las extracciones con cloruro de guanidina se llevaron a cabo bajo las mismas
condiciones comentadas, excepto por el buffer de extracción al que en lugar de urea se
agregaba guanidina 8 M (paso b)
- Las precipitaciones de la población de ARN total se realizaron con ácido acético (en
presencia de alcohol) y no con LiClz como lo sugieren algunos autores (25, 27, 28)
debido a que esta sal precipita el ARN de alto peso molecular, dejando en solución las
poblaciones más pequeñas (37,38) y como consecuencia el rendimiento de la extracción
disminuye.
- La integridad dei ARN total aislado fue corroborada en principio por la presencia de
las dos bandas ;ibosomales (ARNr) 25S y 18S para el caso de los tejidos vegetales,
mientras que para el tejido animal las bandas correspondientes para verificar su
integridad fueron 28S y 18S.
- Las muestras de ARN total se corrieron en un gel de agarosa al 1.5% en condiciones
desnaturalizantes y teñidas con bromuro de etidio como se sugiere en Sambrook et al.
(37).
III.B Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Para verificar la calidad del ARN de cada muestra se llevaron a cabo reacciones de RT
PCR (Transcripción Reversa- Reacción en Cadena de la Polimerasa) con la ayuda del
15
"Reverse transcription system kitTM, de Promega Cat. No. A3500. Las secuencias de
cebadores usadas para la amplificación del ARN mensajero del gen ¡'3-actina de plantas
fueron las siguientes:
Secuencia sentido (5'- TAOCAACTOOOATOACATOG- 3')
Secuencia antisentido (5'- OATOOCTOGAAOAOAACCTC- 3')
La amplificación a partir del ARN mensajero del gen ¡'3-actina de animales fue llevada a
cabo bajo las mismas condiciones, usando el par de cebadores beta-actin Promega Cat.
No. 05740. La reacción fue analizada por la fluorescencia emitida en presencia de
bromuro de etidio (50-100 ng/mL) en un gel de agarosa al 0.8%. El peso molecular de la
banda amplificada fue estimado usando la escalera de pesos moleculares de Promega
lkb Cat. No.G5711
Notas:
- Las condiciones de PCR usadas, son las sugeridas por el kit "beta-actin" de Promega
Cat. No. 05740
- La ausencia de ADN de alto peso molecular fue asumida con base a la no presencia de
bandas fluorescentes por encima de las bandas ribosomales 25S para los tejidos
vegetales y 28S para el tejido animal como lo sugieren Murillo et al. (22). Al comparar
el tamaño de las bandas amplificadas (esperadas) por RT_PCR, las cuales fueron más
pequeñas (en ausencia de ADN) debido a que los cebadores son diseñados a partir de
secuencias que flanquean intrones en el ADN genómico, asumimos también que las
muestras no presentabán contaminación con ADN de alto peso molecular.
16
Resultados y discusión
l. Teoría química y bioquímica
Se propuso con base a la teoría de orbitales moleculares fronteras y el principio acido
base de dureza y blandura de Pearson (29-32), una explicación cualitativa para la
reactividad de la urea como agente inactivador de la ribonucleasa. Las moléculas en
estudio son caracterizadas por sus energías de orbitales fronteras y durezas absolutas
(Tabla 2). Esta es la manera aceptada de visualizar la interacción dador-aceptar (38)
usando las propiedades de las especies aisladas (29-32).
La energía del orbital molecular más alto ocupado de la urea y guanidina protonada
(Tabla 2) es comparada con la energía del orbital molecular más bajo desocupado de la
His y Lys con ambos grupos R protonados, residuos que se cree cumplen un papel
crítico en la hidrólisis del ARN (subsitio Pl) por la RNasa (39-40). El HOMO de la urea
está principalmente localizado sobre el átomo de oxígeno, mientras que el HOMO de la
guanidina protonada está localizado sobre el enlace nitrógeno-hidrógeno y los dos
valores del HOMO de la urea corresponden a los pares solitarios del oxígeno.
Las cargas atómicas (32) sobre los átomos de la molécula y el momento dipolar para la
urea y guanidina protonada fueron analizados (Tabla 2) desde la perspectiva de la teoría
de OM fronteras (29). Tomando en cuenta que la interacción más favorable ocurre entre
el HOMO del donador y el LUMO del aceptar y que una base dura con valor más bajo
interacciona mas fúertemente con un ácido duro que contenga un valor también bajo
(29-30). Los vaiores calculados de la energía de orbitales fronteras y dureza absoluta,
indican una interacción electrostática más favorable H-urea que entre K-urea (Tabla 2,
figura 6). La urea tiene una dureza de 1.05 eV mas baja que guanidina (protonada)
indicando que la urea es un donador mas adecuado y más eficiente para la interacción
con los grupos R de la H y K (cargados) implicados en la catálisis ácido-base de la
ribonucleasa.
17
Tabla 11. Energías calculadas de orbitales fronteras, cargas AIM y momentos dipolares
para la urea, guanidina protonada, histidina protonada y lisina protonada a nivel RHF/6-
31G(d).
Valores Guanidina Histidina Lysina Urea
Teóricos (protonada) (protonada) (protonada)
e o.6166 e 2.2o17
Cargas de Bader o -0.8299
N0.6511 N -1.3815
H 0.4564 H 0.4893
Momento 3.5388 2.6706
dipolar (Deb)
El-loMo (eV) -11.50 -17.27 -13.23 -13.63
-12.64
ELuMo (e V) 0.93 -2.75 -3.18 -2.35
11 (eV) 6.21 7.26 5.02 5.64
La H protonada tiene una dureza de 0.62 e V mas baja que la K cargada, indicando que H
cargada es mejor áceptor que K (Tabla2). La unión electrostática entre urea y H es
estabilizada por' una interacción de tres centros (N:H:O) cuatro electrones (38). Esta
interacción de tres centros-cuatro electrones compensa parcialmente el déficit sobre el
átomo de nitrógeno cargado (generado por compatiir su par solitario con el protón) del
imidazol de H. Además, basado en la densidad de carga negativa sobre el átomo de
oxígeno y el momento dipolar tan elevado de la urea (Tabla 2) la interacción de esta
molécula con el nitrógeno protonado del imidazol de la H resulta en una condición
electrostática fuerte y estable.
18
Energía
Figura 6. Representación esquemática de la interacción de orbitales fronteras entre urea y/o guanidina protonada con H y/o L (ambas protonadas)
Desde el punto de vista de la química cuántica, estos resultados sugieren que la
guanidina protonada tiene una probabilidad más baja de disminuir la velocidad de
reacción de la ribonucleasa en comparación con la urea, debido a que la guanidina tiene
un valor del HOMO de -17.27 eV y un valor de dureza de 7.26 eV, lo que disminuiría su
capacidad para formar aductos (por interacciones HOMO/LUMO y de dureza/blandura)
con H y K protonadas (Tabla 2, figura 6). La guanidina protonada es un compuesto
iónico que tiene "comprometido" el HOMO para estabilizar su protón (cuyo pKa es
13.6) lo que d]sminuirá su capacidad de establecer interacciones favorables con
electrófilos, a diferencia de la urea que puede interaccionar con más facilidad frente a los
aa cargados.
En 1959 Kalnitsky et al. (Fig. 5) (13), compararon la actividad de la ribonucleasa en
presencia y ausencia de urea. Esto evidenció un posible efecto potenciador de la urea
sobre la actividad de la RNasa, corno consecuencia de un incremento en la liberación de
nucleótidos (13). Estos resultados están en desacuerdo con el modelo propuesto en el
presente trabajo, pues aquí se propone que la urea ejerce una inhibición de la actividad
19
de la enzima. Un análisis del trabajo de Kalnitsky et al. permite notar que el buffer
usado para medir la actividad de la enzima fue acetato (pH 5.0), cuyo pH no resulta ser
el óptimo reportado para la enzima (7.0- 7.5) por lo que es de esperar una baja actividad
de la enzima bajo estas condiciones eliminándose así la aparente contradicción con
nuestro trabajo.
En las condiciones descritas por estos autores, buffer acetato a pH 5.0 y en presencia de
urea 8 M, se pueden proponer como explicación alternativa varias hipótesis:
l. Incremento del pH: La urea presenta pares de electrones no enlazantes, tanto en
sus nitrógenos como en sus átomos de oxígeno, lo que le confiere un carácter
básico a la molécula (base de Lewis) y por ende su capacidad de aceptar protones
(base de Bronsted) incrementando el pH del medio al entrar en solución. Esto
conduce a la deprotonación de los grupos fosfatos del sustrato (pKa ~ 6.0), lo cual
en última instancia favorecerá una mayor interacción con el centro de
reconocimiento de la enzima en comparación con la solución buffer a pH 5.0.
II. Relajación del ARN: La presencia de la urea en el medio, bajo las condiciones
descritas, favorece la relajación de las cadenas del ARN (13,14) haciéndolo mas
susceptible al ataque por la enzima.
III. Incremento de la actividad enzimática: La urea, además de causar una variación
físico-química sustancial al alterar factores tales como la fuerza iónica del medio, el
L1pH, y la ruptura de estructuras secundarias del ARN, logrando ejercer un efecto
concentrador como consecuencia de su capacidad para solvatarse en medio acuoso. Esto
último incrementa la probabilidad de encuentro enzima-sustrato y por ende aumentaría
la actividad de la enzima (41).
Para someter a prueba estas hipótesis, se procedió a observar los efectos de
concentraciones crecientes de urea sobre la variación del pH en dos soluciones buffer
20
(tabla 3). Este experimento además pennitió la selección de un buffer conveniente para
medir la actividad de la RNasa A en estudios cinéticos.
Tabla 111. Variación del pH en función de concentraciones crecientes de urea en
buffer acetato y buffer MOPS
Buffer Acetato l 00 mM Buffer MOPS 100 mM [Urea]
(pH5.0) ( pH 6.5)
o 5.05 6.72
0.5 5.05 6.73
5.14 6.76
2 5.26 6.80
3 5.37 6.85
4 5.51 6.89
8 5.89 7.00
En la Tabla 3 se observa que la variación del pH en buffer acetato (0.1 M) siempre es
mayor que en el buffer MOPS (O.lM), lo que indica que el buffer MOPS tiene un efecto
de tamponamiento. superior, haciéndolo más adecuado para estudios cinéticos en
presencia de ureaque el buffer acetato.
Además, se puede notar en la tabla 3, un incremento de casi una unidad de pH (buffer
acetato) en presencia de 8M de urea, lo que apoyaría la primera y tercera de las
hipótesis, indicando esto que el incremento de la actividad de la RNasa observado por
Kalnitsky et al. (13) en presencia de urea es un artefacto generado por el incremento del
pH hacia un pH más apropiado para potenciar la actividad enzimática, debido a la
deprotonación de los fosfatos en el RNA y hacia una concentración de protones más
adecuada para la catálisis de la RNasa.
21
11. Cinética enzimática (RNasa A y RNasa I)
II.A.l Cinética de la RNasa A
Para corroborar la probable inhibición de la ribonucleasa por efecto de la urea debido a
la formación de aductos ácido-base con la enzima, se hicieron experimentos de cinética
de inhibición para así evaluar el efecto de la urea y cloruro de guanidina sobre la
velocidad inicial de la RNasa.
La figura 7 muestra la actividad de la enzima, medida como el incremento de absorción
a 290 nm en función del tiempo, en presencia de urea e hidrocloruro de guanidina. En el
tratamiento control (buffer MOPS sin urea, ni guanidina) la velocidad inicial (que
corresponde a la pendiente mas pronunciada), es mayor en comparación con la pendiente
que corresponde al tratamiento con cloruro de guanidina y significativamente mayor
que el tratamiento con urea. Es decir, la actividad de la enzima se ve más afectada en el
tratamiento con 0.5 M de urea indicando con ésto que la urea inhibe totalmente la
velocidad de reacción de la ribonucleasa, protegiendo así al ácido ribonucleico de la
degradación. Por otro lado la velocidad inicial de la RNasa en el tratamiento con cloruro
de guanidina está dentro del mismo orden de magnitud al compararlo con el experimento
control, lo que sugiere que la velocidad de la enzima en presencia de cloruro de
guanidina, bajo estas condiciones, no es inhibida de manera significativa (figura 7)
0.06 ·¡ y = 0,0002x + 0,0072
0 ,04
... . 0,03
y = 1E-04x + 0,002
... . . . . . .. . 0,01 - • - •
~ 6E-22x + 0.0003 0,00
o 50 10 15 20 250 300
.o. Abs (290) C
- - - Lineal (Abs 290 C)
o o
* Abs (290) u
• Abs (290) G
Tiempo (s)
--Lineal (Abs 290 G) --Lineal (Abs 290 U]
Figura 7. Cinética de inhibición de la RNasa medida como incremento de la absorción a 290 nm. La comparación cinética de la ribonucleasa en presencia de 0.5 M de urea (rojo) y 0.5 M de cloruro de guanidina (azul), muestra el efecto inhibitorio tan significativo que ejerce la urea cuando se compara con el control (líneas negras).
22
Bajo nuestras condiciones experimentales, la inhibición de la enzima por urea no es
debida a un efecto desnaturalizante de este reactivo, ya que el mismo ejerce dicho efecto
a concentraciones mayores de 2M (16, 42-50). El cambio apreciable de la velocidad
inicial de la enzima a la concentración usada de urea (0.5M) puede ser explicada por el
efecto inhibidor de este compuesto sobre la RNasa A. Además, la guanidina no ejerce
un efecto de inhibición sobre la velocidad inicial, tan significativo como el de la urea. La
velocidad de degradación del ARN en presencia de guanidina fue ligeramente más baja
que el control, disminuyendo aproximadamente a la mitad la velocidad inicial de
degradación; por lo tanto, la guanidina no ejerce una completa inhibición sobre la
catálisis de la RNasa.
En paralelo se llevaron a cabo las mediciones a 260 nm y 280 nm [las longitudes de
onda utilizadas en los métodos de Kalnitsky et al. (13) y Shultz et al. (36)] para
comparar y obtener la longitud de onda óptima para la actividad de la RNasa.
0 .20 l
0 .16
A 280 0 .12
0.08
O.O.J
0.00
o
V = O.OOO.Jx + 0 .0828 ...... .
.. • .... .. .. v = 0 .0002x + 0.0226
50 100 150 200 250
A Abs (280) C x Abs (280) U • Abs (280) G
300
Tiempo (s)
- - - · Lineal(Abs 280 C) --Lineal(Abs 280 G) --Lineal(Abs 280 U)
Figura 8. Cinética de inhibición de la RNasa medida como incremento de la absorción a 280 nm. Al comparar la cinética de la ribonucleasa en presencia de 0.5 M de urea (rojo) y 0.5 M de cloruro de guanidina (azul) con el control (punteada), medidas a una longitud de onda de 280 nm, muestra un efecto inhibitorio en la velocidad de reacción.
23
0 .800
y = 0 ,0005x + 0,4918
0 .6 00 L_--.,.----=-----.±.----· 0, 4 00 -
y = 0 ,0004x + 0 ,1922 . - - .. - - - - - - ... -. o. zoo L- .:_- .:_- ...::.- ...::.-_::-_::·;:~~-~-~-:__-:__·_- 2-x _- -- -- -----x--~~=-=
y 0 ,0003x + 0 , 16 0 2
0.000 -4----~--~---~--~---~-~
o 50 100 150
.o. Abs (260) C x Abs (2 6 0 )U
2 00 250
+ Abs (260) G
3 00
Tiempo (s)
--Lin eal (Ab s (2 60) G) - - - ·Lineal (Ab s (260 ) C) --Lineal (Abs (26 0) U)
Figura 9. Cinética de inhibición de la RNasa medida como incremento de la absorción a 260 nm. La compararación cinética de la ribonucleasa en presencia de 0.5 M de urea (rojo) y 0.5 M de cloruro de guanidina (azul) con el control (punteada), medida a una longitud de onda de 260 nm, no muestra un efecto inhibitorio significativo en la velocidad de reacción en presencia de los agentes inactivantes. El valor inicial de absorbancia para el caso del clorhidrato de guanidina sugiere que a tiempo cero el ARN ya esta siendo degradado
En las figura 8 y 9, se puede observar que las velocidades iniciales de degradación del
ARN por la RNasa A, en presencia de urea y guanidina a 280 nm y 260 nm
respectivamente, no presentaron variaciones apreciables. Para el caso de la cinética
medida a una absorbancia de 260 nm las velocidades iniciales del tratamiento control, el
de urea y el de guanidina son similares. La diferencia radica en que la absorbancia
inicial (corte con el eje Y) en el tratamiento con guanidina es dos veces mayor, por lo
que parecería que en presencia de guanidina hay una mayor degradación del ARN,
mientras que las velocidades iniciales, cuantificadas a 280 nm, en presencia de urea y
guanidina, son idénticas, pero se observa una inhibición de la actividad enzimática
(50%) en presencia de ambos agentes inactivantes. Los resultados medidos a 280 nm y
260 nm resultaron contradictorios entre sí (en un caso hay inhibición y en el otro no hay
inhibición por parte de la urea y la guanidina), lo que nos sugirió que las longitudes de
onda a 260 nm y 280 nm (en las condiciones experimentales utilizadas) no son las más
adecuadas para llevar a cabo estudios cinéticos de inhibición de la RNasa. El resultado
de la cinética cuantificada a 290 nm (Fig 7) mostró una diferencia más notoria en la
cinética de inhibición de ambos nucleófilos. Es decir, ambos agentes químicos inhiben la
enzima, pero la inhibición con urea resultó ser total a una concentración de 0.5 M. Por
otra parte, la guanidina solo inhibió el 50% de la actividad de la RNasa, a esa misma
24
concentración, por lo que el ARN resulta ser más degradado en presencia de este agente
caotrópico.
Estas evidencias experimentales se pueden interpretar de dos maneras:
1) Estas dos últimas longitudes de onda (260 y 280 nm) no son las adecuadas para
cuantificar la cantidad de nucleótidos liberados bajo las condiciones
experimentales usadas
2) Que son las adecuadas y que a una absorbancia de 290 nm, la inhibición
observada sea producto de un artefacto generado por el método a esa longitud de
onda.
II.A.2 Determinación de Absorbancia óptima de nucleótidos fosforilados
Para tratar de validar una de estas alternativas y descartar la otra, se llevó a cabo la
detem1inación de la longitud de onda óptima para la cuantificación de los nucleótidos
liberados bajo las condiciones experimentales usadas con la ayuda del factor GQ.
Para verificar los resultados obtenidos en cada uno de los gráficos (figuras 7, 8 y 9) se
prepararon dos muestras (12 repeticiones/muestra) y se les midió la absorbancia a
distintas longitudes de onda (ver metodología II.A.2)
Tabla IV. Valores de GQ y absorbancias de los dNTPs a longitudes de ondas
distintas en bu~fer MOPS en presencia y ausencia de TCA
Solución A760 A2so A29ü
Inicial 2.582 ± 0.065 1.537 ± 0.096 0.475 ± 0.031
Final 1.126 ± 0.009 1.954 ± 0.1065 1.139 ± 0.072
GQ 1,456 -0.4517 -0.664
En la tabla 4 se puede notar que los valores de GQ se hacen más pequeños a medida que
se incrementa la longitud de onda en las muestras. Los resultados de los valores
25
obtenidos del factor GQ sugieren que debemos esperar diferencias de pendientes más
significativas a una longitud de onda de 290 nm entre las cinéticas obtenidas.
Al comparar los valores de GQ con las pendiente de las gráficas obtenidas en las figuras
7, 8 y 9, se puede notar una correlación entre las diferencias de los valores de las
pendientes a una longitud de onda determinada y el valor correspondiente del factor
calculado para esa longitud de onda (según la definición establecida para dicho factor);
es decir, que para una longitud de onda determinada si el valor de GQ es negativo y
cercano a cero la diferencia de las pendientes obtenidas será mas apreciable. Esta
correlación observada entre ambas variables (m y GQ) valida los resultados cinéticos
alcanzados a 290 nm, indicando no sólo que esta longitud de onda es la mas adecuada
para medir la actividad de la enzima bajo las condiciones experimentales usadas, sino
que también nos da más confianza para apoyar el modelo de inhibición por urea sobre la
RNasa propuesto en el presente trabajo.
II.B Cinética de la RNasa 1
La ribonucleasa I fue descrita como una endorribonucleasa periplásmica de 27 kDa,
presente en E. coli (51). En esta enzima también se llevó a cabo un estudio cinético en
presencia y ausencia de urea y cloruro de guanidina obteniéndose los siguientes
resultados:
y = 0.0749x + 0 .0138
2.5 3,5 4 4,5
• 1UE • 0,5UE .A. Guanidina • Urea - Lineal (lUE) - Lineal {0.5UE)
Figura 10. Cinética de inhibición de la RNasa 1 seguida por incremento de la absorción a 290 nm. La comparación cinética de la ribonucleasa 1 en presencia de 0.5 M de urea (líneas rojas) y 0.5 M de cloruro de guanidina (líneas azules punteadas), muestra el efecto inhibitorio absoluto que ejerce la urea y el cloruro de guanidina cuando se compara con la actividad de la enzima a 0.5 y 1 unidad de enzima (línea verde y morado respectivamente).
26
En la figura 1 O, se muestra el efecto de inhibición absoluto que presentan la urea y el
cloruro de guanidina sobre la actividad de otra ribonucleasa. Aunque se conozca muy
poco de esta enzima, toda ribonucleasa debería tener en su estructura nativa, un canal de
residuos cargados de K y R ("centro o región de acoplamiento" con el sustrato) que le
pennita el reconocimiento de las cargas complementarias de los grupos fosfatos y un
centro catalítico cuyos residuos involucrados en la catálisis sean principalmente residuos
básicos cargados. Por esta razón no es de sorprender la inhibición absoluta observada
frente a urea y guanidina 0.5 M aunque se necesitaría un estudio más detallado desde el
punto de vista estructural (análisis de dicroísmo circular, RMN y difracción de rayos X)
para entender mejor el efecto inhibitorio de estos compuestos sobre la actividad de las
ribonucleasas y sobre todo de la RNasa I.
IIJ.A Sistema de purificación de ARN en base a urea
Con base en los resultados de inhibición de la RNasa, se diseñó un sistema de
purificación con urea que generó resultados significativamente más eficientes en cuanto
a cantidad de ARN total/ peso de tejido fresco de los cultivares de cacao, al compararlo
con el método basado en cloruro de guanidina.
En la tabla V se pueden observar los rendimientos obtenidos con cada uno de los
métodos, lograndose apreciar una diferencia de un orden de magnitud sobre el método
de cloruro de guanidina, en los rendimientos obtenidos con el método de la urea aplicado
a cacao. Sin embargo, no se observaron diferencias considerables en cuanto a pureza
(basándose en las·relaciones 260/280) en cada una de las muestras.
El alto rendimiento en ARN total purificado con el método de urea en comparación con
el de cloruro de guanidina es consecuencia del efecto perturbador que la urea ejerce
sobre la velocidad de degradación del ARN durante la extracción. Este efecto fue
evidenciado en los experimentos de cinética enzimática en presencia de urea. Los
resultados observados en la tabla V (en cuanto a rendimiento) podrían explicarse además
por la cualidad que presenta la urea no solo por inhibir la RNasa, sino también por su
capacidad para relajar las poblaciones de ARN total compactados (lo que puede
incrementar el rendimiento en ARN total de la muestra durante la extracción).
27
Tabla V. Rendimiento de ARN total extraído a partir de embriones de cacao usando
dos métodos de aislamiento
Método de cloruro de Tipo de Método de urea Relación
tejido guanidina (¡..tg/g peso
(¡..tg/g peso fresco) 260/280 fresco)
cultivar I 36.5 ± 4 403 ± 10 1.5 ± 0.1
(cacao)
cultivar II 48.7 ± 4 500 ± 10 1.5 ± 0.1
(cacao)
Probablemente cuando el buffer con cloruro de guanidina es mezclado con los tejidos la
RNasa, independientemente del tejido que se esté utilizando, no es totalmente inhibida
(como ocmTe en la cinética de inhibición de la RNasa A en presencia de guanidina) lo
que permite que bajo estas condiciones la enzima degrade parte del sustrato en la fase
inicial de la purificación, incrementando la cantidad de ARN hidrolizado; ésto a su vez
disminuye el rendimiento del sistema empleado. Por el contrario, la urea, al entrar en
contacto con los tejidos relajaría los agregados de las poblaciones de ARN total
[incluyendo ribozimas que tienen la capacidad de degradar ARN de bajo peso molecular
(52)] que se fom1an en solución acuosa y permitirá una menor pérdida del ARN durante
la extracción, al momento de sacrificar pequeñas cantidades de fase acuosa en la
interfase de separación. Además, la urea podría reaccionar con los aminoácidos cargados
(K66, K7, RlO y R85) en el sitio de reconocimiento de la enzima (subsitios P-1, PO y
P2) con los aa involucrados en la catálisis [subsitio Pl (H12, H119, y K41)] y con los aa
involucrados en la especificidad de la catálisis (subsitios B), además de su efecto
desnaturalizante sobre cualquier RNasa que procese a su sustrato de acuerdo a este
modelo catalítico conocido. Todos estos factores provocan la pérdida de actividad de la
enzima y como consecuencia, mayor será la cantidad de ARN total no hidrolizado
generando altos rendimientos en la purificación de ARN con urea.
28
Para corroborar la reproducibilidad de la metodología diseñada con urea y guanidina
para las extracciones del ARN total, los métodos de purificación se repitieron al menos
40 veces; además se probó el sistema de purificación con urea en otros tejidos vegetales
como lo fueron dos cultivares de lechosa y también se usó hígado de rata como fuente de
tejido animal (tabla 6) arrojando resultados satisfactorios por el alto rendimiento y
pureza del ARN aislado.
Tabla VI. Rendimiento y relación de absorbancia de muestras de ARN total purificado
a partir de hojas de lechosa e hígado de rata por el método de urea.
Rendimiento (metodo de urea) Tipo de tejido Ratio 260/280
f.Lg/g peso fresco
Lechosa I 480 ± 10 1.9 ± 0.1
Lechosa II 485 ± 10 1.9 ± 0.1
Hígado de rata 508 ± 10 1.9 ± 0.1
Se puede notar en la tabla 6 que el sistema de purificación diseñado con urea, además de
ser muy efectivo para la extracción de poblaciones de ARN total de otros tejidos, la
relación de absorbancias (A26o 1 A280) tanto para el tejido vegetal (hojas de lechosa)
como para el tejido animal (hígado de rata) es aproximadamente dos, lo que indica que
la preparación extraída esta libre de polisacáridos, proteínas y polifenoles (52) a
diferencia de las muestras de cacao que tienen una relación de absorbancias (A260 1 A280)
más baja, probablemente por que los embriones de cacao poseen mayor cantidad de
polisacáridos y polifenoles.
La integridad del ARN total aislado de todas las muestras usadas fue corroborada por la
aparición de dos bandas de ARN ribosomal (ARNr). La Figura 11 muestra las dos
bandas ribosomales a 3.7 Kb y 1.9 Kb (comparando con la escalera de peso molecular
de ARN) que corresponden a los coeficientes de sedimentación 25S y 18S
respectivamente para los tejidos vegetales (pozos 1, 2, 3, 4, 6, 7) y 4. 7 y 1.9 que
corresponde a 28S y 18S para el tejido animal (pozo 5). Las muestras extraídas con
cloruro de guanidina presentaron una fluorescencia apreciable a lo largo de la corrida,
29
probablemente, como consecuencia de compuestos que coprecipitaron con la muestra y
de ADN de alto peso molecular (en la parte superior de los canales) como se observa en
los pozos (canales 1 y 2); esta fluorescencia no se logra apreciar en las muestras
purificadas usando el método con urea, canales 3-8 .
2 3 4 5 6 7 8
Figura 11 . ElectToforesis en gel de agarosa del ARN total aislado por dos métodos diferentes. a, método con hidrocloruro de guanidina; líneas 1 y 2, 20 p.g de ARN total de embriones de cacao (cultivares I y II respectivamente). b y e, método de extracción con urea, línea 3 y 4, 10 p.g de ARN total de embriones de cacao (cultivares I y II respectivamente), línea 5, 20 p.g de ARN total de hígado de rata; líneas 6 y 7, 20 ¡J,g de ARN total de hojas de lechosa (cultivares I y Il respectivamente) ; línea 8, marcadores de peso molecular de ARN.
III.B RT_PCR a partir de muestras de ARN total extraídas
Para chequear la calidad de la población del ARN total aislado de los diferentes tejidos
purificados con el método de urea, se llevo acabo un RT-PCR usando cebadores para el
gen de la ¡3-actina. La figura 12 muestra los productos amplificados a partir de las
reacciones de RT.::PcR de las !'nuestras de ARN total de lechosa (hojas) de dos cultivares
de procedencias distintas, de dos cultivares distintos de cacao y de hígado de rata. Los
fragmentos de cDNA resultantes fueron de aproximadamente 285 pb tal y como se
esperaba según el disefío de los cebadores, mientras que las dos bandas presentes en
canales 4 y 5 (figura 12) son características cuando se amplifica el gen de ¡3-actina en
lechosa (53). Estos resultados indican que el sistema de purificación diseñado usando
urea es eficiente para purificar ARN total de alta calidad (no degradado), tanto para
tejidos vegetales como animales.
30
Figura 12. Productos amplificados por RT-PCR del gen de ¡3-actina, a partir de ARN total aislado por el método de urea de diferentes tejidos (se cargaron en cada pozo 1 O J,LL del producto amplificado). El cDNA de primera cadena fue sintetizado a partir de 1 ¡,Lg del ARN total aislado de cada muestra. Línea 1, marcadores de peso molecular de ADN ; 1 ínea 2, control negativo; línea 3, hígado de rata; líneas 4 y 5, Lechosa (cultivar 1 y Il) respectivamente; líneas 6 y 7, cacao (cultivar I y II) respectivamente; línea 8, marcadores de peso molecular de ADN
Este trabajo es probablemente el primer repo1ie que propone una explicación con base a
enzimología y química cuántica del mecanismo de acción de la urea como agente
inactivante sobre la 1ibonucleasa, la cual usualmente se limita solamente a los efectos
caotrópicos del compuesto sobre el plegamiento de la enzima (16, 31-32). La literatura
menciona numerosos repmies de la urea como agente desnatura1izante (17, 31 - 38),
pero no se h~n hecho estudios previos a este trabajo sobre la reactividad de esta
molécula a nivel de una interacción donador-aceptor con aa protonados de la enzima
implicados en el reconocii11iento del ARN, en la hidrólisis (39,40) y su impacto directo
en sistemas de plirificación dé ARN total. Este trabajo tiene aplicaciones inmediatas en
las extracciones de ácido ribonucleico para estudios genómicos, de expresión y
regulación génica. Además el método basado en urea tiene un beneficio adicional por ser
un sistema de purificación económico si se compara con el de cloruro de guanidina.
La metodología que se utilizó en este trabajo (estudios químicos-teóricos antes de
realizar experimentos de cinética enzimática y purificación del ARN) permitió hacer un
ensayo más metódico y racional de planificación, para la elaboración de estudios de
inhibición y purificación.
31
Conclusiones
l. Hasta ahora, siempre se había considerado la urea como un agente
desnaturalizante de proteínas, sin embargo los resultados de los estudios
cinéticos con la RNasa A, bajo nuestras condiciones experimentales indican
que la urea actúa también como un inhibidor absoluto de la actividad de la
enzima a concentraciones de 0.5 M.
2. Con la visión cuántica de la teoría de orbitales moleculares fronteras, el
prmc1p10 acido-base de dureza-blandura de Pearson y cálculos
computacionales realizados con la ayuda del grupo de programas Gaussian
98, se pudo comparar la reactividad de la urea y el cloruro de guanidina
frente a aa claves presentes tanto en el sitio de reconocimiento como en el
centro catalítico de la ribonucleasa. Estos resultados junto con las evidencias
de cinética de inhibición enzimática nos permitieron plantear un mecanismo
de inhibición por parte de la urea sobre la RNasa A hasta ahora desconocido.
3. Bajo las condiciones experimentales optimizadas, en este trabajo, se puede
medir eficientemente la actividad de la RNasa A bovina con la ayuda del
factor GQ. Este factor permitió observar diferencias significativas entre las
pendientes resultantes, al realizar cinéticas de inhibición en las que se tenga
que modificar químicamente el solvente para detener la reacción.
4. El cloruro de guanidina comúnmente usado durante las extracciones del ácido
ribonucleko resultó tener un efecto inhibidor significativamente más bajo que
la urea ·sobre la ribonucleasa A bovina. Sin embargo frente a la RNasa I de E.
coli presento un efecto perturbador tan potente como el de la urea.
5. Se diseñó un sistema de purificación de ARN total en base a urea y resultó ser
aproximadamente 1 O veces más eficiente (para cultivares de cacao) en cuanto
a rendimiento en comparación con su equivalente de cloruro de guanidina.
Además este sistema con urea resultó ser eficaz para extracciones del ácido
ribonucleico de otros dos tejidos vegetales y un tejido animal.
32
Bibliografía
l. Smith, B., Soellner, M., and Raines, R. Potent Inhibition of ribonuclease A by
oligo (vinylsulfonic acid). J. Biol. Chem. 278, 20934-20938 (2003).
2. Nelson, D., and Cox, M. Lehninger: Principies of Biochemistry. Worth
Publisher, New York, N. Y. (2000).
3. McPherson, A., Brayer, G., Cascio, D. and Williams, R. The mechanism of
binding of a polynucleotide chain to pancreatic ribonucleases. Science 232, 765-
768 (1986).
4. Aguilar, C., Thomas, P., Mills, D., Moss, D. and Palmer, A. Newly observed
binding mode in pancreatic ribonuclease. J. Mol. Biol. 224, 265-267 (1992).
5. Moussaoui M., Guasch, A., Boix, E., Cuchillo, M. The role of non-catalytic
binding subsite in the endonuclease activity ofbovine pancreatic ribonuclease A.
J. Biol. Chem. 271, 4687-4692 (1996).
6. Rushinsky, G., Knight, A., and Sober, H. Studies on the preferential specificity
of pancreatic ribonuclease as deduced from partial digests. J. Biol. Chem. 236,
2735-2737 (1961).
7. Masachika, I., Watanabe, H., Ohgi, K., Tobe, M., Matsumura, G., Arata, Y.,
Hirose, T., and Inayama, S. Sorne evidence suggesting the existence of P2 and
B3 sites in the active site of bovine pancreatic ribouclease A. J. Biochem. 95,
751-759 (1984).
8. Fotencilla-Camps, J., de Llorens, R., le Du, M., and Cuchillo, C. Cristal structure
ofribonuc1ease A.d (ApTpApApG) complex. J. Biol. Chem. 269, 21526-21531
(1994).
9. Fisher, B., Juneko, E., and Raines, R. A new remote subsite in ribonuclease A. J.
Biol. Chem. 273, 34134-34138 (1998).
10. Thompson, J. and Raines, R. Value of general acid-base to ribonuclease A. J.
Am. Chem. Soc., 116, 5467-5468 (1994).
11. delCardayré, S. and Raines, R. A residue to residue hydrogen bond mediates the
nucleotide specificity ofribonuclease A. J. Mol. Biol. 252, 328-336 (1995)
12. Berg, M., Tyn1oczko, J. and Stryer, L. Biochemistry. New York (2002).
33
13. Ka1nitsky, J., Hummel, P. and Diekers, C. Some factors which affect the
enzymatic digestion ofribonucleic acid. J. Biol. Chem. 234, 1512-1516 (1959).
14. Hummel, P. and Kalnitsky, J. The influence of urea and electrolytes upon yeast
ribonucleic acid. J. Biol. Chem. 234, 1517-1519 (1959).
15. Wu, J. and Wang, Z. New evidence for the denaturant binding model. Protein
Science. 8, 2090-2097 (1999).
16. Ahmad, F. Free energy changes in ribonuclease A denaturation. Effect of urea,
guanidine hydrochloride and lithium salts. J. Biol. Chem. 258, 11143-11146
(1983).
17. Bennion, B. and Daggett, V. The molecular basis for the chemical denaturation
ofprotein by urea. Proc. Natl. Acad. Sci. USA .. lOO, 5142-5147 (2003) ..
18. Kirby, K.S. Isolation ofnucleic acids with phenolic solvents. Meth. Enzymol. 12,
(Parte B), 87-99 (1968).
19. Chomczynski, P. and Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid
guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162,
156-159 (1987).
20. Logeman, J., Schell, J., and Willmitzer, L. Improved method for the isolation of
RNA from plant tissues. Anal. Biochem. 163, 16-20 (1987).
21. Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., MacDonald, R. J. and Rutter, W.J. Isolation of
biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease.
Biochem. 18, 5294-5299 (1979).
22. Murillo, i:, Raventos, D., Jaeck, E. and San Segundo, B. Isolation of total RNA
and mRNA from plant tissues. Promega Notes Magazine Number 54,2-7 (1995).
23. Scott Jr., D.L., Clarence, C.W., Deahl, K.L. and Prakash, C.S. Isolation of
functional RNA from peridem1 tissue of potato tubers and sweet potato storage
roots. Plant Mol. Biol. Rep. 16,3-8 (1998).
24. G1isin, V., Crkvenjakov, R., and Byus, C. Ribonucleic acid isolated by cesium
chloride centrifugation. Biochem. 13, 2633-2637 (1974).
25. http://wheat.pw.usda.gov/~lazo/methods/au/gen6.html
34
26. Tai, H., Pelletier, C. and Beardmore, T. Total RNA isolation from Picea mariana
dry seed. Plant Mol. Biol. Rep. 22, 93a-93e (2004).
27. Auffray, C. and Rougeon, F. Purification ofmouse immunoglobulin heavy-chain
messenger RNAs from total myeloma tumor RNA. Eur. J. Biochem. 107, 303-
314 (1980).
28. Bugos, R.C., Chiang, V.L., Zhang, X.-H., Campbell, E.R., Podila, G. K., and
Campbell, W.H. RNA isolation from plant tissue recalcitrant to extraction in
guanidine. BioTechniques 19, 734-73 7 (1995).
29. Fukui, K. Theory of Orientation and Stereoselection (Springer, Berlin, 197 5).
30. Pearson, R. H. The principie of maximum hardness. Acc. Chem. Res. 26, 250-
255 (1993).
31. Geerlings, P., De Proft, F. and Langenaeker, W. Conceptual density functional
theory. Chem. Rev. 103, 1793-1873 (2003).
32. Bader, R. F. W. Atoms in Molecule. A Quantum Theory (Oxford, New York,
1990).
33. Gaussian Inc. Gaussian 98, Pittsburgh.PA, 1998.
34. Windholz, Martha. The Merck Index 9111 Edition. Merck & Co, INC. Rahway,
N.J.(1976).
35. Kunitz, M. A spectrophotometric method for the measurement of ribonuclease
activity. J. Biol. Chem. 164, 563-568 (1946).
36. Shultz, J., Hurst, R., Lewis, K., Betz, N. and Williams, R. RNasin® Ribonuclease
Inhibitor Part II: A Tale ofTwo Proteins. Promega Notes. 77 12-15 (2001).
37. Sambrook, J., Fritsch, E. and Maniatis, T. Molecular cloning a laboratory
manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).
38. Barlow, J.J., Mathias, A. P. and Willianson, R. A simple method for the
quantitative isolation of undegraded high molecular weight ribonucleic acid.
Biochem. Biophys. Res. Comm. 13, 61-66 (1963)
39. Purcell, K, F. and and Kotz, J. C. Inorganic Chemistry. Saunders, Philadelphia.
( 1977).
35
40. Markley, J., and Finkenstadt, W. Correlation proton magnetic resonance studies
at 250 MHz of bovine pancreatic ribonuclease. III. Mutual electrostatic
interaction between histidine residues 12 and 119. Biochem. 14, 3562-3566
(1975).
41. Jentoft, J., Gerken, T., Jentoft, N. and Dearbom, D. C3CJ Methylated
ribonuclease A. 13C NMR studies of the interaction of lysine 41 with the active
site ligands. J. Biol. Chem. 256,231-236 (1981).
42. Garret, R. and Grisham, C. Biochemistry. (Harcourt Brace College Publishers,
Philadelphia, 1995).
43. Tanford, C. Protein denaturation. Advan. Protein Chem. 23, 121-282 (1968).
44. Tanford, C., Kawahara, K., Lampaje, S., Hooker, T., Zarlengo, M., Salahuddin,
A., Aune, K. and Takagi, T. Proteins as random coils. III. Optical rotatory
dispersion in 6M guanidine hydrochloride. J. Am. Chem. Soc. 89, 5023-5029
(1967).
45. Tagaki, T. and Izutsu, T. Circular dichroism of the disulfide groups of
ribonuclease in 6M guanidine hydrochloride. J. Biochem. 75, 441-446 (1974).
46. Anfinsen, C.H. Principies that govern the folding ofprotein chains. Science 181,
223-230 (1973).
47. Anfinsen, C. and White, F. The ribonucleases, The Enzymes 5, P. Boyer, H.
Lardy and K. Myrback, Academic Press, NY. ( 1961 ).
48. Fischer, G. · and Bang, H. The refolding of urea-denatured ribonuclease A is
catalyzed·by peptidylprolyl cis-trans isomerase. Biochim. Biophys. Acta 828, 39-
42 (1985).
49. Ryle, A. and Anfinsen, C. Studies on the disulfide bridges m ribonuclease.
Biochim. Biophys Acta 24, 633-635 (1957).
50. White, F. and Anfinsen, C. Sorne relationships of structure to function m
ribonuclease. Ann. N Y Acad. Sci. 81, 515-523 (1959).
51. Shen V. and Schlessinnger D. RNase I, II and IV of Escherichia coli. The
enzymes. XV (Parte B), 501-515 (1982).
36
52. Wang, J., Qiu L., and Drlica, K. RNases involved in ribozyme degradation in
Escherichia coli. J. Bacteriol. 178, 1640-1645 (1999).
53. Tem1ant, P., Fem1in, G., Fitch, M.M., Manshardt, R.M., Slightom, J. L., and
Goncalves, D. Papaya ringspot virus resistance of transgenic rainbow and sunup
is affected by gene dosage, plant development, and coat protein homology. Eur.
J. Plant Pathol. 107, 645-653 (2001).
37